Summary
L'obiettivo del protocollo è quello di misurare la gamma di estensione di movimento del ginocchio del ratto. Gli effetti di varie malattie che aumentano la rigidità dell'articolazione del ginocchio e l'efficacia dei trattamenti possono essere quantificati.
Abstract
Ginocchio normale gamma di movimento (ROM) è fondamentale per il benessere e permette di svolgere attività di base come camminare, salire le scale e seduta. Persi ROM è chiamato una contrattura e si traduce in un aumento della morbilità. A causa della difficoltà di inversione ginocchio stabilito contratture, diagnosi precoce è importante, e quindi, conoscendo i fattori di rischio per il loro sviluppo è essenziale. Il topo rappresenta un buon modello con cui può essere studiato l'effetto di un intervento a causa della somiglianza di anatomia del ginocchio del ratto a quello degli esseri umani, la capacità del ratto di tollerare lunghi periodi di immobilizzazione del ginocchio in flessione, e perché possono essere dati meccanici correlato con l'analisi istologica e biochimica del tessuto al ginocchio.
Utilizzando un KT1000 automatizzato, dimostriamo un metodo convalidato, preciso, riproducibile, utente-indipendente di misurazione l'estensione ROM del ginocchio del ratto alle specifiche coppie di serraggio. Questo arthrometer può essere utilizzato per determinare gli effetti degli interventi sul ginocchio congiunta ROM nel ratto.
Introduction
Gamma completa di movimento (ROM) delle articolazioni è fondamentale per salute e benessere1. Una perdita nella ROM passivo congiunto è chiamata una contrattura2. Contratture articolari possono derivare da numerose condizioni, tra cui più bedrest prolungata, paralisi, artroprotesi, ustioni, infezioni e condizioni neurologiche1,3,4,5. Una contrattura del ginocchio può essere invalidante in quanto accelera la degenerazione articolare, aumenta il rischio di cadute e dannosamente influisce sulla capacità di una persona di eseguire attività funzionale di base tra cui camminare, seduto e arrampicata scale6, 7.
Una volta stabilito, contratture del ginocchio sono difficili da trattare, e quindi determinare quali pazienti sono a più alto rischio di sviluppare questa condizione è essenziale per prevenire ed evitare di contrattura-collegato morbosità8. Gli esperimenti sono destinati per valutare 1) le condizioni che causano o che influenzano contratture articolari del ginocchio, 2) la gravità delle contratture, 3) la loro progressione temporale, 4) i tessuti coinvolti nella contrattura, 5) la loro reversibilità, nonché 6) l'utilità di vari interventi preventivi e curativi su ginocchio congiunta ROM. Per tutti questi esperimenti, un metodo valido, obiettivo, preciso e riproducibile per la ROM di misurazione è fondamentale. Altre misure di accompagnamento (dispendio energetico, istomorfometria, contenuto della proteina e di espressione genica) sono indicatori utili per capire la patofisiologia di contratture articolari, ma la limitazione meccanica è quello che limita il paziente e conduce alla disabilità. Alcune delle sfide in questo settore di ricerca include i metodi eterogenei con cui ginocchio ROM può essere verificato sperimentalmente, come pure una mancanza di dati quantitativi9. L'uso di una varietà di metodi sperimentali porta a risultati che non sono paragonabili da laboratorio a laboratorio. Ciò ha portato a polemica per quanto riguarda le condizioni (ad esempio di immobilizzazione o joint arthroplasty) che causano contratture articolari10. Pertanto è necessario un metodo automatizzato di misurare sperimentalmente congiunta ROM in seguito ad un intervento.
Qui, descriviamo un protocollo utente indipendente, valido, preciso e riproducibile per valutare il ginocchio di ratto ROM usando un custom-built KT1000 collegato a una fotocamera digitale per misurare con precisione il ginocchio ROM in estensione. Abbiamo testato l'effetto dei vari periodi di immobilizzazione ginocchio ROM. Descriviamo quindi i metodi per la misurazione ROM pre-specificato coppie sulle immagini digitali risultante utilizzando punti di riferimento fissi ossute. Nel complesso, questi metodi in modo affidabile misurano ginocchio ratto ROM e forniscono dati quantitativi.
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Protocol
Modello di immobilizzazione del ginocchio ratto utilizzato è stato approvato dall'Università di Ottawa Animal Care, servizio veterinario e il comitato etico locale.
1. animale preparazione
- Alla fine del periodo di immobilizzazione predeterminato, eutanasia i ratti con la somministrazione di anidride carbonica.
Nota: Qui abbiamo usato un modello di immobilizzazione con un piatto e 2 viti (quello inserito nel femore prossimale e l'altra nella tibia distale), che evita la violazione di qualsiasi ginocchio congiunta di strutture e mantiene una posizione flessa del ginocchio di 135° come descritto in precedenza6 . Per un periodo di tempo, questo produce una contrattura di flessione del ginocchio11. - Coprire l'area sia sulla e intorno la superficie che il KT1000 verranno messi su con pastiglie di protezione assorbente, resistente all'acqua. Indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali di protezione, mentre il completamento dell'esperimento.
- Usando un bisturi, dividere la pelle per esporre la piastra e viti (vedere la nota seguente passaggio 1.1); Inserire la vite più prossimale nel femore prossimale e la vite più distale nella tibia distale. Palpare per individuare le viti. Una volta che le teste delle viti sono accessibili, rimuovere la vite con un cacciavite.
Nota: Durante il periodo di immobilizzazione, le teste delle viti possono diventare coperta da tessuto molle. In questo caso, è possibile utilizzare il bisturi per rimuovere il tessuto delicatamente e scoprire le teste delle viti. - Una volta rimosse le viti, rimuovere la piastra manualmente o usando il forcipe da un kit di dissezione.
- Con delle forbici, pinze, deglove l'estremità inferiore per rimuovere la pelle da fascia sottostante.
2. animale posizionamento sul Kt1000 motorizzato
Nota: Tutti i test devono essere eseguiti a temperatura ambiente. Qui il arthrometer è alimentato da una V di 120 North American standard di input. L'output dell'adattatore è di 12 V e 500 mA.
- Posizionare l'animale da testare su un fianco con la gamba sperimentale (la gamba da testare) rivolto verso l'alto (Figura 2).
- Fissare il femore nella fascetta metallica scanalata che è integrato con la fase di montaggio dell'arthrometer. Perforare il muscolo con un cacciavite di precisione per posizionare la pinza distale per il grande trocantere e proteggere il femore. Regolare il condilo femorale laterale sopra il centro di rotazione del arthrometer (Figura 1, 2).
- Posizione il movable braccio con due montanti dietro la gamba, appena superiore al calcagno, per spingere il ginocchio in estensione passiva una volta il motore elettrico è attivato.
- Stringere il morsetto del femore alla sua base utilizzando una chiave a brugola fino a quando non è fissato.
- Assicurare la fotocamera è correttamente montata su KT1000 utilizzando un cacciavite ed è messa a fuoco Manuale. Mettere a fuoco la fotocamera sul condilo femorale.
- Selezionare l'impostazione di direzione su arthrometer (in senso orario o in senso antiorario) a seconda della direzione del ginocchio ROM in fase di test e la posizione del ratto.
- Attivare il motore KT1000 premendo contemporaneamente il pulsante di alimentazione e avviare .
Nota: La necessità di spingere il pulsante di alimentazione e avviare simultaneamente è una funzionalità di sicurezza del dispositivo, che impedisce l'attivazione accidentale.- Osservare che il motore KT1000 sarà spostare ad una velocità di 6,6 RPM e poi fermarsi per 2.1 s dopo aver raggiunto il primo valore di coppia.
- Nota: che quando viene raggiunta la prima coppia, il LED corrispondente si accende e la fotocamera digitale porterà automaticamente in una foto del ginocchio.
Nota: Una volta che viene scattata la foto, il arthrometer continuerà a quella successiva, maggiore coppia preimpostati. Una volta le quattro coppie sono state applicate, si fermerà il arthrometer. Una volta che il ratto è posizionato sul KT1000 e test viene avviato, il tempo totale per il test di un ginocchio è circa 18,8 volte s. possono variare leggermente a seconda della condizione della contrattura comune. Le immagini scattate sono utilizzate per misurare l'estensione a ogni coppia.
3. catturare l'angolo di estensione del ginocchio tramite il Arthrometer motorizzato
Nota: Una volta che il motore si è fermato a ogni coppia applicata una fotocamera digitale è attivata per scattare una foto. La telecamera è posizionata sul telaio tale che è direttamente sopra l'articolazione del ginocchio viene testato e messo a fuoco sul condilo femorale.
- Continuare il test con il ginocchio stesso dall'animale stesso, ma in una situazione diversa, ad esempio, dopo una miotomia dei muscoli transarticular posteriore viene eseguita per isolare il componente (non muscolosa) arthrogenic di una contrattura, o con un ginocchio da un altro animale.
- Quando il completamento della miotomia, sezionare il muscolo abbastanza prossimale al ginocchio congiunto per garantire che la capsula non è tagliata.
Nota: È più facile completare la miotomia quando la gamba è in estensione, dopo l'applicazione di impostazione 4 (17.53 N-cm) della coppia. Quindi, ripetere i passaggi 2.1 tramite 3.1.
- Quando il completamento della miotomia, sezionare il muscolo abbastanza prossimale al ginocchio congiunto per garantire che la capsula non è tagliata.
- Una volta che entrambe le gambe sono state testate in tutte le condizioni (ad esempio, prima e dopo miotomia), smaltire la carcassa di animale e tutti i materiali a rischio biologico seguendo il protocollo istituzionale e pulire il arthrometer.
4. analisi di misura ginocchio ROM
- Analizzare ROM usando ImageJ.
Nota: Qui versione 1.45 s è stata usata. - Aprire il file contenente l'immagine digitale scattata con la fotocamera montata sul arthrometer di ratto.
Nota: La persona che effettua l'analisi dovrebbe essere accecata al raggruppamento sperimentale dell'animale (ad es., immobilizzato contro controllo). - Selezionare lo strumento angolo dalla barra degli strumenti principale e tracciare l'angolo femorotibiale tracciando una linea femorale dalla metà del morsetto femore al condilo laterale (allineata con la diafisi femorale, Figura 2) e una linea tibia da laterale condilo femorale al malleolo laterale (Figura 2).
Nota: L'angolo femoro-tibiale corrisponde all'angolo massimo di estensione del ginocchio raggiunto a ogni coppia preimpostati. - Utilizzare lo strumento di misura facendo Analyze | Misura per mostrare l'angolo calcolato prodotto da 2 linee disegnate sopra. Utilizzare la convenzione di 0° per dire estensione completa.
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Representative Results
La quantità di estensione del ginocchio determinato per vari periodi di immobilità sono riassunti per aumentare le durate di immobilità e mostrare che le contratture più gravi sono state prodotte seguendo aumentante lunghezze di immobilizzazione. Risultati rappresentativi usando ImageJ sono mostrati nella Figura 3.
La capacità di misurare la massima estensione delle ginocchia di ratto in modo valido, preciso e riproducibile, utente-indipendente che riduce la distorsione nei dati. Nell'esempio fornito, abbiamo valutato l'estensione massima del ginocchio dopo 16 settimane di immobilizzazione per 7 ratti, confrontando l'arto immobilizzato (sperimentale) per l'arto controlaterale non immobilizzati. L'arto scelto per immobilizzazione alternati da un ratto al successivo (ad es., ratto 1 aveva il ginocchio destro immobilizzato, ratto 2 sinistra). L'investigatore gli angoli di misurazione è stato accecato a cui lato era immobilizzato durante le misurazioni. I risultati sono presentati nella Figura 3. Per il ginocchio immobilizzato, la possibilità per l'estensione massima è stata ridotta rispetto al controlaterale. Divisione dei muscoli transarticular Elimina il componente miogenico della contrattura della flessione. Dopo myotomy, ha aumentato la capacità di estensione massimale per il ginocchio controlaterale e sperimentale; Tuttavia, il ginocchio sperimentale ha continuato a dimostrare una contrattura della flessione (Figura 3).
Figura 1 : Ratto del ginocchio KT1000. (A) intera immagine rappresentativa di apparecchio (B) dell'animale all'interno di arthrometer (C) elettronica display e morsetti per arthrometer. (D) immagine ingrandita della visualizzazione elettronica. I numeri indicano le varie coppie di torsione applicato: coppia 1 = 2.53 N-cm, coppia 2 = 7,53 N-cm, coppia 3 = 12,53 N-cm, 4 = 17,53 N-cm. (E) immagine ingrandita della pinza femorale e tibiale apparato che spinge. Il morsetto femorale è fisso sul palco. Il braccio commovente tibial ha 2 montanti che fissano l'estremità più bassa distale e spostare il ginocchio in estensione. Punta di freccia e chevron indicano il morsetto del femore ed il braccio mobile, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Kt1000 ratto sperimentale per la valutazione e. Al ginocchio (A) estensione dell'arto posteriore è misurata utilizzando il tibia linea tracciata dal condilo femorale laterale malleolo laterale e la femorale linea tracciata dal condilo laterale per mezzo del morsetto femore. Punta di freccia e chevron indicano il morsetto del femore ed il braccio mobile, rispettivamente. (B) immagini di alto ingrandimento del condilo femorale e (C) ad alto ingrandimento del malleolo laterale.
Figura 3 : Ratto immobilizzato e controlaterale al ginocchio ampia libertà di movimento dopo immobilizzazione di 16 settimane. Per entrambe le ginocchia, dopo la prova di estensione del ginocchio con tutti articolare strutture intatte (n = 7), una miotomia dei muscoli trans-articolare è stato effettuato per determinare la limitazione arthrogenic ROM. dati sono presentati come medie gradi dall'estensione completa (utilizzando il convenzione 0 ° = estensione completa) con barre di errore che rappresenta la deviazione standard. * rappresenta p < 0.01 usando i campioni indipendenti T-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il ratto del ginocchio KT1000 è stato sviluppato per riproducibile e affidabile determinare l'estensione massima del ginocchio del ratto dopo un intervento. Vantaggi di questo dispositivo includono la generazione costante di coppia attraverso il giunto con una forza costante braccio di lunghezza ed estensione del ginocchio. Un altro vantaggio include la possibilità di impostare la coppia ad un livello che permette ripetuto test sul giunto stesso per valutare l'influenza delle diverse strutture articolari sul ginocchio ROM, quali muscoli, capsula o del legamento. Ad esempio, di seguito test del giunto completamente intatto, il transarticular posteriore ginocchio muscoli potrebbero essere diviso e KT1000 test ripetuti al fine di determinare il contributo di arthrogenic di estensione limitazione11.
Specifiche caratteristiche meccaniche del KT1000 che ottimizzano la precisione e l'accuratezza di misura includono il morsetto scanalato, che è stato progettato per impedire la rotazione del femore durante il test (Figura 1). I distali due montanti metallici coinvolgere la gamba posteriormente, spingendo il ginocchio in estensione in senso orario e ridurre al minimo il rischio di dislocazione posteriore della tibia sul femore durante il test (Figura 1). L'altezza dei pali e sporgenza anteriore del collegamento verticale superiore assicurano che la tibia non scivola fuori il post. La possibilità dei montanti per ruotare e mantenere la loro posizione sulla tibia appena prossimale al calcagno assicura coppia costante. Quattro coppie sono testati in sequenza: 2.53 N-cm, 7.53 N-cm, 12,53 N e 17.53 N-cm. Il più alto livello di coppia è stato determinato per essere la quantità di forza che ha portato al fallimento capsulare nei giunti di ginocchio normale del ratto (non operato) (cioè, estensione superando 0 °) dopo la divisione di tutti transarticular muscolare. La coppia più bassa è stato il punto di resistenza al moto angolare appena sopra gli importi misurabili sulle articolazioni di ginocchio normale del ratto. Le coppie di due metà dovevano essere circa a metà strada tra le coppie più alta e più bassa.
Altri metodi per la misurazione congiunta ROM specifiche coppie sono state descritti per entrambi ratto e altro animale modelli12,13,14,15,16. Alcuni dei vantaggi del nostro modello su questi altri sistemi includono un formato pratico che permette il posizionamento di benchtop del dispositivo senza la necessità di strutture speciali. Altri modelli possono anche richiedere la disarticolazione dell'arto in fase di studio mentre il modello qui presentato non. Meccanicamente, la via Arco del post riferisce la forza di estensione distale piedino, che segue la progressione angolare del ginocchio, mantenendo così un angolo costante di applicazione della forza. La tappa dell'artrometrico permette il posizionamento del ratto intero sullo strumento di misura, che permette la sperimentazione di tutti in situ strutture articolari che possono contribuire alla ROM perso senza violare anatomia congiunta. Mentre il protocollo di etica per il nostro laboratorio esclude test su animali vivi, questo sarebbe teoricamente possibile con analgesici appropriati e post-test sacrificare protocolli.
Il KT1000 presentano alcuni svantaggi. Il dispositivo è stato dimensionato per il ginocchio di ratto adulto per assicurarsi che il braccio mobile era una lunghezza affinché esso non sarebbe scivolare la gamba e la gamba non sarebbe scivolare il braccio. Più giovani ratti, o piccole e grandi specie beneficerebbero di componenti opportunamente dimensionati. Inoltre, una riprogrammazione dell'ottimale braccio di momento e forza (coppia) sarebbe stato necessario. Se, ad esempio è stato utilizzato un animale più grande o più piccolo, può essere necessario regolare la lunghezza del braccio di momento e/o la quantità di forza applicata per raggiungere la coppia ottimale. Altre parti dell'arthrometer potrebbero anche bisogno di essere ridimensionata, in base alle dimensioni dell'animale. Mentre i movimenti del KT1000 sono utente-indipendente, comune misura usando ImageJ può essere soggetta a errore umano. Tuttavia abbiamo trovato che, utilizzando i metodi presentati qui, esiste alta intra-rater e affidabilità inter-rater con coefficienti di correlazione intraclasse di 0,987 e 0.903, rispettivamente. Perché la coppia più alta spesso danneggia le strutture articolari durante i test, un'affidabilità inter-rater valida per il collocamento degli animali e l'attivazione del arthrometer è difficile da determinare. Per evitare errori di misura che potrebbero essere associato con avere più di un investigatore eseguire questa parte del protocollo, si consiglia di avere il ricercatore stesso proteggere i ratti per il arthrometer per tutta la durata di uno studio, in modo che ogni pregiudizio è coerenza tra sperimentale e controllare le ginocchia. Poiché i tendini del ginocchio oltrepassare il ginocchio e l'anca, retroversione del bacino può verificarsi durante i test a coppie 1 e 2 prima della miotomia. Questo può contribuire all'aumento in estensione del ginocchio per entrambi sperimentale e controllo sulle ginocchia a queste coppie. Infine, i risultati possono variare da vero e proprio nel vivo ROM come il protocollo è stato sviluppato per testare eutanasizzati piuttosto che animali vivi.
Mentre abbiamo descritto l'utilizzo di un dispositivo per valutare gli effetti dell'immobilità sull'articolazione del ginocchio di ratto, altre condizioni che influenzano la ROM congiunta anche potrebbero essere studiati. Ci sono numerosi esempi, alcuni dei quali includono gli effetti del trauma, aumento del tono muscolare secondaria all'insulto del sistema nervoso centrale, o modificazioni genetiche relative alla malattia neuromuscolare. Rispettivi interventi come applicazione di cellule staminali per l'articolazione del ginocchio, blocco di giunzione neuromuscolare o trattamenti di terapia genica che aiutano a scoprire nuove possibilità di trattamento potrebbero essere valutati anche utilizzando il dispositivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno informazioni integrative o conflitti di interesse di dichiarare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Joao Tomas per la sua assistenza tecnica con il dispositivo e Khaoula Louati per assistenza nello sviluppo di metodi di analisi di immagine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arthrometer | The Ottawa Hospital Rehabilitation Centre - Rehabilitation Engineering | N/A | |
| Camera | Canon | EOS-500D | Commonly known as EOS Rebel T1i |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.45s | |
| Absotbent Underpads | VWR | 820202-845 | |
| Dissection Kit | Fisher | 08-855 | Kit Includes: Forceps: medium points, nickel-plated Scissors: 1.5 in. (40 mm) blades, stainless steel Dissecting knife handle: nickel-plated Knife blades: stainless steel, pack of 3 Dropping pipet: glass Bent dissecting needle: stainless steel with plastic handle Straight dissecting needle: stainless steel with plastic handle Vinylite Ruler 6 in. (15 cm) |
| Precision Screw Driver | Mastercraft | 057-3505-8 | |
| Scalpel Blades - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Screwdriver | Stanley | 057-3558-2 | |
| Hex Keys | Mastercraft | 058-9684-2 | |
| Universal AC to DC powder adapter | RCA | 108004951 |
References
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