Summary
Segnaliamo i metodi per la caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in necroptosis compreso formazione immagine convenzionale e confocale microscopia di cellule vive, microscopia elettronica, e associazione basata su NMR del lipido.
Abstract
Necroptosis è una via di morte programmata delle cellule innescata dall'attivazione del recettore interacting protein chinasi 3 (RIPK3), che fosforila e attiva la pseudochinasi dominio chinasi-come stirpe misto, MLKL, rottura o permeabilize la membrana plasmatica . Necroptosis è un percorso infiammatorio associato con patologie multiple, tra cui il cancro, le malattie infettive e cardiovascolari, ictus, neurodegenerazione e autoimmunità. Qui, descriviamo i protocolli che possono essere utilizzati per caratterizzare il MLKL come il boia di rottura della membrana del plasma in necroptosis. Visualizziamo il processo di necroptosis in cellule usando la formazione immagine della vivere-cella con microscopia di fluorescenza confocale e convenzionale e in cellule fissate mediante microscopia elettronica, che insieme hanno rivelato la ridistribuzione dei MLKL dal cytosol al plasma membrana prima di induzione di grandi fori nella membrana plasmatica. Vi presentiamo in vitro analisi di risonanza magnetica nucleare (NMR) utilizzando i lipidi per identificare putativi modulatori di necroptosis MLKL-mediata. Basato su questo metodo, abbiamo identificato quantitativa del lipido-associazione preferenze e fosfatidil-inositolo fosfato (PIPs) come leganti critici di MLKL che sono necessari per il targeting di membrana plasmatica e permeabilizzazione in necroptosis.
Introduction
Identificazione dei componenti genetiche di necroptosis ha facilitato l'uso di modelli animali per testare l'implicazione di necroptosis in fisiologia e malattia1,2,3,4,5. Ko di RIPK3 o MLKL in topi aveva minima implicazione nell'omeostasi sviluppo e adulto, suggerendo che necroptosis non è essenziale per vita3,6. Inoltre, alcune specie non contengono geni o RIPK3 o MLKL, sostenere il ruolo non essenziali di necroptosis in animali7,8. D'altra parte, impegnativo modelli animali knockout con varie patologie indotte in laboratorio ha rivelato un importante ruolo di necroptosis nell'infiammazione, immunità innata e l'infezione virale9,10, 11 , 12.
Necroptosis può essere attivato in diversi modi di segnalazione attraverso sensori differenti immunità innata, tutti che provocano l'attivazione di RIPK31,13,14. RIPK3 attivo a sua volta fosforila e attiva MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Il più studiato e forse il modo più complesso, che portano all'attivazione di RIPK3 coinvolge morte recettore legatura, che si biforca sulla base della composizione a valle dei complessi segnalazione sia indurre apoptosi o necroptosis1. Necroptosis consegue quando segnalazione attraverso RIPK1 è favorita e si traduce in impegno di RIPK319,20. Questo risultato è facilmente favorito su inibizione farmacologica o delezione genetica della caspasi 8, un inibitore endogeno putativo di necroptosis che tiene a bada il necroptosis. RIPK1 lega a ed attiva RIPK3. Un altro modo per attivare necroptosis è attraverso recettori Toll-like TLR3/TLR4 segnalazione, che coinvolge e attiva il RIPK3 TIR-dominio-contenente adattatore-induzione dell'interferone-β (TRIF)21. Un altro modo per morire di necroptosis è di attivazione del sensore del DNA DAI, che direttamente si impegna e si attiva RIPK322.
MLKL è una proteina citosolica composta da un N-terminale dell'elica bundle (NB) e un dominio di pseudochinasi C-terminale (psKD) collegati da una parentesi graffa regolamentazione regione3. In cellule normali, MLKL si trova nel citosol dove si pensa di essere in un complesso inattivo con RIPK314. Attivazione di necroptosis innesca fosforilazione di RIPK3 di MLKL nel ciclo di attivazione della psKD e potenzialmente altri siti nel NB e parentesi graffa3,15,23. La fosforilazione induce un cambio conformazionale in MLKL che si traduce in dissociazione dal RIPK314. Capito male cambiamenti conformazionali rilasciare il tutore dal psKD24. L'ortesi, che contiene 2 eliche, media oligomerizzazione di MLKL in un trimero putativo attraverso il C-terminale dell'elica25. L'elica del N-terminale della ginocchiera inibisce il dominio NB, che è essenziale per la permeabilizzazione della membrana24,26. In isolamento, NB dominio è sufficiente per indurre la permeabilizzazione della membrana del plasma e necroptosis16,24,27. L'attività di pro-necroptotic NB è stato ricostituito in fibroblasti embrionali del mouse carenti in MLKL (mlkl- / - MEFs). NB è un dominio di legame del lipido che coinvolge preferenzialmente il difosfato di fosfatidilinositolo 4,5 del fosfolipide (PIP2). Abbiamo proposto un meccanismo graduale dell'attivazione di MLKL, in cui parentesi graffa oligomerizzazione facilita il reclutamento di MLKL alla membrana del plasma tramite interazioni deboli di NB con il gruppo di testa polare di2 PIP24. La membrana, il NB subisce regolamentato l'esposizione di un sito di associazione aggiuntive di alto-affinità per PIP2, che è mascherato dal tutore in MLKL inattivo. Nel complesso, le interazioni multiple di NB con PIP2 destabilizzano la membrana plasmatica che porta alla sua rottura, anche se il meccanismo molecolare di questi eventi non sono stati delucidati.
Qui illustriamo metodi specifici utilizzati per caratterizzare la funzione di MLKL come boia di necroptosis24. In particolare, ci concentriamo sul dominio più minimo del MLKL, NB e brace (NBB), che è regolata tramite inibizione di parentesi graffa e può essere attivato attraverso la dimerizzazione forzata per indurre la necroptosis e la rottura della membrana del plasma. Descriviamo il nostro sistema di espressione inducibile combinato con forzata dimerizzazione di FKBP-mediata indotta dai farmaci per l'imaging di cellule vive e la microscopia elettronica delle cellule che subiscono necroptosis. Inoltre, vi illustriamo la nostra analisi in vitro NMR delle interazioni della NBB con phosphatidylinositols (PIPs).
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Protocol
1. clonazione e cella linea generazione
- PCR amplificano la regione NBB, corrispondono ai residui dell'amminoacido 1-140 (NBB140), da cDNA umano MLKL per telaio standard basati su enzimi di limitazione clonazione con la proteina legante di oligomerizzazione dominio 2 x FK506 (2xFKBP o 2xFV) e Venus fluorescente proteine nella doxiciclina (Dox) - vettore retrovirale inducibile pRetroX-TRE3G per ottenere NBB140- 2xFV-Venus (tabella 1, figure 1A-B).
- Immortalare primario mlkl- / - o ripk3- / - mlkl- / - fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) ottenuti dai rispettivi topi disponibili in laboratorio verde di trasfezione transiente con antigene SV40-grande esprimendo il plasmide. Selezionare cellule immortalate in ~ 1 – 2 settimane e mantenere in DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, 100 U/mL di penicillina e streptomicina, piruvato di sodio di 1 mM e aminoacidi non essenziali a 37 ° C e 5% di CO2 in tessuto standard incubatori di cultura.
- Trasducono SV40-immortalato mlkl- / - MEFs con il transactivator di tetraciclina inversa controllata (rtTA)-contenente retrovirus espressa da un plasmide contenente il gene di resistenza Consciousness (nostro plasmide modificato) e trattare per 1 settimana con 5 μg/mL Consciousness per selezionare per le cellule che esprimono rtTA28.
- Trasducono i MEFs rtTA-esprimendo con il vettore retrovirale Dox-inducible contenente il chimerico MLKL (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro) e selezionare utilizzando 4 con puromicina μg/mL per una settimana, 2 giorni dopo la trasduzione.
2. vivere-cella microscopia Imaging di Necroptosis MLKL-mediata
- Piastra mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus ad una densità di 50.000 cellule per pozzetto (1 mL/pozzetto) in 24 piastre ed incubare durante la notte (Figura 2A). Utilizzare cellule vive che macchia per conta cellulare automatizzata (Vedi Tabella materiali).
- Curare le cellule per 12 h con Dox (0,5 μg/mL) per indurre l'espressione di NBB140-2xFV-Venus.
- Indurre il necroptosis con dimerizer di 25 nM FKBP (Dim) oltre 25 fluorescente verde membrana impermeabile di nM tingere (Vedi Tabella materiali) in DMEM standard (Vedi 1.2). Cellule che subiscono necroptosis si accumulano il colorante come l'integrità della membrana plasmatica è compromessa da NBB140-mediata di rottura. Effettuare saggi in triplice o quadruplice copia.
- Per monitorare necroptosis utilizzando sistemi di imaging single - o dual-color (Vedi Tabella materiali), posizionare i vasi nella rispettiva unità imaging ospitato in un'incubatrice di coltura di tessuti dei mammiferi.
- Aprire il software (Vedi Tabella materiali) e selezionare la scheda pianificazione prossime analizza sotto l'elenco delle attività.
Nota: questo protocollo è per l'imaging utilizzando sistemi di colore unico, ma un software simile è disponibile per i sistemi dual-color. - Nella scheda Proprietà, selezionare il cassetto", nave, tipi di scansione" e il "modello di scansione" nella scheda "Layout fisico" e "Fast fluorescenza".
- Aggiungere "Scan Time" cliccando sulla finestra "Temporale" e il numero totale di punti di tempo e frequenza di acquisizione (in genere 1 acquisizione ogni 0,5 h-1 h per 6 h alle 12h, o ogni 5 min per fast-cinetica necroptosis) e avviare l'acquisizione di immagini selezionando "App ly"(pulsante rosso).
- Quantificare la necroptosis utilizzando il software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali) selezionando "Riquadro attività", "Oggetto Counting nuova analisi con soglia di segmentazione fissa sopra il livello di sfondo", che può essere determinato facendo passare il cursore del mouse sulle regioni di sfondo in diverse immagini utilizzate nell'analisi.
- Esaminare oggetti fluorescenti selezionando anteprima utilizzando l'immagine corrente e perfezionare i livelli di soglia come necessario.
- Integrare i conteggi di fluorescenza verde aprendo la scheda "Launch New Analysis", scegliere il "intervallo di tempo", selezionare i pozzetti per essere analizzati, inserire il "nome di processo di analisi" e premere "OK".
- Accesso ha analizzato i dati dalla scheda "Analisi processi" facendo doppio clic sul nome del rispettivo lavoro ed esportazione dalla finestra grafico/esportazione per ulteriore analisi in esterno grafica software (Vedi Tabella materiali).
- Quantificare i dati come fluorescenza verde positivo (+ ve) conteggi/mm2 o normalizzare i conteggi di confluenza ed esprimere i dati come fluorescenza verde + ve conteggi/confluenza.
- Facoltativamente, l'endpoint sperimentale, macchia cellule con 100 nM della membrana-permeante verde fluorescente tingere (Vedi Tabella materiali). Normalizzare i dati alle celle necroptotic % come il rapporto della fluorescenza fluorescenza verde/verde all'endpoint.
3. vivere-cella microscopia confocale Imaging di reclutamento della membrana plasmatica e permeabilizzazione di MLKL
- Piastra mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus ad una densità di 20.000 cellule per pozzetto (0,5 mL/pozzetto) in un bicchiere basso camera 4 pozzetti microscopia pretrattato con 50 µ g/mL in PBS a 37 ° C per 30 min e incubare per ~ 12 h ( Figura 2B).
- Trattare le cellule con Dox (0,5 μg/mL) per ~ 12 h di indurre l'espressione di NBB140-2xFV-Venus.
- Indurre necroptosis incubando con medium fresco (1 mL/pozzetto) contenente 25 nM Dim per indurre NBB140-2xFV-attivazione di Venus e traslocazione alla membrana plasmatica.
- Posizionare la camera su un microscopio confocale, costruito su un supporto invertito dotata di controllo ambientale e un 63 di scansione laser di filatura disco 1,4 obiettivo NA e cominciare imaging acquisizione utilizzando software di scelta (Vedi Tabella materiali).
- Inizializzare il software, selezionare l'icona "Focus" e configurazione del filtro di YFP (eccitazione lunghezza d'onda 515 nm).
- Individuare il campo di vista e il piano focale e coinvolgere il sistema di manutenzione di messa a fuoco utilizzando la scheda "Precisa messa a fuoco".
- Per iniziare l'acquisizione, selezionare la scheda di "Acquisizione" seguita da assegnazione di configurazione del filtro, appropriato EMCCD fotocamera esposizione tempo e intensificazione guadagno e parametri di acquisizione Time-lapse compreso intervallo e la lunghezza di acquisizione.
- Monitorare cellulare ridistribuzione del fluorescente NBB140-2xFV-proteina Venus durante necroptosis con l'acquisizione di immagini ogni 10 s di una macchina fotografica EMCCD utilizzando un laser di 515 nm (1 film).
Nota: Photobleaching è una preoccupazione con formazione immagine di proteina fluorescente. Venere è una delle proteine fluorescenti più resistente a photobleaching29. Se vengono utilizzate le proteine fluorescenti che sono più suscettibili di photobleaching, immagine ogni 30 s o più tempo per consentire il ripristino del segnale tra imaging tempo punti. - Per monitorare la membrana plasmatica associazione di NBB140-2xFV-Venus durante necroptosis, immagine ogni 10 s il campione preparato in 3.3 di fluorescenza di riflessione interna totale microscopia (TIRF) utilizzando un microscopio equipaggiato con un cursore TIRF automatizzato e un 100 x 1.4 NA obiettivo e una telecamera EMCCD (2 film). Seguire i passaggi 3,5 – 3,7, ma regolare l'angolo TIRF all'interno della scheda di messa a fuoco TIRF secondo campione e basso spessore di vetro della camera di microscopia.
Nota: i marcatori di membrana plasmatica come LCK-C-RFP possono essere utilizzati come controlli per la localizzazione di membrana plasmatica in analisi TIRF. - Eseguire l'elaborazione delle immagini per migliorare la qualità di convoluzione con il negativo normalizzato secondo derivato di una funzione gaussiana (algoritmo di Marr).
4. microscopia elettronica
- Piastra mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus ad una densità di 5 milioni di cellule in un 150 mm rivestite con plasma cell piastra di coltura e incubare per 12 h (Figura 3).
- Trattare le cellule con doxiciclina (0,5 μg/mL) per indurre l'espressione di NB1-140-2xFV-Venus per 12 h.
- Indurre NBB140-2xFV-attivazione di Venus e traslocazione alla membrana plasmatica con 25 nM di homodimerizer per 5 min. Questa volta è stabilito dalla cinetica di necroptosis osservato nell'imaging di cellule vive.
- Rimuovere il supporto e fissare le cellule con 10 mL di soluzione 2,5% glutaraldeide, paraformaldeide di 2% in tampone 0,1 M a pH 7.4 sodio cacodilato (tampone cacodilato) preriscaldato a 37 ° C.
- Raccogliere il campione da raschiare e girare i campioni per 10 min a 500 x g. Scartare il surnatante.
- Postfix il campione per 1,5 h in tetrossido di osmio ridotto 2% con ferrocianuro di potassio 1,5% in tampone cacodilato di sodio 0.1 M. Tetrossido di osmio è un agente colorante ampiamente utilizzato in TEM per fornire contrasto. Abbiamo usato TEM come analisi preliminare prima del SEM di cella in fase di necroptosis.
- Sciacquare il campione 5 volte in acqua ultrapura per 5 minuti ciascuno a 500 x g, seguito da risciacqui nel buffer (vedere 4.6), acqua ed etanolo su un elaboratore automatico. Scartare il surnatante.
- Per SEM, macchia i campioni precedentemente fissati con 1% uranile acetato e piombo aspartato macchia metalli pesanti31.
- Disidratare i campioni attraverso una serie graduata di alcool e propilene ossido soluzioni.
- Incorporare il campione in resina dura32 per ottenere un blocco di resina.
- Tagliare sezioni spesse di 0,5 μm per determinare la corretta area di analisi.
- Rivestire i campioni con un film ultra-sottile di metallo elettricamente conduttori (Iridium).
- Immagine e analizzare i campioni (Figura 3). Per la quantificazione, viene analizzata una basso ingrandimento immagine della superficie del blocco di resina con cellule esposte a 5 keV utilizzando un microscopio elettronico.
- Visualizzare le cellule attraverso singole immagini catturate da SEM o software di imaging può essere utilizzata per unire più campi di vista in una sola immagine contigua30. Circa 100 cellule possono essere utilizzate per valutare la frazione di cellule in fase di necroptosis in questo modo generando un montaggio ad alta risoluzione nel software di scelta (Vedi Tabella materiali).
Nota: Segnando necrotico morfologia di SEM Confronta caratteristiche della cellula normale con la progressione dei fenotipi pre-necrotici o necrotici. Queste funzionalità includono alterazioni della membrana del plasma tra cui scomparsa microvilli, appiattimento, rotture nelle cellule che vanno da 10 nm a 1 µm in dimensione, o perdita di struttura organello attraverso almeno 30 – 40% della superficie citosolica delle cellule.
5. lipid Binding di MLKL dalla spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)
- Preparare 15N-labeled NBB1-156 di espressione della proteina standard e purificazione come descritto in precedenza24.
- Sciogliere 500 µ g di sale di ammonio 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (18:0 PI) e sale di ammonio di 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (18:1 PI) in 500 µ l di gelida CHCl3 ciascuno per concentrazioni finali di 1 mg/mL.
- Sottoporre ad ultrasuoni 1 mg/mL 18:0 e PI 18:1 in un bagno di acqua di sonicazione per 1 min a temperatura ambiente o fino a 5 min in una miscela di acqua e ghiaccio.
-
Aliquotare 1 mg/mL 18:0 e PI 18:1 in fiale di vetro pulito per singole serie di titolazione di NMR (Figura 4). Trasferimento dei lipidi in solventi organici utilizzando siringhe in vetro ermetico.
- Aliquotare 132 µ l di 1 mg/mL 18:1 PI (massa molare = 880.137 g/mol) in CHCl3 per un volume finale di risospensione di 1.200 µ l a concentrazione di 125 µM.
Nota: Per tubi 5mm NMR, preparare volumi di diluizione seriale di > 1.000 µ l e NMR finale esempio volumi di > 500 µ l. Per tubi da 3 mm NMR, preparare volumi di diluizione seriale di > 300 µ l e NMR finale esempio volumi di > 150 µ l.
- Aliquotare 132 µ l di 1 mg/mL 18:1 PI (massa molare = 880.137 g/mol) in CHCl3 per un volume finale di risospensione di 1.200 µ l a concentrazione di 125 µM.
- Aliquotare 1 mg/mL porcine cervello L-α-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato sale di ammonio in 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (cervello PI (4,5) P2) in fiale di vetro pulito.
- Posizionare fiale sotto un flusso gassoso di argon (Ar) o di azoto (N2) con flusso moderato per far evaporare il solvente organico senza schizzi contro le pareti del flaconcino di vetro. Cinque a trenta min è in genere sufficiente per volumi di solvente organico di 10-200 µ l.
- Organizzare o i flaconcini di vetro in fondo di un Büchner o beuta da vuoto con grande pinzette, sigillare con un tappo di gomma e collegare il tubo di plastica collegato a una linea di vuoto. Evacuare il pallone sotto vuoto mite durante la notte per rimuovere sostanze organiche residue.
- Sovrapporre le aliquote di pellicola lipidica con gas inerte, sigillare con un coperchio a chiusura ermetica e conservare a-20 ° C per l'uso entro un mese o a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.
- Preparare il buffer del campione NMR senza detersivo (-Det) contenente 20 mMxH NayPO4 a pH 6.8, 10% D2O e con detergente (+ Det) contenente 20 mMxH NayPO4 a pH 6.8, 10% D2O, 0,34 mM n-dodecil-β-D-maltopyranoside (DDM).
- Aggiungere + Det buffer per flaconcino di vetro con film lipidico per ottenere la concentrazione desiderata e Sonicare a bagnomaria per fino a 30 min, alternati sonicazione per 10 min seguita da ispezione visiva.
Nota: Sonicazione può riscaldare il campione. Lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per 15 min prima della ricostituzione del campione finale di proteine. - Effettuare diluizioni seriali di micelle lipidiche-detergente in + Det buffer mediante sonicazione di miscele 1:1 per la serie di concentrazione desiderata. A partire da concentrazione di lipidi 125 µM, tre ripetizioni produrrà 62,5 µM, 31,3 µM e dei lipidi in 0,34 mM DDM 15,6-µM.
- Controllo di preparare e fare riferimento a campioni di NMR di proteine e additivi in - Det e + buffer Det, rispettivamente. Aggiungi proteine e additivi per ogni diluizione del lipido in + buffer di Det.
Nota: Per 15NBB N156, proteina è aggiunto ad una concentrazione finale di 40 µM e completata con 2mm deuterated dithiothreitol per mantenere residui di Cys ridotti. - Trasferire il volume appropriato di campioni a 5 mm o 3 mm tubi NMR (vedere nota punto 5.4).
- Caricare i campioni in strumento NMR o organizzare in una piattaforma di automazione come il caricatore di SampleCase manualmente.
- Acquisire spettri NMR compositi utilizzando programmi di impulsi standard per spettri di 1H protone come controllo di qualità, seguita da 2D 1H -15N spettri di correlazione sia come spettroscopia di rilassamento trasversale ottimizzato (TROSY) o eteronucleari multiple quantum coerenza (SOFAST-HMQC)33.
Nota: L'utilizzo di tubi da 3 mm NMR richiede 64 scansioni per 1 H -15TROSY N (~ 3 h) o 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Scansione di numeri sono dimezzati per i tubi NMR di 5 mm. - Elaborati 2D spettri RMN possono essere aggiunto a una CARA repository34 per analisi o altri software di scelta per l'utente.
-
Analisi software annotando 2D risonanze NMR per tre cime ben dispersi e risolti per ciascuno stato di proteina. Registrare le ampiezze di picco per ognuno dei sei picchi per ogni condizione di buffer contenente NBB156 (Figura 5A).
- Utilizzare CARA per preparare un elenco di batch-integrazione (intestazione fare clic sul Menu principale "spettro | Impostazione elenco Batch"...) di tutti gli spettri raccolti e analizzare utilizzando un file di assegnazione singolo picco (intestazione fare clic sul Menu principale "picchi | Importare Peaklist"... e scegliere un file definito dall'utente .peaks con 6 punte totale, 3 per ogni stato di proteina, definita all'interno).
- Regolare le impostazioni ("Integrator | Sintonia modello Peak"...) di larghezza X 0,06 ppm e Y-larghezza 0,30 ppm (intestazione fare clic sul Menu principale "Integrator | Sintonia modello Peak"...) prima di registrare l'output finale in due selezioni di menu (1. Fare clic sull'intestazione di Menu principale "Integrator | Integrare l'elenco Batch") (2. Fare clic sull'intestazione di Menu principale "picchi | Esporta tabella di integrazione") (Figura 5B).
Nota: Le risonanze di ammide di spina dorsale per residui M21, V53 e L105 sono state assegnate per lo stato di chiuso-brace156 NBB. Lo stato di parentesi graffa di apertura è stato assegnato risonanze di ammide di spina dorsale dei residui G130 e A141 e la risonanza di lato-catena protone epsilon di W133 utilizzando 3D di esperimenti NMR24.
- Normalizzare i campioni per confronto diretto da diversi magneti o condizioni campione in media le tre ampiezze di parentesi graffa di apertura dei campioni di riferimento e calcolando un fattore di normalizzazione relative i due riferimenti. Calcolare le ampiezze in scala per risonanze156 NBB utilizzando il fattore di normalizzazione e ampiezze negativo impostazione a zero (tabella 2).
Esempi: 1) confrontando campioni da diversi magneti: magnete una e magnete B, DDM, NBB156+ DDM, NBB156. 2) detergente confronto: 0,34 mM DDM e 1,7 mM DDM. - Calcolare per ogni risonanza la frazione in scala della chiuso-aperto-gancio o dividendo con l'intervallo di ampiezza minima al massimo di tutti gli spettri raccolti contenenti riferimenti appropriati di libero NBB156 e completamente open-brace NBB156 a detergente.
- Tracciare le ampiezze di NMR normalizzate in funzione della concentrazione dei lipidi e confrontare la frazione di Apri-brace NBB156 in condizioni diverse (fig. 5C).
Nota: In alternativa, analisi della frazione di conformazione di parentesi graffa chiusa contro la concentrazione dei lipidi possono essere eseguita per confrontare associazione del lipido a NBB156. Noi preferiamo l'analisi precedente perché è più veloce e migliore rapporti sulla frazione completamente-impegnati dai lipidi.
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Representative Results
Visualizzare l'esecuzione di necroptosis regolamentati in cellule vive è stato possibile attraverso l'espressione inducibile di un costrutto MLKL troncato minimal, NBB140-2xFV-Venus. Questo costrutto mantiene la capacità di indurre la permeabilizzazione della membrana del plasma e viene attivato tramite oligomerizzazione Dim-indotta della cassetta FKBP (2xFV). Osserviamo e quantificare necroptosis da microscopia di cellule vive di imaging, monitoraggio cineticamente (ogni 5 min) l'assorbimento di una tintura di legante in cella fluorescenza verde impermeabile del DNA (Figura 6A). Questo sistema inducibile è molto robusto e completo necroptosis di mlkl- / - MEFs può essere osservato all'interno ~ 1 h all'oligomerizzazione Dim-mediata delle cellule preincubato Dox che esprimono NBB140-2xFV-Venus (Figura 1A ). Ci riferiamo a queste condizioni come fast-cinetica necroptosis. Espressione di Venus solo ± Dim o NBB140-2xFV-necroptosis (Figura 6A) non ha indotto la Venus in assenza di Dim. Eseguiamo solitamente almeno 3 replicati esperimenti imaging in triplice o quadruplice copia in 24, 96 o piastre da 384 pozzetti.
La necroptosis veloce-cinetica indotta dalla forzata dimerizzazione di NBB140-2xFV-Venus (Figura 6A) sostiene il ruolo di MLKL come il presunto boia di rottura della membrana del plasma. Per visualizzare la ridistribuzione di NBB140-2xFV-Venus alla membrana del plasma durante necroptosis, microscopia confocale vivere-cella viene utilizzato per monitorare la fluorescenza di Venus. Durante necroptosis fast-cinetica, entro 2 – 3 min di incubazione con Dim, Venus si osserva un rivestimento della periferia cellulare, seguita da cella graduale arrotondamento (1 film). NBB140-2xFV-accumulazione Venus alla membrana del plasma è visualizzata mediante microscopia confocale TIRF, che si concentra sul volume di cella all'interfaccia membrana-vetro citosol-plasma. Associata di membrana del plasma puncta Venus sono visibili entro 1 – 2 min di incubazione con Dim (2 film). Così, applicate oligomerizzazione di NBB140-2xFV-Venus induce la sua rapida ridistribuzione alla membrana plasmatica.
Microscopia elettronica (SEM) è un potente strumento per rivelare i cambiamenti morfologici in cellule che subiscono necroptosis. Sotto necroptosis veloce indotta dall'oligomerizzazione di NBB140-2xFV-Venus, cellule morfologia cambia da normale forme allungate (tempo 0 min) a arrotondato e si gonfiò (5 min) a parzialmente rotto (10 min) e ampiamente smantellato dove il citosol ha Vanished (20 min) (Figura 6B). SEM integra le precedenti osservazioni da microscopia di cellule vive che correlano la localizzazione MLKL alla membrana plasmatica con rottura della membrana. Nel complesso le tecniche di microscopia presentate qui offrono mezzi complementari per monitorare, valutare e quantificare la necroptosis a livello cellulare, implicano NBB140-2xFV-Venus nell'esecuzione di rottura della membrana del plasma.
Per determinare se MLKL può contattare direttamente la membrana plasmatica eseguiamo in vitro l'esperimenti di binding di lipido monitorato tramite spettroscopia NMR utilizzando ricombinante NBB156. Diluizioni seriali del lipido-detergente micelle, utilizzando una concentrazione costante di detersivo (veicolo per la presentazione dei lipidi) e le concentrazioni nel lipido variabile, sono testati per l'associazione a 15N-labeled NBB156 tramite spettroscopia NMR 2D, che monitor associazione-indotto alterazioni della proteina. NBB156 subisce grandi cambiamenti strutturali all'associazione a spostare la regione di parentesi graffa inibitorio (aminoacidi 132-156) dalla posizione chiusa ed elicoidali del lipido (chiusa parentesi graffa) alla conformazione aperta e intrinsecamente disordinato (parentesi graffa aperta) (Figura 7 A). La spettroscopia NMR bidimensionale fornisce informazioni di residui sulle miscele di entrambi conformeri (Figure 7B-7C). Abbiamo precedentemente assegnato gli ammidi di spina dorsale degli entrambi conformeri24. Possiamo facilmente monitorare le percentuali di conformeri aperti e chiusi in un dato campione come descritto nelle figure 5A-C. Usando questa analisi di associazione, esploriamo associazione156 NBB a PIPs in detergente DDM, che è inerte a NBB156 vincolanti (Figura 5B). In questo saggio, PIP2 è il miglior ligando NBB156 , che induce l'apertura completa della ginocchiera inibitoria a 125 µM (Figura 5C). Al contrario, saturi (18:0) PI e insaturi (18:1) PI sono poveri ligandi di156 NBB inducendo parziale parentesi graffa di apertura alle stesse condizioni (Figura 5C). Nostra analisi obbligatoria del lipido basata su NMR forniscono elementi di prova per l'interazione di MLKL NBB156 con fosfolipidi e suggeriscono un collegamento diretto fra MLKL e la membrana plasmatica.
Figura 1: Stabile linea cellulare che harboring un Tet-On 3 G viscoelastica sistema modificato. Linee cellulari stabilizzate (A) sono state generate da trasduzione retrovirale di/mlkl- / - MEFs con il pTREX-rtTA-esplosione seguita dal pRetroX-TRE3G-NBB140-2xFV-Venus-puro. Ogni trasduzione è stata seguita da selezione antibiotica per fino a 1 settimana prima di passare alla successive analisi. (B) rappresentazione schematica del sistema di espressione inducibile MLKL. Questo sistema si basa su 2 passaggi normativi droga-inducibile: espressione genica i) MLKL e produzione di proteine (+ Dox) e ii) l'attivazione di oligomerizzazione (+ Dim). Quando la produzione della proteina è indotta in anticipo, + Dox, necroptosis fast-cinetica può essere innescato, + Dim. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Imaging di cellule vive di fast-cinetica necroptosis rivela rilocalizzazione di membrana rapida di MLKL. (A) Fast-cinetica necroptosis indotta come in Figura 1B può essere monitorato in un sistema di imaging. Necroptosis è segnato dall'assorbimento della tintura fluorescente verde cellulare impermeabile. (B) rappresentazione schematica dell'imaging di cellule vive di fast-cinetica necroptosis con epifluorescenza e totale analisi di microscopia di fluorescenza (TIRF) riflessione interna. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Rappresentazione schematica della scansione analisi e preparazione del campione di microscopia elettronica (SEM). Cellule da necroptosis veloce-cinetica indotta come descritto nella Figura 1 sono fissate sulla piastra in diversi momenti dopo l'aggiunta di Dim. Le cellule sono quindi preparate per analisi SEM di raschiatura e pool, macchiatura di metalli pesanti, l'incorporamento di resina e rivestimento iridium come descritto nella sezione 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Raccolta di dati e preparazione per titolazioni di NMR di micelle di156 e lipido-detergente NBB N 15campioni. Questo test e analisi viene in genere eseguita in 3 – 4 giorni: durante il giorno 1, aliquote del lipido sono dispensate e secchi durante la notte. Durante il giorno 2, il film lipidico vengono reidratati in dosaggio buffer ± detersivi, sonicati e diluito serialmente (duplice) mescolando volumi uguali della soluzione lipidica reidratato con soluzione tampone privo di lipidi. Ogni diluizione è sonicato per garantire omogeneità e distribuzione dei lipidi in micelle detersivi prima di successive diluizioni. Campioni della proteina sono mescolati nelle diluizioni seriali del lipido-detergente micellare, caricati nei tubi NMR appropriati, collocati in un caricatore di SampleCase (o caricati manualmente) e raccolta automatica di dati NMR è iniziato. Durante i giorni successivi, raccolta dati NMR è completato e seguita da analisi NMR 2D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Preferenze del lipido-associazione di NBB156 misurata mediante NMR 2D. (A) sovrapposto 1H -15spettri TROSY N per 15N-NBB156 in presenza (rosso) o assenza (blu) di 125 µM PI (4,5) P2 a 0,34 mM DDM visualizzati in CARA. (B) unidimensionale fette di risonanze utilizzate per misure di ampiezza e di normalizzazione. Lo spettro grezzo (verde) è overlaid con il limite per ampiezza e integrazione dal programma CARA. (C) normalizzato ampiezze di NBB156 in presenza di micelle di phosphoinositide-DDM tramato contro la concentrazione dei lipidi. PIP2 induce l'apertura completa della ginocchiera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Necroptosis fast-cinetica indotta dall'oligomerizzazione di NBB140-2xFV-Venus in/mlkl- / - MEFs. (A) Necroptosis quantificazione da formazione immagine di fluorescenza ad alta velocità di assorbimento della tintura fluorescente verde cellulare impermeabile, DNA-binding. Necroptosis robusto induzione è osservato solo all'oligomerizzazione Dim-indotta di NBB140-2xFV-Venus, ma non in assenza di Dim. Vengono inoltre eseguiti esperimenti di controllo di sola Venus. Tutte le condizioni sono fatto in triplice copia e vengono tracciate come media e SD da un rappresentante per replicare. (B) necroptosis Fast-cinetica indotta in presenza di Dim visualizzato con microscopia elettronica a scansione. Il tempo cambia corso rivela morfologica necroptosis sottostante tra cui cella arrotondamento e gonfiore (5 min), rottura della membrana plasmatica (10 min) e completare lo stravaso del citosol (20 min). Ogni campione ha avuto numero simile di cellule al tempo 0 min. Da sinistra a destra, l'area ingrandita in contiene 26, 32, 23 e 36 cellule con i nuclei. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Associazione di NBB156 a fosfoinositidi monitorati tramite spettroscopia NMR. Spettro di TROSY N 1H -15(A) di 15N-NBB156. Gli spostamenti chimici di risonanze utilizzate per normalizzazione dello spettro parentesi graffa chiusa o quantificazione dello stato aperto sono evidenziati con quadrati o cerchi, rispettivamente. Giusto, schematica delle firme di NMR rilevato nell'assenza o nella presenza di micelle lipidiche-detergente. NBB156 non vincola micelle detergente DDM in assenza di fosfoinositidi. (B) sovrapposto spettri TROSY N di 1H -15di 15N-NBB156 in presenza le micelle lipidiche-detergente rispettive. (C) singolo 1H -15spettri TROSY N di 15N-NBB156 in presenza le rispettive micelle di lipido-detergente dal pannello B. Rilevando le conformazioni aperte e chiuse senza ambiguità nelle miscele delle due conformazioni possiamo quantificare le percentuali dei due conformeri in un dato campione. PIP2 è il ligando preferito del lipido della NBB156 che fornisce un collegamento diretto tra MLKL e i fosfolipidi della membrana del plasma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tampone di PCR (10x) | 5,0 Μ l |
| Modello di DNA (100 ng / µ l) | 1,0 Μ l |
| cDNA per MLKL, 2 x FKBP, Venus) | |
| dNTP (25 mM ogni NTP) | 0,5 Μ l |
| Gli iniettori di PCR in avanti (F) (100 ng / µ l) | 1,3 Μ l |
| Gli iniettori di PCR in avanti (FR (100 ng / µ l) | 1,3 Μ l |
| NBB140 F | ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT |
| NBB140 R | TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC |
| 2xFKBP F | ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT |
| 2xFKBP R | TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC |
| Venus F | ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| Venus R | TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC |
| DNA polimerasi (2,5 U / µ l) | 1,0 Μ l |
| Distillata o deionizzata (ddH2O) | 39,9 Μ l |
| Volume di reazione totale | 50,0 Μ l |
| Parametri in bicicletta PCR | |
| 1 ciclo | 94-98 ° C; 45 s |
| 25 – 30 cicli | 94-98 ° C; 45 s |
| 58 ° C; 45 s | |
| 72 ° C; 1-2 min | |
| 1 ciclo | 72 ° C; 10 min |
Tabella 1: reazione di PCR di NB 140 -2xFV-Venus per clonazione degli enzimi di limitazione-based in pRetroX-TRE3G.
Tabella 2: dati grezzi per gli spettri RMN ha presentati nella figura 5, che illustra la trasformazione normalizzata dei dati raccolti da un secondo magnete di NMR allo stato calcolato parentesi graffa di apertura media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella.
Movie 1: necroptosis Fast-cinetica indotta dall'oligomerizzazione di NBB 140 -2xFV-Venus in Mlkl- / - MEFs. Vivere la microscopia confocale mostrando la rapida traslocazione di NBB140-2xFV-Venus dal citosol alla membrana plasmatica dopo forzata oligomerizzazione del dominio FKBP. Le cellule sono state trattate come descritto in figura 1. Giallo: NBB140-2xFV-Venus. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Movie 2: microscopia TIRF di fast-cinetica necroptosis. Microscopia TIRF risultati rilocalizzazione veloce (~ 2 min) e l'aggregazione dei MLKL sulla membrana plasmatica con l'aggiunta di Dim mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Forniamo i protocolli per le tecniche che abbiamo combinato implicati MLKL come il presunto boia di membrana plasmatica rottura24. Oltre a decifrare la rete di regolamentazione che regola necroptosis MLKL-mediata, queste tecniche possono essere utilizzate in modo indipendente per caratterizzare altri sistemi biologici adatti. In pratica, queste tecniche sono strumenti di rilevamento medio-basso rendimento.
Abbiamo usato ordinariamente imaging di cellule vive di NBB140-2xFV-Venus-mediare necroptosis e quella indotta da altri costrutti MLKL, meccanicistico dissezionare il regolamento di MLKL in necroptosis tramite mutagenesi e utilizzando la piccola molecola chimica le sonde. In particolare, noi ed altri gruppi abbiamo dimostrato che umano e costrutti del mouse di MLKL che contengono la regione minima di NBB possono mediare necroptosis in umani e linee cellulari di topo. Uno ha segnalato avvertimento direttivo necroptosis MLKL-mediata è specie specificità di interazione RIPK3 e MLKL, che impedisce la cross-reattività tra le specie osservate dopo stimolazione a Monte di combinazione di TNF, smac mimetics e inibizione di caspase 25,35,36. Di conseguenza, umano e del mouse RIPK3 e proteine MLKL non cross-reagiscono sotto queste condizioni25,35,36. Per ignorare le limitazioni di inter-specie, introduciamo le mutazioni che attivano umano MLKL o utilizzano cassette di oligomerizzazione come illustrato di seguito per NBB140-2xFV-Venus24. Umano NBB140 è un costrutto che mantiene la regione inibitoria e quindi rimane inattivo nel contesto della NBB140-2xFV-Venus. Dimerizzazione del 2xFV è pensata per attivare NBB140 rilasciando la parentesi graffa. Al contrario, umano NBB182 induce necroptosis anche in assenza dell'oligomerizzazione, perché questo costrutto è in grado di oligomerizzazione spontaneamente24. Inoltre, punto di mutanti (R30A, R30E, E136A ed E136R) attivazione della regione NB nel contesto del full-length umano MLKL superare la necessità per l'attivazione di RIPK3 fosforilazione24. Inoltre, abbiamo ricostituito dimerizable RIPK3 umano (Cerulean-2xFV-RIPK3) e Dox-inducible full-length umano MLKL-Venere, che sono compatibili e robustamente indurre necroptosis in/ripk3- / - mlkl- / - MEFs24 . Altri recentemente ha rivelato ulteriori mutazioni o dominio umano-mouse scambiato costrutti MLKL che possono superare le barriere di specie specificità25.
Siamo in genere ottimizzare le condizioni di dosaggio necroptosis effettuando diversi esperimenti di telemetria in piastre da 96 pozzetti. Abbiamo poi seguire con esperimenti ottimizzati a 24 pozzetti, che forniscono cellule sufficienti per multiplexing con l'ordinamento attivata fluorescente complementare delle cellule (FACS) e analisi macchiantesi occidentali effettuati successivamente sugli stessi campioni immediatamente dopo il punto finale tempo di imaging. Attualmente, formazione immagine della vivere-cella si basa sulla rilevazione della fluorescenza verde e rosso, limitando le possibilità d'etichettatura per molte applicazioni. Una comune alternativa al verde tinture fluorescenti è il cella-impermeabile ioduro di propidio tintura fluorescente DNA-legantesi (PI). Strumenti di imaging doppio colore offrono la possibilità di utilizzare queste tinture con complementari proteine fluorescenti verde o rosse per migliorare il contenuto di informazioni e utilità di formazione immagine di necroptosis.
La capacità di MLKL di traslocare alla membrana plasmatica dopo la sua attivazione, rende microscopia diretta la tecnica di scelta per studiare la biologia di questa proteina e per seguire in tempo reale la morfologica cambia necroptosis sottostante. Microscopia TIRF risolve inequivocabilmente MLKL aggregati della proteina sulla membrana plasmatica, soprattutto quando eseguito in presenza di indicatori che co-localizzano alla membrana plasmatica. Abbiamo usato LCK-C-RFP come indicatore per la membrana plasmatica co-localizzazione24. La capacità di proteine di tag di interesse con diversi fluorofori, consente inoltre di studiare contemporaneamente l'attività di numerose proteine coinvolte nello stesso processo. La prossima generazione di microscopia di Super-risoluzione parzialmente supera il problema del limite di diffrazione in microscopia confocale standard e ha il potenziale per rivelare caratteristiche aggiuntive di necroptosis MLKL-mediata.
Uno dei tratti distintivi di necroptosis è la permeabilizzazione della membrana del plasma. Anche se diverse tecniche possono indirettamente quantificare o indicare rotture della membrana, solo EM può visualizzare discontinuità nell'integrità della membrana del plasma indotto da MLKL. Mentre TEM ha il più alto potere di risoluzione, SEM ha la possibilità di mappare le aree campione più grandi. Questa caratteristica, unita con lo sviluppo del nuovo e potente software in grado di gestire una maggiore quantità di dati, è migliorata l'utilità di SEM nella caratterizzazione della morfologia delle cellule. Inoltre, SEM è in grado di scansionare campione consecutivo sezioni permettendo la ricostruzione 3D quando accoppiato ad altri sistemi, come fascio focalizzato di ioni. Alcuni degli svantaggi di analisi EM includono il costo della strumentazione e della manutenzione, necessità di personale altamente specializzato e investimento di tempo significativo in analisi e trattamento dei campioni.
Analisi di dot blot sono state utilizzate originariamente per connessioni dirette tra MLKL e fosfolipidi della membrana plasmatica16,27. La nostra analisi obbligatoria basata su NMR del lipido implica definitivamente MLKL in fosfolipide specifici leganti, evidenziando PIP2 come il legante MLKL di scelta. I nostri risultati dimostrano un effetto deleterio di saturazione catena acil associazione NBB156 fosfatidilinositolo. Ciò nonostante, come associazione di MLKL a PIP2e potenzialmente altri fosfolipidi, provoca membrana plasmatica rottura rimane sconosciuto. Usando questo protocollo qualsiasi altri fosfolipidi possono essere testati per l'associazione a MLKL. Nostra analisi servono come un ottimo strumento per testare modelli emergenti di mediare MLKL necroptosis, come può essere utilizzato con mutanti di MLKL e vari ligandi per individuare i contributi specifici all'associazione del lipido. Inoltre, può essere utilizzato per eventuali altri sistemi di membrana associato per interrogare i loro profili di associazione del lipido.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
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