Summary
Мы приводим методы для характеризации MLKL-опосредованной плазматической мембраны разрыв в necroptosis, включая обычные и конфокальная микроскопия клеток изображений, сканирующей электронной микроскопии и привязки на основе ЯМР липидов.
Abstract
Necroptosis это путь запрограммированной клеточной смерти вызваны активации рецептора, взаимодействующих киназу 3 (RIPK3), которая фосфорилирует и активирует смешанной родословной киназы как домен pseudokinase, MLKL, разрыв или разрушения плазматической мембраны . Necroptosis это воспалительные путь, связанный с несколькими патологий, включая аутоиммунные заболевания, инфекционные и сердечно-сосудистых заболеваний, инсульта, нейродегенеративные и рак. Здесь мы описываем протоколы, которые могут использоваться для характеристики MLKL как палач разрыв мембраны плазмы в necroptosis. Мы визуализировать процесс necroptosis в клеток с использованием клеток изображений с обычными и конфокальный флуоресцентной микроскопии и фиксированных ячеек с помощью электронной микроскопии, которые вместе показали перераспределения MLKL от цитозоль для плазмы мембрана до индукции больших отверстий в плазматической мембраны. Мы представляем в vitro ядерного магнитного резонанса (ЯМР) анализ с использованием липиды для выявления предполагаемых модуляторы MLKL-опосредованной necroptosis. На основе этого метода, мы определили как важнейших связующих MLKL, которые требуются для ориентации плазматической мембраны и permeabilization в necroptosis количественные липидов привязки предпочтений и фосфатидилхолин инозитол фосфаты (PIPs).
Introduction
Определение генетических компонентов necroptosis способствовало использование животных моделей для проверки причастности necroptosis в физиологии и болезни1,2,3,4,5. Нокаут RIPK3 или MLKL в мышах имеет минимальные последствия развития и взрослого гомеостаза, предполагая, что necroptosis не имеет важное значение для жизни3,6. Кроме того некоторые виды не содержат RIPK3 или MLKL генов, поддерживая роль неосновных necroptosis в животных,7,8. С другой стороны сложные нокаут животных моделей с различными патологиями, индуцированной в лаборатории показали важную роль necroptosis в воспаление и врожденный иммунитет, вирусные инфекции9,10, 11 , 12.
Necroptosis может быть активирован несколькими способами передачи сигналов через различные врожденного иммунитета датчики, все из которых приводят к активации RIPK31,,1314. Активные RIPK3 в свою очередь фосфорилирует и активирует MLKL3,4,5,6,,78,9,10 ,11,12,13,14,,1516,17,18. Наиболее изучены, и возможно наиболее сложные пути, ведущие к активации RIPK3 включает смерть рецептор перевязки, который может разветвлять каждой присваивать по течению состав тонального комплексов либо навести apoptosis или necroptosis1. Necroptosis наступает при сигнализации через RIPK1 благоприятствования и результаты участия RIPK319,20. Этот результат легко благоприятствования по фармакологическим ингибирования или генетических удаления caspase 8, предполагаемый эндогенных ингибиторов necroptosis, которая держит в страхе necroptosis. RIPK1 связывается и активирует RIPK3. Еще один способ, чтобы активировать necroptosis — через Толл подобные рецепторы TLR3/TLR4 сигнализации, который привлекает и активирует RIPK3 через МДП домен содержащих вызывая адаптер-интерферона β (TRIF)21. Еще еще один способ умереть от necroptosis является активация ДНК датчика DAI, который непосредственно занимается и активирует RIPK322.
MLKL — цитозольной белок состоит из N-терминальный спирали расслоение (NB) домена и домен pseudokinase C-терминал (psKD) соединены регулирования Брейс область3. В нормальных клетках MLKL находится в цитозоле, где он считается неактивного комплекса с RIPK314. Активация necroptosis вызывает фосфорилирование RIPK3 MLKL в петле активации psKD, и потенциально дополнительные сайты в NB и фигурная скобка3,15,23. Фосфорилирование вызывает конформационные изменения в MLKL, что приводит к диссоциации от RIPK314. Плохо понимали конформационные изменения версии скобу с psKD24. Брейс, которая содержит 2 спиралей, посредником олигомеризации MLKL в предполагаемый тример через C-терминала спирали25. N-терминальный спирали скобу подавляет NB домен, который имеет важное значение для мембраны permeabilization24,26. В изоляции NB домен достаточно, чтобы побудить плазматической мембраны permeabilization и necroptosis16,24,27. Про necroptotic активность NB была воссоздана в мыши эмбриональных фибробластов в MLKL (mlkl- / - MEFs). NB — это домен привязки липидов, что преимущественно занимается дифосфат фосфатидилинозитол 4,5 фосфолипидов (пункт2). Мы предложили поэтапного механизм активации MLKL, в котором Брейс олигомеризации облегчает набор MLKL к плазматической мембране через слабого взаимодействия NB с PIP2 полярные начальник группы24. В мембраны NB подвергается регулируемого воздействия дополнительного высокоспецифичные связывающие сайта для пункта2, который замаскированы скобу в неактивных MLKL. В целом несколько взаимодействий NB с PIP2 дестабилизировать плазматической мембраны, ведущих к ее разрыву, хотя молекулярный механизм этих событий не выяснены.
Здесь мы иллюстрируем конкретные методы, используемые для описания функции MLKL как палач necroptosis24. В частности мы сосредоточены на самых минимальных домен MLKL, NB и фигурной скобкой (НББ), который регулируется Брейс торможение и может быть активировано через насильственных димеризации побудить плазмы плодного и necroptosis. Мы описываем наши системы индуцибельной выражение в сочетании с насильственных наркотиков индуцированной FKBP-опосредованной димеризации для клеток и электронной микроскопии клетки проходят necroptosis. Кроме того мы показываем наши в vitro ЯМР анализ взаимодействия Нацбанка с phosphatidylinositols (PIPs).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. клонирование и клеточной линии поколения
- PCR усиливает НББ региона, соответствующий аминокислотных остатков 1-140 (140НББ), от человека MLKL cDNA для в кадр стандарта энзима ограничения based клонирование с олигомеризации домена 2 x FK506 белок (2xFKBP или 2xFV) и Венеры люминесцентные белка в доксициклин (Dox) - индуцибельной ретровирусной вектор pRetroX-TRE3G для получения НББ140- 2xFV-Венера (Таблица 1, цифры 1A-B).
- Основной mlkl- / - или ripk3- / - mlkl- / - мышь эмбриональных фибробластов (MEFs) получено от соответствующих доступных мышей в зеленый лаборатории переходных трансфекции с SV40-большой антигена увековечивают выражая плазмиды. Выберите увековечен клетки в ~ 1-2 недели и поддерживать в DMEM дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамином, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, пируват натрия 1 мм и заменимые аминокислоты при 37 ° C и 5% CO2 в стандартные ткани Культура инкубаторы.
- Передают SV40, увековечено mlkl- / - MEFs с обратной тетрациклин контролируется transactivator (rtTA)-содержащих ретровируса, выразил от плазмида, содержащие ген сопротивления blasticidin (наш модифицированных плазмида) и лечения для 1 Неделя с 5 мкг/мл blasticidin для выбора ячеек, стабильно выражая rtTA28.
- Передают rtTA выражая MEFs с Dox индуцибельной ретровирусной вектор, содержащий химерных MLKL (pRetroX НББ140-2xFV-Венера-puro) и выберите с помощью 4 мкг/мл puromycin для одной недели, 2 дня после трансдукции.
2. жить Cell микроскопии изображений MLKL-опосредованной Necroptosis
- Плита mlkl- / - MEFs, выражая НББ140-2xFV-Венера на плотности 50 000 ячеек на хорошо (1 мл/а) в 24 хорошо пластины и инкубировать на ночь (рисA). Использование клеток пятная для автоматизированного клеток подсчета (см. Таблицу материалы).
- Лечить клетки для 12 h с Dox (0,5 мкг/мл) чтобы побудить выражение НББ140-2xFV-Венера.
- Побудить necroptosis с 25 Нм FKBP dimerizer (дим) в дополнение к 25 Нм мембраны непроницаемый зеленый флуоресцентных красителей (см. Таблицу материалы) в стандартной среде DMEM (см. 1.2). Клетки проходят necroptosis накапливаться красителя, как их плазматической мембраны целостность нарушалась НББ140-опосредованной разрыв. Выполнение анализов в трех экземплярах или составленном.
- Для контроля за necroptosis, с помощью единого или двойного цвета тепловизионных систем (см. Таблицу материалы), место судов в соответствующих изображений блок, размещенный в инкубаторе млекопитающих культуры ткани.
- Открытое программное обеспечение (см. Таблицу материалы) и выберите вкладку Расписание предстоящих сканирует в списке задач.
Примечание: этот протокол для изображений с помощью систем одного цвета, но аналогичное программное обеспечение доступно для двойной цвет систем. - Выберите «лоток, судно, типы сканирования» и «Сканировать шаблон» вкладку «Физический макет» и «Быстро флуоресценции» на вкладке Свойства.
- Добавить «Сканирования время», нажав на окно «Временная шкала» и общее число моментов времени и частоты приобретения (обычно 1 приобретение каждые 0,5 ч до 1 ч для 6 ч до 12 ч, или каждые 5 минут для быстрого кинетика necroptosis) и начать получение изображения, выбрав «App ly» (красная кнопка).
- Количественно с помощью программного обеспечения для анализа изображения necroptosis (см. Таблицу материалы), выбрав из «Панели задач», «Объект подсчета новый анализ с фиксированным сегментации порог выше фонового уровня», который может определяться зависания курсор мыши над регионами фон в нескольких изображений, используемых в анализе.
- Изучить флуоресцентных объектов, выбрав Просмотр с использованием текущего изображения и соответствующим образом откорректируйте пороговых уровней.
- Интегрировать зеленой флуоресценцией графов, открыв вкладку «Запустить новый анализ», выберите «Диапазон времени», выберите скважин анализироваться, введите имя «задания анализ» и нажмите «OK».
- Доступ проанализированы данные из вкладки «Анализ работы», дважды щелкнув на имя соответствующего задания и экспорт из окна графика/экспорт для дополнительного анализа в внешнего графического программного обеспечения (см. Таблицу материалы).
- Quantitate данных как зеленая Флуоресценция положительный (+ ve) счетчики/мм2 или нормализовать отсчеты путем слияния и выражаем данные как зеленая Флуоресценция + ve графов/слияния.
- При необходимости, в экспериментальной конечной точке, запятнать клетки с 100 Нм мембраны permeant флуоресцентный зеленый краситель (см. Таблицу материалы). Нормализации данных для % necroptotic клетки как отношение флуоресценции зеленый/зеленый флуоресценции в конечной точке.
3. жить клеточной Confocal микроскопии изображений набора плазматической мембраны и Permeabilization по MLKL
- Плита mlkl- / - MEFs, выражая НББ140-2xFV-Венера на плотность 20 000 ячеек на колодец (0,5 мл/а) в стакане дно камеры 4-ну микроскопии, предварительно обработанных с 50 мкг/мл фибронектин в PBS при 37 ° C за 30 мин и проинкубируйте ~ 12 h ( Рисунок 2B).
- Лечить клетки с Dox (0,5 мкг/мл) для ~ 12 h побудить выражение НББ140-2xFV-Венера.
- Вызвать necroptosis, инкубации с свежими среднего (1 мл/а), содержащие 25 Нм Dim заставить Нацбанк140-2xFV-Венера активации и транслокации к плазматической мембраны.
- Разместите камеру на вращающийся диск лазерного сканирования конфокального микроскопа построен на Перевернутый стенд оборудован экологического контроля и 63 1.4 NA цель и начать изображений приобретение с помощью программного обеспечения по выбору (см. Таблицу материалы).
- Инициализировать программного обеспечения, выберите значок «Фокус» и рекламы ЯФП конфигурации фильтра (возбуждения волны 515 нм).
- Найдите поле зрения и фокальной плоскости и взаимодействовать с системой обслуживания фокус, используя вкладку «Определенный фокус».
- Чтобы начать приобретение, выберите вкладку «Захват», следуют назначения конфигурации фильтра, соответствующие EMCCD камеры воздействия времени и интенсификация выгоды и параметров промежуток времени приобретения, включая интервал и длина приобретения.
- Контролировать сотовой перераспределения флуоресцентные НББ140-2xFV-Венера белков во время necroptosis путем приобретения фото каждые 10 s EMCCD камеры с помощью 515 нм лазер (фильм 1).
Примечание: Фотообесцвечивание является проблемой с изображениями флуоресцентный белок. Венера является одним из более устойчивы флуоресцентных белков Фотообесцвечивание29. Если используются флуоресцентные белки, которые более чувствительны к Фотообесцвечивание, изображения каждые 30 s или больше времени, чтобы разрешить восстановление сигнала между изображений моментами времени. - Для мониторинга плазматической мембраны ассоциации НББ140-2xFV-Венера во время necroptosis, изображение каждые 10 s образца подготовленный 3.3 полное внутреннее отражение флуоресценции микроскопии (TIRF), с помощью микроскопа оснащен автоматической слайдер TIRF и 100 x 1.4 NA цель и EMCCD камера (фильм 2). Выполните шаги 3,5 — 3,7, но отрегулировать угол TIRF в закладке фокус TIRF согласно толщины стекла образца и нижней палаты микроскопии.
Примечание: маркеры плазматическую мембрану например LCK-C-ППП может использоваться как элементы управления для локализации плазматической мембраны в анализе TIRF. - Выполнение обработки для повышения качества, свертка с отрицательным нормализованных второй производной функцией Гаусса (Марр алгоритм) изображений.
4. Электронная микроскопия
- Плита mlkl- / - MEFs, выражая НББ140-2xFV-Венера на плотности тарелок 5 миллионов клеток в плазме покрытием 150 мм ячейку культуры блюдо и инкубировать в течение 12 ч (рис. 3).
- Лечить клетки с доксициклин (0,5 мкг/мл) чтобы побудить выражение NB1-140-2xFV-Венера в течение 12 ч.
- Заставить Нацбанк140-2xFV-Венера активации и транслокации к плазматической мембраны с 25 Нм homodimerizer 5 мин. Это время устанавливается из кинетика necroptosis наблюдается в клеток.
- Удалите средства массовой информации и исправить клеток с использованием 10 мл 2,5% глютаральдегид, 2% параформальдегида в 0,1 М натрия cacodylate буфер рН 7,4 (cacodylate буфер) предварительно нагревают при 37 ° C.
- Собирать образца соскабливания и спина образцы для 10 мин на 500 x g. Выбросите супернатант.
- Постфиксная образца для 1,5 h в снижение 2% осмия тетраоксид с 1,5% Ферроцианид калия в буфер cacodylate натрия 0,1 М. Осмия тетраоксид является агентом окрашивание, широко используется в ТЕА для обеспечения контраст. Мы использовали ТЕА как предварительный анализ до SEM клетки проходят necroptosis.
- Промойте образца 5 раз в ультрачистая вода для 5 мин на 500 x g, следуют полоскания в буфере (см. 4.6), воды и этанола на процессоре автоматический. Выбросите супернатант.
- Для SEM пятно ранее фиксированной образцы с 1% уранила ацетат и свинца аспартат пятно метал31.
- Обезвоживает образцы через серию градуированных алкоголя и пропилена оксида решений.
- Внедрите образца в32 жесткий смолы для получения блока смолой.
- Стрижки толщиной 0,5 мкм, чтобы определить правильную область анализа.
- Герб образцы с ультра-тонкой пленки электрически проведение металла (Iridium).
- Изображения и анализировать образцы (рис. 3). Для количественной оценки, низкий увеличение изображения поверхности блока смолы с открытой клетки сканируется на 5 кэВ, с помощью электронного микроскопа.
- Визуализировать клетки через отдельные изображения захвачен SEM или обработки изображений программное обеспечение может использоваться для объединения нескольких полей зрения в один непрерывный образ30. Примерно 100 клеток могут быть использованы для оценки доли клеток происходят necroptosis таким образом, создавая разрешением монтаж в программное обеспечение по выбору (см. Таблицу материалы).
Примечание: Озвучивание некротические морфологии, SEM сравнивает нормальной клеточной функции с прогрессированием предварительно некротические или некротических фенотипов. Эти функции включают изменения плазматической мембраны, включая исчезновение микроворсинки, уплощение, разрывов в клетках, начиная от 10 Нм до 1 мкм в размер, или потере структуры органеллы через по крайней мере 30 – 40% от площади цитозольной ячейки.
5. липидов связывание MLKL методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР)
- Подготовка 15N-меченых НЛС1-156 стандартных белков и очищение как описано24.
- Растворите в 500 мкг 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol Аммониевая соль (18:0 PI) и 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) соли аммония (18:1 PI) в 500 мкл ледяной КХКЛ3 каждый для окончательного концентрации 1 мг/мл.
- Sonicate 1 мг/мл 18:0 и 18:1 PI в водяной бане sonication за 1 мин при комнатной температуре или до 5 мин в ледяной воде смеси.
-
18:0 аликвота 1 мг/мл и 18:1 PI в чистые стекла флаконы для титрования серии отдельных ЯМР (рис. 4). Липиды передачи в органических растворителях с использованием стекла герметично шприцы.
- Аликвота 132 мкл 1 мг/мл 18:1 PI (молярная масса = 880.137 г/моль) в КХКЛ3 для окончательного ресуспендирования объемом 1200 мкл на 125 мкм концентрации.
Примечание: Для трубок 5 мм ЯМР, подготовить серийный разрежения объемы > 1000 мкл и окончательный ЯМР образец объемы > 500 мкл. Для трубы 3 мм ЯМР, подготовить серийный разрежения тома > 300 мкл и окончательный ЯМР образец тома > 150 мкл.
- Аликвота 132 мкл 1 мг/мл 18:1 PI (молярная масса = 880.137 г/моль) в КХКЛ3 для окончательного ресуспендирования объемом 1200 мкл на 125 мкм концентрации.
- Аликвота 1 мг/мл свиного мозга соли аммония L-α-фосфатидилинозитол-4,5-Бисфосфат в 20:9:1 КХКЛ3/метанола/H2O (мозга PI (4,5) P2) в чистые стекла флаконы.
- Место флаконы под поток Газообразный аргон (Ar) или азота (N2) с умеренного потока для испарения органических растворителей без брызг против стеклянный флакон стены. Пяти до тридцати минут обычно достаточно для томов 10 – 200 мкл концентрированного органического растворителя.
- Организовать vial(s) стекла в нижней части Бюхнера или термос с помощью большого пинцета, печать с резиновой пробкой и придают пластиковые трубы, подключенный к вакуумной линии. Эвакуировать колбу под мягкий вакууме на ночь, чтобы удалить остаточные органические.
- Наложение аликвоты липидной пленки с инертным газом, печать с герметичной крышкой и хранить при температуре-20 ° C для использования в течение одного месяца или -80 ° C для долгосрочного хранения.
- Подготовить ЯМР пример буферов без моющих средств (-Det) содержащий 20мм NaxHyPO4 рН 6,8, 10% D2O и с моющим средством (+ Det), содержащий 20мм NaxHyPO4 рН 6,8, 10% D2O, 0,34 мм н додецил β-D-maltopyranoside (DDM).
- Добавить + Det буфер стеклянный флакон с липидной пленки для достижения желаемой концентрации и sonicate в водяной бане до 30 мин, чередуя sonication за 10 мин, затем путем визуального осмотра.
Примечание: Sonication может согреть образца. Дайте прибору остыть до комнатной температуры за 15 мин до окончательного белка пример растворения. - Выполните последовательный разрежения мицеллы липидов-моющее средство в + Det буфера с использованием sonication смесей, 1:1 для нужной концентрации серии. Начиная с 125 мкм концентрации липидов, трех повторений даст 62,5 мкм, мкм 31.3 и 15.6 мкм липидов в 0,34 мм DDM.
- Подготовить управления и ссылки на примеры ЯМР белков и добавок в - Det и + Det буферов, соответственно. Добавьте белка и добавки для каждого разведения липидов в + Det буфера.
Примечание: Для 15N НББ156, белок добавляется конечная концентрация 40 мкм и дополнены Дитиотреитол 2 мм Транс сохранить остатки Cys сокращены. - Передать соответствующий объем выборок 5 мм или 3 мм пробирки для NMR (см. Примечание в шаге 5.4).
- Вручную загрузить образцы в ЯМР инструмент или организовать в платформу автоматизации как загрузчик SampleCase.
- Приобрести составные NMR спектров с использованием стандартных пульс программ для 1H Протон спектры как контроль качества, либо в виде поперечной релаксации оптимизированный спектроскопии (TROSY) следуют 2D 1H -15N корреляции спектры или гетероядерных несколько квантовой согласованности (SOFAST-HMQC)33.
Примечание: Использование трубы 3 мм ЯМР требует 64 сканирование для 1 H -15N TROSY (~ 3 h) или 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 мин.). Проверка числа уменьшаются вдвое для трубок 5 мм ЯМР. - Обработанные 2D NMR спектрами могут быть добавлены к Кара репозитория34 для анализа или другого программного обеспечения по выбору пользователя.
-
Анализ программного обеспечения путем пометки 2D ЯМР резонансы на три хорошо дисперсных и решены вершины для каждого государства, белка. Запись для каждого из шести вершины для каждого условия буфер, содержащий НББ156 (рис. 5A) пик амплитуд.
- Используйте Кара подготовить список партии интеграции (нажмите Главное меню заголовок «спектр | ««Настройка пакетный список»...) всех спектров собраны и анализировать с помощью файла назначения один пик (нажмите Главное меню заголовок «пики | Импорт Peaklist».. .and выбрать определяемые пользователем .peaks файл с 6 всего пиков, 3 для каждого белка государства, определенные в).
- Настройки параметров («интегратор | ««Настройте пик модель»...) X-ширины 0,06 ppm и Y-ширина 0,30 ppm (главное меню, нажмите заголовок «интегратор | ««Настройте пик модель»...) перед записью конечный результат в два меню выбора (1. Щелкните заголовок главного меню «интегратор | Интегрировать пакетный список») (2. Щелкните заголовок главного меню «Peaks | Экспорт таблицы интеграции») (рис. 5B).
Примечание: Костяк Амида резонансов для остатков M21, V53 и L105 были назначены для государства закрыты скобки156 НББ. Состояние открытых Брейс был назначен позвоночника Амида резонансы остатков G130 и А141 и Эпсилон Протон боковой цепи резонанс W133 с использованием 3D ЯМР эксперименты24.
- Нормализовать образцы для прямого сравнения из разных магнитов или примера условий путем усреднения три открытых Брейс амплитуд эталонных образцов и расчета коэффициента нормализации, касающиеся две ссылки. Вычислите масштабированных амплитуд НББ156 частотный диапазон с помощью нормализации фактор и установка негативные амплитуд до нуля (Таблица 2).
Примеры: 1) сравнение образцов из разных магнитов: Магнит A, NBB156+ DDM и магнит B, NBB156+ DDM. 2) моющим средством сравнения: 0,34 мм DDM и 1,7 мм DDM. - Рассчитать для каждого резонанс масштабированных дроби из закрытой - или открыть Брейс, разделив с диапазоном от минимальной до максимальной амплитуды всех спектров собранные содержащие соответствующие ссылки бесплатно НББ156 и полностью открыть скобка НББ156 в моющее средство.
- Участок нормализованных амплитуд ЯМР в зависимости от концентрации липидов и сравнить долю открыть скобка НББ156 в различных условиях (рис. 5 C).
Примечание: Кроме того, анализ часть закрыть скобку конформации против концентрации липидов могут выполняться для сравнения Связывание липидов НББ156. Мы предпочитаем бывший анализ, потому что это быстрее и лучше доклады о фракции полностью нанятые липиды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Визуализация исполнения регулируется necroptosis в живых клетках стало возможным благодаря индуцибельной выражение минимальный усеченная MLKL конструкции, NBB140-2xFV-Венера. Эта конструкция обеспечивает возможность побудить плазматической мембраны permeabilization и активируется через Dim индуцированной олигомеризации FKBP кассеты (2xFV). Мы наблюдать и количественно necroptosis, клеток микроскопии изображений, мониторинг кинетически (каждые 5 мин) поглощение красителя привязки ДНК клетки непроницаемый зеленый флуоресцирования (рисA). Эта индуцибельной система является очень надежной, и полная necroptosis mlkl- / - MEFs может наблюдаться в течение ~ 1 ч после Dim опосредованной олигомеризация Dox преинкубации клеток, которые выражают НББ140-2xFV-Венера (рис. 1A ). Мы называем эти условия быстро кинетика necroptosis. Выражение Венеры только ± Dim или НББ140-2xFV-Венера в отсутствие Dim не вызвать necroptosis(рис. 6). Мы обычно выполняют репликацию по крайней мере 3 изображений эксперименты в составленном в 24-, 96- или 384-ну пластин или экземплярах.
Быстро кинетика necroptosis индуцированных насильственных димеризации НББ140-2xFV-Венера (рисA) поддерживает роль MLKL как предполагаемый палач плазмы плодного. Чтобы визуализировать перераспределения НББ140-2xFV-Венеры к плазматической мембране во время necroptosis, конфокальная микроскопия живой клетки используется для мониторинга флуоресценции Венеры. Во время necroptosis быстро кинетика, в течение 2-3 мин инкубации с тусклым Венера, покрытие на периферии клетки наблюдается, следуют постепенно клетки округления (фильм 1). НББ140-2xFV-Венера накопления на плазматической мембраны визуализированное TIRF confocal микроскопии, который фокусируется на объем ячейки в интерфейсе мембраны стекло цитозоль плазмы. Связанные плазматической мембраны Венера puncta видны в течение 1 – 2 мин инкубации с Dim (фильм 2). Таким образом, соблюдение олигомеризации НББ140-2xFV-Венера заставляет его быстрого перераспределения к плазматической мембране.
Сканирующая электронная микроскопия (SEM) является мощным инструментом, чтобы раскрыть морфологические изменения в клетках, проходят necroptosis. При быстрой necroptosis индуцированных олигомеризации НББ140-2xFV-Венера, клетки изменения морфологии от нормальной удлиненной формы (время 0 мин) к округлые и поводков (5 мин) частично разрывом (10 мин) и подробно разобраны, где цитозоль имеет исчез (20 мин) (Рисунок 6B). SEM дополняет предыдущие замечания от клеток микроскопии, соотнося с плодного MLKL локализации на плазматической мембраны. В целом представленные здесь методики микроскопии предлагают дополнительные средства для мониторинга, оценки и количественного определения necroptosis на клеточном уровне и обвинить НББ140-2xFV-Венера в исполнении плазмы плодного.
Чтобы определить, если MLKL может напрямую связаться плазматической мембраны мы выполняем привязку в vitro липидов эксперименты, контролируется ЯМР спектроскопии с использованием рекомбинантного НББ156. Для привязки к 15N-меченых НББ156 серийных разведений мицелл липидов-моющее средство, с помощью постоянной концентрации моющего средства (автомобиль для презентации липидов) и переменной липидные концентрации, проверяются 2D ЯМР спектроскопии, который Привязка индуцированной отслеживает изменения в протеине. НББ156 претерпевает крупные структурные изменения после привязки сместить регионе ингибирующее Брейс (аминокислоты 132-156) от закрытого и винтовой липидов (закрыт скобка) для открытого и неразрывно неупорядоченных конформацию (открыть скобка) (рис. 7 A). Плоской NMR спектроскопии обеспечивает каждого остатков информацию о смеси обоих конформеров (Цифры 7B-7 C). Мы ранее назначенных амидов костяк обеих конформеров24. Мы можем легко контролировать процент закрытых и открытых конформеров в данной выборке, как описано в мультфильмов 5A-C. Используя этот assay привязки, мы исследуем НББ156 привязки пунктов DDM моющего средства, который является инертным НББ156 привязки (рис. 5B). В этот assay PIP2 является лучшим НББ156 лиганд, которая вызывает полное открытие ингибирующее скобу на 125 мкм (рис. 5C). В отличие от насыщенных (18:0) PI и ненасыщенных PI (18:1) являются бедные НББ156 лигандов, вызывая частичной Брейс, открытие на тех же условиях (рис. 5C). Наши ЯМР основанный липид привязки предоставляет доказательства для взаимодействия MLKL NBB156 с фосфолипидами и предлагает прямую связь между MLKL и плазматической мембраны.
Рисунок 1: Стабильный линия клетки укрывательство модифицированную тет-на 3 G индуцибельной систему. (A) стабильных клеточных линий были порожденных ретровирусных трансдукции mlkl- / - MEFs с pTREX-rtTA Взрыв последовал pRetroX-TRE3G-Нацбанк140-2xFV-Венера-puro. Каждый трансдукции последовали антибиотика выбора для до 1 недели до переезда последующие анализы. (B) схематическое представление системы индуцибельной выражение MLKL. Эта система основана на 2 наркотиков индуцибельной нормативные меры: i) MLKL экспрессии генов и белков производства (+ Dox) и ii) Активация олигомеризации (+ Dim). Когда производство белков индуцируется в заранее + Dox, быстро кинетика necroptosis могут быть вызваны, + Dim. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Live Клеточная томография быстро кинетика necroptosis показывает быстрое мембраны relocalization MLKL. (A) быстро кинетика necroptosis, вызванного как Рисунок 1B может контролироваться в систему обработки изображений. Necroptosis забил поглощения клеток непроницаемый зеленый Люминесцентную краску. (B) схематическое представление клеток изображений быстро кинетика necroptosis с эпифлуоресцентного и всего анализа микроскопии флуоресцирования (TIRF) внутреннего отражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Схематическое изображение сканирования электронная микроскопия (SEM) пробоподготовки и анализа. Клетки из фаст кинетика necroptosis индуцированных как описано в рисунке 1 фиксируются на плите в разное время точках после добавления Dim. Клетки затем подготовлен для анализа SEM соскоб и объединения, окрашивание хэви-метал, встраивание смолы и Иридиум покрытие, как описано в разделе 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Образец подготовки и сбора данных для ЯМР титрования 15N НББ156 и липидов-моющее средство мицелл. Этот assay и анализ обычно выполняется в 3 – 4 дня: день 1, липидов аликвоты обойтись и сушат в течение ночи. Во время 2-й день липидной пленки являются регидратации в Пробирной буфера ± моющие средства, sonicated и последовательно разреженных (два раза), смешивая равных объемах Регидратированные липидов решения с липидов свободного буферного раствора. Каждого разведения sonicated для обеспечения равномерного смешивания и распределение липидов в мицеллах моющего средства до последующих разведениях. Образцы протеина смешанные в разведениях серийный липидов-моющее средство мицеллы, загружаются в соответствующие пробирки для NMR, помещены в SampleCase погрузчик (или загружена вручную), и начинается автоматический сбор данных ЯМР. В течение последующих дней ЯМР сбор данных завершен и следуют 2D ЯМР анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Липидов привязки предпочтений НББ156 измеряется с помощью ЯМР 2D. (A) накладывается 1H -15N TROSY спектры для 15N-Нацбанк156 в присутствии (красный) или отсутствие (синий) 125 мкм PI (4,5) P2 в 0,34 мм DDM визуализирована в Кара. (B) одномерный ломтики резонансов, используемых для измерения амплитуды и нормализации. Сырые спектра (зеленый) накладывается с границей для амплитуды и интеграции в программе Кара. (C) нормированный амплитуд156 НББ в присутствии phosphoinositide-DDM мицеллы заговор против концентрации липидов. ПУНКТ2 вызывает полное открытие скобу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Fast кинетика necroptosis индуцированных олигомеризации НББ140-2xFV-Венера в/mlkl- / - MEFs. (A) Necroptosis квантификации по высокой пропускной способностью флуоресценции изображений поглощения клеток непроницаемый, ДНК связывающих зеленого флуоресцентного красителя. Надежные necroptosis индукции наблюдается только после Dim индуцированной олигомеризации НББ140-2xFV-Венера, но не в отсутствии Dim. Венера только управления являются также эксперименты. Все условия выполняются в трех экземплярах и выводятся как среднее и реплицировать SD от одного представителя. (B) быстро кинетика necroptosis индуцированных присутствии Дим визуализированы с растровая электронная микроскопия. Время, курс показывает морфологические изменения базовой necroptosis, включая округление клеток и отек (5 мин), разрыв мембраны плазмы (10 мин) и полное кровоподтек цитозоле (20 мин). Каждый образец имел аналогичное количество клеток на время 0 мин. Слева направо увеличенной в область содержит 26, 32, 23 и 36 клетки с ядрами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Связывание НББ156 до фосфоинозитидов контролируется ЯМР спектроскопии. (A) 1H -15N TROSY спектр 15N-Нацбанк156. Химические сдвиги резонансов, используется для нормализации спектра закрытая скобка или количественной оценки состояния открытых выделяются с квадрата или окружности, соответственно. Справа, схема ЯМР подписей, обнаружены в отсутствие или наличие мицеллы липидов-моющего средства. НББ156 не привязывает DDM стиральный порошок мицеллы в отсутствие фосфоинозитидов. (B) накладывается 1H -15N TROSY спектры 15N-Нацбанк156 в присутствии соответствующих мицеллы липидов-моющего средства. (C) один 1H -15N TROSY спектры 15N-Нацбанк156 в присутствии соответствующих мицеллы липидов-моющее средство из группы B. Путем обнаружения открытых и закрытых конформации однозначно в смеси двух конформации поддаётся доли двух конформеров в данной выборке. ПУНКТА2 является предпочтительным липидов лигандом НББ156 обеспечивая прямую связь между MLKL и фосфолипидов плазматической мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Буфер ПЦР (10 x) | 5.0 МКЛ |
| Шаблон ДНК (100 нг/мкл) | 1.0 МКЛ |
| cDNAs для MLKL, 2 x FKBP, Венера) | |
| дНТФ (25 мм каждый NTP) | 0.5 МКЛ |
| Праймеры PCR вперед (F) (100 нг/мкл) | 1.3 МКЛ |
| Праймеры PCR вперед (FR (100 нг/мкл) | 1.3 МКЛ |
| НББ140 F | ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT |
| НББ140 R | TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC |
| 2xFKBP F | ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT |
| 2xFKBP R | TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC |
| Венера F | ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| Венера R | TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC |
| ДНК-полимераза (2,5 U/мкл) | 1.0 МКЛ |
| Дистиллированной деионизированной воды (ddH2O) | 39.9 МКЛ |
| Общая реакция объем | 50.0 МКЛ |
| Велоспорт параметры ПЦР | |
| 1 цикл | 94-98 ° C; 45 s |
| 25 – 30 циклов | 94-98 ° C; 45 s |
| 58 ° C; 45 s | |
| 72 ° C; 1-2 мин | |
| 1 цикл | 72 ° C; 10 мин |
Таблица 1: реакции PCR НБ 140 -2xFV-Венера для энзима ограничения based клонирования в pRetroX-TRE3G.
Таблица 2: необработанные данные для NMR спектров, представлены на рисунке 5, иллюстрирующие нормализованных преобразование данных собранных от второй магнит ЯМР в состояние расчетный средний открытая фигурная скобка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой таблицы.
Фильм 1: Fast кинетика necroptosis индуцированных олигомеризации Нацбанк 140 -2xFV-Венера в mlkl- / - MEFs. Live confocal микроскопии, показаны быстрого транслокации НББ140-2xFV-Венера из цитозоль к плазматической мембране после насильственного олигомеризации FKBP домена. Клетки рассматривались как описано в рисунке 1. Желтый: НББ140-2xFV-Венера. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Фильм 2: TIRF микроскопии быстро кинетика necroptosis. TIRF микроскопии, показывая relocalization быстро (~ 2 мин) и агрегирования MLKL на плазматической мембране после добавления Dim mlkl- / - MEFs, выражая НББ140-2xFV-Венера. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы предоставляем протоколы для методов, которые мы объединили причастны MLKL как предполагаемый палач плазматической мембраны разрыв24. В дополнение к расшифровке регулирования сети, которая регулирует MLKL-опосредованной necroptosis, эти методы может использоваться самостоятельно для характеристики других подходящих биологических систем. Практически говоря, эти методы являются средне низкой пропускной обнаружения инструментов.
Мы регулярно использовали клеток изображений НББ140-2xFV-Венера-посредником, necroptosis и что вызванных другими MLKL конструкции, механически вскрыть регулирование MLKL в necroptosis через мутагенеза и, используя малые молекулы химических зонды. В частности мы и другие группы продемонстрировали, что человека и мыши конструкции MLKL, которые содержат минимальное региона НББ может посредничать necroptosis в человека и мыши клеточных линий. Один сообщил, что предостережение, управляющих MLKL-опосредованной necroptosis видов специфики взаимодействия RIPK3 и MLKL, который предотвращает перекрестной реактивности среди видов наблюдается на вышестоящем стимуляции сочетанием ФНО, Смак mimetics и ингибирование caspase 25,35,36. Соответственно человека и мыши, RIPK3 и MLKL белки не cross-react под эти условия по25,35,36. Чтобы обойти ограничения межвидовой, мы представляем мутации, которые активировать человека MLKL или использовать олигомеризации кассеты как показано ниже для НББ140-2xFV-Венера24. Человека НББ140 представляет собой конструкцию, которая поддерживает ингибирующее региона и поэтому остается неактивным в контексте НББ140-2xFV-Венера. Димеризация 2xFV считается активировать НББ140 , выпустив скобу. В отличие от человека НББ182 индуцирует necroptosis даже в отсутствие олигомеризации, потому что эта конструкция имеет возможность спонтанно oligomerize24. Кроме того, точка мутантов (R30A, R30E, E136A и E136R) Активация NB региона в контексте полнометражных человека MLKL преодолеть необходимость активации RIPK3 фосфорилирования24. Кроме того, мы восстановленный dimerizable человека RIPK3 (Лазурный 2xFV-RIPK3) и Dox индуцибельной полнометражного человека MLKL-Венера, которые совместимы и энергично стимулировать necroptosis в/ripk3- / - mlkl- / - MEFs24 . Другие недавно выяснилось, дополнительные мутации или человека мыши домен сменил MLKL конструкций, которые могут преодолеть видов специфика барьеры25.
Мы обычно оптимизации условий Пробирная necroptosis, выполнив несколько экспериментов дальности в 96-луночных пластины. Мы затем следовать с оптимизированной эксперименты в 24-ну пластин, которые обеспечивают достаточную клетки для мультиплексирования с дополнительных флуоресцентных активированных клеток сортируя (FACS) и Западный blotting анализ впоследствии же образцы сразу же после обработки изображений в последний раз точки. В настоящее время клеток основан на обнаружении зеленой и красной флуоресценции, ограничивая возможности маркировки для многих приложений. Общий альтернативой зеленый флуоресцентных красителей является ячейка непроницаемый ДНК связывающих Люминесцентную краску пропидий йодидом (PI). Двойной цвет изображений инструменты предлагают возможность использовать эти красители с взаимодополняющими зеленый или красный флуоресцентных белков для повышения полезности и информационного содержания necroptosis изображений.
MLKL возможность перемещать к плазматической мембране после его активации, делает живой микроскопии методика выбора для изучения биологии этого белка и следовать в режиме реального времени морфологические изменения базовой necroptosis. TIRF микроскопии недвусмысленно разрешает агрегатов MLKL белка на мембране плазмы, особенно при выполнении присутствии маркеры, которые совместно локализовать к плазматической мембраны. Мы использовали LCK-C-ППП в качестве маркера для плазматической мембраны Сопредседатель локализации24. Возможность тег протеинов интереса с различными флуорофоров, также позволяет одновременно изучить активность несколько белков, участвующих в том же процессе. Следующее поколение суперразрешением микроскопии частично преодолевает проблему дифракционный предел в стандартных confocal микроскопии и имеет потенциал, чтобы выявить дополнительные возможности при посредничестве MLKL necroptosis.
Одна из отличительных особенностей necroptosis является permeabilization плазматической мембраны. Даже если несколько методов можно количественно или косвенно указывают мембраны разрывов, только EM может визуализировать несплошностей в целостности плазматической мембраны, индуцированных MLKL. Хотя ТЕА высшая власть резолюции, SEM имеет возможность сопоставлять больших областей образца. Эта функция, в сочетании с разработкой новых и мощное программное обеспечение может управлять больший объем данных, повысило полезность SEM в характеристике морфологии клеток. Кроме того SEM также способна сканировать подряд образца разделы, позволяя 3D реконструкции при сочетании с другими системами, например сосредоточены ионного пучка. Некоторые из недостатков EM анализа включают в себя стоимость инструментария и обслуживания, необходимость высококвалифицированных сотрудников и значительное время инвестиций в пример обработки и анализа.
Первоначально были использованы анализов помаркой точка для прямого соединения между MLKL и плазматической мембраны фосфолипидов16,27. Наши пробирного привязки на основе ЯМР липидов окончательно подразумевает MLKL в привязке конкретных фосфолипидов, подчеркнув PIP2 как лиганд MLKL выбора. Наши результаты показывают пагубное воздействие ацильные цепи насыщения на НББ156 привязки фосфатидилинозитол. Тем не менее как MLKL привязки пункта2, и потенциально другие фосфолипидов, приводит к плазматической мембране разрыв остается неизвестной. Используя этот протокол может испытываться другие фосфолипидов для привязки к MLKL. Наши пробирного служит большой инструмент для тестирования новых моделей necroptosis, MLKL-посредником, он может использоваться с мутантами MLKL и различных лигандов определить конкретный вклад Связывание липидов. Кроме того она может использоваться для любых других систем мембране связанные допросить их профили Связывание липидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет.
Acknowledgments
Нет.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
- Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
- Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
- Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
- Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
- Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
- Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
- Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
- Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
- Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
- Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
- Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
- Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
- Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
- Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
- Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
- Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
- Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
- Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
- Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
- Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).
- Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
- Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
- Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
- Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).
