Summary
Nous rapportons des méthodes de caractérisation de la rupture des membranes de plasma induite par le MLKL en necroptosis y compris l’imagerie conventionnelle et confocale microscopie de cellules vivantes, microscopie à balayage électronique et liaison lipidique axée sur les NMR.
Abstract
Necroptosis est un chemin de mort cellulaire programmée déclenché par l’activation du récepteur interaction protéine kinase 3 (RIPK3), qui phosphoryle et active le pseudokinase domaine kinase similaire de lignée mixte, MLKL, à se rompre ou permeabilize de la membrane plasmique . Necroptosis est une voie inflammatoire associée à des pathologies multiples, y compris l’auto-immunité, maladies infectieuses et cardiovasculaires, accidents vasculaires cérébraux, neurodégénérescence et le cancer. Nous décrivons ici les protocoles pouvant servir à qualifier le bourreau de rupture de la membrane plasmique dans necroptosis MLKL. Nous visualisons le processus de necroptosis dans les cellules à l’aide d’imagerie de cellules vivantes par microscopie de fluorescence conventionnels et confocale et dans les cellules fixes à l’aide de la microscopie électronique, qui ensemble ont révélé la redistribution des MLKL du cytosol au plasma membrane avant induction de grands trous dans la membrane plasmique. Nous présentons en vitro analyse de résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’aide de lipides pour identifier des modulateurs putatifs de médiation MLKL necroptosis. Selon cette méthode, nous avons identifié quantitatives préférences de lipide-fixation et phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) comme liants critiques des MLKL qui sont requises pour le ciblage de la membrane plasmique et la perméabilisation dans necroptosis.
Introduction
Identifier les composantes génétiques de necroptosis a facilité l’utilisation de modèles animaux pour tester l’implication des necroptosis dans la physiologie et les maladies1,2,3,4,5. Ko de RIPK3 ou MLKL chez les souris avait une implication minimale dans l’homéostasie développement et adulte, ce qui laisse supposer que necroptosis n’est pas essentiel pour la vie3,6. En outre, certaines espèces ne contiennent pas de gènes soit RIPK3 soit MLKL, appuyant le rôle de non essentiels des necroptosis animaux7,8. En revanche, contester les modèles animaux Knock-Out avec diverses pathologies induites dans le laboratoire a révélé un important rôle de necroptosis dans l’inflammation, l’immunité innée et infection virale9,10, 11 , 12.
Necroptosis peut être activé de plusieurs façons par la signalisation au moyen de capteurs de l’immunité innée différents, tous de qui se traduisent par l’activation de RIPK31,13,14. RIPK3 active à son tour phosphoryle et active MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Le plus étudié, et peut-être la manière plus complexe, conduisant à l’activation de RIPK3 implique mort récepteur ligature, qui bifurque basée sur la composition en aval des complexes de signalisation soit induire l’apoptose ou necroptosis1. Il s’ensuit des Necroptosis lorsque la signalisation par le biais de RIPK1 est favorisée et se traduit par l’engagement de RIPK319,20. Ce résultat est facilement favorisé lors de l’inhibition pharmacologique ou délétion génétique de la caspase 8, un inhibiteur endogène putatif de necroptosis qui garde necroptosis à la baie. RIPK1 lie et active RIPK3. Une autre façon d’activer necroptosis est par le biais de récepteurs Toll-like TLR3/TLR4 signalisation, qui s’engage et RIPK3 se déclenche grâce à TIR-domaine-contenant adaptateur induisant l’interféron β (FTBC)21. Encore une autre façon de mourir par necroptosis est par l’activation de la sonde ADN DAI, qui directement se livre et active RIPK322.
MLKL est une protéine cytosolique composée un domaine N-terminal de bundle (NB) hélice et un domaine de pseudokinase C-terminal (psKD) reliés par un renfort réglementaire région3. Dans les cellules normales, les MLKL se trouve dans le cytosol où il est censé être dans un complexe inactif avec RIPK314. L’activation de necroptosis déclenche la phosphorylation de RIPK3 de MLKL dans la boucle d’activation de la psKD et potentiellement d’autres sites dans le NB et orthèse3,15,23. La phosphorylation induit un changement conformationnel dans MLKL qui se traduit par une dissociation du RIPK314. Mal comprise des changements conformationnels libèrent l’accolade du psKD24. L’orthèse, qui contient 2 hélices, négocie l’oligomérisation de MLKL dans un trimère putatif à travers le d’hélice C-terminale25. L’hélice N-terminale de l’orthèse inhibe le domaine NB, qui est essentiel pour membrane perméabilisation24,26. Isolément, domaine NB est suffisante pour induire la perméabilisation de la membrane plasmique et necroptosis16,24,27. L’activité de pro-necroptotic de NB a été reconstituée dans les fibroblastes embryonnaires de souris déficientes en MLKL (mlkl- / - MEFs). NB est un domaine de liaison du lipide qui engage préférentiellement le diphosphate de phosphatidylinositol 4, 5 de phospholipides (PIP2). Nous avons proposé un mécanisme par étapes d’activation de MLKL, dans lequel oligomérisation orthèse facilite le recrutement de MLKL à la membrane plasmique via les interactions faibles du NB avec le PIP2 groupes polaires24. Au niveau de la membrane, le NB subit une exposition réglementée d’un site de liaison de haute affinité supplémentaires pour PIP2, qui est masqué par l’orthèse en MLKL inactif. Dans l’ensemble, les interactions multiples du NB avec PIP2 déstabilisent la membrane plasmique, conduisant à sa rupture, bien que le mécanisme moléculaire de ces événements n’ont pas été élucidés.
Ici, nous illustrons les méthodes spécifiques utilisées pour caractériser la fonction de MLKL comme bourreau de necroptosis24. En particulier, nous nous concentrons sur le domaine plus minime de MLKL, le NB et l’accolade (BNB), qui est réglementé par l’inhibition de l’orthèse et peut être activé par le biais de dimérisation forcée pour induire la necroptosis et la rupture de la membrane plasmique. Nous décrivons notre système d’expression inductible combiné avec forcée dimérisation FKBP-mediated médicamenteuse à l’imagerie de cellules vivantes et microscopie des cellules subissant necroptosis. En outre, nous illustrons notre analyse in vitro RMN des interactions de BNB avec phosphatidylinositols (PIPs).
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Protocol
1. clonage et de génération de ligne de cellules
- PCR amplifier la région de la BNB, correspondant aux résidus d’acides aminés (BNB140), 1-140 de cDNA de la MLKL humaine pour cadre standard axée sur les enzymes de restriction clonage avec la protéine de liaison oligomérisation domaine 2 x FK506 (2xFKBP ou 2xFV) et fluorescentes de Vénus protéine dans la Doxycycline (Dox) - vecteur rétroviral inductible pRetroX-TRE3G pour obtenir la BNB140- 2xFV-Venus (tableau 1, figure 1 a-B).
- Immortaliser la primaire mlkl- / - ou ripk3- / - mlkl- / - fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) obtenues des souris respectives disponibles dans le laboratoire vert par transfection transitoire avec antigène SV40-large exprimant le plasmide. Sélectionnez les cellules immortalisées dans ~ 1 à 2 semaines et de maintenir en DMEM additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine, pyruvate de sodium 1 mM et des acides aminés non essentiels à 37 ° C et 5 % de CO2 dans le tissu standard incubateurs de la culture.
- Transduce SV40-immortalisé mlkl- / - MEFs avec le transactivateur de tétracycline inverse contrôlée (rtTA)-contenant des rétrovirus exprimée à partir d’un plasmide contenant le gène de résistance blasticidine (notre plasmide modifié) et traiter pour 1 semaine avec 5 μg/mL blasticidine pour sélectionner des cellules exprimant de manière stable rtTA28.
- Transduce les MEFs rtTA exprimant avec le vecteur rétroviral Dox-inducible contenant le MLKL chimérique (pRetroX-BNB140-2xFV-Venus-puro) et sélectionnez à l’aide de la puromycine 4 μg/mL pendant une semaine, 2 jours après la transduction.
2. cellules vivantes microscopie imagerie de Necroptosis induite par le MLKL
- Plaque mlkl- / - MEFs exprimant BNB140-2xFV-Vénus à une densité de 50 000 cellules par puits (1 mL/puits) dans 24 bien plaques et incuber pendant la nuit (Figure 2A). Utiliser la coloration de cellules vivantes pour comptage de cellules automatisées (voir Table des matières).
- Traiter les cellules pendant 12 h avec Dox (0,5 µg/mL) pour induire l’expression de la BNB140-2xFV-Venus.
- Induire des necroptosis avec dimerizer FKBP 25 nM (Dim) en plus de fluorescent vert membrane imperméable de 25 nM teindre (voir Table des matières) en standard DMEM (voir 1.2). Cellules subissant necroptosis accumulent le colorant que leur intégrité de la membrane plasmique est compromise par la BNB140-médiée par la rupture. Effectuer des essais en triple exemplaire ou quatre exemplaires.
- Pour surveiller les necroptosis à l’aide de systèmes d’imagerie unique - ou bicolores (voir Table des matières), placer les navires dans l’unité imageur respectif, abrité au sein d’un incubateur de culture de tissus chez les mammifères.
- Ouvrez le logiciel (voir Table des matières) et sélectionnez l’onglet Calendrier scanne à venir sous la liste des tâches.
NOTE: ce protocole est pour l’imagerie à l’aide de systèmes de simple-couleur, mais un logiciel similaire est disponible pour les systèmes bicolores. - Sélectionner le « bac, bateau, Types de balayage » et le modèle « Scan » dans l’onglet « Disposition physique » et « Fast Fluorescence » dans l’onglet Propriétés.
- Ajouter le « Scan Time » en cliquant sur la fenêtre « Montage » et le nombre total de points dans le temps et la fréquence d’acquisition (en général 1 acquisition chaque 0,5 h à 1 h pour 6 h à 12 h ou toutes les 5 min pour necroptosis rapide-cinétique) et commencer l’acquisition d’images en sélectionnant « App ly » (bouton rouge).
- Quantifier les necroptosis en utilisant le logiciel d’analyse de l’image (voir la Table des matières) en sélectionnant dans le volet « tâches », « Objet Counting nouvelle analyse avec seuil fixe de Segmentation au-dessus du niveau de fond », qui peut être déterminé en vol stationnaire le curseur de la souris au-dessus des régions de fond dans plusieurs images utilisées dans l’analyse.
- Examiner les objets fluorescents en sélectionnant aperçu à l’aide de l’image courante et affiner les seuils selon les besoins.
- Intégrer des comtes de fluorescence verte en ouvrant l’onglet « Lancer New Analysis », choisissez la « plage horaire », sélectionnez les puits pour être analysés, entrez le nom « analyse du travail » et appuyez sur « OK ».
- Accès a analysé les données de l’onglet « Analyse emplois » en double-cliquant sur le nom du travail respectifs et en exportant depuis la fenêtre graphique/Export pour complément d’analyses dans un logiciel graphique externe (voir la Table des matières).
- Quantifier les données sous forme de fluorescence vert positif (+ ve) chefs d’accusation/mm2 ou normaliser les comtes de confluence et d’exprimer les données comme la fluorescence verte + ve comtes/confluence.
- Éventuellement, au point de terminaison expérimentale, détachant les cellules avec 100 nM de la membrane perméable fluorescent vert colorant (voir Table des matières). Normaliser les données aux cellules necroptotic % comme le ratio de la fluorescence de fluorescence vert/vert au point de terminaison.
3. cellules vivantes microscopie confocale imagerie de recrutement de la Membrane plasmique et la perméabilisation de MLKL
- Plaque mlkl- / - MEFs exprimant BNB140-2xFV-Vénus à une densité de 20 000 cellules par puits (0,5 mL par puits) dans un verre bas Chambre 4 puits microscopie prétraité avec la fibronectine de 50 µg/mL dans du PBS à 37 ° C pendant 30 min et incuber pendant environ 12 heures ( Figure 2B).
- Traiter les cellules avec Dox (0,5 µg/mL) pendant environ 12 h induire l’expression de la BNB140-2xFV-Venus.
- Induire des necroptosis par incubation avec un milieu frais (1 mL/puits) contenant 25 nM Dim pour induire la BNB140-2xFV-Venus activation et la translocation vers la membrane plasmique.
- Placez la chambre sur un laser de disque de filature microscope confocal à construit sur un stand inversé équipé de contrôle de l’environnement et un 63 1,4 objectif NA et commencer l’acquisition en utilisant le logiciel de choix d’imagerie (voir Table des matières).
- Initialiser le logiciel, sélectionnez l’icône « Focus » et la configuration du filtre YFP (excitation d’onde 515 nm).
- Localisez le champ de vision et le plan focal et engager le système de maintenance de focus à l’aide de l’onglet « Mise au point définitive ».
- Pour commencer l’acquisition, cliquez sur l’onglet « Capture », suivie par la cession de configuration du filtre, approprié EMCCD caméra exposition temps et intensification gain et paramètres d’acquisition Time-lapse dont intervalle et longueur d’acquisition.
- Surveiller la redistribution cellulaire du BNB fluorescent140-2xFV-protéine de Vénus au cours de la necroptosis par l’acquisition d’images toutes les 10 s par une caméra EMCCD à l’aide d’un laser à 515 nm (film 1).
NOTE : Photoblanchiment est un sujet de préoccupation avec l’imagerie de la protéine fluorescente. Vénus est une des protéines fluorescentes plus résistantes au photoblanchiment29. Si les protéines fluorescentes qui sont plus sensibles aux photoblanchiment servent, image toutes les 30 s ou plus pour permettre la récupération du signal entre les points d’imagerie dans le temps. - Pour surveiller l’association de la membrane plasmique de BNB140-2xFV-Venus au cours de la necroptosis, l’image toutes les 10 s l’échantillon préparé en 3.3 par fluorescence de réflexion totale interne microscopie (FRBR) à l’aide d’un microscope équipé d’un curseur FRBR automatisé et un 100 x 1,4 NA objective et une caméra EMCCD (film 2). Suivez les étapes de 3,5 à 3,7, mais régler l’angle de la FRBR dans l’onglet de mise au point de la FRBR selon l’épaisseur du verre échantillon et en bas de la chambre de microscopie.
NOTE : membrane plasmique marqueurs tels que LCK-C-DP peuvent être utilisés comme contrôles pour la localisation de la membrane plasmique dans l’analyse de la FRBR. - Effectuer le traitement pour améliorer la qualité de convolution avec la dérivée seconde normalisée négative d’une fonction gaussienne (algorithme de Marr) de l’image.
4. microscopie électronique
- Plaque mlkl- / - MEFs exprimant BNB140-2xFV-Vénus à une densité de 5 millions de cellules dans un 150 mm revêtement plasma cellulaire de Petri et incuber pendant 12 h (Figure 3).
- Traiter les cellules avec la Doxycycline (0,5 µg/mL) pour induire l’expression de NB1-140-2xFV-Venus pendant 12 h.
- Induire la BNB140-2xFV-Venus activation et la translocation vers la membrane plasmique avec 25 nM de homodimerizer pendant 5 min. Cette heure est déterminée de la cinétique des necroptosis observées en imagerie de cellules vivantes.
- Retirez le support et fixer les cellules à l’aide de 10 mL de glutaraldéhyde à 2,5 %, 2 % paraformaldéhyde à 0,1 M pH tampon cacodylate 7,4 (tampon cacodylate) préchauffé à 37 ° C.
- Recueillir les échantillons en grattant et faire tourner les échantillons pendant 10 min à 500 x g. Jeter le surnageant.
- Suffixe de l’échantillon pendant 1,5 h en réduit le tétroxyde d’osmium 2 % à 1,5 % ferrocyanure de potassium dans le tampon de cacodylate de sodium 0,1 M. Le tétroxyde d’osmium est un agent de coloration couramment dans TEM pour offrir un contraste. Nous avons utilisé le TEM comme analyse préliminaire avant la SEM de la cellule en cours de necroptosis.
- Rincer l’échantillon 5 fois dans l’eau ultrapure de 5 min chacun à 500 x g, suivie de rinçages dans un tampon (voir 4.6), l’eau et l’éthanol sur le processeur automatique. Jeter le surnageant.
- Pour la SEM, tacher les échantillons fixés préalablement avec 1 % d’uranyle acétate et plomb aspartate teinté de heavy metal31.
- Déshydrater les échantillons à travers une série graduée de solutions oxyde l’alcool et du propylène.
- Incorporer l’échantillon en résine dure32 pour obtenir un bloc de résine.
- Coupes épaisses de 0,5 μm pour déterminer la bonne zone d’analyse.
- Enrober les échantillons avec un film ultra-mince de métaux conducteurs d’électricité (Iridium).
- L’image et l’analyse des échantillons (Figure 3). Pour la quantification, une image de faible grossissement de la surface du bloc de résine avec des cellules exposées est scannée à 5 keV à l’aide d’un microscope électronique.
- Visualiser les cellules à travers des images capturées par SEM ou logiciel d’imagerie peut-être être utilisée pour rejoindre les multiples champs de vision en une seule image contigus30. Environ 100 cellules peuvent être utilisées pour évaluer la fraction des cellules subissant des necroptosis de cette manière en générant un montage haute résolution dans le logiciel de choix (voir Table des matières).
NOTE : Marquant nécrotique morphologie par SEM compare les caractéristiques des cellules normales avec la progression des phénotypes pré nécrotiques ou nécrotiques. Ces fonctionnalités incluent des modifications de la membrane de plasma notamment disparition des microvillosités, aplatissement, ruptures dans les cellules allant de 10 nm à 1 µm dans la taille, ou perte de structure des organites au moins 30 à 40 % de la superficie de la cellule cytosolique.
5. lipides liaison de MLKL par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
- Préparer 15BNB marqué N1-156 par expression de la protéine standard et purification comme décrit précédemment24.
- Dissoudre 500 µg de sel d’ammonium 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (18:0 PI) et de sel d’ammonium de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (18:1 PI) à 500 µL de glacee CHCl3 chaque pour la concentration finale de 1 mg/mL.
- Laisser agir 1 mg/mL 18:0 et 18:1 PI dans un bain d’eau de sonication pendant 1 min à température ambiante ou jusqu'à concurrence de 5 min dans un mélange eau-glace.
-
Aliquote de 1 mg/mL 18:0 et 18:1 PI dans des flacons de verre propre pour des séries individuelles de titrage des NMR (Figure 4). Transfert de lipides dans des solvants organiques à l’aide de seringues hermétique verre.
- Aliquote 132 µL de 1 mg/mL 18:1 PI (masse molaire = 880.137 g/mol) dans CHCl3 pour un volume de resuspension finale de 1 200 µL à 125 concentration µM.
Remarque : Pour les tubes de 5 mm NMR, préparer des volumes de dilution en série de > 1000 µL et NMR final échantillon volumes de > 500 µL. Pour les tubes de 3 mm NMR, préparer des volumes de dilution en série de > 300 µL et NMR final des volumes de l’échantillon > 150 µL.
- Aliquote 132 µL de 1 mg/mL 18:1 PI (masse molaire = 880.137 g/mol) dans CHCl3 pour un volume de resuspension finale de 1 200 µL à 125 concentration µM.
- 1 mg/mL aliquote porcine cerveau sel d’ammonium L-α-phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate en 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (cerveau PI (4,5) P2) dans des flacons de verre propre.
- Placer les flacons sous un courant gazeux d’argon (Ar) ou de l’azote (N2) avec un débit modéré s’évaporer le solvant organique sans éclabousser contre les murs de flacon de verre. Cinq à trente min est généralement suffisante pour les volumes de solvant organique de 10 à 200 µL.
- Organiser des vial(s) de verre au fond d’un Büchner ou fiole à vide à l’aide de grandes pinces, sceller avec un bouchon en caoutchouc et raccorder le tube en plastique relié à une ligne vide. Évacuer le flacon sous vide doux toute la nuit pour enlever les matières organiques résiduelles.
- Superposition des aliquotes film lipidique avec un gaz inerte, sceller avec un couvercle hermétique et conserver à-20 ° C pour une utilisation dans le mois ou à-80 ° C pour le stockage à long terme.
- Préparer les tampons échantillon NMR sans détergent (-Det) contenant 20 millimètres NaxHyPO4 pH 6,8, 10 % D2O et avec un détergent (+ Det) contenant 20 millimètres NaxHyPO4 pH 6,8, 10 % D2O, 0,34 mM n-dodécyl-β-D-maltopyranoside (DDM).
- Ajouter + Det tampon flacon en verre avec film lipidique pour obtenir la concentration désirée et laisser agir au bain-marie jusqu'à 30 min, alternant sonication pendant 10 minutes suivie d’une inspection visuelle.
Remarque : La Sonication peut réchauffer échantillon. Laisser refroidir à température ambiante pendant 15 min avant reconstitution échantillon final de protéine. - Effectuer des dilutions de lipide-détergent micelles dans + Det tampon à l’aide de sonication de mélanges 1:1 pour la série de la concentration désirée. À partir de concentration de lipides 125 µM, trois répétitions rapportera 62,5 µM, 31,3 µM et 15,6 lipides µM à 0,34 mM DDM.
- Préparer le contrôle et faire référence à des échantillons de NMR de protéine et d’additifs au - Det et + Det tampons, respectivement. Ajouter des protéines et additifs pour chaque dilution de lipides chez + Det tampon.
Remarque : Pour 15BNB N156, protéine est ajouté à une concentration finale de 40 µM et additionné de 2 mM deutéré dithiothréitol pour garder les résidus Cys réduits. - Transférer le volume approprié d’échantillons de 5 mm ou 3 mm tubes de NMR (voir la note à l’étape 5.4).
- Charger des échantillons en instrument de NMR ou organiser dans une plate-forme d’automatisation tels que le chargeur SampleCase manuellement.
- Acquérir les spectres de RMN du composites à l’aide de programmes d’impulsion standard pour les spectres du proton 1H sous contrôle de la qualité suivie par les spectres de corrélation 2D 1H -15N soit comme spectroscopie de relaxation transversale optimisée (TROSY) ou hétéronucléaire multiples quantique cohérence (SOFAST-HMQC)33.
Remarque : L’utilisation de tubes de 3 mm NMR nécessite 64 scans pour 1 H -15N TROSY (~ 3 h) ou 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Scan les numéros sont réduites de moitié pour les tubes de 5 mm NMR. - Les spectres de RMN 2D transformés peuvent être ajoutés à un référentiel de CARA34 pour analyse ou tout autre logiciel de choix à l’utilisateur.
-
Analyser les logiciels en annotant des résonances de NMR 2D pour trois pics bien dispersés et résolus pour chaque État de protéine. Enregistrer les amplitudes crête pour chacun des six sommets pour chaque condition de mémoire tampon contenant la BNB156 (Figure 5A).
- CARA permet de préparer une liste de lots-intégration (rubrique cliquez sur le Menu principal « spectre | « « Configuration liste des lots »...) de tous les spectres collectés et d’analyser à l’aide d’un fichier d’affectation seul pic (rubrique cliquez sur le Menu principal « pics | L’importation Peaklist ».. .et choisissez un fichier défini par l’utilisateur .peaks avec 6 pics totales, 3 pour chaque État de protéine, définis au sein).
- Le réglage de la mélodie ("intégrateur | « « Tune modèle Peak »...) de largeur X 0,06 ppm et Y-largeur 0,30 ppm (rubrique cliquez sur le Menu principal « intégrateur | « « Tune modèle Peak »...) avant d’enregistrer la sortie finale dans deux sélections de menu (1. Cliquez sur l’en-tête de Menu principal « intégrateur | Intégrer la liste des lots ») (2. Cliquez sur l’en-tête de Menu principal « pics | Exporter la Table d’intégration ») (Figure 5B).
Remarque : Les résonances d’amide épine dorsale pour les résidus de M21, V53 et L105 ont été attribués à l’état fermé-brace de BNB156 . L’état ouvert-brace fut assignée aux résonances amide épine dorsale des résidus G130 et A141 et la résonance epsilon de chaîne latérale proton de W133 utilisant 3D NMR expériences24.
- Normaliser les échantillons pour une comparaison directe de différents aimants ou les conditions de l’échantillon en moyenne les amplitudes d’ouverture-brace trois des échantillons de référence et en calculant un facteur de normalisation concernant les deux références. Calculer les amplitudes à l’échelle pour les résonances de156 BNB en utilisant le facteur de normalisation et les amplitudes négatives de réglage à zéro (tableau 2).
Exemples : 1) comparant les échantillons provenant de différents aimants : aimant A,156de la BNB et aimant B, BNB,156+ DDM, DDM. 2) Comparaison de détergent : 0,34 DDM et 1,7 mM DDM. - Calculer pour chaque résonance la fraction à l’échelle de fermé - ou ouvrir-brace en divisant avec la gamme d’amplitude minimale au maximum de tous les spectres collectés contenant les références appropriées de libre BNB156 et pleinement ouverte-brace BNB156 dans détergent.
- Tracer les amplitudes de NMR normalisées en fonction de la concentration de lipides et de comparer la fraction d’ouvrir-brace BNB156 dans des conditions différentes (Figure. 5C).
NOTE : Alternativement, analyse de la fraction de conformation fermée-brace contre concentration lipidique peut être exécutée pour comparer liaison lipidique à156de la BNB. Nous préférons l’ancienne analyse parce que c’est plus rapide et de meilleurs rapports sur la fraction-enclenché par les lipides.
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Representative Results
Visualisation necroptosis réglementé l’exécution dans des cellules vivantes a été possible grâce à une expression inductible d’une construction minimale de MLKL tronquée, BNB140-2xFV-Venus. Cette construction maintient la capacité d’induire la perméabilisation de la membrane plasmique et est activée par oligomérisation Dim-induite de la cassette FKBP (2xFV). Nous observons et quantifier necroptosis par microscopie des cellules vivantes d’imagerie, le suivi cinétique (toutes les 5 min) l’absorption d’un colorant de liaison ADN cellulaire imperméable fluorescence verte (Figure 6A). Ce système inductible est très robuste et complet necroptosis de MEFs mlkl- / - puisse être observé dans ~ 1 h à Dim-mediated oligomérisation des cellules Dox-préincubés qui expriment la BNB140-2xFV-Venus (Figure 1A ). Nous appelons ces conditions necroptosis rapide-cinétique. Expression de Venus seul ± Dim ou BNB140-2xFV-Venus en l’absence de Dim n’induit pas de necroptosis (Figure 6A). Nous effectuons généralement au moins 3 expériences d’imagerie répétés en trois copies ou exemplaires en 24, 96- ou plaques 384 puits.
La necroptosis rapide-cinétique induite par dimérisation forcée du BNB140-2xFV-Venus (Figure 6A) prend en charge le rôle de MLKL comme le bourreau présumé de rupture de la membrane plasmique. Pour visualiser la redistribution des BNB140-2xFV-Venus à la membrane plasmique lors de necroptosis, la microscopie confocale cellules vivantes est utilisé pour surveiller la fluorescence de Vénus. Au cours de la necroptosis rapide-cinétique, dans 2-3 min d’incubation avec Dim, Vénus, revêtement de la périphérie de la cellule est observée, suivie de cellulaire progressive arrondi (film 1). NBB140-2xFV-accumulation de Vénus à la membrane plasmique est visualisée par microscopie confocale FRBR, qui met l’accent sur le volume de la cellule à l’interface de membrane de verre cytosol-plasma. Examen de Vénus associée à la membrane de plasma sont visibles dans les 1 à 2 min d’incubation avec Dim (film 2). Ainsi, appliqué l’oligomérisation de BNB140-2xFV-Venus induit sa redistribution rapide vers la membrane plasmique.
Microscopie électronique (MEB) est un outil puissant pour révéler les changements morphologiques dans les cellules en cours de necroptosis. En vertu de la necroptosis rapide induite par l’oligomérisation de BNB140-2xFV-Venus, cellules changement de morphologie des formes allongées normales (durée 0 min) à arrondie et gonflé (5 min) et partiellement rompu (10 min) et largement démantelé où le cytosol a disparu (20 min) (Figure 6B). SEM complète les précédentes observations de microscopie de cellules vivantes corrélant localisation MLKL à la membrane plasmique avec la rupture des membranes. Dans l’ensemble des techniques de microscopie présentées ci-après offrent des moyens complémentaires pour surveiller, évaluer et quantifier des necroptosis au niveau cellulaire et impliquer BNB140-2xFV-Venus dans l’exécution de la rupture de la membrane plasmique.
Pour déterminer si les MLKL peuvent contacter directement la membrane plasmique, nous effectuons en vitro lipidique des expériences de liaison surveillées par spectroscopie RMN à l’aide de recombinant BNB156. Des dilutions successives des micelles de lipide-détergent, en utilisant une concentration constante de détergent (véhicule pour présentation de lipides) et les concentrations des lipides variable, sont testées pour la liaison à 15N-étiqueté BNB156 par spectroscopie de RMN 2D, qui changements de moniteurs induite par la liaison à la protéine. 156 de la BNB subit des transformations structurelles majeures sur les lipides contraignant à déplacer la région inhibitrice brace (acides aminés 132-156) du fermé et hélicoïdale (accolade fermée) à la conformation ouverte et intrinsèquement désordonnée (ouvrir Brace) (Figure 7 A). Spectroscopie de RMN bidimensionnelle fournit par informations de résidus sur les mélanges de deux conformères (Figures 7 b-7C). Précédemment, nous avons attribué les amides de l’épine dorsale des deux conformères24. Nous pouvons facilement surveiller les pourcentages des conformères fermées et ouvertes dans un échantillon donné, tel que décrit dans la figure 5 a-C. À l’aide de l’essai de cette liaison, nous explorons liaison156 BNB à pépins dans un détergent DDM, qui est inerte à la BNB156 contraignant (Figure 5B). Dans cet essai, PIP2 est le meilleur ligand de156 BNB, qui induit une ouverture complète de l’orthèse inhibitrice à 125 µM (Figure 5C). En revanche, saturés (18:0) PI et insaturé (18:1) PI sont pauvres ligands de156 BNB, induisant l’orthèse partielle d’ouverture dans les mêmes conditions (Figure 5C). Notre essai de liaison axée sur le NMR de lipides fournit des preuves à l’appui pour l’interaction de MLKL NBB156 avec des phospholipides et suggère un lien direct entre la MLKL et la membrane plasmique.
Figure 1 : Stable hébergeant un Tet-sur 3 G inductible système modifié de la lignée cellulaire. Lignées cellulaires stables (A) ont été générées par transduction rétrovirale du/mlkl- / - MEFs avec le pTREX-rtTA-explosion suivie par le pRetroX-TRE3G-BNB140-2xFV-Venus-puro. Chaque transduction a été suivie de sélection antibiotique pendant 1 semaine avant de passer à des analyses subséquentes. (B) Représentation schématique du système d’expression inductible MLKL. Ce système est basé sur 2 étapes réglementaires inductible par la drogue : l’expression des gènes MLKL i) et la production de protéines (+ Dox) et activation ii) par oligomérisation (+ Dim). Lorsque la production de protéines est induite en avance, + Dox, necroptosis rapide-cinétique peut être déclenchée, + Dim. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Imagerie de cellules vivantes de necroptosis rapide-cinétique révèle relocalisation rapide membrane de MLKL. (A) Fast-cinétique necroptosis induite comme dans la Figure 1 b peuvent être surveillés dans un système d’imagerie. Necroptosis est marqué par l’absorption du colorant fluorescent vert imperméable au cellulaire. (B) Représentation schématique de l’imagerie de cellules vivantes de necroptosis rapide-cinétique avec épifluorescence et total analyse de microscopie de fluorescence (FRBR) de réflexion interne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Représentation schématique du scanning electron microscopy (SEM) préparation des échantillons et l’analyse. Cellules de necroptosis rapide-cinétique induit comme décrit à la Figure 1 sont fixés sur la plaque à des moments différents après l’addition du Dim. Les cellules sont ensuite préparés pour l’analyse de SEM par grattage et mise en commun, coloration de heavy metal, résine enrobage et revêtement iridium tel que décrit à l’article 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Échantillon préparation et collecte de données pour titrages NMR de 15BNB N156 et lipides-détergent micelles. Ce test et analyse est généralement effectuée dans 3 à 4 jours : jour 1, aliquotes de lipides sont dispensés et séchés pendant la nuit. Au cours de la journée 2, les films de lipides sont réhydratés dans dosage tampon ± détergents, soniquées et en série dilué (double) en mélangeant des volumes égaux de la solution lipidique réhydraté avec une solution tampon sans lipides. Chaque dilution est sonication pour assurer un mélange homogène et la répartition des lipides dans les micelles de détergent avant dont les dilutions successives. Échantillons de protéines sont mélangés dans les dilutions de série micelle de lipide-détergent, chargés dans les tubes de NMR appropriés, placés dans un chargeur de SampleCase (ou chargés manuellement), et la collecte automatique de données NMR est démarrée. Au cours des jours suivants, collecte de données de NMR est terminée et suivie par des analyses RMN 2D. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Préférences de lipide-fixation de la BNB156 mesurée à l’aide de la RMN 2D. (A) superposées des spectres de TROSY N15 1H - pour 15N-BNB156 dans la présence (rouge) ou non (bleu) de 125 µM PI (4,5) P2 à 0,34 mM DDM visualisée à la CARA. (B) les tranches unidimensionnel de résonances utilisés pour les mesures de l’amplitude et de normalisation. Le spectre de raw (vert) se superposent avec la limite de l’amplitude et l’intégration du Programme CARA. (C) après normalisation des amplitudes de BNB156 en présence de micelles phosphoinositide-DDM complotèrent contre concentration lipidique. PIP2 induit une ouverture complète de l’orthèse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Fast-cinétique necroptosis induite par l’oligomérisation de BNB140-2xFV-Venus en/mlkl- / - MEFs. (A) Necroptosis quantification par imagerie de fluorescence forte capacité d’absorption du colorant fluorescent vert imperméable au cellulaire, liaison à l’ADN. Necroptosis robuste est seulement observé sur Dim induite par l’oligomérisation de BNB140-2xFV-Venus, mais pas en l’absence du Dim. Venus uniquement des expériences de contrôle sont également effectuées. Toutes les conditions sont faites en triple exemplaire et sont tracées sous forme de moyenne et répliquer les SD à un représentant. (B) necroptosis rapide-cinétique induit en présence de Dim visualisé à l’aide de microscopie électronique à balayage. Le temps change de cours révèle morphologiques necroptosis sous-jacente, y compris les cellules arrondi et l’enflure (5 min), rupture de la membrane plasmique (10 min) et terminer l’extravasation du cytosol (20 min). Chaque échantillon a eu un nombre similaire de cellules à temps 0 min. De gauche à droite, la zone zoomée en comporte 26, 32, 23 et 36 cellules avec des noyaux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : La liaison de la BNB156 à phosphoinositides surveillés par spectroscopie RMN. (A) spectre 1H -15TROSY N 15N-BNB156. Les déplacements chimiques des résonances utilisés pour la normalisation du spectre accolade fermée ou quantification de l’état ouvert sont mis en évidence avec des carrés ou des cercles, respectivement. Schéma de droite, des signatures de NMR détecté en l’absence ou la présence de lipides-détergent micelles. 156 de la BNB ne lie pas de micelles détergents DDM en l’absence des phosphoinositides. (B) superpose les spectres de TROSY N15 1H - de 15N-BNB156 en présence les micelles de lipide-détergent respectifs. (C) seul 1H - spectres de TROSY N15de 15N-BNB156 en présence les micelles de lipide-détergent respectifs du tableau B. En détectant les conformations ouvertes et fermées sans ambiguïté dans les mélanges des deux conformations nous pouvons quantifier les pourcentages des deux conformères dans un échantillon donné. PIP2 est le ligand de lipides préféré du BNB156 fournissant un lien direct entre les MLKL et les phospholipides de la membrane plasmique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Tampon de PCR (10 x) | 5,0 ΜL |
| Matrice d’ADN (100 ng/µL) | 1,0 ΜL |
| ADNc des MLKL, 2 x FKBP, Vénus) | |
| dNTPs (25 mM chaque NTP) | 0,5 ΜL |
| Des amorces PCR (F) vers l’avant (100 ng/µL) | 1,3 ΜL |
| Transmettre des amorces de PCR (FR (100 ng/µL) | 1,3 ΜL |
| NBB140 F | ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT |
| NBB140 R | TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC |
| 2xFKBP F | ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT |
| 2xFKBP R | TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC |
| Vénus F | ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| Vénus R | TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC |
| ADN polymérase (2,5 U/µL) | 1,0 ΜL |
| Eau distillée et désionisée (ddH2O) | 39,9 ΜL |
| Volume de réaction totale | 50,0 ΜL |
| Paramètres PCR | |
| 1 cycle | 94-98 ° C ; 45 s |
| 25 à 30 cycles | 94-98 ° C ; 45 s |
| 58 ° C ; 45 s | |
| 72 ° C ; 1-2 min | |
| 1 cycle | 72 ° C ; 10 min |
Tableau 1 : réaction de PCR de NB 140 -2xFV-Venus pour base d’enzymes de restriction clonage dans pRetroX-TRE3G.
Tableau 2 : données brutes pour les spectres de RMN présentés dans la Figure 5, illustrant la transformation normalisée des données recueillies entre un deuxième aimant NMR et l’état de l’accolade ouvrante moyen calculé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette table.
1 film : Fast-cinétique necroptosis induite par l’oligomérisation de BNB 140 -2xFV-Vénus en mlkl- / - MEFs. Vivre la microscopie confocale montrant la translocation rapide de BNB140-2xFV-Venus du cytosol vers la membrane plasmique après oligomérisation forcée du domaine FKBP. Les cellules ont été traitées comme décrit à la Figure 1. Jaune : BNB140-2xFV-Vénus. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Movie 2 : microscope TIRF de rapide-cinétique necroptosis. Microscope TIRF montrant la relocalisation rapide (environ 2 min) et l’agrégation de MLKL sur la membrane plasmique lors de l’addition de Dim à/mlkl- / - MEFs exprimant BNB140-2xFV-Venus. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Nous fournissons des protocoles pour les techniques que nous avons combiné impliqué MLKL comme le bourreau présumé de rupture de la membrane plasmique24. En plus de déchiffrer le réseau de régulation qui régule induite par le MLKL necroptosis, ces techniques peuvent servir indépendamment pour caractériser d’autres systèmes biologiques adaptés. Concrètement, ces techniques sont des outils de découverte du milieu à faible débit.
Régulièrement, nous avons utilisé une imagerie de cellules vivantes de la BNB140-2xFV-Venus-médiation de necroptosis et celle induite par les autres constructions MLKL, de façon mécaniste disséquer la réglementation des MLKL en necroptosis par mutagenèse et à l’aide de petites molécules chimiques les sondes. En particulier, les autres groupes et nous avons démontré que humain et les constructions de souris des MLKL qui contiennent la région minime de BNB peuvent servir de médiateur necroptosis chez les humains et les lignées de cellules de souris. Un signalé AVERTISSEMENT régissant induite par le MLKL necroptosis est spécifique d’interaction RIPK3 et MLKL, ce qui empêche les réactions croisées entre les espèces observées lors de la stimulation en amont par combinaison de TNF, smac mimétiques et caspase inhibition 25,35,,36. En conséquence, humaine et RIPK3 de la souris et les protéines MLKL ne pas de réaction croisée sous ces conditions25,35,36. Afin de contourner les limites entre les espèces, nous introduisons des mutations qui activer MLKL humaine ou utilisent des cassettes d’oligomérisation comme indiqué ici pour BNB140-2xFV-Venus24. Humaine BNB140 est une construction qui maintient la région inhibitrice et donc reste inactif dans le contexte de la BNB140-2xFV-Venus. Dimérisation du 2xFV est censée activer BNB140 en libérant de l’orthèse. En revanche, humaine BNB182 induit necroptosis même en l’absence d’oligomérisation, car cette construction est capable d’oligomerize spontanément24. Par ailleurs, point de mutants (R30A, R30E, E136A et E136R) activant la région NB dans le contexte de le MLKL humaine pleine longueur surmonter la nécessité pour l’activation par phosphorylation de RIPK324. En outre, nous avons reconstitué dimerizable RIPK3 humaine (Cerulean-2xFV-RIPK3) et Dox-inducible pleine longueur humaine MLKL-Vénus, qui sont compatibles et induire solidement necroptosis dans/ripk3- / - mlkl- / - MEFs24 . D’autres ont révélé récemment mutations additionnelles ou homme-souris domaine troqué des constructions MLKL qui peuvent l’emporter sur les espèces spécificité barrières25.
En général, nous optimisons les conditions de test necroptosis en effectuant plusieurs expériences de télémétrie en plaques 96 puits. Nous puis un suivi avec des expériences optimisées en plaques 24 puits qui contient des cellules suffisants pour le multiplexage avec le tri de cellules activées fluorescent complémentaire (FACS) et ouest analyses buvard effectuées ultérieurement sur les mêmes échantillons immédiatement après le point dans le temps final de l’imagerie. Actuellement, l’imagerie de cellules vivantes est basée sur la détection de la fluorescence verte et rouge, limitant les possibilités d’étiquetage pour de nombreuses applications. Une alternative commune à des colorants fluorescents verts est l’iodure de propidium colorant fluorescent liant à l’ADN cellulaire-imperméable (PI). Les instruments d’imagerie bicolore offrent la possibilité d’utiliser ces colorants avec des protéines fluorescentes rouges ou verts complémentaires pour améliorer le contenu utilitaire et d’information de l’imagerie necroptosis.
La capacité de MLKL de translocation vers la membrane plasmique après son activation, rend direct microscopie la technique de choix pour étudier la biologie de cette protéine et pour suivre en temps réel la morphologique change necroptosis sous-jacent. Microscope TIRF résout sans équivoque agrégats protéiques MLKL sur la membrane plasmique, surtout lorsque exécuté en présence de marqueurs qui localiser conjointement à la membrane plasmique. Nous avons utilisé LCK-C-DP comme marqueur de la membrane plasmique co-localisation24. La capacité de protéines de balise d’intérêt avec des fluorophores différents, permet également d’étudier simultanément l’activité de plusieurs protéines impliquées dans le même processus. La prochaine génération de microscopie de Super-résolution partiellement surmonte le problème de limite de diffraction en microscopie confocale standard et est susceptible de révéler des fonctionnalités supplémentaires de necroptosis induite par le MLKL.
Une des caractéristiques de necroptosis est la perméabilisation de la membrane plasmique. Même si plusieurs techniques peuvent indirectement quantifier ou indiquer des ruptures de la membrane, seulement EM peut visualiser des discontinuités dans l’intégrité de la membrane plasmatique induite par le MLKL. Alors que le TEM a la puissance la plus élevée de la résolution, SEM a la capacité de tracer les grandes zones de spécimen. Cette caractéristique, combinée avec le développement du nouveau et puissant logiciel capable de gérer une plus grande quantité de données, a amélioré l’utilité des SEM dans la caractérisation de la morphologie cellulaire. En outre, SEM est également capable de parcourir les sections consécutives d’échantillon permettant la reconstruction 3D lorsqu’elle est associée à d’autres systèmes, comme le faisceau d’ions concentré. Certains des inconvénients de l’analyse de l’EM comprennent le coût de l’instrumentation et l’entretien, la nécessité de personnel hautement spécialisé et l’investissement de temps important en analyse et traitement des échantillons.
Dot blot dosages ont été utilisés à l’origine pour établir des connexions directes entre MLKL et les phospholipides de la membrane plasmique16,27. Notre essai de liaison du lipide axée sur les NMR implique définitivement MLKL dans la liaison de phospholipides spécifiques, en soulignant la PIP2 comme ligand MLKL de choix. Nos résultats démontrent un effet délétère de saturation chain acyl sur liaison156 BNB en phosphatidylinositol. Néanmoins, comment liaison MLKL PIP2, et potentiellement d’autres phospholipides, traduit par rupture de membrane plasmique demeure inconnu. Utilisant ce protocole toute autres phospholipides peut être testé pour se lier à MLKL. Notre essai sert un excellent outil pour tester les nouveaux modèles de médiation-MLKL necroptosis, il peut être utilisé avec des mutants de MLKL et de divers ligands pour identifier les contributions spécifiques à la liaison de lipides. En outre, il peut être utilisé pour tout autre système de membrane associée à interroger leurs profils de liaison des lipides.
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Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Aucun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
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