Ved hjælp af en knæ Arthrometer at vurdere væv-specifikke bidrag til knæ fleksion kontraktur i rotter

Summary

Målet med protokollen er at måle den forlængelse vifte af bevægelse i knæet, rotte. Virkningerne af forskellige sygdomme, der øger stivhed af knæleddet og effektiviteten af behandlinger kan kvantificeres.

Abstract

Normale knæ vifte af bevægelse (ROM) er afgørende for trivsel og tillader en at udføre basale aktiviteter såsom vandreture, klatring trapper og sidder. Tabt ROM kaldes en fælles kontraktur og resulterer i øget sygelighed. På grund af vanskeligheden ved baglænskørsel etablerede knæ kontrakturer, tidlig påvisning er vigtig, og dermed vide risikofaktorer for deres udvikling er afgørende. Rotter udgør en god model, hvormed effekten af en intervention kan studeres på grund af ligheden af rotte knæ anatomi til mennesker, rottes evne til at tåle lange varigheder af knæet immobilisering i fleksion, og fordi mekaniske data kan være korreleret med histologiske og biokemiske analyser af knæet væv.

Ved hjælp af en automatiseret arthrometer påvise vi en valideret, præcise, reproducerbar, bruger-uafhængige metode til måling af udvidelse ROM af rotte knæleddet på specifikke halssmykker. Denne arthrometer kan bruges til at bestemme virkninger af interventioner på knæ blandede ROM i rotter.

Introduction

Har fuld vifte af bevægelse (ROM) af leddene er kritisk for sundhed og trivsel¹. Et tab i fælles passiv ROM kaldes en kontraktur². Fælles kontrakturer kan skyldes mange forhold, herunder langvarig sengeleje, lammelse, fælles artroplastik, forbrændinger, infektion og neurologiske forhold^1,3,4,5. En kontraktur af knæet kan invaliderende som det accelererer fælles degeneration, øger risikoen for fald og negativt påvirker en persons evne til at udføre grundlæggende funktionelle opgaver herunder gå, sidde og klatring trapper^{6, 7}.

Når der oprettet kontrakturer i knæet er vanskelige at behandle, og derfor afgøre, hvilke patienter er den højeste risiko for at udvikle denne betingelse er afgørende for forebyggelse og forhindring af kontraktur-associerede sygelighed⁸. Eksperimenter er designet til at evaluere 1) de betingelser, der forårsager eller påvirke knæ fælles kontrakturer, 2) sværhedsgraden af kontrakturer, 3) deres tidsmæssige progression, 4) involveret i kontraktur, 5) deres reversibilitet samt 6) nytten væv forskellige forebyggende og helbredende interventioner på knæ blandede ROM. For alle disse eksperimenter er en gyldig, objektive, præcise og reproducerbar metode til måling af ROM kritisk. Andre supplerende foranstaltninger (energi-udgifter, histomorfometri, gene expression og protein indhold) er nyttige markører til at forstå Patofysiologi af fælles kontrakturer, men den mekaniske begrænsning er hvad begrænser patienten og fører til handicap. Nogle af udfordringerne i dette område af forskning omfatter heterogene metoder som knæ ROM kan afprøves eksperimentelt, samt mangel på kvantitative data⁹. Brug af en række forskellige eksperimentelle metoder fører til resultater, der ikke er sammenlignelige, fra laboratorium til laboratorium. Dette har ført til kontrovers vedrørende de betingelser (såsom immobilisering eller fælles artroplastik), der forårsager fælles kontrakturer¹⁰. En automatiseret metode til eksperimentelt måling fælles ROM efter et indgreb er derfor nødvendig.

Her, beskriver vi en bruger-uafhængige, gyldig, nøjagtige og reproducerbare protokol for at vurdere rotte knæet ROM ved hjælp af en specialbygget arthrometer kædet sammen med et digitalt kamera til at nøjagtigt måle knæet ROM i forlængelse. Vi har testet effekten af forskellige perioder med immobilisering på knæ ROM. Derefter beskriver vi metoderne til måling af ROM på forhånd fastsat momenter på de resulterende digitale billeder ved hjælp af faste knoklet vartegn. Samlet set disse metoder pålideligt måle rotte knæ ROM og give kvantitative data.

Protocol

Den rotte knæ immobilisering anvendte model er blevet godkendt af University of Ottawa Animal Care og veterinaere tjeneste og den lokale etiske komité.

1. animalsk forberedelse

1. I slutningen af perioden forudbestemt immobilisering, aflive rotter ved administration af kuldioxid.
   Bemærk: Vi brugte her en immobilisering model med en plade og 2 skruer (en indsat i den proksimale femur og den anden i den distale tibia), som undgår overtrædelse af enhver knæ fælles strukturer, og vedligeholder et knæ bøjede stilling på 135° som beskrevet tidligere⁶ . Over en periode giver det en knæ fleksion kontraktur¹¹.
2. Dække området både på og omkring den overflade, arthrometer skal placeres på med puder, absorberende og vandtæt beskyttelse. Bære handsker, laboratoriekittel og øjenbeskyttelse, mens du udfylder eksperimentet.
3. Ved hjælp af en skalpel, opdele huden til at udsætte pladen og skruerne (se note følgende trin 1.1); indsætte mere proksimale skruen i den proksimale femur og indsætte mere distale skruen i den distale skinneben. Palpere for at finde skruerne. Når skrue hoveder er tilgængelige, skal du fjerne skruen med en skruetrækker.
   Bemærk: I periode med immobilisering, lederne af skruerne kan blive omfattet af blødt væv. Hvis dette sker, skal du bruge skalpel til forsigtigt at fjerne væv og afdække skruehoveder.
4. Når skruerne er fjernet, fjerne pladen manuelt eller ved hjælp af pincet fra en dissektion kit.
5. Ved hjælp af saks og pincet, deglove den nederste ende for at fjerne hud fra underliggende fascia.

2. dyret positionering på motordreven Arthrometer

Bemærk: Alle test bør udføres ved stuetemperatur. Her er arthrometer drevet af en standard North American 120 V input. Adapter output er 12 V og 500 mA.

1. Placer dyr skal testes på sin side med den eksperimentelle ben (ben skal testes) vender opad (figur 2).
   1. Sikre lårbenet i den rillede metal klemme, som er integreret i montering fase af arthrometer. Punch huller gennem musklen med en precision skruetrækker til at placere klemmen distalt for større trochanter og sikre lårbenet. Justere den laterale femoralis kondyl over midten af rotation af arthrometer (figur 1, 2).
   2. Holdning bevægelige arm med to opretstående stillinger bag benet, bare overlegen til calcaneus, at skubbe knæet i passiv forlængelse en gang elektromotor er aktiveret.
   3. Stramme lårbenet klemme på sin base ved hjælp af en hex-nøgle, indtil det er sikret.
2. Sikre kameraet er korrekt monteret på arthrometer med en skruetrækker og er på Manuel fokus. Fokusere kameraet på den femoralis kondyl.
3. Vælg indstillingen retning på arthrometer (med eller mod uret) afhængigt af retningen af knæet ROM bliver testet og placeringen af rotten.
4. Aktivere arthrometer motor ved samtidigt at trykke på knappen Power og starte .
   Bemærk: Nødvendigheden af at skubbe knappen power og start samtidig er en sikkerhedsfunktion i enheden, som forhindrer utilsigtet aktivering.
   1. Observere, arthrometer motor vil bevæge sig med en hastighed på 6,6 RPM og derefter stoppe for 2.1 s ved ankomsten til den første forudindstillede drejningsmoment.
   2. Bemærk: at når den første drejningsmoment er nået, den tilsvarende førte vil lyse og det digitale kamera vil tage et billede af knæet automatisk.
      Bemærk: Når billedet er taget, arthrometer vil fortsætte til næste, højere forudindstillede drejningsmoment. Når de fire momenter har været anvendt, vil arthrometer stoppe. Når rotten er placeret på arthrometer og test er indledt, er den samlede tid til at teste knæ ca 18,8 s. gange kan variere lidt afhængigt af tilstanden af den fælles kontraktur. Billeder taget bruges til at måle forlængelsen på hver drejningsmoment.

3. fange vinklen af knæet udvidelse ved hjælp af en motordreven Arthrometer

Bemærk: Når motoren er stoppet på hver anvendt drejningsmoment, udløses et digitalt kamera for at tage et billede. Kameraet er placeret på rammen således, at det er direkte over knæleddet bliver testet og fokuseret på den femoralis kondyl.

1. Fortsætte med at teste med det samme knæ fra det samme dyr, men i en anden situation, fx efter en myotomy af de posteriore transarticular muskler er udført for at isolere arthrogenic (ikke-muskulære) komponent af en kontraktur, eller med et knæ fra et andet dyr.
   1. Ved udfyldelsen af den myotomy, dissekere den proksimale nok til knæleddet at sikre at kapslen ikke er skåret muskel.
      Bemærk: Det er lettest at gennemføre de myotomy, når benet er i forlængelse heraf efter anvendelse af drejningsmoment indstilling 4 (17,53 N-cm). Gentag derefter trin 2.1 gennem 3.1.
2. Når begge ben er blevet testet i alle forhold (f.eks. før og efter myotomy), bortskaffelse af dyr slagtet og alle biologisk skadelige materialer efter institutionelle protokol, og rengør arthrometer.

4. knæ ROM måling analyse

1. Analysere ROM bruger ImageJ.
   Bemærk: Her version 1.45s blev brugt.
2. Åbn den fil, der indeholder det digitale billede taget med kameraet monteret på rotte arthrometer.
   Bemærk: Den person, der udfører analysen bør være blindet til den eksperimentelle gruppering af dyret (fx immobiliseret versus kontrol).
3. Vælg vinkel værktøj fra hovedværktøjslinjen og spore femorotibial vinklen ved at tegne en femoral linje fra midten af femur klemme til den laterale kondyl (justeret med den femorale diaphysis, figur 2), og en tibial linje fra lateralt femoral kondyl til den laterale malleol (figur 2).
   Bemærk: Den femoro-tibiale vinkel svarer til maksimal vinklen på knæ udvidelse nåede på hver preset drejningsmoment.
4. Brug værktøjet måling ved at klikke på analyser | Foranstaltning til at vise den beregnede vinkel produceret af de 2 streger ovenfor. Brug konventionen fra 0° til at betyde fuldt udtræk.

Representative Results

Mængden af knæet udvidelse bestemmes for forskellige perioder med immobilitet opsummeres for at øge varigheden af immobilitet og viser, at mere alvorlige kontrakturer blev produceret efter stigende længder af immobilisering. Repræsentative resultater ved hjælp af ImageJ er vist i figur 3.

Evnen til at måle maksimal udvidelse af rotte knæ i en gyldig, nøjagtige og reproducerbare, bruger-uafhængig måde, der reducerer skævhed i data. I eksemplet forudsat vi evalueret den maksimale knæ forlængelse efter 16 ugers immobilisering for 7 rotter, sammenligne de immobiliserede (eksperimentel) lemmer til den ikke-immobiliseret kontralaterale ekstremitet. Lem vælges for immobilisering vekslede fra et rat til næste (fx rotte 1 havde den højre knæ immobiliseret, rotte 2 venstre). Investigator måle vinkler var blindet, som side var usejldygtigt under målingerne. Resultaterne præsenteres i fig. 3. For immobiliseret knæet, blev mulighed for maksimal udvidelse reduceret i forhold til de kontralaterale. Division af transarticular muskler fjerner komponenten myogenic, fleksion kontraktur. Efter at myotomy, maksimal udvidelse kapacitet for den eksperimenterende og kontralaterale knæ steg; den eksperimentelle knæ fortsatte dog med at demonstrere en fleksion kontraktur (figur 3).

Figur 1 : Rotte knæ arthrometer. (A) hele apparater (B) repræsentativt billede af dyret inden for arthrometer (C) elektronik display og klemmer for arthrometer. (D) forstørret billede af elektronik display. Tallene angiver de forskellige momenter anvendes: drejningsmoment 1 = 2,53 N-cm, drejningsmoment 2 = 7.53 N-cm, drejningsmoment 3 = 12.53 N-cm, drejningsmoment 4 = 17.53 N-cm. (E) forstørret billede af collum klemme og tibial skubbe apparater. Femoral klemmen er fastgjort til scenen. Den tibial bevægelige arm har 2 oprejst stillinger, at lave den distale nedre ende og flytte knæet i forlængelse. Pilespids og chevron angiver lårbenet klemme og den bevægelige arm, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Arthrometer og eksperimentel rotte for evalueringen. (A) knæ udvidelse af den bageste lemmer er målt ved hjælp af den tibial linje fra den laterale femoralis kondyl til den laterale malleol og den femoralis linje fra den laterale kondyl til midten af femur klemme. Pilespids og chevron angiver lårbenet klemme og den bevægelige arm, henholdsvis. (B) høj forstørrelse billeder af collum kondyl og (C) høj forstørrelse af laterale malleol.

Figur 3 : Immobiliserede og kontralaterale rotte knæ vifte af bevægelse efter 16 ugers immobilisering. For begge knæ, efter at have testet knæ udvidelse med alle artikulære strukturer intakt (n = 7), en myotomy af de trans-artikulære muskler blev udført for at bestemme arthrogenic begrænsning på ROM. Data præsenteres som betyde grader fra fuld extension (ved hjælp af den konventionen 0 ° = fuld extension) med fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. * repræsenterer p < 0,01 ved hjælp af uafhængige-prøver T-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Rotte knæ arthrometer blev udviklet reproducerbar og pålideligt bestemmer den maksimale forlængelse af rotte knæ efter en intervention. Fordele ved denne enhed omfatter den konsekvente generation af drejningsmoment på tværs af knæleddet med en konstant arm længde og udvidelse kraft. En anden fordel omfatter evnen til at indstille drejningsmomentet på et niveau, der tillader gentagne forsøg med den samme fælles at vurdere indflydelsen af forskellige artikulære strukturer på knæ ROM, muskel, kapsel og ledbånd. For eksempel, efter afprøvning af den fuldt intakt fælles, bageste transarticular knæet muskler kan opdeles og arthrometer afprøvning gentagne for at bestemme arthrogenic bidrag til forlængelse begrænsning¹¹.

Specifikke mekaniske funktioner af arthrometer, der optimerer målenøjagtighed og præcision omfatter den rillede klemme, som er designet til at forhindre rotation af lårbenet under testen (figur 1). De distale to metal oprejst indlæg engagere benet posteriort, at skubbe knæet i forlængelse i urets retning, og minimere risikoen for posterior dislokation af skinnebenet på lårbenet under testen (figur 1). Højden af indlæg og anterior overhæng af den øverste oprejst link sikre at tibia ikke glide af stillinger. Evne til de opretstående stillinger til at rotere og fastholde deres position på skinnebenet lige proksimalt for calcaneus sikrer konstant drejningsmoment. Fire momenter er testet i rækkefølge: 2,53 N-cm, 7.53 N-cm, 12.53 N-cm og 17,53 N-cm. Den højeste drejningsmoment niveau var fast besluttet på at være mængden kraft, der førte til kapsulær fiasko i normal (unoperated) rotte knæled (dvs. forlængelse overgår 0 °) efter fordeling af alle transarticular muskelmasse. Den laveste drejningsmoment var punktet af resistens over for kantede motion lige over målelige mængder på normal rotte knæled. Den midterste to momenter blev sat til at være ca. midtvejs mellem den højeste og laveste halssmykker.

Andre metoder til måling af fælles ROM på specifikke momenter er blevet beskrevet i både rotte og andre dyre modeller^{12,13,14,15,16}. Nogle af fordelene ved vores model over disse andre systemer omfatter en praktisk størrelse, der tillader benchtop placering af enhed uden behov for særlige faciliteter. Andre modeller kan også kræve disarticulation af ekstremiteten undersøges, mens modellen præsenteres her ikke. Mekanisk, gælder buet stien til stillingen udvidelse kraft den distale ben, efter den kantede progression af knæet, således opretholde en konsekvent vinkel af force ansøgning. Fase af arthrometer tillader placering af hele rotten på den måling værktøj, giver mulighed for prøvning af alle i situ artikulære strukturer, der kan bidrage til tabt ROM uden at overtræde fælles anatomi. Mens etik protokollen for vores lab udelukker test på levende dyr, ville det teoretisk set være muligt med passende analgesi og post-test ofrer protokoller.

Arthrometer er forbundet med nogle ulemper. Enheden blev dimensioneret til voksen rotte knæet for at sikre, at den bevægelige arm var på en længde for at sikre, at det ikke ville glide ned af benet og benet ikke ville glide fra armen. Yngre rotter eller større og mindre arter ville drage fordel af passende størrelse komponenter. Derudover en omprogrammering af det optimale tidspunkt arm og kraft (drejningsmoment) ville være nødvendig. Hvis for eksempel en større eller mindre dyr blev brugt, kan justering af længden af den øjeblik arm og/eller mængden af kraft, for at nå optimale drejningsmoment være nødvendigt. Andre dele af arthrometer skal muligvis også blive ændret, efter størrelsen af dyret. Mens bevægelser af arthrometer er brugeren-uafhængig, kan fælles måling ved hjælp af ImageJ være underlagt menneskelige fejl. Vi har dog fundet, at, ved hjælp af de metoder, der præsenteres her, der er stor intra-rater og Inter-rater pålidelighed med intraclass korrelationskoefficienter af 0.987 og 0,903, henholdsvis. Fordi den højeste drejningsmoment ofte skader de artikulære strukturer under testen, er en gyldig Inter-rater pålidelighed for animalske placering og aktivering af arthrometer vanskeligt at afgøre. For at undgå målefejl, som kan være forbundet med at have mere end én person, der udfører denne del af protokollen, anbefales det, at have den samme investigator sikre rotter til arthrometer for varigheden af en undersøgelse, således at enhver form for partiskhed er overensstemmelse mellem eksperimenterende og styre knæ. Fordi hamstrings krydse både knæ og hofteled, kan retroversion af bækken forekomme under testen på halssmykker 1 og 2 inden myotomy. Dette kan bidrage til stigninger i knæet forlængelse for både eksperimentelle og kontrol knæ på disse momenter. Endelig kan resultater variere fra sande i vivo ROM, da protokollen blev udviklet for at teste aflivede frem for levende dyr.

Mens vi beskrevet brugen af en enhed for at vurdere virkningerne af immobilitet på rotte knæleddet, kunne andre forhold, der berører fælles ROM også undersøges. Der er mange eksempler, hvoraf nogle omfatter virkninger af traumer, øget muskulær tone sekundært til centralnervesystemet fornærmelse eller genetiske ændringer vedrører neuromuskulære sygdomme. Respektive interventioner såsom stamcelle ansøgning til knæleddet, neuromuskulære junction blokade eller gen terapi behandlinger, der hjælpe med at opdage nye behandlingsmuligheder kan også vurderes ved hjælp af enheden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arthrometer	The Ottawa Hospital Rehabilitation Centre - Rehabilitation Engineering	N/A
Camera	Canon	EOS-500D	Commonly known as EOS Rebel T1i
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.45s
Absotbent Underpads	VWR	820202-845
Dissection Kit	Fisher	08-855	Kit Includes:  Forceps: medium points, nickel-plated  Scissors: 1.5 in. (40 mm) blades, stainless steel  Dissecting knife handle: nickel-plated  Knife blades: stainless steel, pack of 3  Dropping pipet: glass  Bent dissecting needle: stainless steel with plastic handle  Straight dissecting needle: stainless steel with plastic handle Vinylite Ruler 6 in. (15 cm)
Precision Screw Driver	Mastercraft	057-3505-8
Scalpel Blades - #10	Fine Science Tools	10010-00
Screwdriver	Stanley	057-3558-2
Hex Keys	Mastercraft	058-9684-2
Universal AC to DC powder adapter	RCA	108004951