Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

doi: 10.3791/58079 Published: August 29, 2018

Summary

ポリソーム分離灌流マウスの心臓でプロファイリングを実行するためのプロトコルをご紹介します。心の灌流、プロファイリング、ポリソーム Mrna、Mirna、・ ポリソーム プロテオーム解析に関してポリソーム分数の解析法について述べる。

Abstract

タンパク質翻訳のダイナミックな変化の研究では、特殊なメソッドを必要とします。ここで虚血と再灌流ポリソームのプロファイリングと相まって分離灌流マウスの心臓を使用する新規合成される蛋白質の変化を調べた。タンパク質翻訳のダイナミックな変化をさらに理解する私たちは (ポリゾームまたはポリソーム) ゾル性細胞質のリボソームで読み込まれたともミトコンドリア ポリソームを回復し、mRNA とタンパク質の分布を比較して Mrna を特徴と、高効率分数 (多数リボソームが mRNA に付着)、低効率 (少ないリボソームが付着) ミトコンドリア ポリソームと非翻訳分画も含まれています。Mirna が翻訳されているが, 翻訳の効率を減らす Mrna に関連付けることも、分数の miRNAs の分布を調べた。グローバル ・虚血、再灌流の 30 分後と 30 分の終わりに、基底の灌流条件下で Mrna、Mirna、および蛋白質の分布を調べた。この分析を達成するために使用されるメソッドの紹介-特に、これとしてショ糖密度勾配からの蛋白質の抽出の最適化へのアプローチはないの前に記載されている-いくつかの代表的な結果を提供して。

Introduction

中心部は、(I) 虚血と再灌流 (R) ダイナミックなファッションでの傷害に応答します。ただし、応答の中にタンパク質合成に急性の変化に少し洞察力があります。これに対処するため行ったリボゾームとポリソーム、細胞質から並進規制要因の再分配を反映したタンパク質豊富に変更を識別するために1をプロファイリング ポリソームの確立方法の利点と新しく合成されたタンパク質 (Nsp) の増加します。私の設定で/R、新しい Mrna2; の転写と一貫性がないタイム フレームでの蛋白合成の増加が発生しますまた、mRNA 発現および蛋白質量の不一致は、報告された3をされています。これらの理由から、タンパク質翻訳を反映して動的プロテオームの変化を分析することを選びました。これを行うには、我々 はポリソーム分数の mRNA を定量化し、ポリソーム分数のタンパク質組成を分析します。最後に、マイクロ Rna (miRs) Mrna の翻訳の可用性を調節するタンパク質翻訳45の効率を妨げることができますので、我々 の分布を調べた miRs ポリソーム画に焦点を当て、私への応答/r.

マウス単離蛍光灌流モデルと持続灌流、30 分虚血流入なしと虚血後再灌流の 30 分, 30 分後の基底条件下で収穫された組織を使用決定しました。心臓組織を可溶化し、ショ糖密度勾配をポリソームを区切ってそれぞれプロテオーム解析と Mrna と PCR、マイクロ アレイ、miRNAs の選択的検出が続きます。このメソッドの組み合わせを表す NSPs、マイクロ Rna、mRNA の同時検出だけでなく、nontranslating の分数の間調節タンパク質、マイクロ Rna、mRNA の再配布を有効にするプロテオームを理解するための強力なアプローチ低効率ポリソームと高効率ポリソーム (図 1参照)。この過程の動的調節への洞察力は、神経: Eif2 など mTOR 因子のリン酸化の詳細な分析によって拡張されます。これらの個々 のステップは、今詳細に説明します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

すべての動物の研究は制度のガイドラインに従って実施されますされ、機関動物のケアと使用ヒマラヤスギ シナイ医療センター委員会によって承認されました。

1. 蛍光マウス心臓血流

  1. マウスの心臓虚血と再灌流の蛍光灌流
    1. 管理腹腔内ペントバルビ タール ナトリウム 70 mg/kg (8 週齢、オス、C57BL6/j) の大人のマウスに。ピンチをつま先に撤退の欠如によって深い麻酔を確認します。
    2. 腹腔内ヘパリン 500 とており U/kg。
    3. 胸骨切開を介して胸を開きます。横隔膜を開き、前方腋窩軸に肋の国境に沿ってカットします。その後、胸郭を開く完全に前肢まで前方腋窩軸をカットします。後、心を可視化、上行大動脈を鉗子でクランプし、急速に中心部を切除します。死は、外れると出血によるものです。冷たいクレブスに中心を置く (塩化ナトリウム 6.9 g/L、KCl 0.35 g/L、NaHCO3 2.1 g/L、KH2PO4 0.16 g/L、MgSO4 0.141 g/L、ブドウ糖 2 g/L、CaCl2 0.373 g/L)。
    4. 鈍い先端針で大動脈を cannulate し、一定の圧力モードでクレブス ソリューションと逆行性心臓を灌流します。
    5. 15 分間の安定期間後、30 分の 30 分間再潅流のグローバル ・虚血心を対象します。
    6. 15 分ベースライン灌流後、30 分の虚血、または 30 分再灌流後の心を収穫します。アトリア、切り落とすとスナップ凍結組織を液体窒素で。
    7. 使用するまで-80 ° C で保存します。

2. 組織の均質化、可溶化、およびショ糖密度勾配沈降

  1. グラデーションの準備
    1. 100 mL のショ糖、食塩 2.5 M の 4 mL を混合の 2 解 (15% と 50%) を準備します。
      0.8 mL MgCl2 1.25 M;1 mL トリス-HCl 1 M, pH 7.5;15 g や 50 g のショ糖 (15%、50%、それぞれ);純水 100 mL に到達するにはキシレンシアノール (0.02 mg/mL) 15% 溶液の色に
    2. 各ソリューション (0.22 μ m フィルター) をフィルター処理します。
    3. グラデーションは、使用日各ショ糖液 40 mL を準備し、シクロヘキシミドを 100 μ g/mL の最終的な集中を達成するために各ソリューションに追加
      1. 15% と 50% の糖溶液との間のミックスを準備するのにグラデーション メーカーを使用します。
      2. 15% ショ糖密度勾配の 5 mL と左室を埋める
      3. 50% ショ糖密度勾配を持つ右の区画を記入します。
      4. 水道の蛇口を開き、マグネチックスターラーで 2 つの小さな区画をかき混ぜるにポンプのスイッチ
      5. 使用管は、薄い壁で超遠心分離管に流れる混合のショ糖液を許可する 2 番目のタップにリンク。最終巻は、約 10 mL になります。
    4. 4 ° C でグラデーションを続ける (必要な場合は一晩がより長くない)
  2. 心臓組織の均質化
    1. (ショ糖勾配分別の変更) のフィルター処理された換散バッファーの polytron の新鮮なまたは冷凍の中心を均質化 100 mM KCl、20 mM Tris pH 7.5、5 mM MgCl20.4% を含む NP 40。ポリソーム構造、0.1 U RNase 阻害剤、プロテアーゼ阻害剤カクテル (50 mL の 1 錠) を維持するために 100 μ g/mL シクロヘキシミドにはが含まれます。
    2. ライセートを孵化に氷の 15 分。
    3. 不溶性物質を除去し、上澄みを集め 4 ° C で 15 分間 18,000 × gで遠心分離機します。
    4. タンパク質の定量、RNA の隔離と RNA 整合性の解析 (図 2参照) の 50 μ L をぜひご予約ください。
    5. グラデーションの上に上清 (500-100 μ L) を層し、の換散バッファーと管のバランスをとる。
  3. 堆積と分数のコレクション
    1. 37,000 回転スイング バケツ ローターで 4 ° c で 120 分間遠心を実行します。メーカーによると、これは 228,000 x gで最大半径に対応します。
    2. 17 分 (各約 600 μ L 分画) として常時監視を 254 で吸光度のマイクロ遠心チューブ用の各グラデーションを収集 nm (OD254)。
    3. 一部のコレクターのプログラムは次のよう。
      1. (グラデーションの前にチューブに含まれる液体に対応する) コレクションの最初の 3 分を破棄します。
      2. 4 ~ 19 分、17 分に 1 mL/分の速度で分数を収集します。
    4. それぞれを収集はすぐに氷で分数を配置します。彼らがすぐに処理されていない場合は、-80 ° c のサンプルを凍結します。典型的なグラデーションの UV デンシトメトリー トレースが収集される図 1に示します。

3. 分離と Mrna はポリソームと Nontranslating 分画の分析

  1. MRNA の抽出
    1. 彼らはコレクションの後フラッシュ凍結された場合、氷上では、分数を解凍します。
    2. 新鮮な管に各画分の 200 μ L を転送します。
      注: この手順では、2 つ以上の連続した画分をプールできる一緒に。それは慎重にポリソームと非ポリソームの分数がちゃ OD254グラフを分析後されるべきであります。
    3. 10 追加ルシフェラーゼ正規化の目的のために各サンプルに内部統制として RNA の ng。
      注: ルシフェラーゼ プライマーは、結果を正規化する内部統制として使用する必要があります。
    4. 各チューブに 700 μ L の RNA 抽出試薬 (フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の単相性ソリューション; 参照材料テーブル) を追加します。よく混ぜ、常温 (室温) 5 分管を孵化させなさい。
    5. 室温 2 〜 3 分間 15 s. 加温の 140 μ L のクロロホルムと渦を追加します。
    6. 遠心分離機の 4 ° C で 12,000 × gで 15 分のサンプル
    7. 慎重に上部の水相を新しいチューブに転送します。
    8. 分数の RNA 含量は高いため、各チューブにキャリアとして 10 μ g のグリコーゲンを追加します。
    9. 各チューブに 350 μ L のイソプロパノールを追加します。よく混合し、収量を高めるため 1 時間-20 ° C で孵化させなさい。
    10. 4 ° C で 12,000 × gで 15 分間遠心します。
    11. 上澄みを廃棄し、RNA のペレットを洗浄する 75 %700 μ L エタノールを追加します。
    12. 4 ° C で 7,500 × gで 5 分間遠心
    13. エタノールを削除し、10-15 分の乾燥ペレット空気。
      注: は、水の完全な可溶化をできなくなります過剰 RNA ペレットを乾燥します。
    14. RNase フリー超高純度 H2o. の 50 μ L の RNA ペレットを再懸濁します
    15. 55 ° C で 10 分間のサンプルをインキュベートします。
    16. 各サンプルの 2 μ L を使用して品質と抽出された RNA の量を測定し、-80 ° C で保存
  2. 逆のトランスクリプションと qPCR
    1. 逆のトランスクリプション cDNA 合成の 4 μ L を使用して 20 μ L 反応キット (材料の表を参照してください)。サンプルの数によるとスーパー ミックスを準備します。各管に必要なボリュームを転送し、各管に入力 RNA の 5 μ L を追加します。このボリュームは、Taq ポリメラーゼ労働条件の範囲に関連する修正ことができます。
    2. メーカーが推奨する次のプログラムでサーマルサイクラーにチューブを孵化させなさい: 25 ° C で 5 分、46 ° c、20 分 20 分逆のトランスクリプションおよび 95 ° C で 1 分の逆転写酵素の不活化
    3. QPCR をプライマーのペアごとに最適化されたプログラムを実行します。
      注: 分数で特定の Mrna の存在を検出するため等しいボリューム (隔離された RNA) の各画分からは逆のトランスクリプションの使用ください。
  3. 結果の分析
    1. 興味の遺伝子と、ルシフェラーゼの Ct 値を使用して、デルタ Ct 値を計算するには
    2. (表 1) の異なる画分での mRNA の分布を視覚化するすべての画分に含まれる mRNA の総額の割合として各分数デルタ Ct 値を表現します。

4. 分離とポリソーム分数と分数の Nontranslating からの Mirna の解析

  1. MRNA とマイクロ Rna の抽出
    注: このプロトコル変更がいくつかの製造元の指示に従います。
    1. グリコーゲンとスパイクの制御を解凍します。氷の上を保ちます。
    2. プールされたサンプルを 200 μ l 添加するマイクロ Rna 抽出試薬の 700 μ L を追加します。
    3. グリコーゲンの 1 μ g/μ L を追加し、ピペットを使用してそれを均質化します。室温で 5 分間インキュベートそれ。
    4. 1.6 10 制御スパイクで8倍の 3.5 μ L を追加し、それを混ぜます。
    5. クロロホルムと渦を 200 μ l 添加少なくとも 15 秒のためにそれ。
    6. 室温で 3 分間インキュベートします。
    7. 4 ° C で 15 分間、12,000 × gで遠心分離
    8. ピペットを使用して、新しい 1.5 mL チューブに上清を転送します。中間と下部のフェーズを破棄します。
    9. 上清に 1.5 x 量の 100% エタノールを加え、それを混ぜます。
    10. マイクロ Rna 抽出列に 700 μ L のこの混合物を転送し、15 の全速力で遠心分離機 RT で破棄フロースルー; s任意の残りのサンプルでこの手順を繰り返します。
    11. 列にバッファー 1 の 700 μ L を追加し、15 の全速力で遠心 RT; s流れを破棄します。
    12. 列にバッファー 2 の 500 μ L を追加し、15 の全速力で遠心分離機 RT; s流れを破棄します。
    13. 列に 80% エタノール 500 μ L を追加し、フルスピードで RT; で 2 分間遠心流れを破棄します。
    14. 脱帽新しい 2 mL のチューブ、蓋を開けるし、RT でフル速度で 5 分間遠心分離機のそれの列を転送します。流れを破棄します。
    15. 列と遠心分離機完全にそれは右で 1 分の溶出液氷の上速度または将来の分析-80 ° C で保存に RNAse フリー水の 16 μ L を追加します。
      メモ: 2 マイクロリットル各サンプルは、OD 解析に使用できます。
  2. 逆のトランスクリプション
    1. 氷の上を準備します。各 20 μ RT-PCR の反作用の miRNA RT バッファーの 4 μ L、核酸の 2 μ L、総 RNA、2 μ L の酵素 RNAse 自由水の 3 μ L の 9 μ L を追加します。それを混ぜるし、簡単にスピンダウンします。
    2. 熱 Cycler を以下のように設定します。
      37 ° C、60 分;
      95 ° C、5 分。
      4 ° C を保持します。
    3. 熱 cycler からチューブを外し、RNAse フリー水を 200 μ l 添加します。-20 ° C で保存したり、リアルタイム pcr 法に進みます。
  3. リアルタイム PCR
    注: このプロトコル 96 well プレートの形式に従います。氷の上の反応混合物を準備します。
    1. PCR 反応混合物を準備し、プロトコルによって受け入れられる範囲によると (上記 Mirna) から cDNA を追加します。バッチで複数の反応を用意できます。
    2. 各ウェルに 25 μ L の PCR ミックス + cDNA の合計を追加します。
    3. 光プレート シールを使用してプレートをシールします。
    4. 常温 1,000 × gで 1 分のプレートを遠心します。
    5. リアルタイムのサーマルサイクラーのプログラムは次のよう。
      15 分; 95 ° C の最初のライセンス認証手順
      3 ステップ サイクリング: 15 94 ° C で変性 s;30 55 ° C で熱処理 s;30 70 ° C で拡張子 s (蛍光データ コレクションを実行)。40 サイクルを追加します。
      融解曲線サーマルサイクラー既定によると。
  4. 比較分析
    1. 正規化の例 (表 2参照)。
      1. SCM の最小値を見つけます。
      2. この最小値 SCM 値を正規化します。
      3. 利子 (MOI) および参照の遺伝子 (REF) の miRNAs の Ct 値からこの値を減算します。
      4. 2-ΔCt式を使用してデータを分析します。

5. プロテオーム解析

  1. ポリソーム分数からの蛋白質の抽出
    1. 3 最終的な分数に収集したショ糖分数を結合します。重い(4、5、6、7 のショ糖濃度が最も高いプールの分数で高効率ポリソーム; 勾配管の下部) として分数をマーク(プールされた分数 8、9、10、11 で低効率ポリソーム; の中間、勾配管) と非翻訳(プールされた分数 12、13、14、15 最低の濃度のショ糖の; 勾配管の上部)。プールされた分数に対して蛋白質の試金を行います。
    2. トリクロロ酢酸 (TCA) の株式を 100% を準備し、暗闇の中で 4 ° C で保存します。100% の 60 μ L で 0.5 mL サンプルをミックス TCA と暗闇の中で一晩-20 ° C で孵化させなさい。
      注: は、1.5 mL 低蛋白保持管 (材料の表を参照) を使用します。
    3. 一晩インキュベートした後雪解けの氷と 15,000 × g、30 分破棄上清の 4 ° C で遠心分離機のサンプルを実行します。
      注: サンプルの総蛋白質の 100 μ g チューブ下部に表示されるタンパク質のペレットを与えます。
    4. -20 ° C のフリーザーでアセトンをチル済み。蛋白ペレットと 15,000 × g、15 分破棄上清の 4 ° C で遠心分離機に冷アセトン 0.5 mL を追加します。この手順を 2 回繰り返します。
    5. 空気は乾燥ペレットです。50 mM トリス塩酸バッファー (pH 8) の 360 μ L でペレットを再懸濁します。
      注: 必要な場合は、ペレットを再懸濁しますにパルス超音波発生装置を使用します。
    6. 0.1 M ジチオトレイトールが 40 μ L を追加 (最終濃度 10 mM) し, 0.15 M ヨードアセトアミド 45 分追加 50 μ L のシェーカーに 55 ° C で (最終濃度 17 mM) し、暗闇の中で 30 分間シェーカーで室温で孵化させなさい。
    7. トリプシン溶液を準備: 50 mM 重炭酸アンモニウムの 100 μ L でトリプシンの 20 μ g を再懸濁します。1:50 (w/w) で、トリプシン溶液量に応じたサンプルを加えるトリプシン: 蛋白比、pH が 8 を確認し、37 ° C でシェーカーで一晩インキュベートします。
      注: 追加 1 M 重炭酸アンモニウム 8 に pH をもたらすため。
    8. トリプシン消化したクールなサンプルでは、簡単にベンチの遠心分離機、遠心追加 10% ギ酸 pH 2-3 トリプシン活性をクエンチしサンプルの脱塩に進みます。
      メモ: サンプルの脱塩の μ 溶出プレートを使用します。
    9. 吸着の井戸の条件 3 回続いてエアコン 0.1% ギ酸の 200 μ L で 3 回真空を利用したメタノールの 200 μ L で 96 well プレートです。サンプルをロードし、サンプル洗浄 3 回 0.1% ギ酸の 200 μ L を使用してを実行します。低蛋白保持 0.5 mL チューブに 2 回 50 %acetonitrile/0.1% ギ酸の 100 μ L のサンプルを溶出します。
      注: 溶出サンプルゆっくりと最初に重力を使用して続いて低真空します。
    10. コンセントレーターを使用して乾燥するサンプル溶出液を蒸発させるし、いずれかを直接質量分析またはストアを運ぶ使用まで-80 ° c。
  2. 質量分析法による解析
    1. 50-100 μ L の各ペレット (トリプシンのペプチドから成る) を再構成し、質量分析計に 1 μ L を注入します。
      注: は、LC ・ MS/MS 信号の最大強度を取得する再構成やインジェクションのボリュームを最適化します。私たちの場合は、最大信号 (総イオン電流;TIC) でスキャンの心に 2E9 1E8 の範囲にあった。
    2. トラップ列 C18 を使用 (300 × 5 mm、5 μ m、100 μ m 内径) が続いて C18 カラム (75 × 250 mm、2 μ m、100 μ m 内径) を用いたペプチド分離 275 ° C、2 にスプレー電圧 300 nL/分セット ナノ ソース キャピラリー温度で流れの速度設定と kV。
    3. 90 分 5-35 %b、95% B 7 分と 25 分 (a: 0.1% ギ酸/水とアセトニ トリルの b: 0.1% ギ酸) を 5 %b で平衡を保持している、3 分間 35-95 %b の線形グラデーションを適用します。MS2 CID モードを使用して各 MS1 スキャンから 15 の最高強度イオン スペクトルを取得します。3 質量分析法は、分析サンプルごとにレプリケートします。
      注: 最適化し、実験条件および特定の質量分析装置のあなたのサンプルに適したパラメーターを使用します。条件/パラメーター セクション 5.2 で説明します。使用され、私たちの研究室で最適化します。
  3. タンパク質同定・定量
    1. 質量分析の分析の後に、生スペクトル ファイルを MSConvert ソフトウェア (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html) を使用して互換性のある mzXML ファイルに変換します。
    2. 検索条件での SEQUEST 検索エンジン (最新正規レビュー); UniProtKB/スイス人 Prot マウス データベースなどに変換されたファイルを送信します。トリプシンを使用して半酵素ダイジェスト (KR 後/-);最大 2 逃した亀裂;前駆体の質量範囲: 400 に 4,500 amu;静的な変更: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu;ペプチド質量許容差: 50 ppm;大容量タイプのフラグメント: モノアイソ。
      注: その他タンパク質データベース、検索エンジン、データ パイプラインを使用できます。例えばラット、マウスおよびヒトのデータベースよりも不完全であるためデータベースを使用して場合に、マウス (または人間) に対して検索を実行可能性があります、プロテオームのカバレッジを高めるためのデータベース。この場合、蛋白質名の冗長性を削除する必要があります。
    3. ポスト検索の分析を実行します。データを表示するフィルターを設定します。たとえば、95% あるいは 99%、すなわち、統計解析がサンプルに存在することの 95% あるいは 99% の確率を意味タンパク質だけが表示されますとして最小のタンパク質確率 (蛋白質のしきい値) を設定します。ペプチドのしきい値 (例えば95%) のフィルターを設定、すなわちスペクトルがペプチドを識別するかどうか決定する際に使用される最小の確率。タンパク質が存在するかを決定するペプチドの最小数を選択 (タンパク質の同定、最低限 2 ペプチドをお勧めします)。
    4. 質/量の識別された蛋白質を評価します。Proteotypic ペプチドが定量化のため使用されることを確認します。アイソ フォームが確認された場合は、特定のアイソ フォームにユニークなアミノ酸配列から成るトリプシン ペプチドの観測基地だを確認します。任意の「ような」または仮想的な蛋白質はどう比較を受けなければならない観測されたペプチドは知られている蛋白質に対応します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

mRNA の解析
mRNA の結果は、各画分 (図 3 a); 特定の mRNA の分布として表現できます。定量化, polyribosomal 翻訳分数を結合および非翻訳分数 (図 3 b)、nontranslating の分数に変換する mRNA の豊かさの割合を提示に比較します。追加情報は、高効率ポリソーム分数低効率ポリソーム分数を個別に (または nontranslating 分数とは別) を調べることによって得られます。(どこ彼らは彼らのターゲット Mrna のタンパク質翻訳を妨げる) 低効率分数に富む Mirna を解析するとき、これは特に重要です。

代表は、翻訳と nontranslating の分画マウス心は虚と虚血/再灌流を行った後にその分布に比べて偽の変更は、図 4で示されている特定の mRNA の結果します。

miRNA 配列解析
MiRNA 配列解析の代表的な結果は、図 5のとおりです。ここでは、Mirna (配列の特注プレート) のサブセットを 22 Mirna と関連付けられたことポリソーム虚血、9 の miRNas の中に虚血と再灌流の両方の条件に共通だった 7 中を示すプールの重画分に行った。これは、miRNAs の協会は虚血と再灌流のストレス応答の動的な示しています。

プロテオーム解析
シャム (制御) サンプルの重い、軽い、非翻訳画分の分析:
総蛋白の 881 が質量分析によって識別されました。3、合計の 46 と 208 のタンパク質はそれぞれ非トランス、光重の分数にユニークだった (図 6 a)。ミトコンドリアのリボソーム蛋白質 (28 秒、39 s) の大半 (88%) いた光分数 (36 のうち 41) で識別され、細胞質のリボソーム蛋白質 (40 代・ 60 代) の大半 (88%) は、重くおよび軽い分数 (53 のうち 60) でよく識別されました。効率的な分離とプロテオミクスを確認特定の重いのゾル性細胞質の対能力はミトコンドリアのリボソーム蛋白質を軽量化します。図 6Bに識別されたミトコンドリアおよび細胞質のリボソームタンパク質のサブセットを示します。

Figure 1
図 1: ショ糖密度勾配のポリソーム分数の典型的な UV 吸光度プロファイル。最初の 3 つの分数は、チューブの空洞の体積を表します。高効率 (高分子量、HMW) 分数、分数 4-7 低で収集された効率 (低分子量、低分子) 8-11、非翻訳 (と残りのゾル性細胞質材料) の分数が分数 12 15 (収集nontranslating、NTR)。赤い線は導電性を示し、青のトレースを示します 254 UV 吸光度 nm。右側はポリソームの沈降の後でグラデーション、示す分布をショ糖と試験管の漫画です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: バイオアナライザーに RNA の整合性制御解析します。心臓全体ライセートから分離された総 RNA の RNA 整合性数 (鈴)。凛の計算によると 18 と 28 のピーク。凛の範囲: 1-10、そして鈴 = 10 を表す非常に良い整合性。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: ショ糖密度勾配での mRNA の分布の代表的なプロファイルです。基底の蛍光灌流や虚血再灌流心を受けた (私/R)。(A)心 lysates はショ糖密度勾配に解決され、GAPDH (左) と COX4 (右) の mRNA のコンテンツは各分画で決定されました。プロット (シャム、赤いラインとダイヤモンド) 基底の灌流、虚血/再灌流の各分画 (x 軸の数分数) の mRNA 量を示しています (私/R、青色の線、正方形)。プロットの上に重ね、紫外線吸光度を示す合計 mRNA コンテンツ (光グレー曲線) とコンダクタンス (ストレート グレー傾斜線)。どのように分数を集めたボックスを示します。(B)バー グラフのプロットは (ポリソーム) vs nontranslating (NT) 分数の GAPDH (左) COX4 (右) Mrna の翻訳に mRNA 量の比率を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 代表的な mRNA 結果。実験群によると変化を示すプールされた分数 (高分子、低分子、NTR) で 1 つの mRNA の定量。蛍光灌流後マウス中心のポリソーム分別を行った。合計 mRNA (上部パネル) の % と nontranslating の分数 (NTR) にポリソーム (HMW + 低分子) の比率として、結果がプロットされます。誤差範囲は、グループごとの 5 心から結果を表す (シャムや虚血、/R)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 代表 miRNA 結果。経路のベン図形型図表の心の後の miRNA 解析表示とマウス サンプルの重質留分プール ダウンレギュ レート miRNAs の集中虚血または虚血と再灌流。カットオフ値: 約 1.5 倍。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6 : 蛋白質質量分析法によって識別されます。(A)一般的な重い、光、トランス以外の分数にユニークなタンパク質のベン図形型図表。ミトコンドリアおよび細胞質のリボソームタンパク質の識別の(B)のサブセットです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: タンパク質抽出方法の概略のワークフローをテストします。蛋白質の抽出方法は、シャム (制御) サンプルと重い (高効率ポリソーム) を使用してテストされた最高のスクロース含量の割合。赤内の数字は、タンパク質質量分析によって特定された数を示す2 つの数値が表示するように、彼らは 2 つの独立した実験からです。詳細な説明は、テキストで与えられます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

分数 遺伝子 Ct ルシフェラーゼ Ct ΔCt 2ΔCt すべての分数の和 各画分の % ポリソーム/NTR 比
高効率分画法 28.75 22.79 5.96 0.016 0.046 34.64 2.77
低効率 (低分子) 28.43 22.63 5.80 0.018 38.81
非翻訳 (NTR) 29.12 22.77 6.35 0.012 26.55
ポリソーム/NTR 比率 = (HMW + LMW)/NTR

表 1:MRNA の解析のサンプルです。量的な PCR 後プールの異なる画分 (高分子、低分子、NTR) に対して 1 つの mRNA の解析の方法を示します。ΔCt = Ct - Ct、ルシフェラーゼの遺伝子、2ΔCt、2ΔCt

SCM の最小値を見つける: 22.77
サンプル 1 サンプル 2 サンプル 3
Ct モイ 22.92 22.36 22.58
Ct SCM 22.81 22.77 22.9
Ct REF 23.27 23.55 23.19
この最小値 SCM 値を正規化します。
サンプル 1 サンプル 2 サンプル 3
Ct SCM 0.05 0 0.13
モイと REF の Ct 値からこれらの値を引く
サンプル 1 サンプル 2 サンプル 3
Ct モイ 22.87 22.36 22.45
Ct REF 23.22 23.55 中 23.06

表 2: サンプル ・ ポリソームと nontranslating の画分に miRNA 発現比較のためのリアルタイム PCR 計算します。虚血または虚血/再灌流後マウスのプールの重画分の利子 (MOI) および参照の遺伝子 (REF) の Mirna を行ったCt 値がスパイクでコントロール (SCM) Ct 値、次の 2-ΔCt数式に正規化された最初は、miRNA の表現を比較する使用されました。

メソッド サンプル ボリューム [mL] # 特定の蛋白質の コメント
FASP 1 227 ショ糖の大部分は、フィルターで沈殿
アセトンの沈殿物 0.6 372 チューブ下部; ショ糖の粘性汚泥4:1 (試薬: サンプル) ボリューム。ない表示蛋白ペレット
クロロホルム ・ メタノール降水量 0.32 389 チューブ下部; ショ糖の粘性汚泥8:1 (試薬: サンプル) ボリューム。ない表示蛋白ペレット
(4 ° C) で TCA 沈殿物 0.5 405, 415 ショ糖沈殿物;0.12:1 (試薬: サンプル) ボリューム。管の下部に表示されているペレット
再沈殿物 85、60 最初のペレットが収集された後の上清の追加 TCA 沈殿物
(-20 ° C) で TCA 沈殿物 0.5 440、430 ショ糖沈殿物;0.12:1 (試薬: サンプル) ボリューム。管の下部に表示されているペレット
再沈殿物 81、55 最初のペレットが収集された後の上清の追加 TCA 沈殿物

テーブル 3:タンパク質抽出法の比較。FASP、アセトンの沈殿物、クロロホルム ・ メタノール沈殿物および 4 ° C、-20 ° C で TCA 沈殿物を評価しました。目標は、蛋白質の特定の数を最大化することでした。TCA の降水は、再現性を確認する資料の 2 番目のバッチで評価しました。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ポリソーム プロフィール分析と、特定の mRNA の全体のトランスクリプトーム6,7並進状態の分析によりタンパク質翻訳の研究。ローカル翻訳シナプトソーム8など検討する必要がある場合、それは大きな助けとだも。伝統的に、この方法は、モノとポリゾームとショ糖密度勾配をゲノムと結合することができるまたは目的の結果6,9を取得するプロテオミクス技術に関連する Mrna の分離を含みます。例えば、私たちのグループによって実行される最近の調査は患者の虚血/再灌流障害を模倣した体外循環心で実行される転写後調節機構を明らかにしました。ポリソーム プロフィール分析のを活かして、我々 は CPB の手順2の後の心核符号化されたミトコンドリア蛋白質の翻訳で増加を示しています。

ここで紹介したプロテオーム polyribosomal プロファイリング方法ポリゾームと積極的に翻訳されて、タンパク質に関連する Mrna の人口の変化を明らかにできます。Mrna の翻訳は、miRNAs によって部分的に支配されるとこれらの画分の Mirna の解析は、追加の洞察力を明らかにできます。実際には、いくつかの研究このメソッドを変更し、調査規制10,11の miRNA モードに適切かつ信頼性の高い方法であることを証明しました。

最後の 10 年間に踏み込んで、Mirna の役割様々 な生体機能12,13にその重要性を考慮した多くの研究を行った。ポリソーム プロフィール分析を実行されており、翻訳 Mrna14,をターゲット ポリソーム分数の miRNAs はある実際に示されている miRNAs 行動分解用にマークするために対応する Mrna とベースのペアリングをので15,16. ミール 21 は良い例が低い抑圧と弱いポリソーム ポリソームとの関連付けは増加する癌細胞と抑制の効果は多くの強い17正常細胞でのバインディングに関連付けられています。

本研究ではリアルタイム PCR 分析を行った (MOI) の興味の miRNAs の Ct 値を使用して、スパイクの Ct 値制御はサンプルの間で安定している miRNA (SCM) 技術的な変化と参照の遺伝子や miRNA (REF) の Ct 値を削減します。最初のステップは、覚書と SCM の Ct 値を REF の Ct 値を正規化することでした。REF に MOI の第 2 ステップの正規化があったし、2-ΔCt数式を計算結果の値を使用します。グループ間の違いを示すには、これらの値またはフォールドの変更値を使用できます。

タンパク質の抽出はポリソームの一部分から難しいので、今まで行われた研究のほとんどは西部のしみの分析のために直接分数を使用しています。彼ら単に土砂の SDS-PAGE 解析8,18を使用する SDS の読み込みとバッファー率・ ミックス各たんぱく。ここでは、ペプチドおよびタンパク質質量分析を続行する高品質のためにも、分別後抽出 Mrna、miRNAs のだけではなく私たちを可能にする手法を開発しました。

このアプローチを拡張することができる積極的にメチオニン19,20azidohomoalanine (AHA) など、双直交アミノ酸の相同物など代謝ラベリング処理による新生タンパク質を測定することによってさらに。なるほどクリックケミストリーに続いて設立 AHA を組み込まれてすべての蛋白質のストレプトアビジン浄化続くビオチン タグの混入の可能します。これにより、新たに合成されたタンパク質の決定的な同定 — 動的なプロテオームの他の部分。刺激に対する反応で翻訳と nontranslating の分画の中で再配布 miRNAs の検出 (私ここで/R) タンパク質翻訳の動的制御の尋問をことができます。しかし、リボソーム バインド mRNA の身辺に Mirna を募集の要因は識別され、体系的に調査に残る。

TCA 沈殿物に加えて、私たちの研究では、我々 はポリソームの一部分からの蛋白質の抽出のための他の 3 つの方法をテスト: i) FASP (フィルター支援サンプル準備)21ii) アセトンの沈殿物、および iii) クロロホルム ・ メタノール沈殿物。高濃度スクロースの画を処理する能力の両方に基づく方法の適合性を評価した (50% まで) といくつかの蛋白質の質量分析法 (図 7及び表 3) によって識別されます。

FASP メソッドの 30 kDa の相対分子質量のカットオフと限外ろ過ユニットを採用 FASP 蛋白質消化キットによって与えられたサンプル準備のプロトコルを追った以降ペプチド分離を妨げるだろう高分子量の物質 (タンパク質や DNA) を保持する能力を持つ洗剤除去、バッファー交換、蛋白質の分解、ペプチド溶出するためのツールとして提供していますこのフィルター ユニット21します。 サンプルが簡単に、尿素を含む混ぜバッファー、ヨードアセトアミド ソリューションとして手順を回転ユニット スピン フィルターに読み込まれると、トリプシン溶液と塩化ナトリウム溶液 (溶出) その後が追加されました。消化ペプチドを含む最終的な濾液 TFA により酸性化させた、脱塩し、質量分析のため保存されています。このメソッドを使用すると、ただし、沈殿したショ糖の一括着実に蓄積フィルター、遠心分離をレンダリングし、洗浄手順が難しい上に。

アセトンの沈殿物は、/メタノール クロロホルムの沈殿物のサンプルの単一の容積からの蛋白質を沈殿させる溶剤の複数のボリュームが必要でした。これは沈殿物を 1.5 mL チューブ (蛋白質低保持管) に行ったときに適用サンプル ボリュームのサイズが制限されます。同様に、両方の方法のための沈殿物の後管の下部に蓄積された糖の粘性汚泥およびアセトンの沈殿物およびクロロホルム-メタノール中の沈殿物の後表示ペレット チューブ下部と液体の界面がなかったそれぞれ。

表 3および図 7実験ワークフローを最適化するために使用私たち 4 つのタンパク質抽出法の比較を示します。各メソッド (図 7) に与えられた赤い数字は質量分析によって識別された蛋白質の数を表す (セクション 5.2 と 5.3 を参照)。各メソッドの使用サンプル ボリュームが異なると、クロロホルム ・ メタノール ・ TCA 析出特定タンパク質の最大数の結果。ただし、(サンプル ボリュームの制限とショ糖降水量) 上記の欠点のため、我々 はその後の実験のための TCA 沈殿物を選びました。

サンプル処理の最適条件を見つけるには、様々 な温度で TCA 濃度22,23,24を TCA 沈殿物を行った。したがって、10.7% の沈殿物を行った 4 ° C、-20 ° C で TCA TCA の 60 μ L 追加で上清をさらに沈殿し、(最後の 19.4 %tca) ペレットを収集した後。これは、質量分析法による分離を行った 4 つのペレットで起因しました。さらに、得られた結果が再現できるように 2 回全体のプロトコルを繰り返しました。ワークフローと 4 ° C、-20 ° C の条件下でペレットの 2 つの繰り返し実験で識別されます蛋白質の数は図 7 (赤数字) で表示されます。培養上清が蛋白質 (85 および 4 ° C; 81 で 60 と 55-20 ° C で); の追加数を得られたペレットの分析に由来するが蛋白質の大半が最初のペレットで既に識別されて、したがって、我々 は 10.7% を使用することを選んだすべての後の実験のための TCA。我々 はいくつかの利点のための TCA 沈殿物を優先/メタノール クロロホルムの沈殿物は、TCA 沈殿物と比較して識別された蛋白質の同じような数で起因したが: 私) (60 μ TCA の蛋白質を沈殿させるために必要な溶媒の量が少ない1.28 mL のクロロホルム/メタノール/水) 便利な沈殿物、ii のため 1.5 mL チューブを使用している必要なサンプルの大量の使用を有効にする場合) チューブ下部と iii ペレットの可視性) 中のスクロースの蓄積沈殿物の手順を実行します。

並進状態についての詳細な機能を提供する、にもかかわらずこのメソッドの主な欠点は、新鮮で大きな原料の必要性です。多くの研究は、細胞や組織の少量を使用して条件を最適化または解凍 RNA および蛋白質25の効率を高めるためのステップを追加を試みた。場合同じ実験条件の下でさまざまな動物から得られた組織を一緒にプルがまだ、する必要があります。

結論としては、このプロトコルは、mRNA、miRNA、ポリソーム虚血/再灌流に関与する調節機構を研究するプロファイリングから得られた画分からの蛋白質の同時解析できます。しかし、更なる研究が虚血再灌流後翻訳 Mrna が誘導されるかどうか、彼らはストレスの除去時に有効なるかどうかを参照してください必要があります。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

NIH P01 HL112730 (布、JVE) NIH R01 HL132075 (ぼろきれ、JVE)、バーブラ ・ ストライサンド女性のハート センター (ぼろきれ、JVE)、ドロシーと e. フィリップ リヨン椅子分子循環器 (布) で、女性の心の健康 (JVE)、チェコ科学アカデミー エリカ グレイザー寄附施設支援 RVO: 68081715 (MS)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentobarbital Vortech Phamaceuticals 9373 for euthansia
Heparin Sagent 103424 used in langendorff preparation
forceps Fine Science Tools 91110-10 used to hang the heart
Langendorff system Radnoti + home made n/a A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths
NaCl Sigma S7653-5KG Krebs buffer and Sucrose gradient
KCl Sigma P5405 Krebs buffer and Lysis buffer
KH2PO42 Sigma P-5504 Krebs buffer
MgSO4 Sigma M7774-500G Krebs buffer
Glucose Sigma G5767 Krebs buffer
CaCl2 Sigma C1016-500G Krebs buffer
Sucrose powder Sigma S0389-1KG Sucrose gradient
MgCl2 Sigma 208337 Sucrose gradient and Lysis buffer
Tris-base Sigma T1503-1KG Sucrose gradient and Lysis buffer
Xylene Cyanole Sigma X-4126 Sucrose gradient
Cycloheximide Sigma-aldrich 239763 Sucrose gradient and Lysis buffer
RNaseOUT Life Technologies C00019 RNAse inhibitor for Lysis buffer
Igepal CA-360 (NP40) Sigma I3021 Lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free Roche 5056489001
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059
Ultracentrifuge Beckman LE-80K Ultracentrifugation of the gradients
Rotor Beckman SW41 Ultracentrifugation of the gradients
Biologic LP (pump) Biorad 731-8300 Fractionation of the gradients
BioFrac Biorad 741-0002 Fractionation of the gradients
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube Sigma Z666513-100EA Gradient fraction and RNA extraction
TRIzol Reagent Life technologies AM9738 RNA extraction
Luciferase Control RNA Promega L4561 RNA extraction
Chloroform Fisher Scientific C606-4 RNA extraction
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 RNA extraction
Isopropanol Sigma I9516 RNA extraction
Ethanol Sigma E7023-1L RNA extraction
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 170-8891 Reverse transcription
iTaq Universal SYBR Green Supermix BioRad 175-5122 Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50) Qiagen 217084 Kit for total RNA isolation
miScript II RT Kit (50) Qiagen 218161 Kit for miRNA reverse transcription
miScript Sybr Green PCR Kit (200) Qiagen 218073 Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs
Centrifuge 5424R Eppendorf For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g
Centrifuge 5810R Eppendorf For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g
My Cycler Thermal Cycler Bio-Rad For reverse transcription
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad For real-time PCR analysis
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610 For quality control of RNA isolation
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear Bio-Rad HSP9641 For real-time PCR analysis
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001 For real-time PCR plate sealing
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL Eppendorf UX-24505-02 For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P20 Gilson F123600G For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P200 Gilson F144565 For pipetting
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL Gilson 17011782 For pipetting
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 Improves total RNA isolation efficiency
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color Denville C2170 RNA isolation and storage; reagent mix
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically Denville C18098-4 (1000910) Reverse transcription reaction
Sharp 10 Precision barrier Tips Denville P1096-FR For pipetting
Sharp 20 Precision barrier Tips Denville P1121 For pipetting
Sharp 200 Precision barrier Tips Denville P1122 For pipetting
Tips LTS 1 mL Filter Rainin RT-L1000F For pipetting
miScript Primer Assay (200) Qiagen (it changes according to the miRNA) For real-time PCR analysis
Gradient Master ver 5.3 Model 108 BioComp Instruments For preparation of sucrose gradients
trichloroacetic acid Sigma Aldrich T6399
acetone Sigma Aldrich 650501
Tris hydrochloride Amresco M108
dithiothreitol Fisher Scientific BP172
iodoacetamide Gbiosciences RC-150
sequencing grade modified trypsine, porcine Promega V5111
ammonium bicarbonate BDH BDH9206
formic acid, Optima LC/MS Fisher Chemical A117
methanol, Optima LC/MS Fisher Chemical A454
acetonitrile, Optima LC/MS Fisher Chemical A996
Protein LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf AG 22431064
Protein LoBind tubes 1.5 mL Eppendorf AG 22431081
HLB µElution plate 30 µm Oasis 186001828BA
SpeedVac concentrator Thermo Scientific Savant SPD2010
sonicator Qsonica Oasis180
centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend micro 21R
LC trap column PepMap 100 C18 Thermo Scientific 160454
LC separation column PepMap RSLC C18 Thermo Scientific 164536
mass spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer
MSConvert software ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST software Sage-N Research, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).More

Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter