Summary
우리는 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 및 NMR 기반 지질 바인딩 전통과 confocal 라이브 셀 현미경 이미징를 포함 하는 necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 방법 보고.
Abstract
Necroptosis는 단백질 키 니 아 제 3 (RIPK3), phosphorylates 및 혼합된 계보 니 같은 도메인 pseudokinase, MLKL, 파열 또는 permeabilize 원형질 막 활성화는 상호 작용 하는 수용 체의 활성화에 의해 트리거되는 프로그램된 한 세포 죽음 통로 . Necroptosis 면역, 감염 및 심장 혈관 질환, 뇌졸중, neurodegeneration, 그리고 암 등 여러 병 리와 관련 된 염증 통로 이다. 여기, 우리는 necroptosis에 플라즈마 막 파열의 사형 집행으로 MLKL 특성을 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 우리 전통과 공초점 형광 현미경 검사 법, 함께 라이브 셀 이미징 사용 하 여 셀에 함께 계시는 플라즈마는 cytosol에서 MLKL의 재배포 전자 현미경을 사용 하 여 고정된 셀에 necroptosis의 과정을 시각화 원형질 막에 큰 구멍의 유도 전에 막. 핵 자기 공명 (NMR) 분석 생체 외에서 지질을 사용 하 여 necroptosis MLKL 중재의 putative 변조기를 식별 하는 선물이. 이 방법에 따라, 우리 됨으로 양적 지질 바인딩 환경과 phosphatidyl-이노 시 톨 인산 염 (PIPs) MLKL의 원형질 막 지정 하 고 necroptosis에 permeabilization에 필요한 중요 한 바인더.
Introduction
Necroptosis의 유전자 구성 요소를 식별 생리학과 질병1,2,3,,45necroptosis의 의미를 테스트 동물 모델의 사용을 촉진 했다. 녹아웃 쥐에 RIPK3 또는 MLKL의 제안 하는 necroptosis는 생활3,6에 대 한 필수적인 개발 및 성인 항상성에서 최소한의 의미를 했다. 또한, 특정 종 동물7,8necroptosis의 비 본질적인 역할을 지 원하는 RIPK3 또는 MLKL 유전자를 포함 하지 않습니다. 다른 한편으로, 염증, 타고 난 면제 및 바이러스 감염9,10, necroptosis의 중요 한 역할을 계시 했다 다양 한 병 리 실험실에서 유도 된 녹아웃 동물 모델 도전 11 , 12.
Necroptosis는 여러 가지 방법으로 다른 타고 난 면역 센서를 통해 신호에 의해 활성화 될 수 있다 RIPK31,,1314의 활성화에 결과의 모든. Active RIPK3에서 phosphorylates 및 MLKL3,,45,6,7,,89,10 를 활성화 11,12,13,14,15,,1617,18. 가장 공부 하 고 아마도 가장 복잡 한 방법, RIPK3의 활성화로 이어지는 죽음 수용 체 결 찰, 분기는 apoptosis 또는 necroptosis1을 유도 하거나 신호 복합물의 다운스트림 구성에 따라 포함 됩니다. Necroptosis 때 RIPK1를 통해 신호 선호 RIPK319,20의 교전에서 결과 인가요. 이 결과 쉽게 약리 억제 또는 caspase 8, 베이에서 necroptosis을 유지 하는 necroptosis의 상 상속 생 억제제의 유전 삭제 시 선호 합니다. RIPK1을 하 고 RIPK3를 활성화 합니다. 또 다른 방법은 necroptosis 활성화 하입니다 수용 체 통행세 같이 TLR3/TLR4 신호, 종사 하 고 유도 하는 어댑터 인터페론-β (TRIF) 사격 도메인 포함21를 통해 RIPK3를 활성화. 아직 necroptosis에 의해 죽고 또 다른 방법은 DNA 센서 다이, 직접 종사 하 고 활성화 하는 RIPK322의 활성화입니다.
MLKL는 N 맨끝 나선 번들 (NB) 도메인 및 규제 중괄호 지역3로 연결 단자 pseudokinase 도메인 (psKD)의 구성 cytosolic 단백질 이다. 정상 세포에서 MLKL RIPK314와 비활성 복잡 한에 생각 된다 cytosol에서 발견 된다. Necroptosis의 활성화는 psKD, 그리고 주의 중괄호3,,1523에 잠재적으로 추가 사이트의 활성화 루프에서 MLKL의 RIPK3 인 산화를 트리거합니다. 인 산화 MLKL RIPK314에서 분리 결과에 구조적 변화를 유도 합니다. 불완전 하 게 이해 구조적 변화 psKD24에서 중괄호를 놓습니다. 2 나선 포함, 중괄호, oligomerization MLKL의 C-터미널 나선25통해 putative 삼합체에 중재. 중괄호의 N 맨끝 나선 막 permeabilization24,26필수적 이다 NB 도메인 억제. 격리, NB 도메인은 원형질 막 permeabilization와 necroptosis16,,2427유도 충분 합니다. NB의 프로 necroptotic 활동은 마우스 미 발달 섬유 아 세포 MLKL (mlkl-/- MEFs)의 결핍에서 재구성 된다. NB는 우선적으로 종사 하는 인지질 phosphatidylinositol 4, 5 diphosphate (핍2) 지질 바인딩 도메인입니다. 우리는 어떤 점에서 중괄호 oligomerization 핍2 북극 머리 그룹24NB의 약한 상호 작용을 통해 플라즈마 막에 MLKL의 모집을 용이 하 게 MLKL의 활성화의 stepwise 메커니즘을 제안 했다. 막에서 주의 핍2는 중괄호 비활성 MLKL에 의해 마스크에 대 한 추가 높은 친 화력 바인딩 사이트의 규제 노출을 겪 습. 이러한 이벤트의 분자 메커니즘 해명 하지는 있지만 전반적으로, 핍2 NB의 여러 상호 작용 원형질 막의 파열으로 이어지는 불안정.
여기 우리 necroptosis24의 사형 집행으로 MLKL의 기능을 특성화 하는 데 사용 하는 특정 방법을 설명 합니다. 특히, 우리는 MLKL, NB (NBB), 중괄호는 중괄호 억제에 의해 규제 및 적용된 이합체 화 유도 플라즈마 막 파열 및 necroptosis를 통해 활성화 될 수 있다의 가장 최소한의 도메인에 초점. 우리는 우리의 유도할 수 있는 식 시스템 적용된 약물 유발 FKBP 중재 이합체 화 라이브 셀 이미징, 및 necroptosis를 받고 세포의 전자 현미경과 함께 설명 합니다. 또한, 우리 우리의 생체 외에서 NMR 분석을 phosphatidylinositols (PIPs)와 NBB의 상호 작용을 보여 줍니다.
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Protocol
1. 복제 및 셀 라인 생성
- PCR 증폭 NBB 지역 해당 아미노산 잔류물 1-140 (NBB140), 인간 MLKL cDNA에서에 대 한 프레임 표준 제한 효소 기반 복제 oligomerization 도메인 2 x FK506 의무적인 단백질 (2xFKBP 또는 2xFV)와 금성 형광에 하 단백질에 Doxycycline (Dox)-NBB140를 유도할 수 있는 retroviral 벡터 pRetroX-TRE3G-2xFV-금성 (표 1, 그림 1A-B).
- 기본 mlkl또는 ripk3-/- mlkl-/- -/- 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 과도 transfection SV40 큰 항 원과 녹색 실험실에서 사용할 수 있는 각 생쥐에서 얻은 불멸 플라스 미드를 표현합니다. ~ 1-2에서 불멸 하 게 셀을 선택, 주 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린과 스, 1mm 나트륨 pyruvate, 표준 조직에서 37 ° C, 5% CO2 에서 불필요 한 아미노산 보충 DMEM에 유지 하 고 문화 인큐베이터입니다.
- SV40 불후 mlkl-/- MEFs 제어 역방향 항생물질 transactivator (rtTA)와 transduce-blasticidin 저항 유전자 (우리의 수정된 플라스 미드)를 포함 하는 플라스 미드에서 표현 하는 레트로 바이러스를 포함 하 고 1에 대 한 치료 5 μ g/mL blasticidin rtTA28안정적으로 표현 하는 셀에 대 한 선택과 주.
- 공상 MLKL를 포함 하는 Dox를 유도할 수 있는 retroviral 벡터와 rtTA 표현 MEFs transduce (pRetroX-NBB140-2xFV-금성-순수 하지 않아) 4 μ g/mL puromycin를 사용 하 여 변환 후 1 주 2 일에 대 한 선택.
2. 라이브 셀 현미경 이미징 Necroptosis MLKL 중재의
- 플레이트 mlkl-/- NBB140을 표현 하는 MEFs-2xFV-24에서 잘 (1 mL/잘) 당 50, 000 셀의 밀도에서 금성 판, 고 밤새 품 어 (그림 2A). 라이브 셀 자동된 셀 카운팅 ( 재료의 표참조)에 대 한 얼룩 사용 합니다.
- Dox 12 h에 대 한 세포 치료 (0.5 μ g/mL) NBB140의 표현을 유도-2xFV-금성.
- 25 nM 멤브레인 스며들 지 않는 녹색 형광 외 25 nM FKBP dimerizer (Dim)와 necroptosis를 유도 표준 DMEM에 ( 재료의 표참조) 염색 (1.2 참조). NBB140에 의해 그들의 원형질 막 무결성은 손상으로 necroptosis를 받고 셀 염료 축적-파열 중재. 3 중 또는 quadruplicate에서 분석을 수행 합니다.
- 단일 또는 듀얼 컬러 이미징 시스템 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 necroptosis을 모니터링 하려면 혈관 포유류 조직 문화 인큐베이터에 각각 이미징 장치에 놓습니다.
- 소프트웨어를 오픈 ( 재료의 표참조) 곧 스캔 작업 목록에서 일정 탭을 선택.
참고:: 이 프로토콜은 단일 색상 시스템을 사용 하 여 이미징 이지만 비슷한 소프트웨어가 듀얼 컬러 시스템에서 사용할 수 있습니다. - 속성 탭에서 "실제 레이아웃" 탭에 "빨리 형광" "쟁반, 그릇, 검색 유형", 그리고 "스캔 패턴"을 선택 합니다.
- "스캔 시간"를 클릭 하 여 "타임 라인" 창에 총 시간 포인트와 수집 (일반적으로 1 수집 1 h 6 12 h, h 또는 빠른-속도 론 necroptosis에 대 한 모든 5 분 마다 0.5 h)의 주파수를 추가 하 고 "응용 프로그램을 선택 하 여 이미지 수집 시작 히 "(빨간 버튼)
- Necroptosis 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 계량 ( 재료의 표참조) ","개체 세기 새로운 분석 배경 수준 이상의 고정 분할 임계값"," 작업 창에서 선택 하 여를 유혹 하 여 결정 될 수 있다는 분석에 사용 된 여러 이미지에 배경 영역에 마우스 커서입니다.
- 현재 이미지를 사용 하 여 Previewing를 선택 하 여 형광 개체를 검토 하 고 필요에 따라 임계값 수준을 수정.
- "발사 새로운 분석" 탭을 열어 녹색 형광 카운트를 통합, "시간 범위"를 선택, 선택 분석 "분석 작업 이름"를 입력 하 고 "확인"을 눌러 하 웰 스.
- 액세스 각 작업 이름을 두 번 클릭 하 고 외부 그래픽 소프트웨어에서 추가 분석을 위해 그래프/내보내기 창에서 내보내기로 "분석 작업" 탭에서 데이터를 분석 ( 재료의 표참조).
- 녹색 형광 긍정적인 (+ ve)으로 데이터 카운트/m m2 을 quantitate 또는 합류 하 여 카운트를 정상화 하 고 녹색 형광 + ve 카운트/합류로 데이터를 표현 한다.
- 필요에 따라 실험 끝점에서 100 셀 얼룩 막 permeant 녹색 형광의 nM 염색 ( 재료의 표참조). 끝점에서 녹색 형광/녹색 형광의 비율로 서 %necroptotic 셀으로 데이터를 정상화.
3. 라이브 셀 Confocal 현미경 이미징 플라즈마 멤브레인 모집 및 MLKL에 의해 Permeabilization의
- 플레이트 mlkl-/- NBB140을 표현 하는 MEFs-2xFV-유리에 잘 (0.5 mL/잘) 당 20000 셀의 밀도에서 금성 4 잘 현미경 챔버와 PBS에서 30 분 동안 37 ° C에서 50 µ g/mL fibronectin 청소용된 바닥, ~ 12 h ( 에 대 한 품 어 그림 2B).
- Dox 셀 치료 (0.5 μ g/mL) ~ 12 h NBB140의 표현을 유도를 위한-2xFV-금성.
- Necroptosis 25 포함 된 신선한 매체 (1 mL/음) 잠복기에 의해 유도 nM NBB140유도 Dim-2xFV-금성 활성화와 전 좌 원형질 막에.
- 환경 제어와는 63 거꾸로 스탠드에 내장 하는 confocal 현미경 검사는 회전 디스크 레이저 챔버 위 1.4 나 목표 수집 선택의 소프트웨어를 사용 하 여 이미징 시작 ( 재료의 표참조).
- 소프트웨어를 초기화, 선택 하 고 "포커스" 아이콘과 YFP 필터 구성 (여기 파장 515 nm).
- 보기의 필드와 초점 비행기를 찾아서 "명확한 초점" 탭을 사용 하 여 시스템을 유지 관리 하는 초점을 참여.
- 수집을 시작 하려면 다음 필터 구성, 적절 한 EMCCD 카메라 노출 시간과 강화, 및 이득 취득의 길이 간격을 포함 하 여 시간 경과 인수 매개 변수 할당 "캡처" 탭을 선택 합니다.
- 형광 NBB140의 세포질 재분배를 모니터링-2xFV-necroptosis 인수 동안 금성 단백질 이미지 마다 10 EMCCD 카메라 (동영상 1) 515 nm 레이저를 사용 하 여 s.
참고: Photobleaching 형광 단백질 영상과 관심사 이다. 금성은 photobleaching29에 더 강한 형광 단백질 중 하나입니다. 형광 단백질 photobleaching에 더 취약을 사용 하는 경우 이미지 매일 30 s 이상 이미징 시간 포인트 사이의 신호의 복구를 허용 하도록. - NBB140의 플라즈마 멤브레인 협회를 모니터링 하려면-2xFV-necroptosis, 동안 금성 이미지 마다 10의 샘플 준비 3.3에서 총 내부 반사 형광에 의해 사용 하 여 자동화 된 TIRF 슬라이더를 갖춘 현미경 (TIRF) 현미경 및 100 X 1.4 나 목적 그리고 EMCCD 카메라 (동영상 2). 단계 3.5-3.7, 하지만 현미경 챔버의 샘플 및 아래쪽 유리 두께 따라 TIRF 초점 탭 TIRF 각도 조정.
참고: LCK-C-RFP와 같은 플라즈마 멤브레인 마커로 사용할 수 있습니다 컨트롤로 TIRF 분석에서 플라즈마 멤브레인 지역화. - 가우스 함수 (마 알고리즘)의 부정적인 정규화 된 두 번째 파생 된 회선으로 품질을 향상 시키기 위해 처리 하는 이미지를 수행 합니다.
4입니다. 전자 현미경 검사 법
- 플레이트 mlkl-/- NBB140을 표현 하는 MEFs-2xFV-플라즈마 코팅 150 m m에 5 백만 셀의 밀도에서 금성 문화 접시를 셀, 12 h (그림 3)에 대 한 품 어.
- Doxycycline 셀 치료 (0.5 μ g/mL) 주의1-140의 표현을 유도-2xFV-12 h에 대 한 비너스.
- 유도 NBB140-2xFV-금성 활성화 및 25와 원형질 막에 전 5 분 동안 homodimerizer의 nM. 이 이번 라이브 셀 이미징에 관찰 하는 necroptosis의 활동에서 설정 됩니다.
- 미디어를 제거 하 고 10 mL의 2.5%도, 2% paraformaldehyde 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 ph 7.4 (cacodylate 버퍼) 37 ° c.에 미리 예 열을 사용 하 여 셀을 수정
- 된다고 하 여 샘플을 수집 하 고 500 x g에서 10 분에 대 한 샘플을 회전. 폐기는 상쾌한.
- 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 1.5% 칼륨 ferrocyanide 감소 2% 오스뮴 tetroxide에 1.5 h에 대 한 샘플 접미사 오스뮴 tetroxide 얼룩 에이전트에서에서 널리 이용 된다 가장 대비를 제공 하는. 우리는 SEM 셀 necroptosis를 겪고 전에 예비 분석으로 가장을 사용 합니다.
- 500 x g, 린스 버퍼에 다음에 5 번 5 분 초순에에서 샘플을 린스 (4.6 참조), 물, 그리고 자동 프로세서에 에탄올. 폐기는 상쾌한.
- SEM에 대 한 1 %uranyl 아세테이트와 aspartate 중 금속 얼룩31이전 고정된 샘플 얼룩.
- 탈수 알코올 및 프로필 렌 산화물 솔루션의 등급된 시리즈를 통해 샘플.
- 하드 수 지 수 지 블록을 얻기 위해32 에 샘플을 포함 합니다.
- 분석의 올바른 영역을 결정 하는 0.5 μ m의 두꺼운 부분을 잘라.
- 전기 전도성 금속 (리 듐)의 초박형 필름으로 샘플 코트.
- 이미지 및 분석 샘플 (그림 3). 정량화, 대 한 수 지 블록 표면에 노출 된 세포의 낮은 확대 이미지 5에서 스캔 되는 전자 현미경을 사용 하 여 케빈.
- SEM으로 촬영 된 개별 이미지에 걸쳐 세포를 시각화 하거나 이미징 소프트웨어 하나의 연속 이미지30으로 여러 분야의 보기 가입 활용 될 수 있습니다. 대략 100 셀 셀 선택의 소프트웨어에 고해상도 몽타주를 생성 하 여 이러한 방식으로 necroptosis를 겪고의 분수를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 ( 재료의 표참조).
참고: 미리 괴 사 성 또는 괴 사 성 고기의 진행과 정상 세포 기능 비교 SEM으로 괴 사 성 형태를 채 점 합니다. 이러한 기능에는 원형질 막 변경 microvilli 실종을 포함 하 여, 병합, 10에서 배열 하는 셀에 파열 nm 1 µ m 크기, 또는 적어도 30-40%의 cytosolic 셀 영역에 걸쳐 세포 기관이 구조의 손실.
5. 핵 자기 공명 (NMR) 분광학에 의해 MLKL의 지질 바인딩
- 15N 표시 NBB1-156 표준 단백질 표정 및 앞에서 설명한24로 정화 하 여 준비 합니다.
- 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol 염화 소금 (18:0 PI), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) 염화 소금 (18:1 PI) 얼음 처럼 차가운 CHCl3 각 1 mg/mL의 최종 농도 대 한 500 µ L에 500 µ g을 분해.
- 1 mg/mL 18:0, 18:1 실내 온도에서 1 분 동안 쥡니다 물 욕조에 PI를 sonicate 또는 얼음 물 혼합물에 5 분까지.
-
Aliquot 1 mg/mL 18:0 고 개별 NMR 적정 시리즈 (그림 4)에 대 한 깨끗 한 유리 튜브로 18:1 PI. 유리 밀폐 주사기를 사용 하 여 유기 용 매에 있는 전송 지질.
- 1 mg/mL 18:1 PI의 aliquot 132 µ L (어 금 니 질량 = 880.137 g/mol) CHCl3 125 µ M 농도에서 1200 µ L의 최종 물의 resuspension 볼륨에 대 한.
참고: 5mm NMR 튜브에 대 한 준비의 직렬 희석 볼륨 > 1000 µ L 및 최종 NMR 샘플의 볼륨 > 500 µ L. 3mm NMR 튜브에 대 한 준비의 직렬 희석 볼륨 > 300 µ L 및 최종 NMR 샘플의 볼륨 > 150 µ L.
- 1 mg/mL 18:1 PI의 aliquot 132 µ L (어 금 니 질량 = 880.137 g/mol) CHCl3 125 µ M 농도에서 1200 µ L의 최종 물의 resuspension 볼륨에 대 한.
- Aliquot 1 mg/mL 돼지 뇌 L-α-phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 염화 소금 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (뇌 PI (4, 5) P2) 깨끗 한 유리 튜브에.
- 아르곤 (Ar) 또는 질소 (N2) 유리 유리병 벽에 튀는 없이 유기 용 매를 증발을 적당 한 흐름의 가스 스트림 아래 튜브를 배치 합니다. 5 ~ 30 분 양의 10-200 µ L 유기 용 매에 대 한 일반적으로 충분 하다.
- 정렬 유리 vial(s) Büchner 또는 큰 족집게를 사용 하 여 진공 플라스 크의 하단에는 고무 마와 인감 및 진공 라인에 연결 하는 플라스틱 튜브를 연결. 잔여 유기 물 제거를 하룻밤 가벼운 진공 아래 플라스 크 철수
- 불활성 가스와 지질 영화 aliquots 오버레이, 밀폐 뚜껑으로 밀봉 하 고 장기 저장을 위해 사용 1 개월 이내 또는-80 ° C-20 ° C에서 저장 합니다.
- 세제 없이 NMR 샘플 버퍼 준비 (-Det) 20mm 나xHy포4 pH 6.8, 10% D2O와 20mm 나xHy포4 pH 6.8를 포함 하는 세제 (+ Det) 포함 된 10% D2O, 0.34 m m n-라우릴-β-D-maltopyranoside (DDM).
- 추가 + 원하는 농도 달성 하 여 최대 30 분, 10 분 동안 쥡니다 번갈아 물 목욕에서 sonicate 지질 영화와 유리 유리병에 Det 버퍼 다음 검사.
참고: 쥡니다 샘플을 따뜻하게 수 있습니다. 최종 단백질 샘플 재구성 하기 전에 15 분 동안 실내 온도에 냉각 수 있습니다. - 지질 세제 micelles + 1:1 혼합물의 쥡니다를 사용 하 여 원하는 농도 시리즈에 대 한 Det 버퍼의 직렬 희석을 수행 합니다. 125 µ M 지질 농도에서 시작, 3 개의 반복 62.5 µ M, 31.3 µ M, 및 0.34 m m DDM 15.6 µ M 지질 얻을 것입니다.
- 제어를 준비 하 고 단백질과-Det에 첨가제의 NMR 샘플을 참조 하 고 + Det 버퍼, 각각. 단백질 및 지질에의 각 희석에 첨가제 + Det 버퍼 추가 합니다.
참고: 15N NBB156, 단백질은 40 µ M의 최종 농도에 추가 및 Cys의 잔류물 감소 계속 2mm deuterated dithiothreitol 보충. - 3mm 또는 5mm NMR 튜브 (단계 5.4에서에서 참고 참조)을 샘플의 적절 한 볼륨을 전송 합니다.
- 수동으로 NMR 악기에서 샘플 로드 하거나 SampleCase 로더 같은 자동화 플랫폼에 정렬 합니다.
- 2D 1H-15N 상관 관계 스펙트럼 뒤에 최적화 된 가로 휴식 분광학 (TROSY)으로 품질 관리로 1H 양성자 스펙트럼에 대 한 표준 펄스 프로그램을 사용 하 여 복합 NMR 스펙트럼을 취득 또는 heteronuclear 여러 양자 일관성 (SOFAST-HMQC)33.
참고: 3 mm NMR 튜브의 사용 1 H-15N TROSY (3 h) 또는 1H-15N SOFAST-HMQC (~ 90 분) 64 검사 필요합니다. 스캔 5mm NMR 튜브에 대 한 숫자를 절반 가까이 떨어졌다. - 처리 된 2D NMR 스펙트럼 분석 또는 사용자에 게 선택의 다른 소프트웨어에 대 한 카라 저장소34 에 추가할 수 있습니다.
-
각 단백질 상태에 대 한 3 개의 잘 분산 및 해결 피크에 대 한 2D NMR 공명 하 여 소프트웨어를 분석 합니다. NBB156 (그림 5A)를 포함 하는 각 버퍼 조건에 대 한 6 개의 봉우리의 각 피크 진폭을 기록 합니다.
- 카라를 사용 하 여 일괄 통합 목록 준비 (클릭 메인 메뉴 제목 "스펙트럼 | 설치 일괄 처리 목록 "...) 모든 스펙트럼의 수집 하 고 단일 피크 할당 파일을 사용 하 여 분석 (클릭 메인 메뉴 제목 "봉우리 | Peaklist 가져오기".. 그리고 6 총 봉우리, 3 내에 정의 된 각 단백질 상태에 대 한 사용자 정의 된.peaks 파일을 선택).
- 설정을 조정 ("통합 | 조정 피크 모델 "...) X-폭의 0.06 p p m과 Y-폭 0.30 p p m (클릭 메인 메뉴 제목 "통합 | 조정 피크 모델 "...) 두 메뉴 선택 (1에서에서 최종 출력을 기록 하기 전에. 메인 메뉴 제목 클릭 "통합 | 통합 배치 목록") (2. 메인 메뉴 제목 클릭 "봉우리 | 통합 테이블 내보내기") (그림 5B).
참고: 잔류물 M21, V53, 및 L105의 등뼈 아 미드 공명 NBB156 폐쇄 중괄호 상태에 대 한 할당 되었습니다. 오픈 중괄호 상태 G130 및 A141 잔류물의 등뼈 아 미드 공명과 엡실론 양성자 사이드 체인의 공명 W133 3D NMR 실험24를 사용 하 여에 할당 했다.
- 3 오픈 중괄호 진폭 참조 샘플의 평균 관련 된 두 개의 참조 정규화 요소를 계산 하 여 다른 자석 또는 샘플 조건에서 직접 비교를 위해 샘플을 정상화. NBB156 공명 정규화 요소 설정 부정적인 진폭을 사용 하 여 0 (표 2)에 대 한 확장 된 진폭을 계산 합니다.
예제: 1) 다른 자석에서 샘플 비교: 자석 A, NBB156DDM과 자석 B, NBB156+ DDM. 2) 세제 비교: 0.34 m DDM m 및 1.7 mM DDM. - 환산된 분수의 폐쇄-또는 오픈-중괄호 모든 스펙트럼의 최소 최대에 진폭의 범위와 함께 나누어 수집 무료 NBB156 와 완전히 오픈 중괄호 NBB156 에 적절 한 참조를 포함 하는 각 공명에 대 한 계산 세제입니다.
- 지질 농도의 기능으로 정규화 NMR 진폭을 플롯 하 고 오픈 중괄호 NBB156 다른 조건 (그림. 5 C)에서 일부를 비교 합니다.
참고: 또는, 지질 농도 대 한 폐쇄 중괄호 구조의 분수의 분석 수행할 수 있습니다 NBB156에 지질 바인딩 비교 하. 우리는 때문에 더 빠른 더 나은 보고서는 분수에 완전히-약혼 지질에 의해 전 분석을 선호 합니다.
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Representative Results
라이브 셀에서 레 귤 레이트 된 necroptosis 실행 시각화 하는 최소한의 잘린된 MLKL 구문, NBB140의 유도할 수 있는 표현을 통해 가능 했습니다-2xFV-금성. 이 구조 원형질 막 permeabilization 유도 하는 기능을 유지 하 고 FKBP 카세트 (2xFV)의 oligomerization Dim 유도 통해 활성화 됩니다. 우리는 관찰 하 고 라이브 셀 현미경 이미징, 모니터링 운동 (5 분 마다) 셀 스며들 지 않는 녹색 형광 DNA 바인딩 염료 (그림 6A)의 이해에 의해 necroptosis 계량. 유도할 수 있는이 시스템은 매우 강력 하 고, 그리고 mlkl-/- MEFs의 완전 한 necroptosis ~ 1 h NBB140을 표현 하는 Dox preincubated 셀의 oligomerization Dim 중재 시 내에서 관찰 될 수 있다-2xFV-금성 (그림 1A ). 우리는 빠른 속도 론 necroptosis로 이러한 조건을 참조 하십시오. 표현의 금성 혼자 ± Dim 또는 NBB140-2xFV-Dim의 부재에서 금성 necroptosis (그림 6A)을 유도 하지 않았다. 우리는 일반적으로 3 중 또는 quadruplicate 24-96 / 384-잘 접시에 3 복제 이미징 실험을 수행합니다.
NBB140의 시행된 이합체 화에 의해 유도 된 빠른-속도 론 necroptosis-2xFV-금성 (그림 6A) 원형질 막 파열의 putative 사형 집행으로 MLKL의 역할을 지원 합니다. NBB140의 재분배를 시각화 하려면-2xFV-플라즈마 막 necroptosis, 라이브 셀 confocal 현미경 검사 법 중에 금성 금성 형광을 모니터링 하는 데 사용 됩니다. 빠른 속도 necroptosis, Dim, 가진 외피의 2-3 분 이내 동안 코팅 셀 주변을 관찰 하는 금성 점진적 셀 (영화 1) 반올림 다음. NBB140-2xFV-원형질 막에 금성 축적 cytosol 플라즈마 멤브레인 유리 인터페이스에서 셀 볼륨에 초점을 맞추고 TIRF confocal 현미경 검사 법에 의해 시각 이다. 플라즈마 멤브레인 관련 금성 puncta Dim (동영상 2)를 가진 외피의 1-2 분 내에서 볼 수 있습니다. 따라서, 적용 NBB140의 oligomerization-2xFV-금성 유도 플라즈마 막에 그것의 급속 한 재배포.
스캐닝 전자 현미경 (SEM) 세포 necroptosis를 겪고 형태학 상 변화를 공개 하는 강력한 도구입니다. NBB140의 oligomerization에 의해 유도 된 빠른 necroptosis에서-2xFV-금성, 세포 변화 형태를 (시간 0 분) 정상 길쭉한 모양에서 반올림 하 고 부분적으로 파열 (10 분) (5 분)을 부 어 광범위 하 게는 cytosol는 해체 (20 분) (그림 6B) 사라졌다. Sem의 라이브 셀 현미경 MLKL 지역화 플라즈마 멤브레인 막 파열과 연관에서 이전 관측을 보완 합니다. 여기에 소개 하는 현미경 검사 법 기술 모니터링 평가 및 세포 수준에서 necroptosis 계량, NBB140연루를 보완 수단을 제공 하는 전반적인-2xFV-플라즈마 막 파열의 실행에서 금성.
MLKL 플라즈마 막 문의 직접 수 확인 하려면 우리는 재조합 NBB156를 사용 하 여 NMR 분광학에 의해 모니터링 지질 바인딩 실험 체 외에 수행 합니다. 지질-세제 micelles, 세제 (지질 프레 젠 테이 션에 대 한 차량)의 일정 한 농도 사용 하 여 변수 지질 농도의 직렬 희석 2D NMR 분광학에 의해 15N 표시 NBB156 바인딩에 대 한 테스트는 모니터 바인딩 유도 단백질의 변화입니다. NBB156 지질 억제 중괄호 지역 (아미노산 132-156) 폐쇄 및 헬리컬 치환에 바인딩 (폐쇄 중괄호) 오픈 하 고 본질적으로 무질서 나 란 (오픈 대비) (그림 7에 따라 주요 구조 변화를 겪 습 A). 2 차원 NMR 분광학 두 conformers (그림 7B-7 C)의 혼합물에 잔류물 정보 당 제공합니다. 우리는 이전 두 conformers24의 백본 amides를 할당. 우리가 쉽게 5A-C 수치에 설명 된 대로 주어진된 샘플에 폐쇄 하 고 오픈 conformers의 백분율을 모니터링할 수 있습니다. 우리는 (그림 5B) 바인딩 NBB156 에 불활성 DDM 세제에 pips NBB156 바인딩을 찾아보기이 바인딩 분석 결과 사용 하 여. 이 분석 결과에서 핍2 최고의 NBB156 ligand 125 µ M (그림 5C) 금지 중괄호의 완전 개방을 유도 하는. 반면, 포화 (18:0) PI와 불포화 (18:1) PI 가난한 NBB156 ligands 유도 부분 중괄호 (그림 5C) 동일한 조건 하에서 여는. 우리의 NMR 기반 지질 바인딩 분석 결과 인지질과 MLKL NBB156 의 상호 작용에 대 한 지원 증거를 제공 하 고 MLKL와 원형질 막 사이 직접 연결을 제안.
그림 1: 셀 라인 수정된 Tet에 3 G 유도할 수 있는 시스템을 은닉 안정. (A) 안정적인 셀 라인 pTREX-rtTA-폭발 뒤에 pRetroX-TRE3G-NBB140 와/mlkl-/- MEFs retroviral 변환에 의해 생성 된-2xFV-금성-순수 하지 않아. 각 변환 후속 분석을 이동 하기 전에 최대 1 주에 대 한 항생제 선택에 선행 되었다. (B) 유도할 수 있는 MLKL 식 시스템의 도식 적인 표현입니다. 이 시스템은 2 약물을 유도할 수 있는 규제 단계에 기반: i) MLKL 유전자 발현 및 단백질 생산 (+ Dox) 및 oligomerization (+ Dim)에 의해 활성화 ii). 사전, + Dox 단백질 생산을 유도 하는 경우 빠른 속도 론 necroptosis 트리거될 수 + 희미 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 빠른-속도 론 necroptosis의 라이브 셀 이미징 보여준다 MLKL의 급속 한 막 relocalization. (A) 빠른-속도 론 necroptosis 그림 1B 에서 유도 된 이미징 시스템을 모니터링할 수 있습니다. Necroptosis 셀 스며들 지 않는 녹색 형광 염료의 통풍 관에 의해 점수입니다. (B) epifluorescence 및 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 분석으로 빠른 속도 necroptosis의 라이브 셀 이미징의 도식 적인 표현입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 샘플 준비 및 분석의 도식 대표. 그림 1 에 설명 된 대로 유도 하는 빠른-속도 론 necroptosis에서 셀 Dim의 추가 후에 다른 시간 지점에서 접시에 고정 됩니다. 세포는 근 근이 살아가고 및 풀링, 중 금속 얼룩, 수 지를 포함, 및 이리듐 코팅 섹션 4에서에서 설명한 대로 다음 SEM 분석을 위한 준비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 15N NBB156 와 지질 세제 micelles의 NMR titrations에 대 한 준비 및 데이터 수집 샘플. 이 분석 결과 및 분석은 일반적으로 3-4 일에서 수행: 하루 동안 1, 지질 aliquots는 적절 하 고 하룻밤 건조. 2 일 동안 지질 영화는 지질 무료 버퍼 솔루션 rehydrated 지질 솔루션의 동일한 볼륨을 혼합 하 여 sonicated, 분석 결과 버퍼 ± 세제에 순차적으로 희석된 (2 배) rehydrated. 각 희석 되도록 균질 혼합 세제 micelles 후속 희석 이전에 지질 분포 sonicated 됩니다. 단백질 견본 직렬 지질 세제 micelle 희석에 혼합, 적절 한 NMR 튜브 로드, SampleCase 로더에 배치 (또는 수동으로 로드), 그리고 자동 NMR 데이터 수집을 시작 했다. 연속적인 일 동안, NMR 데이터 수집 완료 이며 2D NMR 분석에 의해 따라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : NBB156 의 지질 바인딩 기본 2D NMR을 사용 하 여 측정. (A)는 (빨간색) (블루)의 유무 DDM 시각 카라 0.34 m m에서 125 µ M PI (4, 5) P2 에서 1H-15N TROSY 스펙트럼 15N-NBB156 겹쳐. (B) 공명 진폭 측정 및 정규화에 대 한 사용 1 차원 조각 (녹색) 원시 스펙트럼은 프로그램 카라에 의해 진폭 및 통합에 대 한 경계와 중첩 됩니다. (C) phosphoinositide-DDM micelles 존재 NBB156 의 정규화 진폭 지질 농도 대 한 플롯. 핍2 는 중괄호의 전체 개방을 유도합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : NBB140의 oligomerization에 의해 유도 된 빠른-속도 론 necroptosis-2xFV- mlkl-/- MEFs 금성. (A) 셀 불 침투성, DNA 바인딩 녹색 형광 염료의 통풍 관의 높은 처리량 형광 영상에 의해 Necroptosis 정량화. 강력한 necroptosis 유도 NBB140oligomerization Dim 유도 시 관찰만-2xFV-금성, 하지만 Dim의 부재. 금성 전용 제어 실험도 수행 됩니다. 모든 조건 3 중에서 평균으로 그려집니다 및 한 담당자는 SD 복제. (B) 빠른-속도 론 necroptosis Dim 전자 현미경을 스캐닝과 시각의 유도. 형태학 상 과정 밝혀 변경 기본 necroptosis 셀 반올림 등 붓기 (5 분), 시간 (10 분), 원형질 막의 파열 하 고 cytosol (20 분)의 넘쳐 흐름. 각 샘플 시간 0 분에 셀의 유사한 수를 했다. 왼쪽에서 오른쪽, 확대 된 영역은 26, 32, 23, 및 핵과 36 셀을 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : Phosphoinositides NMR 분광학에 의해 모니터링을 NBB156 의 바인딩. (A) 1H-15N TROSY 스펙트럼 15N-NBB156의. 닫힌된 중괄호 스펙트럼의 정규화 또는 오픈 상태의 정량화 사용 공명 화학 교대 사각형 또는 원형, 각각 강조 표시 됩니다. NMR 서명 부재 또는 지질 세제 micelles의 존재 검출의 오른쪽, 회로도 NBB156 phosphoinositides의 부재에 DDM 세제 micelles을 바인딩할 하지 않습니다. (B) 1H-15N TROSY 스펙트럼 15N-NBB156 각각 지질 세제 micelles 존재의 겹쳐. (C) 단일 1H-15N TROSY 스펙트럼 15N-NBB156 패널 B.에서에서 각각 지질 세제 micelles 존재의 두 conformations의 혼합물에서 열리고 닫힌 conformations를 명확 하 게 감지 하 여 우리가 주어진된 샘플에 두 명의 conformers의 비율 계량 수 있습니다. 핍2 선호 지질 ligand NBB156 MLKL와 원형질 막 인지질 사이 직접 연결을 제공 하는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| PCR 버퍼 (10 배) | 5.0 Μ L |
| DNA 템플렛 (100 ng / µ L) | 1.0 Μ L |
| MLKL, 2에 대 한 cDNAs x FKBP, 금성) | |
| dNTPs (25 m m 각 NTP) | 0.5 Μ L |
| PCR 뇌관 전달 (F) (100 ng / µ L) | 1.3 Μ L |
| PCR 뇌관 전달 (FR (100 ng / µ L) | 1.3 Μ L |
| NBB140 F | ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT |
| NBB140 R | TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC |
| 2xFKBP F | ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT |
| 2xFKBP R | TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC |
| 금성 F | ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| 금성 R | TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC |
| DNA 중 합 효소 (2.5 U / µ L) | 1.0 Μ L |
| 이온을 제거 된 증류수 (ddH2O) | 39.9 Μ L |
| 총 반응 볼륨 | 50.0 Μ L |
| PCR 자전거 매개 변수 | |
| 1 주기 | 94-98 ° C; 45 s |
| 25-30 사이클 | 94-98 ° C; 45 s |
| 58 ° C; 45 s | |
| 72 ° C; 1-2 분 | |
| 1 주기 | 72 ° C; 10 분 |
표 1: NB의 PCR 반응 140 -2xFV-pRetroX-TRE3G에서 복제 제한 효소-기반 금성.
표 2: 계산 된 평균 여는 중괄호 상태로 두 번째 NMR 자석에서 수집 된 데이터의 정규화 된 변화를 설명 하는 그림 5에 제시 하는 NMR 스펙트럼에 대 한 원시 데이터. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: NBB의 oligomerization에 의해 유도 된 빠른-속도 론 necroptosis 140 -2xFV-금성 mlkl-/- MEFs. Confocal 현미경 검사 법 NBB140의 급속 한 전 좌를 보여주는 라이브-2xFV-FKBP 도메인의 시행된 oligomerization 후 원형질 막에는 cytosol에서 금성. 셀 그림 1에 설명 된 대로 처리 했다. 노란색: NBB140-2xFV-금성. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 2: TIRF 현미경의 빠른-속도 론 necroptosis. TIRF 현미경 mlkl/- NBB140표현 MEFs Dim의 추가 따라 원형질 막에 고속 (~ 2 분) relocalization 및 MLKL의 집계를 보여주는-2xFV-금성. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
우리는 우리가 MLKL 플라즈마 막 파열24의 putative 사형 집행으로 연루 결합 기술에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. MLKL이 중재 necroptosis 규제 규제 네트워크 해독, 뿐만 아니라 이러한 기술은 사용할 수 있습니다 하지 독립적으로 다른 적당 한 생물 학적 시스템의 특성. 실질적으로 말하자면, 이러한 기술은 매체-낮은 처리량 검색 도구입니다.
우리는 정기적으로 라이브 셀 이미징 NBB140의 사용-2xFV-금성-necroptosis, 그리고 mechanistically necroptosis mutagenesis 통해 및 작은 분자 화학을 사용 하 여 MLKL의 규정을 해 부를 다른 MLKL 구조에 의해 유도 된 중재 조사 합니다. 특히, 우리와 다른 그룹을 인간의 증명 및 인간에서 necroptosis 및 마우스 셀 라인 NBB의 최소한의 영역을 포함 하는 MLKL의 마우스 구조 중재 수 있습니다. 하나 MLKL이 중재 necroptosis 관리 경고는 RIPK3 및 MLKL 상호 작용의 업스트림 자극에 따라 TNF, smac mimetics 및 caspase 금지 의 조합에 의해 관찰 하는 종 중 분 방지 종 특이성을 보고 25,,3536. 따라서, 인간의 마우스 RIPK3 및 MLKL 단백질이 조건25,,3536에서 cross-react 하지 않습니다. 간 종 제한 하지 않으려면, 우리 소개 돌연변이 인간 MLKL 활성화 또는 NBB140에 대 한 같이 oligomerization 카세트를 사용 하는-2xFV-금성24. 인간의 NBB140 은 금지 영역을 유지 하 고 따라서 NBB140의 맥락에서 비활성 남아 구문-2xFV-금성. 2xFV의 이합체 화 NBB140 는 중괄호를 해제 하 여 활성화 하 생각 된다. 이 구문을 자연스럽 게24oligomerize 수 때문에 대조적으로, 인간의 NBB182 necroptosis oligomerization의 부재에도 유도 합니다. 또한, 돌연변이 (R30A, R30E, E136A, 및 E136R)을 가리킨 RIPK3 인 산화24로 활성화를 위한 필요를 극복 하는 전장 인간 MLKL의 맥락에서 NB 지역 활성화. 또한, 우리 dimerizable 인간의 RIPK3를 재구성 (리안-2xFV-RIPK3)와 Dox를 유도할 수 있는 전체 길이 인간의 MLKL-비너스, 호환 되는 necroptosis/ripk3-/- mlkl-/- MEFs24 에 견고 하 게 유도 . 다른 최근 추가 돌연변이 또는 종 특이성 장벽25를 극복할 수 있는 MLKL 구조를 바꾼 인간 마우스 도메인 공개.
우리는 일반적으로 96 잘 접시에 몇 가지 범위 찾기 실험을 수행 하 여 necroptosis 분석 결과 상태를 최적화 합니다. 우리 다음 후속 조치 보완 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)으로 다중화에 대 한 충분 한 세포와 같은 샘플에 이후에 수행 하는 서쪽 더 럽 히 분석 제공 하는 24-잘 접시에 최적화 된 실험 마지막 시간 이미징 직후 포인트. 현재, 라이브 셀 이미징은 많은 응용 프로그램에 대 한 라벨링 가능성 제한 녹색과 적색 형광의 탐지에 기반 하 고 있다. 녹색 형광 염료에 일반적인 대안이 이다는 셀 스며들 지 않는 DNA 바인딩 형광 염료 propidium 요오드 화물 (PI). 듀얼 컬러 이미징 인스트루먼트 necroptosis 이미징 유틸리티 및 정보 콘텐츠를 향상 시키는 보완 녹색 또는 빨간색 형광 단백질이 염료를 사용 하는 옵션을 제공 합니다.
그것의 활성화 후 원형질 막에 이동 하는 MLKL의 능력 라이브 현미경이이 단백질의 생물학을 공부 하는 선택의 기술을 만들고는 형태학 실시간에 따라 기본 necroptosis를 변경. TIRF 현미경 공동 원형질 막에 지역화 마커 존재 실행 하는 경우에 특히 명백 하 게 플라즈마 멤브레인에 MLKL 단백질 집계를 해결 합니다. 우리는 플라즈마 막 공동 지역화24마커로 LCK-C-RFP를 사용합니다. 태그 단백질 다른 fluorophores, 관심의 능력 또한 공부 동시에 같은 프로세스에 관련 된 여러 단백질의 활동을 수 있습니다. 슈퍼 해상도 현미경의 다음 세대는 부분적으로 표준 confocal 현미경 검사 법에서 회절 한계 문제를 극복 하 고 중재 하는 MLKL necroptosis의 추가 기능을 가능성이 있다.
Necroptosis의 특징 중 하나는 원형질 막 permeabilization입니다. 몇 가지 기술을 직접 계량 수 또는 막 파열을 나타냅니다, 경우에 그들만 MLKL에 의해 유도 된 플라즈마 멤브레인 무결성에 불연속을 시각화할 수 있습니다. 가장 해상도의 최고 힘이 있다, 하는 동안 sem의 큰 견본 영역을 매핑할 수가 있다. 이 기능을 데이터의 큰 볼륨을 관리할 수 있게 하는 새롭고 강력한 소프트웨어의 개발과 결합 세포 형태학 특성에 SEM의 유틸리티를 강화 했다. 또한, sem의 중심 이온 빔 등의 시스템을 사용할 경우 3 차원 개조를 허용 하는 연속 샘플 섹션을 스캔 수 이기도 합니다. EM 분석의 단점 중 일부 샘플 처리 및 분석에 계측 및 유지 관리 비용, 고도로 전문화 된 직원, 그리고 상당한 시간 투자의 필요성을 포함합니다.
점 오 점 분석 실험 MLKL와 원형질 막 인지질16,27사이 직접 연결을 원래 사용 되었습니다. 우리의 NMR 기반 지질 바인딩 분석 결과 결정적으로 특정 인지질 바인딩, 선택의 MLKL ligand로 핍2 강조에 MLKL 연루. 우리의 결과 phosphatidylinositol NBB156 바인딩에 acyl 체인 채도의 해로운 효과 보여 줍니다. 그럼에도 불구 하 고, 어떻게 MLKL에 바인딩 핍2및 잠재적으로 다른 인지질, 원형질 막 파열 남아 알 수 없는에 발생합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 다른 인지질 MLKL 바인딩을 위해 테스트할 수 있습니다. 우리의 분석 결과 역할을 necroptosis MLKL 중재의 새로운 모델을 테스트 하기 위한 훌륭한 도구로 지질 바인딩 특정 기여를 정확 하 게 MLKL 및 다양 한 ligands의 돌연변이 함께 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 그들의 지질 바인딩 프로필이 다른 막 관련 시스템에 대 한 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
없음입니다.
Acknowledgments
없음입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
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