Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utföra polysome profilering på isolerade perfunderade mus hjärtat. Vi beskriver metoder för hjärtat perfusion, polysome profilering och analys av polysome fraktioner med avseende på mRNA, MicroRNA och det polysome proteomet.
Abstract
Studier i dynamiska förändringar i protein översättning kräver specialiserade metoder. Här undersökt vi förändringar i nyligen-synthesized proteiner som svar på ischemi och reperfusion använder isolerade perfunderade mus hjärtat tillsammans med polysome profilering. För att ytterligare förstå de dynamiska förändringarna i protein översättning, vi kännetecknas av mRNA som var lastade med cytosoliska ribosomer (polyribosomes eller polysomes) och också återvinnas mitokondriella polysomes och jämförs mRNA och protein distribution i den högeffektiv fraktioner (många ribosomer knutna till mRNA), låg effektivitet (färre ribosomer knutna) som också ingår mitokondriell polysomes och icke-översätta fraktioner. MicroRNA kan också associera med mRNA som översätts, vilket minskar effektiviteten i översättning, vi undersökt fördelningen av MicroRNA över fraktioner. Fördelningen av mRNA, MicroRNA och proteiner undersöktes under basala perfunderade förhållanden, i slutet av 30 min av globala utan flöde ischemi och efter 30 min reperfusion. Här presenterar vi de metoder som används för att utföra denna analys – i synnerhet metoden till optimering av protein utvinning från sackaros övertoningen, eftersom detta inte har beskrivits innan — och ge några representativa resultat.
Introduction
Hjärtat svarar på skadan av ischemi (I) och reperfusion (R) på ett dynamiskt sätt. Det finns dock lite insikt i akuta ändringar i proteinsyntesen under svaret. För att åtgärda detta, tog vi fördel av väletablerade metoden för polysome profilering1 för att identifiera ändringar i protein överflöd som återspeglar omfördelning av ribosomer och translationell reglerande faktorer från cytosolen till polysomes, och ökning av nyligen syntetiserade proteiner (nål-och sprututbyte). I inställningen av I / R, ökningen av nya proteinsyntesen inträffar i en tidsram som är oförenligt med transkription av nya mRNA2; discordance mellan mRNA-uttrycksnivåerna och protein överflöd har dessutom varit rapporterade3. Av dessa skäl valde vi att analysera förändringar i det dynamiska proteomet som återspeglas av protein översättning. Detta gör vi kvantifiera mRNA i polysome fraktioner och analysera protein sammansättningen i polysome fraktioner. Slutligen, eftersom mikroRNA (miRs) reglera tillgängligheten av mRNA för översättning och kan störa effektiviteten av protein översättning4,5, vi har granskat fördelningen av miRs i polysome fraktioner, med fokus på den svar till jag / R.
Vi valde att använda isolerade musmodell av perfusion och skördade vävnad under basala förhållanden av fortlöpande perfusion, efter 30 min globala utan flöde ischemi, och efter 30 min av ischemi följt av 30 min reperfusion. Vi sedan solubilized hjärtat vävnaden och separerade polysomes över en sackaros lutning, följt av proteomiska analys och selektiv upptäckt av mRNA och MicroRNA av PCR och microarray, respektive. Denna kombination av metoder representerar en kraftfull metod att förstå det dynamiska proteomet, som möjliggör samtidig identifiering av mRNA, miRNA, och nål-och sprututbyte, samt omfördelning av reglerande proteiner, miRNA och mRNA mellan nontranslating fraktioner, låg-effektivitet polysomes och högeffektiv polysomes (se figur 1). Insikter i dynamiska regleringen av denna process kommer att förlängas med ytterligare analys av fosforylering av reglerande faktorer t.ex eIF2α eller mTOR. Dessa individuella stegen nu beskrivs i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier var utförs i enlighet med institutionella riktlinjer och godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén av Cedars-Sinai Medical Center.
1. av Perfusion av mus hjärta
-
Av perfusion av mus hjärta med ischemi och reperfusion
- Administrera intraperitoneal pentobarbital natrium 70 mg/kg till vuxen mus (8 veckor gamla, hane, C57BL6/j). Bekräfta djup anestesi genom avsaknaden av uttag till tå nypa.
- Anticoagulate med intraperitoneal heparin 500 E/kg.
- Öppna kistan via sternala snitt. Öppna mellangärdet och skär längs kustnära gränsen till främre axillär axeln. Sedan skär den främre axillär axeln upp till forelimb helt öppna bröstkorgen. Efter, visualisera hjärtat, klämma aorta ascendens med pincett och snabbt punktskatt hjärtat. Döden är på grund av exsanguination. Placera mitt i kalla Krebs (NaCl 6,9 g/L, KCl 0,35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0.16 g/L, MgSO4 0.141 HB, glukos 2 g/L och CaCl2 0,373 g/L).
- Cannulate aorta med en trubbig spets nål och BEGJUTA hjärtat retrogradely med Krebs lösning i konstant tryck läge.
- Efter en stabilisering av 15 min, omfattas av hjärtat en global utan flöde ischemi i 30 min följt av reperfusion i 30 min.
- Skörda hjärtan efter 15 min baslinjen perfusion, efter 30 min ischemi eller efter 30 min reperfusion. Trimma bort förmaken och snapin-frysa vävnaden i flytande kväve.
- Förvaras vid-80 ° C fram till användning
2. vävnad homogenisering, lösbarhet och sackaros täthet lutning sedimentering
-
Gradient förberedelse
- Förbered 2 lösningar (15% och 50%) 100 mL sackaros, blanda 4 mL NaCl 2,5 M;
0,8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL 1 M Tris-HCl, pH 7.5; 15 g eller 50 g sackaros (15% och 50%, respektive); ultrarent vatten att nå 100 mL; och xylen cyanol (0,02 mg/mL) att färga den 15% lösningen - Filtrera varje lösning (0,22 µm filter)
- Den dag övertoningen ska användas, förbereda 40 mL varje sackaroslösning och lägga till Kungliga Automobilklubben i varje lösning att uppnå slutlig koncentration på 100 µg/mL
- Använda en gradient maker för att förbereda en blandning mellan 15 och 50% sackaros lösningarna
- Fyll i vänstra facket med 5 mL 15% sackaros övertoningens
- Fyll i rätt fack med 50% sackaros övertoningen
- Öppna kranen och slå på pumpen att röra de två små fack med magnetomrörare
- Använd ett rör kopplat till andra kranen att tillåta den blandade sackaroslösning att flöda i en ultra-centrifugering rör med tunna väggar. Slutlig volym kommer att vara ca 10 mL.
- Hålla lutningarna vid 4 ° C (över natten om det behövs, men inte längre)
- Förbered 2 lösningar (15% och 50%) 100 mL sackaros, blanda 4 mL NaCl 2,5 M;
-
Homogenisering av hjärtat vävnad
- Homogenisera färsk eller fryst hjärta med en polytron i filtrerade lyseringsbuffert (modifierad för sackaros gradient fraktionering) innehållande 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0,4% NP-40. Inkludera Kungliga Automobilklubben 100 µg/mL för att upprätthålla polysome struktur, 0,1 U RNase inhibitor och cocktail proteashämmare (1 tablett för 50 mL).
- Inkubera den lysate på is 15 min.
- Centrifugera vid 18.000 x g i 15 minuter vid 4 ° C att avlägsna olösligt material och samla supernatanten.
- Reservera 50 µL för protein bestämning, RNA isolering och RNA integritet analys (se figur 2).
- Lagret supernatanten (500 – 100 µL) ovanpå Övertoningarna och balansera rören med lyseringsbuffert.
-
Sedimentering och samling av fraktioner
- Utföra ultracentrifugering under 120 minuter vid 37 000 rpm vid 4 ° C i en svängande hink rotor. Enligt tillverkaren motsvarar detta 228.000 x g vid maximal radie.
- Samla varje övertoning som 17 fraktioner (cirka 600 µL varje fraktion) i mikrocentrifugrör med kontinuerlig övervakning av absorbansen vid 254 nm (OD254).
- Programmera bråkdel samlaren enligt följande:
- Kassera de första 3 min samling (motsvarande vätskan i rören innan övertoningen)
- Från 4 till 19 min, samla fraktionerna vid en hastighet på 1 mL/min hos 17 fraktioner.
- Placera bråk på isen så snart varje samlas. Frysa prover vid-80 ° C, om de inte bearbetas omedelbart. En typisk UV Densitometrisk spårning av toningen visas som det samlas in i figur 1.
3. isolering och analys av mRNA från Polysome och Nontranslating fraktioner
-
Utvinning av mRNA
- Tina fraktionerna på is, om de var flash-frysta efter samlingen
- Överföra 200 µL av varje del till en frisk slang
Obs: I detta steg, två eller flera på varandra följande fraktioner kan poolas tillsammans. Det bör göras noggrant efter att ha analyserat OD254 grafen så att polysome och icke-polysome fraktioner inte blandas. - Lägg till 10 ng av luciferas RNA som intern kontroll till varje prov för normalisering ändamål.
Obs: Luciferas primers bör användas som intern kontroll för att normalisera resultaten. - Tillsätt 700 µL av RNA extraktion reagens (monofasiska lösning av fenol och guanidin isotiocyanat; se Tabell för material) till varje rör. Blanda väl och inkubera rören för 5 min på RT (rumstemperatur).
- Lägg till 140 µL kloroform och vortex för 15 s. Inkubera i 2-3 min på RT.
- Centrifugera proverna för 15 min vid 12 000 x g vid 4 ° C.
- Noggrant överföra övre vattenfasen till en ny tub.
- Eftersom RNA innehållet i fraktioner inte är hög, lägga till 10 µg av glykogen som bärare i varje rör.
- Tillsätt 350 μl isopropanol i varje rör. Blanda väl och inkubera vid-20 ° C för 1 h att öka avkastningen.
- Centrifugera i 15 min på 12 000 x g vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och lägga 700 µL etanol 75% för att tvätta RNA pelleten.
- Centrifugera under 5 minuter vid 7 500 x g vid 4 ° C.
- Ta bort etanol och låt pelleten lufttorka för 10 – 15 min.
Obs: Uttorkning RNA pelleten förhindrar dess komplett lösbarhet i vatten. - Återsuspendera pelleten RNA i 50 μL av RNase-fri ultrarena H2O.
- Inkubera proverna för 10 min vid 55 ° C.
- Använda 2 μL av varje prov för att mäta kvalitet och kvantitet av den extraherade RNA och lagra resten vid-80 ° C.
-
Omvänd Transkription och qPCR
- Använd 4 μL av omvänd Transkription cDNA syntes kit (se Tabell för material) för en 20 μL reaktion. Förbereda supermix enligt antalet prover. Överföra volymen som behövs till varje rör och tillsätt 5 μl av ingående RNA i varje rör. Denna volym kan korrigeras för att vara relevanta för spänna av arbetsförhållandena Taq polymeras.
- Inkubera rören i en termocykel med följande program som rekommenderas av tillverkaren: 5 min vid 25 ° C, 20 min omvänd Transkription i 20 min på 46 ° C och omvänt transkriptas inaktivering för 1 min på 95 ° C.
- Kör qPCR med optimerade program för varje par av primers.
Obs: För att upptäcka förekomsten av vissa mRNA i fraktioner, lika volym från respektive fraktion (av isolerade RNA) bör användas för omvänd Transkription.
-
Analys av resultaten
- Använda Ct värdet av den berörda genen och luciferas för att beräkna de delta-Ct-värdena
- Express varje fraktion delta Ct-värde som procentuella andelen totala mRNA värdet i alla fraktioner att visualisera fördelningen av mRNA över de olika fraktionerna (tabell 1)
4. isolering och analys av MicroRNA från Polysome fraktioner och Nontranslating fraktioner
-
Utvinning av mRNA och miRNA
Obs: Detta protokoll följer tillverkarens instruktioner, med några förändringar.- Tina glykogen och spike-i kontrollen. Hålla på is.
- Lägga till 700 µL av miRNA utvinning reagens 200 µL av samlingsprov.
- Tillsätt 1 µg/µL av glykogen och homogenisera den med pipetten. Inkubera det 5 min i rumstemperatur.
- Tillsätt 3,5 µL av 1.6 x 108 spike-i kontroll och blanda.
- Tillsätt 200 µL av kloroform och vortex det i minst 15 sekunder.
- Inkubera under 3 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera vid 12 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
- Överför med pipett supernatanten till en ny 1,5 mL tub. Kassera de mellersta och nedre faserna.
- Lägga till 1,5 x volym 100% etanol i supernatanten och blanda.
- Över 700 µL av denna blandning till kolumnen miRNA utvinning och centrifugera det i full fart för 15 s vid RT och kassera genomströmmande; Upprepa detta steg med eventuella återstående prov.
- Tillsätt 700 µL buffert 1 i kolumnen och centrifugera det i full fart för 15 s vid RT; Kassera genomflöde.
- Tillsätt 500 µL buffert 2 i kolumnen och centrifugera det i full fart för 15 s vid RT; Kassera genomflöde.
- Tillsätt 500 µL av 80% etanol till kolumnen och centrifugera det i full fart i 2 min på RT; Kassera genomflöde.
- Överföra kolumnen för att en ny 2 mL icke-utjämnade tube, öppna locket och centrifugera det RT i 5 min på full fart; Kassera genomflöde.
- Lägg till 16 µL RNAse-gratis vatten i kolumn och centrifugera det vid full hastighet för 1 min på RT. hålla eluatet på is eller förvaras vid-80 ° C för framtida analys.
Obs: Två mikroliter av varje prov kan användas för OD analys.
-
Omvänd Transkription
- Förbered på is. För varje 20 µL RT-PCR-reaktion, lägga till 4 µL av miRNA RT bufferten, 2 µL av nukleinsyror, 9 µL av total-RNA, 2 µL av enzym och 3 µL RNAse-fritt vatten; Blanda och snurra den ner kort.
- Ställ den termocykel enligt följande:
37 ° C i 60 min;
95 ° C i 5 min;
4 ° C håller. - Ta bort rören från termocykel och tillsätt 200 µL RNAse-gratis vatten. Förvaras vid-20 ° C eller Fortsätt till realtids PCR.
-
Realtids-PCR
Obs: Detta protokoll följer 96 väl platta format. Förbereda reaktionsblandning på is.- Förbered PCR-reaktionsblandning och tillsätt cDNA (från MicroRNA ovan) enligt intervallet accepteras av protokollet. Flera reaktioner kan tillagas i batch.
- Lägga till en summa av 25 µL av PCR-mix + cDNA i varje brunn.
- Försegla plattan med hjälp av en optisk plattan sigill.
- Centrifugera plattan för 1 min vid 1 000 x g vid rumstemperatur.
- Programmera den realtid apparat enligt följande:
Första aktiveringen steg vid 95 ° C i 15 min;
3-steg cykling: denaturering vid 94 ° C i 15 s; glödgning vid 55 ° C i 30 s; förlängning vid 70 ° C i 30 s (utföra datainsamling fluorescens); lägga till 40 cykler;
Smältande-kurvan enligt apparat standard.
-
Jämförande analys
- Exempel på normalisering (se tabell 2):
- Hitta SCM minimivärdet.
- Normalisera alla SCM värden till detta minimum.
- Subtrahera detta värde från Ct värdena för MicroRNA av intresse (MOI) och Referensgenen (REF).
- Analysera data med hjälp av 2-ΔCt formel.
- Exempel på normalisering (se tabell 2):
5. proteomiska analys
-
Utvinning av proteiner från polysome fraktioner
- Kombinera insamlade sackaros fraktioner i tre slutliga fraktioner. Markera fraktionerna som tunga (högeffektiv polysomes i poolade fraktionerna 4, 5, 6 och 7 med den högsta koncentrationen av sackaros; gradient rörets botten), ljus (låg effektivitet polysomes i poolade fraktionen 8, 9, 10 och 11; mitten av den toning tube) och icke-översätta (poolade fraktioner 12, 13, 14 och 15 med den lägsta koncentrationen av sackaros; toppen av lutning röret). Utföra protein assay på poolade fraktioner.
- Förbereda 100% lager triklorättiksyra (TCA) och lagra den på 4 ° C i mörker. Blanda 0,5 mL av provet med 60 µL av 100% TCA och inkubera vid-20 ° C över natten i mörkret.
Obs: Använd 1,5 mL låg protein lagring rör (se Tabell för material). - Efter natten inkubation, Tina provet på is och centrifugera vid 15000 x g, 4 ° C i 30 min. Kassera supernatanten.
Obs: 100 µg totalt protein i prov ger synliga protein pellets längst ned röret. - Pre chill aceton i-20 ° C frys. Lägg till 0,5 mL kall aceton i protein pellets och centrifugera vid 15000 x g, 4 ° C i 15 min. Kassera supernatanten. Upprepa detta steg två gånger.
- Luften torr pelleten. Återsuspendera pelleten i 360 µL av 50 mM Tris-HCl buffert (pH 8).
Obs: Om det behövs, Använd en puls någon sonikator för att återsuspendera pelleten. - Tillsätt 40 µL 0,1 M Ditiotreitol (slutlig koncentration 10 mM) och inkubera vid 55 ° C på shaker för 45 min. Tillsätt 50 µL av 0,15 M iodoacetamide (slutlig koncentration 17 mM) och odla i rumstemperatur på shaker i 30 min i mörker.
- Förbereda trypsin lösning: Återsuspendera 20 µg av trypsin i 100 µL av 50 mM hjorthornssalt. Lägga till motsvarande volym av trypsin lösning på prov i 1:50 (w/w) förhållandet mellan trypsin: protein, säkerställa att pH är 8 och inkubera i shaker vid 37 ° C under natten.
Lägg Till 1 M hjorthornssalt för att få pH till 8. - Efter trypsin matsmältningen, cool provet, Centrifugera kort i bänk centrifug, lägga till 10% myrsyra pH 2 – 3 släcka aktiviteten trypsin, och fortsätta med prov avsaltning.
Obs: Använd µ-eluering plattan för provet avsaltning. - Villkoret sorbenten i brunnarna 96 väl tallrik med 200 µL metanol med dammsugare tre gånger följt av luftkonditionering av 200 µL 0,1% myrsyra tre gånger. Ladda urval och utföra en prov tvätt med 200 µL 0,1% myrsyra tre gånger. Eluera provet med 100 µL av 50% acetonitrile/0.1% myrsyra två gånger till låg protein lagring 0,5 mL rör.
Obs: Eluera provet långsamt först med hjälp av gravitation följt av lågt vakuum på. - Avdunsta prov eluatet till torrhet med koncentrator och antingen direkt utföra masspektrometri analys eller store vid-80 ° C fram till användning.
-
Masspektrometri analys
- Bered varje pellet (bestående av de tryptic peptiderna) i 50 – 100 µL och injicera 1 µL i masspektrometer.
Obs: Optimera beredning och injektion volymer för att få maximal intensitet LC/MS/MS signal. I vårt fall, den maximala signalen (totala ion aktuell; TIC) i hjärtat av genomsökningen var i rad 1E8 till 2E9. - Använda en fälla kolumn C18 (300 µm i.d. x 5 mm, 5 µm, 100Å) följt av peptid separation hjälp C18 kolumn (75 µm i.d. x 250 mm, 2 µm, 100Å) med en flöde klassar inställning på 300 nL/min. Set nano-source kapillär temperaturen till 275 ° C och spray spänningen till 2 kV.
- Använda en linjär övertoning 5 – 35% B för 90 min, 35 – 95% B för 3 min, holding på 95% B för 7 min och Jämviktstiden på 5% B för 25 min (A: 0,1% myrsyra/vatten och B: 0,1% myrsyra i acetonitril). Förvärva MS2 spectra för 15 högsta intensitet jonerna från varje MS1 scan med CID-läge. Använd 3 masspektrometri replikat för varje prov som analyseras.
Obs: Optimera och använda experimentella förhållanden och parametrar som är lämpliga för dina prover på viss masspektrometri instrumentet. Villkor/parametrar anges i avsnitt 5.2. användes och optimerad i vårt laboratorium.
- Bered varje pellet (bestående av de tryptic peptiderna) i 50 – 100 µL och injicera 1 µL i masspektrometer.
-
Protein identifiering/kvantitering
- Efter masspektrometri analys, konvertera raw spectra filer till kompatibel mzXML filer med MSConvert programvara (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
- Lämna de konverterade filerna i SEQUEST sökmotor med sökvillkor, t.ex., UniProtKB/Swiss-Prot mus databas (mest uppdaterade kanoniska recenserade); semi enzym digest använder trypsin (efter KR /-); med upp till 2 missade Klyvningar; föregångaren massa utbud: 400 till 4.500 amu; statiska modifiering: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu; peptid massan tolerans: 50 ppm. fragmentera massa typ: monoisotopic.
Obs: Andra protein databas sökning motorer och data rörledningar kan användas. Om du använder databasen för t.ex. råtta, som är mindre fullständig än databaser för mus och människa, du kan behöva söka mot mus (eller mänskliga) databaser att öka proteomet täckning. I det här fallet kommer att redundans i protein namn behöva tas bort. - Utföra en efter Sök analys. Ställ in filtren för att visa data. Till exempel ange en minsta protein sannolikhet (protein tröskel) som 95% eller 99%, dvs bara de proteiner som en statistisk analys innebär 95% eller 99% sannolikhet att i provet kommer att visas. Ange filtret för peptid tröskelvärde (t.ex., 95%), dvs en lägsta sannolikhet som ska användas för att fastställa huruvida ett spektrum identifierar en peptid. Välj det minsta antalet peptider som kommer att avgöra om ett protein är närvarande (2 peptider som ett minimum för protein identifiering rekommenderas).
- Utvärdera identifierade proteiner för kvalitet/kvantitet. Säkerställa att proteotypic peptider används för kvantifiering. Om isoform identifieras ansvara baser på observation av en tryptic peptid som består av en aminosyrasekvens som är unik för den specifika isoformen. Några ”liknar” eller hypotetiska proteiner bör genomgå jämförelse att se om den observerade peptider motsvarar en känd protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
mRNA analys
mRNA resultat kan uttryckas som en fördelning av en viss mRNA i respektive fraktion (figur 3A); för kvantifiering, kombinera polyribosomal översätta fraktioner och jämför med den icke-översätta fraktionen (figur 3B), presenterar ett förhållande av mRNA överflöd att översätta till nontranslating fraktioner. Ytterligare information kan fås genom att undersöka de högeffektiva polysome fraktionerna separat från låg-effektivitet polysome fraktioner (och separat från nontranslating fraktioner). Detta är särskilt viktigt när man analyserar MicroRNA, som är berikad på låg-effektivitet fraktioner (där de störa protein översättning av deras mål mRNA).
Representativa resultat för en viss mRNA som ändringar dess fördelning över översättnings- och nontranslating fraktioner efter musen hjärtan utsattes för ischemi och ischemi/reperfusion jämfört med placebo visas i figur 4.
miRNA-array-analys
Representativa resultat från en miRNA-array-analys visas i figur 5. Här, en delmängd av MicroRNA (skräddarsydda array plattan) analyserades i de poolade tunga fraktioner som visar att 22 MicroRNA var förknippade med polysomes under ischemi, 9 MicroRNA under ischemi och reperfusion, med 7 som var gemensamma för båda villkoren. Detta visar att föreningen av MicroRNA är dynamiska svar på stressiga ischemi och reperfusion.
Proteomiska analys
Analys av tunga, ljus och icke-översätta fraktioner av sham (kontroll) provet:
881 av totala proteiner identifierades genom masspektrometri; 3, 46 och 208 proteiner av totalt var unika för tunga, ljus och icke-trans fraktioner, respektive (figur 6A). Flesta (88%) av mitokondriell ribosomala proteiner (28S och 39S) identifierades i lätta fraktionen (36 av 41) och en majoritet (88%) av cytosoliska ribosomala proteiner (40S och 60S) identifierades vanligen i både tunga och lätta fraktioner (53 av 60) förmåga att identifierade tyngre cytosoliska vs bekräftar effektiv separation och proteomiska och ljusare mitokondriell ribosomala proteiner. En delmängd av de identifierade mitokondrie och cytosoliska ribosomala proteiner visas i figur 6B.
Figur 1: typiska UV absorbansen profil av polysome fraktioner på sackaros övertoning. De första tre fraktionerna representerar ogiltig volym i slangen. Hög effektivitet (hög molekylvikt, HMW) fraktioner samlas i fraktioner 4-7, låga effektivitet (låg molekylvikt, LMW) fraktioner i 8-11, och icke-översättning (och återstående cytosoliska material) samlas i fraktioner 12-15 ( nontranslating, NTR). Den röda linjen ledningsförmåga och blå tracen anger UV absorbansen vid 254 nm. Till höger är en tecknad av ett provrör med sackaros gradient, visar fördelningen av polysomes efter sedimentering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: RNA integritet kontrollanalys på Bioanalyzer. RNA integritet antal (RIN) total-RNA isoleras från hjärtat hela lysate. RIN beräknas enligt 18S och 28S toppar. RIN intervall: 1-10, och RIN = 10 representerar en mycket bra integritet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa profil av mRNA fördelning i sackaros övertoning. Hjärtan utsattes för basal av perfusion eller ischemi och reperfusion (jag / R). (A) hjärtat lysates löstes på sackaros lutning och mRNA innehåll för GAPDH (vänster) och COX4 (till höger) har fastställts i respektive fraktion. Handlingen visar relativa mRNA överflöd i varje bråk (bråktal nummer på x-axeln) för basal perfusion (sham, röda linjen och diamanter) och ischemi/reperfusion (jag / R, blå linjen och torg). Överlagrade på tomten är UV absorbansen som anger total mRNA innehåll (ljus grå kurva) och konduktans (rak grå sluttande linje). Rutorna ange hur fraktioner var poolade. (B) stapeldiagram tomt visar förhållandet mellan mRNA överflöd att översätta (polysomes) vs nontranslating (NT) fraktioner för GAPDH (vänster) och COX4 (höger) mRNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa mRNA resultat. Kvantitering av en mRNA i de poolade fraktionerna (HMW, LMW, NTR) visar ändringar enligt den experimentella gruppen. Polysome fraktionering av mus hjärtan utfördes efter av perfusion. Resultaten ritas som % av totala mRNA (övre panel) samt förhållandet mellan polysomes (HMW + LMW) nontranslating fraktion (NTR). Felstaplar representera resultat från 5 hjärtan per grupp (sham, ischemi eller jag / R). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representant miRNA resultat. Venndiagram ett utbildningsavsnitt fokuserade miRNA analyser visar och nedreglerade MicroRNA i tunga bråkdel pooler av möss prover efter hjärtat ischemi eller ischemi och reperfusion. Cut-off värde: 1,5 gånger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: proteiner identifierats av masspektrometri. (A) Venndiagram av proteiner vanliga och unika för tunga, ljus och icke-trans fraktioner. (B) delmängd av mitokondrie och cytosoliska ribosomala proteiner identifierats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Schematisk arbetsflöden för protein utvinning metoder testade. De protein utvinning metoderna testades med hjälp av sham (kontroll) prov och tunga (högeffektiv polysomes) bråk med högsta sackaroshalten. Nummer i rött indikerar numrera av proteiner som identifierades av masspektrometri; där två tal visas, är de från två separata experiment. Detaljerad beskrivning ges i texten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| FRAKTIONER | GEN Ct | LUCIFERAS Ct | ΔCt | 2ΔCt | SUMMAN AV ALLA FRAKTIONER | % AV RESPEKTIVE FRAKTION | Polysome/NTR baserat |
| Hög effektivitet (HMW) | 28,75 | 22.79 | 5,96 | 0,016 | 0.046 | 34.64 | 2,77 |
| Låg effektivitet (LMW) | 28.43 | 22.63 | 5,80 | 0,018 | 38.81 | ||
| Icke att översätta (NTR) | 29.12 | 22.77 | 6,35 | 0,012 | 26.55 | ||
| Polysome/NTR baserat = (HMW + LMW) / NTR |
Tabell 1: Prova analys av mRNA. Analysmetod en mRNA visas för de olika poolade fraktionerna (HMW, LMW, NTR) efter kvantitativ PCR. ΔCt = gen Ct - luciferas Ct, och 2ΔCt är 2ΔCt.
| Hitta minimivärdet SCM: 22.77 | |||
| Prov 1 | Prov 2 | Prov 3 | |
| CT MOI | 22,92 | 22.36 | 22,58 |
| CT SCM | 22,81 | 22.77 | 22,9 |
| CT REF | 23.27 | 23,55 | 23.19 |
| Normalisera alla SCM värden till detta minimum | |||
| Prov 1 | Prov 2 | Prov 3 | |
| CT SCM | 0,05 | 0 | 0,13 |
| Subtrahera dessa värden från Ct värdena MOI och REF | |||
| Prov 1 | Prov 2 | Prov 3 | |
| CT MOI | 22.87 | 22.36 | 22.45 |
| CT REF | 23,22 | 23,55 | 23.06 |
Tabell 2: prova realtids PCR-beräkning för miRNA jämförelse uttryck i polysome och nontranslating fraktioner. MicroRNA av intresse (MOI) och Referensgenen (REF) analyserades i de poolade tunga fraktionerna av möss efter ischemi eller ischemi/reperfusion. Ct värden var först normaliserade till kontrollen spike-i (SCM) Ct-värde, sedan formeln 2-ΔCt användes för att jämföra miRNA uttryck.
| Metoden | Provets volym [mL] | # av proteiner identifierats | Kommentarer |
| FASP | 1 | 227 | huvuddelen av sackaros som fälls ut på filter |
| aceton utfällning | 0,6 | 372 | trögflytande slam sackaros röret längst ner; 4:1 (reagens: prov) volymer; inga synliga protein pellets |
| kloroform/metanol nederbörd | 0,32 | 389 | trögflytande slam sackaros röret längst ner; 8:1 (reagens: prov) volymer; inga synliga protein pellets |
| TCA nederbörd (vid 4 ° C) | 0,5 | 405, 415 | ingen sackaros nederbörd; 0.12:1 (reagens: prov) volymer; synliga pellet längst tube |
| ny nederbörd | 85, 60 | ytterligare TCA utfällning av supernatanten efter första pellet samlades | |
| TCA nederbörd (vid-20 ° C) | 0,5 | 440, 430 | ingen sackaros nederbörd; 0.12:1 (reagens: prov) volymer; synliga pellet längst tube |
| ny nederbörd | 81, 55 | ytterligare TCA utfällning av supernatanten efter första pellet samlades |
Tabell 3: Jämförelse av protein extraktionsmetoder. FASP, aceton utfällning, kloroform/metanol nederbörd och TCA nederbörd vid 4 ° C och -20 ° C utvärderades. Målet var att maximera antalet proteiner identifierats. TCA nederbörd utvärderades på ett andra parti på material att bekräfta reproducerbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polysome profil analys möjliggör studiet av protein översättning genom att analysera den translationella delstaten en specifik mRNA eller hela transkriptom6,7. Det är också till stor hjälp när lokal översättning behöver studeras såsom synaptosomes8. Denna metod innebär traditionellt, separation av mono - och polyribosomes och den associerade mRNA på sackaros toning som kunde kopplas till genomisk eller proteomiska tekniker för att uppnå de avsedda resultat6,9. Till exempel, har en studie som utförs av vår grupp avslöjat en post-transcriptional reglerande mekanism som avrättades i hjärtat av patienter som genomgår CPB, som härmar ischemi/reperfusionsskada. Dra nytta av polysome profil analys, vi har visat en ökning i översättning av kärn-kodade mitokondrie proteiner i hjärtat efter CPB procedur2.
Den dynamiska proteome profilering strategi för polyribosomal som presenteras här kan avslöja förändringar i befolkningen av mRNA som associeras med polyribosomes och de proteiner som översätts aktivt. Som översättning av mRNA styrs delvis av MicroRNA, kan analys av MicroRNA i dessa fraktioner avslöja ytterligare insikter. I själva verket har flera studier denna metod och visade sig det vara en lämplig och tillförlitlig metod att undersöka miRNA funktionsläget av förordning10,11.
Många studier har gjorts i det senaste decenniet djupdykning i rollen som MicroRNA, med tanke på deras betydelse i olika biologiska funktioner12,13. Eftersom MicroRNA agera genom bas-ihopkoppling med motsvarighet mRNA för att markera dem för nedbrytning, har polysome profil analys utförts och visat att MicroRNA finns i själva verket i polysome fraktioner, inriktning att översätta mRNA14, 15 , 16. miR-21 är ett bra exempel där det är associerade med en låg repression och svag polysomes bindande i normala celler, medan i cancerceller, associering med polysomes ökar och den hämmande effekten är mycket starkare17.
I denna studie, Real-time PCR-analys utfördes med hjälp av Ct-värden för MicroRNA sevärdheter (MOI), de Ct-värdena av spike styra miRNA (SCM) för att minska tekniska variationer och Ct värdet av en referens gen eller miRNA (REF) som är stabilt bland proverna. Det första steget var att normalisera MOI och REF till Ct värden i SCM Ct värden. Sedan fanns det ett andra steg normalisering av MOI till REF och det resulterande värdet användes för att beräkna formeln 2-ΔCt . Dessa värden eller -faldig förändring kan användas för att påvisa skillnader mellan grupperna.
Eftersom utvinning av proteiner är svårt från polysome fraktioner, har de flesta av de studier som utförts hittills använt fraktioner direkt för western blot analys. De helt enkelt sediment proteinhalten i varje fraktion och blanda det med SDS-lastning buffert för SDS-PAGE analys8,18. Här har vi utvecklat en metod som tillåter oss att inte bara utdrag mRNA och MicroRNA efter fraktionering, men också att erhålla peptider och proteiner med hög kvalitet att fortsätta med masspektrometri analys.
Detta synsätt skulle kunna utvidgas ytterligare genom att aktivt mäta nyligen syntetiseras proteinerna med metabola märkning såsom biorthogonal aminosyra homolog, såsom azidohomoalanine (AHA) för metionin19,20. AHA möjliggör inkorporering följt av klick kemi införlivandet av en biotin tagg följt av streptividin rening av alla proteiner som införlivade AHA. Detta tillåter slutgiltiga identifiering av nyligen syntetiserade proteiner — den andra delen av det dynamiska proteomet. Påvisande av MicroRNA att omfördela bland översättnings- och nontranslating fraktioner i respons på ett stimulus (här med jag / R) tillåter förhör av dynamiska regleringen av protein översättning. De faktorer som rekryterar MicroRNA till närheten av Ribosomen-bundna mRNA återstår dock identifieras och systematiskt undersökt.
I vår studie, förutom TCA nederbörd, vi testade tre andra metoder för protein utvinning från polysome fraktioner: i) FASP (filter-aided provberedning)21, ii) aceton utfällning och iii) kloroform/metanol nederbörd. Lämpligheten av metoder utvärderades baserat på både förmågan att behandla fraktioner med hög koncentration av sackaros (upp till 50%) och antal proteiner identifierats av masspektrometri (figur 7 och tabell 3).
För FASP metod följde vi protokollet av den provberedning som ges av ett FASP Protein matsmältningen Kit som sysselsatt en ultrafiltrering enhet med en relativ molekylär massa cut-off av 30 kDa. Detta filterenheten serveras som ett verktyg för tvättmedel borttagning, buffert exchange, protein matsmältningen och peptid eluering med förmågan att behålla hög molekylvikt ämnen (proteiner och DNA) som skulle annars stör efterföljande peptid separation 21. i korthet provet blandades med urea-innehållande buffert och lastas på enheten spin filter med spinning steg som iodoacetamide lösning, trypsin lösning och natriumkloridlösning (eluering) därefter tillkom. Slutliga filtratet som innehöll smält peptider var försurade av TFA, avsaltat och lagras för masspektrometri analys. Med den här metoden dock huvuddelen av utfällda sackaros stadigt samlats på toppen av filtret, återgäldande centrifugeringen och tvätt steg svårt.
För aceton utfällning och kloroform/metanol nederbörd för flera volymer av lösningsmedel att fälla ut proteiner från en enda volym av provet. Den begränsade storleken på provvolymen tillämpas när nederbörden utfördes i 1,5 mL rör (protein low-lagring rör). Samt, trögflytande slam från sackaros ackumulerade längst ned på rören efter nederbörd för båda metoderna och det fanns inga synliga pellets längst ned röret och vid flytande gränssnitt efter aceton utfällning och kloroform/metanol nederbörd, respektive.
Tabell 3 och figur 7 visar jämförelse av fyra protein utvinning metoder vi använde för att optimera våra experimentella arbetsflöde. Röda siffror på varje metod (figur 7) representerar antalet proteiner som identifierades av masspektrometri (se avsnitt 5.2 och 5.3). Men provvolymer används för varje metod var olika, resulterade kloroform/metanol och TCA nederbörd i högsta antal proteiner identifierats. Vi valde dock på grund av nackdelar som nämns ovan (prov volymbegränsning och sackaros nederbörd), TCA nederbörd för efterföljande experiment.
För att hitta de optimala förhållandena för provet bearbetning, genomfördes TCA nederbörd vid olika temperaturer och TCA koncentrationer22,23,24. Således vi utfört en nederbörd med 10,7% TCA vid 4 ° C och -20 ° C och vidare utfällda supernatanterna med ytterligare 60 µL av TCA (slutliga 19,4% TCA) efter pellets samlades. Detta resulterade i fyra pellets som analyserades avgränsade med masspektrometri. Dessutom upprepade vi hela protokollet två gånger för att säkerställa att erhållna resultaten är reproducerbara. Arbetsflödet och antalet proteiner identifierats i pellets på både 4 ° C och -20 ° C förhållanden med två upprepade experiment visas i figur 7 (nummer i rött). Även om analysen av pellets härrör från gav supernatanterna ytterligare ett antal proteiner (85 och 60 på 4 ° C, 81 och 55 vid-20 ° C); en majoritet av proteiner identifierades redan i första pellets och därför valde vi för att använda 10,7% TCA för alla efterföljande experiment. Även om kloroform/metanol nederbörd resulterade i ett liknande antal proteiner identifierats jämfört med TCA nederbörd, vi föredrog TCA nederbörd på grund av flera fördelar: jag) liten volym spädningsvätska som behövs för att fälla ut proteiner (60 µL av TCA vs 1,28 mL kloroform/metanol/vatten) möjliggör användning av större provmängder om behövs medan bekvämt med 1,5 mL tuber för nederbörd, ii) synbarheten av pelleten tube nedtill, och iii) ingen ackumulering av sackaros under nederbörd steg.
Trots att erbjuda fördjupad funktionell information angående tillståndet translationell, är en stor nackdel med denna metod behovet av färska och stora utgångsmaterial. Många studier har försökt att optimera villkoren med liten volym av celler eller vävnader eller lägga till stegen för att öka effektiviteten i utdrager RNA och proteiner25. Fortfarande, vävnaderna från olika djur på samma experimentella villkor kunde dras ihop, om behöver vara.
Avslutningsvis möjliggör detta protokoll samtidig analys av mRNA, miRNA och protein från fraktioner erhålls från polysome profilering för att studera de reglerande mekanismerna som är involverade i ischemi/reperfusion. Ytterligare krävs studier dock att se om de översätta mRNA induceras efter ischemi eller reperfusion och om de kommer att vara avstängda vid avlägsnande av stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), Barbra Streisand kvinnors hjärta Center (RAG, JVE), Dorothy och E. Phillip Lyon stol i molekylär kardiologi (RAG), Erika Glazer begåvad stol i kvinnans hjärthälsa (JVE) och tjeckiska vetenskapsakademin Institutionellt stöd RVO: 68081715 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO42 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |
References
- Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
- Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
- Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
- Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
- Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
- Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
- Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
- Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
- Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
- Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
- Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
- Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
- McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
- Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
- Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
- Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
