Summary
Her præsenterer vi en protokol for at vurdere organiseringen af astrocytic netværk. Den beskrevne metode minimerer bias for at give beskrivende foranstaltninger af disse netværk såsom celletal, størrelse, område og position inden for en kerne. Anisotropy vurderes med en vektorielle analyse.
Abstract
Det er blevet stadig mere klart, at astrocytter modulere neuronal funktion på synaptic og encellede niveau, men også på netværksniveau. Astrocytter er stærkt forbundet med hinanden gennem kløften vejkryds og kobling gennem disse knudepunkter er dynamisk og stærkt regulerede. Et spirende koncept er at astrocytic funktioner er specialiserede og tilpasset til funktionerne af neuronal kredsløbet som de er forbundet. Derfor er metoder til at måle forskellige parametre af astrocytic netværk for at bedre beskrive regler for deres kommunikation og kobling og til yderligere at forstå deres funktioner.
Her, ved hjælp af billede analyse software (fx., ImageJFIJI), vi beskriver en metode til at analysere Konfokal billeder af astrocytic netværk afsløret af farvestoffet-kobling. Disse metoder giver mulighed for 1) en automatiseret og upartiske påvisning af mærket celler, 2) beregningen af størrelsen af netværket, 3) beregning af de præferentielle orientering af farvestof spredes inden for netværket, og 4) Repositionering af netværk inden for området af interesse .
Denne analyse kan bruges til at karakterisere astrocytic netværk af et bestemt område, sammenligne net af forskellige områder knyttet til forskellige funktioner eller sammenligne netværk opnået under forskellige forhold, der har forskellige effekter på koblingen. Disse observationer kan føre til vigtige funktionelle overvejelser. For eksempel, analyserer vi de astrocytic net af en trigeminus kerne, hvor vi har tidligere vist, at astrocytic kobling er afgørende for neuroner evne til at skifte deres affyring mønstre fra tonic til rytmiske bristende1. Ved at måle størrelsen, indespærring og privilegerede orientering af astrocytic netværk i denne kerne, kan vi opbygge hypoteser om funktionelle domæner, at de afgrænse. Flere undersøgelser tyder på, at flere andre områder i hjernen, herunder tønde cortex, lateral superior olive, olfaktoriske glomeruli og sensoriske kerner i thalamus og visuel cortex, for at nævne et par stykker, kan drage fordel af en lignende analyse.
Introduction
Mange undersøgelser har beskrevet, hvordan dialogen neuron-astrocyte på subcellulære eller synaptic plan kan få konsekvenser i neuronal funktioner og synaptisk transmission. Det er godt etableret, astrocytter er følsomme over for omkring neuronal aktivitet; i virkeligheden, har de receptorer for mange neurotransmittere, herunder glutamat, GABA, acetylcholin, og ATP (Se tidligere offentliggjorte anmeldelser2,3,4). Til gengæld behandler astrocytic ensheath synaptic elementer og indflydelse neuronal aktivitet både der og på extrasynaptic websteder ved at regulere ekstracellulære ionisk homøostase og frigive flere faktorer eller sendere såsom glutamat, D-Serin og ATP 5 , 6 , 7.
Den idé, at astrocytter også kan modulere neuronal funktion på netværksniveau opstået med beviser at astrocytic kobling reguleres rumligt og svarer til neuronal segmentering i områder præget af en klart anatomisk opdelingen (ligesom områder med sensoriske repræsentationer), der angiver, at astrocytter vil koble til andre astrocytter, der betjener den samme funktion i stedet for kun dem, der er tæt på. I den laterale superior olive, eksempelvis er mest astrocytic netværk orienteret vinkelret på den tonotopic akse8, mens der i tønde cortex eller olfactoty glomeruli, kommunikation mellem astrocytter er meget stærkere inden for tønder eller glomeruli og svagere mellem tilstødende dem9,10. I begge tilfælde er de astrocytic netværk orienteret mod midten af den glomerule eller tønde9,10.
Vi viste for nylig, at astrocytic aktivitet modulerer neuronal fyring ved at mindske koncentrationen af ekstracellulære Ca2 + ([Ca2 +]e), formentlig via frigivelse af S100β, en Ca2 +-bindende protein11. Denne effekt, som blev påvist i en population af trigeminus rhythmogenic neuroner i den dorsale del af trigeminus main sensoriske kernen (NVsnpr, menes at spille en vigtig rolle i generation af masticatory bevægelser), skyldes faktum, rytmisk fyring i disse neuroner afhænger af en vedvarende Na+ aktuelle der er fremmet af falder [Ca2 +]e11,12. Rytmisk fyring i disse neuroner kan "fysiologisk" fremkaldes ved stimulation af deres input eller kunstig nedsættelse af [Ca2 +]e. Vi viste yderligere, at astrocytic kobling var påkrævet for neuronal rytmiske fyring1. Dette rejste muligheden at astrocytic netværk kan danne afgrænset funktionelle domæner hvor neuronal aktivitet kan synkroniseres og samordnes. For at vurdere denne hypotese, skulle vi først udvikle en metode til at dokumentere strengt organiseringen af disse net inden for NVsnpr.
Tidligere undersøgelser på astrocytic netværk har for det meste beskrives omfanget af kobling cell antal og tæthed og dækningsområde. Forsøg på at evaluere astrocytic netværk form og retning af dye-kobling var for det meste udføres ved at sammenligne størrelsen af netværk langs to akser (x og y) i den tønde cortex9, hippocampus13,14, 15, barreloid felter i thalamus16, lateral superior oliven8, olfaktoriske glomeruli10og cortex14. De metoder, der beskrives her aktiverer upartiske tællinger af mærket celler i et netværk og et skøn over det område, de dækker. Vi har også udviklet værktøjer til at definere den foretrukne orientering af kobling inden for et netværk og til at vurdere, om de foretrukne orientering er mod midten af kernen eller i en anden retning. I forhold til tidligere anvendte metoder giver denne protokol mulighed for at beskrive organisationen og orientering af astrocytic netværk i strukturer som den dorsale trigeminus vigtigste sensoriske kerne, der ikke har en kendt klart anatomisk opdelingen. I de ovennævnte undersøgelser, netværk orientering er beskrevet som en relation til formen af den struktur, som er allerede dokumenteret (fx., barreloid i thalamus, Tønder i cortex, lag i hippocampus og cortex, glomeruli i den olfaktoriske pære, osv.). Derudover vektorielt analyse giver mulighed for sammenligninger af kobling retningslinjer afsløret under forskellige betingelser. For at analysere, om disse parametre ændres efter placeringen af netværk inden for kernen, udviklet vi også en metode til at erstatte hver netværk i forhold til grænserne for kernen. Disse værktøjer kan let tilpasses til andre områder for behandlende netværk af koblede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer abode af canadiske institutter for sundhedsforskning regler og blev godkendt af University of Montreal dyrs pleje og brug udvalget.
1. forberedelse af rotte hjernen skiver
- Forberede 1 L saccharose-baseret løsning (tabel 1) og 1 L standard kunstige cerebral-spinal væske (aCSF) (tabel 2).
- Boble saccharose-baseret løsning med en blanding af 95% O2 og 5% CO2 (carbogen) i 30 min før du placerer det i-80 ° C i ca 30 min, indtil løsningen er kold men ikke helt frosset. Brug denne iskolde saccharose som skæring buffer til udskæring af hjernen. Holde den på is, når det er fjernet fra fryseren.
- Boble aCSF med carbogen gennem hele eksperimentet. Brug denne løsning for skive opbevaring og som den perfusing buffer, som patch-fastspænding og biocytin-fyldning af astrocytter vil blive udført. Forberede en skive opsving holder kammer at deponere hjernen skiver, så snart de er skåret.
Bemærk: Skive opsving bedrift salen kunne være skræddersyede og består hovedsagelig af en lille brønd med en maskestørrelse på bunden suspenderet i en større godt, der er fyldt med aCSF, som en tube er indsat for at bringe carbogen fra bunden. - Bruge 15 til 21 dage gamle Sprague-Dawley rotter uden nogen sex - eller stamme-specifikke bias. Bedøver dyr med isofluran (1 mL af isofluran i en anæstesi induktion kammer). Kontroller dybden af anæstesi ved forsigtigt klemme bagben pote eller halen af dyret.
- Hug hovedet af rotte ved hjælp af en guillotine, skære sit kranium med en saks, og hurtigt fjerne hjernen fra kraniet med en flad spatel.
- Dyp hjernen i den iskolde saccharose-baseret løsning til om 30 s og overførsel det (med løsningen) til en petri fad. Med et barberblad, fjerne de dele, der er forreste og bagerste til området for at være i snit, hvis skære skiver i et tværplan.
- Lim den resterende blok af hjernevæv på sin rostralt side og gå videre til at skære hjernen skiver (350 µm tykt) i saccharose-baserede medium ved hjælp af en vibratome. Derefter, overføre indsamlede udsnittene i et opsving holder kammer fyldt med carbogenated aCSF ved stuetemperatur (RT), indtil de er klar til brug (tillade mindst 1 time til nyttiggørelse).
Bemærk: De seneste udviklinger i feltet Tillad længere tids inkubation op til 24 timer af hjernen skiver i in vitro betingelser17.
2. Sulforhodamine 101 (SR-101) mærkning af astrocytter
- Pre varme vandbad til 34 ° C og Anbring to slice inkuberingen kamre i det. Fyld en slice inkuberingen kamre med en løsning af aCSF indeholdende 1 μM SR-101, og fyld den anden kun med aCSF.
- Inkuber skiver i inkubation salen indeholdende 1 µM SR-101 for 20 min og derefter overføre dem til den anden inkubation kammer til at skylle ud overskydende SR-101 fra vævet. Lad det inkuberes i 20 min eller mere på 34 ° C, derefter holde inkubation salen indeholdende skiver på RT, indtil de er nødvendige for18.
3. astrocyte lappe og Biocytin fyldning
- Marker et udsnit og placere det i optagelse kammer i mikroskopet. At lappe astrocytter, bruge elektroder med en modstand af 4-6MΩ når den er fyldt med en kalium gluconat-baseret løsning (Se tabel 3).
- Under visuel vejledning og ved hjælp af en micromanipulator, direkte optagelse elektrode mod en SR-101-mærket astrocyte som vist i figur 1. Undgå celler ligger på overfladen af udsnittet, eftersom de er mere tilbøjelige til at være beskadiget eller har mistet forbindelser til tilstødende celler.
- For at forhindre lækage af biocytin i vævet, minimere overtryk tilføjes patch pipette og anvende det kun når det er tæt på den astrocyte, der vil blive lappet (0,1-0,4 mL i en sprøjte med 1 mL).
- Før patching, justere forskydningen af pipetten og dens kapacitans. Korrigere for flydende junction potentialer, som nøjagtige og præcise spænding kommandoer er afgørende for eksperimenter19.
- Flyt pipetten tæt nok til astrocyte at observere depression forårsaget af de overtryk. Derefter fjerne det overtryk og langsomt anvende nogle undertryk. Spænd astrocyte på -70 mV når forseglingen når 100 MΩ. Vent indtil seal når 1-3 GΩ. Fortsat gælde undertryk indtil bryde ind i cellen. Vær forsigtig, mens negative pressionsmiddel, da astrocytter er meget skrøbelige.
- Vurdere de elektrofysiologiske egenskaber af cellen lappet. I spænding-clamp tilstand, udføre en helhed-celle nuværende spænding protokol med en rampe spænding kommandoen over 600 ms varighed spænder fra -120 til +110 mV. I aktuelle-clamp tilstand, udføre en trin IV protokol som injektion af 1000 ms nuværende trin af 100 pA fra -1 til 1 nA, samplingfrekvens af hele-celle optagelser er 10 kHz.
Bemærk: Astrocytter viser en lineær nuværende spænding profil uden nogen form for berigtigelse (som vist i figur 1B) og ingen handling potentiale fyring på membran depolarisering (figur 1 c). Den hvilende membran potentiale (RMP) bør være stabil og ikke positivt til - 60mV. I nogle områder i hjernen er RMP i astrocytter mere hyperpolarized end i NVsnpr. - Tillade biocytin at udbrede inden for astrocyte i 30 min. mens de udfører et trin IV protokol hvert 5 min.
- Trække og frigøre patch pipette forsigtigt uden at beskadige den lappet astrocyte og straks tage til efterretning af forskydningen af pipetten før du tager det ud af optagelse salen. Trække værdien fra membran potentielle optagelser.
- Forlade hjernen skive til hvile i optagelse kammer i mindst 15 min (ud over 30 min til injektion) for at give mulighed for spredning af tracer fra den lappet astrocyte til hele netværket af koblede celler.
Bemærk: For at afsløre et netværk af sammenkoblede celler, kun en enkelt celle skal være lappet i kernen af interesse. Hvis flere forsøg er nødvendige for at opnå en vellykket patch, kassere sagen og forsøge at lappe på de kontralaterale side eller i en anden hjerne skive. - Gøre en mark eller indsnit i vævet til at identificere, hvilken side af udsnittet opad, og overføre skive først til en petriskål, som indeholder normale aCSF, derefter ind i en opløsning af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA). Inkuber skive ved 4 ° C natten over.
Forsigtig: PFA er yderst skadeligt. Bruge værnemidler i en ventileret hætte. Sikre, at alle materialer (børster, rør, osv.), der har været i kontakt med PFA ikke kontakte inddrivelse holding chamber, inkubation kammer eller andre materialer, der anvendes til at optage den frisk væv.
4. Biocytin åbenbaring
- Åbenbaring med fluorescerende streptavidine
- Vask hjernen skiver 2 x 10 min i 0,1 M fosfat buffer saltvand (PBS) på RT. Derefter, afsløre biocytin ved at inkubere hjernen skiver med streptavidine konjugeret med et fluorophore på 1/200 fortynding i PBS med 4% nonionisk detergent for 4 h på RT.
- Vask hjernen skiver 3 x 10 min i 0,1 M PBS på RT og montere sektionerne på glas dias ved hjælp af en vandig montering medium. Objektglassene de sider, der blev sprøjtet opad, coverslip, og forsegle dem med neglelak.
- Åbenbaring med DAB
Bemærk: DAB (3,3-diaminobenzidine) åbenbaring kan bruges, når fluorescens ikke kan bruges. I dette tilfælde bør kun én åbenbaring metode benyttes til at foretage sammenligninger.- Vask hjernen skiver 3 x 10 min i PBS på RT. inkuberes skiver i PBS + H2O2 0,5% i 1 time på RT.
- Skyl skiver 3 x 10 min i PBS på RT. Derefter inkuberes skiver i en begærlighed-biotin komplekse Farvningsopløsningen sammensat af PBS og 0,1% nonionisk detergent + begærlighed-biotin komplekse peroxidase standard farvning kit reagenserne på 1/100 døgn på RT.
- Skyl skiver 3 x 10 min i PBS på RT, inkuberes dem i en opløsning af PBS + DAB 0,05% for 20 min på RT, og overføre dem til en løsning af PBS + DAB 0,05% + H2O2 0,5%.
Forsigtig: DAB er yderst skadeligt. Bruge værnemidler i en ventileret hætte. Farve reaktionen standses når skiver overføres i PBS. - Skyl skiver 5 x 10 min i PBS på RT, montere sektionerne på glas dias (står over de sider, der blev sprøjtet opad) og lad dem tørre på et dias, tørring bænk overnatning på 34 ° C.
- Dykke glas dias for 1 min i flere alkohol bade på 70%, 95% og 100%, og ende med et bad af xylen i 1 minut.
- Mount glas dias ved hjælp af en toluen-baseret syntetisk harpiks montering medium. Placer coverslips på dias og forsegle dem med neglelak.
5. network Imaging
- Visualisere de astrocytic netværk ved hjælp af en scanning Konfokal mikroskop udstyret med 20 X og 4 X mål (eller en passende mål at visualisere hele kernen hvor netværket er placeret) og en laser til at opdage fluorophore (i dette tilfælde, Alexa-594 er brugt).
- Brug 20 X forstørrelse at gøre en z-stak af netværket af mærket celler. Bruge en opløsning på 800 x 800 pixels og scan hastighed på 12,5 μs/pixel.
Bemærk: For at billedet hele nettet, flere stakke er normalt kræves, og antallet af stakke skal reguleres for hvert netværk. Opløsning og scanning hastigheden kan ændres, men sørg for at bruge de samme indstillinger til alle billeddata. - Brug 4 X forstørrelse at tage billeder af nettet og en region af interesse.
Bemærk: 4 X imaging bruges til at bestemme positionen netværk i kernen af interesse. Altid billede det samme felt i gennemlysning. Dette billede vil være nyttigt, hvis du ikke kan bestemme grænsen til kernen i Konfokal fluorescerende billedet.
6. billedanalyse
- Dataforberedelse
- Brug software ImageJFIJI (dataoverføre sig henne https://fiji.sc/). Åbn filen og klik på OK i vinduet "Bio-formater Import Options".
- Hvis du vil omdefinere en z-stak, der indeholder kun optisk skiverne er nødvendige for den endelige z-stak (figur 2A), klik på "Stack" knappen i værktøjslinjen (finde, først skal du vælge stk | Z-projektet). Vælg "Max intensitet" i projektion type indstilling (figur 2A). Gem filen og navngiv den "stable fil".
- Hvis filen imaging indeholder flere kanaler, delt det for at bevare kun kanalen med astrocytic network imaging (billedet | Farve | Opdele kanaler).
- Kontrollerer indstillinger for pixel i billedet [billede | Egenskaber | Pixel (med "1" for pixeldimension)].
- Brug værktøjet Subtraher baggrund (processen | Subtrahere baggrund) til at fjerne baggrunden af biocytin mærkning. Bruge preview-funktionen til at angive den rullende kugle radius, der er generelt fastsat til 50 pixels (figur 2B).
- Brug værktøjet Fjern outliers (processen | Støj | Fjerne Outliers) hvis det er påkrævet efter Subtraher baggrund trin. Vælg "Bright" i indstillingen "Som Outliers" (figur 2 c). Bruge preview-funktionen til at indstille radius og tærskel. Vær forsigtig med dette værktøj, da det kan sløre dataene, som vist i figur 2D.
Bemærk: Dette værktøj fjerner de små pletter forårsaget af uspecifik aflejringer af streptavidine (som det fremgår af de hvide pile i figur 2B og 2 C før og efter behandling, henholdsvis). - Justere tærsklen (billedet | Justere | Tærskel). Vælg "Standard" og "B & W" tilstand (figur 2E). Klik på "Anvend".
Bemærk: Auto-justering kan bruges, men Manuel justering med de to skydere foretrækkes. Formålet med dette trin er at reducere støj til maksimalt uden at miste nogen mærket celler. - Konvertere billedet til et binært billede med værktøjet binære proces (processen | Binære | Gøre binære) som vist i figur 2F. Gem filen som en TIFF-fil og navngiv den "binær fil".
- Celle tælle
- Kontroller indstillingen af funktionen (analyser | Sæt måling). Vælg indstillingen "Barycentrum".
- Brug værktøjet "Analysere partikler" på filen"binær" (figur 3A) produceret i det foregående trin (analyser | Analysere partikel) (figur 3 c til venstre). Vælg "Konturerne" i indstillingen "Vis" (figur 3 c). Dette opretter en ny fil, der viser resultatet af påvisning (figur 3B).
- Spille med parametre: størrelse (at afsløre kun celler, bruge værdier mellem 30 og 6000) og cirkularitet (til at bestemme et interval mellem 0 til 1, i hvilke "1" definerer en perfekt cirkel og "0" en tilfældig form) at forfine påvisning (figur 3 c, venstre del). Køre påvisning ved at klikke på "OK".
Bemærk: To tabeller vises efter påvisning: 1) en tabel med titlen "Sammenfatning", der giver antallet af fundne celler, og 2) en tabel med titlen "Resultater" (figur 3 c, højre del), hvor x - og y-koordinaterne for hver celle. - Kopiere Værdierne og indsætte dem i et regnearksprogram. Gem denne tabel under navnet "opdagelse bord". En fil med et plot af fundne celler vil også blive vist (figur 3B). Gem denne fil som en TIFF-fil under navnet "påvisning fil".
- Hvis en gruppe af 2 eller flere mærket celler i netværket er registreret som en enkelt celle med værktøjet analyser partikler, fordi de er for tæt på hinanden, bruger værktøjet watershed (processen | Binære | Vandskel) på den binært billede før du anvender analyze partikler værktøj, og redo analyze partikler trin.
Bemærk: Værktøjet vandskel skaber en afgrænsning af 1 pixel bred mellem meget tætte celler. En celle counter plug-in kan bruges, når mærkning er utvetydig og kan udføres manuelt.
- Måling astrocytic netværksområde
- For at måle arealet af netværkene, brug den påvisning fil ved hjælp af billede J.
- Brug værktøjet polygon markering (venstre klik på knappen i værktøjslinjen for at vælge det) at opspore en polygon, der forbinder alle cellerne ligger i eksterne periferien af netværket (figur 4A). Venstre klik for at starte sporing på polygonen, og højreklik for at lukke den.
Bemærk: Denne polygon vil blive defineret som en region af interesse (ROI) og dens overflade måles Bestem arealet af netværket. - Åbn vinduet Indstil måling (analyser | Indstille måling) og vælge indstillingen "Område". Åbn ROI Manager (analysere | Værktøjer | ROI Manager) (figur 4B). Derefter tilsættes røbestof polygonen i ROI Manager ved at klikke på '' Tilføj '' (figur 4B) og køre målingen ved at klikke på '' foranstaltning '' i ROI Manager.
Bemærk: Området måling vises i en tabel og udtrykkes i pixels. Glem ikke at konvertere denne værdi med omregningsfaktoren for mikroskop bruges til at få en værdi i μm2.
- Bestemmelse af hovedretning vektor
- Bestemmelse af den lappet celle
- Åbn stakfilen i ImageJFIJI og identificere den lappet celle i stakfilen baseret på dens stærkere mærkning intensitet (figur 4 c). Derefter åbne filen med navnet "afsløring tabel" i et regnearksprogram og finde antallet knyttet til cellen lappet og dens tilsvarende koordinater.
- Hvis ikke præcist fastslå den lappet celle, omgiver det område, hvor deponering af biocytin er tættere i de afbildede netværk af koblede celler, ved hjælp af værktøjet Polygon i ImageJFIJI, og henvise til denne position som den lappet celle (figur 4D).
- Bruge styring af ROI (analysere | Værktøjer | ROI Manager). Derefter, trække en ROI på lappet celleplacering og tilføje det til ROI Manager (Se figur 4B).
- Angiv en måling (analyser | Indstille måling) og vælge indstillingen "Barycentrum".
- I ROI Manager, klik på "Foranstaltning" at få koordinaterne for barycentrum af vektoriserede-området. Bruge disse koordinater som referencepunkt for dette specifikke netværk.
- Referentiel Oversættelse
- Beregne koordinaterne for hver celle i forhold til den lappet astrocyte ved hjælp af følgende formel:
Med:
som koordinater for en given celle; 
som koordinaterne for cellen lappet (eller den referentielle punkt i netværket); og 
som koordinater for en given celle i den nye referentiel.
Bemærk: Udtrykker koordinaterne for hver celle i forhold til den lappet astrocyte er et vigtigt skridt i beregning af vektorer fra den lappet astrocyte. Vær forsigtig, når du bruger ImageJFIJI som den referentielle for ethvert billede er placeret i øverste venstre hjørne af billedet.
- Beregne koordinaterne for hver celle i forhold til den lappet astrocyte ved hjælp af følgende formel:
- Bestemmelse af de vigtigste vektor af præferentiel orientering
- Beregne koordinaterne for det vigtigste vektor af præferentiel orientering med følgende formel:
Med: (
) som koordinaterne for det vigtigste vektor af præferentiel orientering; og 
som koordinaterne for hver celle i netværket opnås med den lappet celle som referentiel.
Bemærk: For hver celle i netværket, er en vektor fastsættes i forhold til den lappet astrocyte koordinater. De vigtigste vektor af præferentiel orientering af netværket er summen af alle disse vektorer. - Divider længden af de vigtigste vektor (leveres af koordinaterne fremstillet ved hjælp af formlen ovenfor) med antallet af celler i netværket minus én (da koordinaterne for cellen lappet ikke er inkluderet), at normalisere værdierne og muliggøre sammenligninger mellem netværk. En skematisk oversigt over denne analyse er præsenteret i figur 5.
- Beregne koordinaterne for det vigtigste vektor af præferentiel orientering med følgende formel:
- Bestemmelse af den lappet celle
- Placering af analyseret netværk i kernen af interesse
- Justering af 20 X og 4 X billeder
- For at bestemme placeringen af hvert netværk i kernen af interesse (NVsnpr), brug 4 X billedet. Åbn den 4 X-image med en vektor billede editor.
- Vælg den 4 X-image og ændre dets størrelse ved multiplikation med 5. Vinduet dimension er placeret i højre del af den øverste vandrette værktøjslinje. For eksempel, for en 4 X-image, som har været stikprøven på 800 x 800 pixels, ændre samplingopløsning til 4000 x 4000 pixels (hvis du vil angive arbejdsenhed i pixels, gå til "Opsætning af hoveddokument" under fanen fil: filen | Dokumentopsætning). Eksportere filen i TIFF-format og benævne det "størrelse 4 X".
- Juster øverste venstre hjørne af billedet med det nederste venstre hjørne af Adobe Illustrator-dokumentet.
Bemærk: Softwaren giver koordinater fra en referentiel punkt, nederst til venstre. - Åbn 20 X billedet af netværket. Brug '' binære fil '' eller '' påvisning fil '', fordi de er lettere at justere. Derefter spille med værktøjet opacitet på 20 X billedet for at justere det med re størrelse 4 X '' binære fil '' billede.
Bemærk: Værktøjet opacitet er i den øverste vandrette værktøj advokatstanden. - Når justeringen er, Vælg og hold værktøjet pipette så måleværktøj vises, og vælg det på venstre værktøjslinjen.
- Brug værktøjet foranstaltning til at klikke på øverste venstre hjørne af 20 X billedet for at få koordinaterne for 20 X referentiel pege på de størrelse 4 X billede.
Bemærk: Disse koordinater, der betegnes som den 20 X referentiel (20XR i figur 5), vil være nyttig for at udtrykke holdning af hvert netværk på en skematisk tegning af kernen.
- Normalisering af kernen af interesse
Bemærk: For at opsummere dataene, en normalisering af kernen (NVsnpr) som et rektangel er brugt. Fremgangsmåden er beskrevet nedenfor.- Åben 4 X størrelse fil i ImageJFIJI, og brug polygonværktøjet til omgiver kernen (NVsnpr). Bruge billedet med gennemlysning, hvis grænser af kernen ikke er i stand til at blive set; i så fald, Husk at ændre størrelsen på det først.
- Åbn ROI Manager og tilføje den tegnede ROI. "Sæt måling", Vælg indstillingen '' afgrænser rektangel ''.
Bemærk: Indstillingen "Afgrænser rektangel" beregner det mindste rektangel omkring trukket kernen. - Klik på "Foranstaltning".
Bemærk: Der vises en tabel med BX og BY, koordinater for den øverste venstre hjørne af rektanglet: '' rektangel holdning '' og giver højde og bredde. BX og BY er afgrænsningsrammen rektanglet referentiel koordinater, som kaldes
og 
.
- Udtryk for hver netværk position i den normaliserede kerne
- Express koordinaterne for hver celle med 4 X referentiel (sorte firkant i fig. 5) ved hjælp af følgende formel:
Hvor:
er celle koordinater med 4 X referentiel; 
er celle koordinater med 20 X referentiel (orange firkant i figur 5); og 
er koordinaterne for 20 X referentiel punkt i 4 X-billedet (20XR). - Express celle koordinater i afgrænsningsrammen rektanglet referentiel (blå i fig. 5) ved hjælp af følgende formel:
Hvor:
er cellen koordinerer i afgrænsningsrammen rektanglet referentiel; 
er celle koordinater i 4 X referentiel; og 
er koordinaterne for afgrænsningsrammen rektanglet referentiel i 4 X billedet. - Omdanne cellen koordinater i afgrænsningsrammen rektanglet referentiel at procentdelen af bredde og højde af afgrænsningsrammen rektangel ved hjælp af følgende formel:
Hvor:
er cellen koordinerer i procentdelen af bredde og højde af afgrænsningsrammen rektangel; 
er cellen koordinerer i afgrænsningsrammen rektanglet referentiel; 
er bredden af afgrænsningsrammen rektanglet målt over i protokollen; og 
er afgrænsningsrammen rektanglets højde målt over i protokollen. - For at repræsentere alle netværk på den samme figur, tage hensyn til orientering af skive (venstre eller højre side). For at standardisere dataene, anvendes den referentielle på venstre side af udsnittet. Overfør netværket koordinater til højre til venstre side ved at anvende følgende formel kun x-koordinaterne:
Hvor:
er x-koordinaten på højre side af udsnittet; og 
er den nye x-koordinat udtrykt i den referentielle på venstre side af udsnittet.
Bemærk: Alternativt spejl billede i ImageJFIJI før analysen (billedet | Omdanne | Spejlvend vandret). - For at udtrykke koordinaterne for det vigtigste vektor af præferentiel orientering, følge de samme trin med celle koordinater (trin 6.5.3.1 til 6.5.3.4).
Bemærk: Udtryk for koordinater i procenter giver mulighed for en samling af data som en enkelt plot, hvor kernen (NVsnpr) er designet som et rektangel.
- Express koordinaterne for hver celle med 4 X referentiel (sorte firkant i fig. 5) ved hjælp af følgende formel:
- Justering af 20 X og 4 X billeder
- Undersøgelse af kantede differensen mellem de vigtigste vektor af præferentiel retning
Bemærk: Den kantede forskel på en astrocytic netværk bruges til at afgøre, om dens privilegerede orientering er mod midten af kernen af interesse. For at beregne den kantede forskel (α i figur 5), som er vinklen mellem de vigtigste vektor af præferentiel retning af netværk (PD, røde linje i figur 5) og den linje, der forbinder Pedersen c, gælde Al-Kashi teorem i trekant PDC (jf. inset figur 5 og Supplerende metoder).- Først beregne forskellige længder ved hjælp af anvendelsen af den pythagoræiske læresætning i en kartesiske referentiel hjælp af følgende ligning:
Hvor: koordinaterne for P og C er
og 
, henholdsvis i afgrænsningsrammen rektanglet referentiel (som beregnet ovenfor). - Bestemme den kantede forskel i radianer ved hjælp af følgende formel:
- Konvertere kantede forskellen i grader (f.eks. med funktionen grader i Excel software).
- Indsamle alle de kantede forskelle af plotte dem i lodret søjlediagrammer (figur 7C og 7 D) og afgøre, om der er en præferentiel orientering af astrocytic netværk.
- Først beregne forskellige længder ved hjælp af anvendelsen af den pythagoræiske læresætning i en kartesiske referentiel hjælp af følgende ligning:
som koordinater for en given celle; 
som koordinaterne for cellen lappet (eller den referentielle punkt i netværket); og 
som koordinater for en given celle i den nye referentiel.
) som koordinaterne for det vigtigste vektor af præferentiel orientering; og 
som koordinaterne for hver celle i netværket opnås med den lappet celle som referentiel.
og 
.
er celle koordinater med 4 X referentiel; 
er celle koordinater med 20 X referentiel (orange firkant i figur 5); og 
er koordinaterne for 20 X referentiel punkt i 4 X-billedet (20XR).
er cellen koordinerer i afgrænsningsrammen rektanglet referentiel; 
er celle koordinater i 4 X referentiel; og 
er koordinaterne for afgrænsningsrammen rektanglet referentiel i 4 X billedet.
er cellen koordinerer i procentdelen af bredde og højde af afgrænsningsrammen rektangel; 
er cellen koordinerer i afgrænsningsrammen rektanglet referentiel; 
er bredden af afgrænsningsrammen rektanglet målt over i protokollen; og 
er afgrænsningsrammen rektanglets højde målt over i protokollen.
er x-koordinaten på højre side af udsnittet; og 
er den nye x-koordinat udtrykt i den referentielle på venstre side af udsnittet.
og 
, henholdsvis i afgrænsningsrammen rektanglet referentiel (som beregnet ovenfor).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Koblingen mellem celler i hjernen er ikke statisk, men derimod dynamisk reguleret af mange faktorer. De beskrevne metoder er udviklet til at analysere astrocytic netværk afsløret under forskellige forhold og til at forstå deres organisation i NVsnpr. Disse resultater har været allerede udgivet1. Vi udførte biocytin fyldning af enkelt astrocytter i den dorsale del af NVsnpr i tre forskellige tilstande: i hvile (i kontrol betingelser i mangel af enhver stimulation), i Ca2 +-gratis betingelser og efter den elektriske stimulation af sensoriske fibre, at projektet til kernen. De eksperimentelle indstillinger til biocytin påfyldning af astrocytter for hver betingelse er illustreret i de venstre side af figur 6A-C.
Netværk af biocytin-mærket celler blev observeret i kontrol betingelser og bekræftet en basal tilstand af cellen kobling mellem NVsnpr astrocytter på resten. I 11 testet tilfælde viste biocytin formidling netværk bestående af 11 ± 3 celler (midterste panel i figur 6A, figur 6D) strækker sig over et areal på 34737 ± 13254 µm2 (figur 6E). Carbenoxolone (CBX, 20 μM), en ikke-specifik blokering af kløften vejkryds, blev brugt i et uafhængigt sæt af eksperimenter til at sikre, at den observerede mærkningsbestemmelserne var et resultat af biocytin diffusion gennem kløften kryds og ikke optagelse af celler i biocytin, som kan lække i det ekstracellulære rum fra den positive tryk, patch pipette før patching. Bad anvendelse af CBX reduceret antallet af mærket celler til 2 ± 0,5 celler (højre panel i figur 6A, figur 6D; Iman-Conover metode, P = 0.016; Holm-Sidak test, P = 0.010) og området i biocytin spredt sig til 2297 ± 1726 µm2 (figur 6E; Iman-Conover metode, P = 0.0009; Holm-Sidak test, P = 0,025).
Effekten af calcium fjernelse fra mediet på NVsnpr astrocytic netværk blev testet fordi lav ekstracellulære calcium koncentrationen er kendt for at åbne connexins og gap vejkryds20,21,22, og det kan bruges som en massiv og ensartet incitament til at lukke sig op syncytium og maksimere tracer diffusion gennem kløften vejkryds. De astrocytic net, der blev afsløret i Ca2 +-fri betingelser (n = 10) viste et større antal celler end netværk afsløret i kontrol betingelser, med 37 ± 10 mærket celler (midterste panel i figur 6 c, figur 6D; Iman-Conover metode, P = 0.016; Holm-Sidak test, P < 0,001) dækker et areal på 108123 ± 27450 μm2 (midterste panel i figur 6 c, figur 6E; Iman-Conover metode, P = 0,009; Holm-Sidak test, P = 0,001).
I forhold til de fuldstændig fjernelse af calcium fra mediet, er elektrisk stimulation af afferente indgange til kernen af interesse en mere fysiologisk stimulus, som direkte involverer den neuronale kredsløb af interesse. Derfor kan resultater fra denne type manipulation give meningsfulde oplysninger vedrørende de funktionelle konsekvenser af de astrocytic net observeret. For eksempel, input fra to forskellige veje kan føre til forskellige effekter på denne basal celler kobling i et givet område, eller det kan fremkalde kobling mellem astrocytter i forskellige underafdelinger af kernen. I vores kredsløb, elektrisk stimulation af sensoriske fibre projekt til NVsnpr ved hjælp af 2-sekunders tog på 0,2 ms pulser på 40-60 Hz (n = 11) produceret en stigning på kobling mellem NVsnpr astrocytter, i forhold til de unstimulated betingelser, med 23 ± 6 celler (midterste panel i fig. 6B, figur 6D; Iman-Conover metode, P = 0.016; Holm-Sidak test, P = 0,012) breder sig ud over et areal på 814174 ± 15270 μm2 (midterste panel i figur 6B, finde 6E; Iman-Conover metode, P = 0,009; Holm-Sidak test, P = 0,004).
Virkningerne af disse to former for stimulation, fjernelse af calcium fra medium, og den elektriske stimulation af afferente indgange, er alle forstyrret af CBX. De astrocytic net i denne betingelse består kun 5 ± 1 celler i Ca2 +-gratis aCSF (højre panel i figur 6 c, figur 6D; n = 4; Iman-Conover metode, P = 0.016; Holm-Sidak test, P < 0,001) og 9 ± 2 celler med sensoriske fibre stimulation (højre panel i fig. 6B, figur 6D; n = 6; Iman-Conover metode, P = 0.016; Holm-Sidak test, P = 0,023). Netværk overfladen områder var også reduceret til 17987 ± 9843 µm2 med Ca2 +-gratis aCSF (figur 6E; n = 4; Iman-Conover metode, P = 0,009; Holm-Sidak test, P = 0,004) og til 39379 ± 11014 µm2 med sensoriske fibre stimulation (figur 6E; n = 6; Iman-Conover metode, P = 0,009; Holm-Sidak test, P = 0.055).
Anatomiske analyse blev udført kun i tilfælde hvor NVsnpr grænser kunne være klart defineret på 4 X imaging, hvilket var tilfældet for 9 ud af 10 netværk opnået med Ca2 +-gratis aCSF og 8 ud af 11 netværk fremstillet med elektrisk stimulation. Plotning af alle de analyserede astrocytic netværk på en teoretisk NVnspr viser, at de fleste celler består i nettene var begrænset inden for nucleus grænser (tal 7A og 7B, venstre og mellemste paneler). Under Ca2 +-gratis aCSF, 4 ud af 9 astrocytic netværk spredt uden for NVsnpr i retning af den motoriske kerne ligger medialt til NVsnpr. I disse 4 sager, var det store flertal af mærket cellerne begrænset til kernen. Netværk af mærket celler fremstillet med elektrisk stimulation af sensoriske fibre var mere begrænset. Kun 2 netværk udvides over kernen grænser, hvor en spredes over grænsen mediodorsal i laterale supratrigeminal område (mørke grønne netværk i figur 7B, venstre og mellemste paneler). I det andet tilfælde krydsede 2 astrocytter i den røde netværk (figur 7B, venstre og mellemste paneler) til den ventrale del af NVsnpr.
Den vektorielle analyse for astrocytic netværk præferentielle orientering (højre panel i figur 7A og 7B) produceret forskellige resultater afhængigt af stimulus anvendes. Faktisk, for de astrocytic net observeret med Ca2 +-gratis aCSF, alle undtagen én af vektorer af præferentiel orientering var orienteret mod midten af NVsnpr. For de astrocytic net observeret med elektrisk stimulation, var præferentielle orientering vektorer for det meste rettet mod grænserne af kernen. Dette afspejles af de beregnede kantede forskelle i præferentielle orientering mellem de astrocytic netværk opnået med Ca2 +-gratis aCSF og dem, der opnås med elektrisk stimulation af sensoriske fibre. Under Ca2 +-gratis aCSF, de lodrette søjlediagrammer distribution af kantede forskellen viste, at de fleste af net af mærket celler har en kantet forskellen mellem 0 og 40 grader, med en middelværdi på kantede forskel på 39,5 ± 12,7 grader ( Figur 7C). Med elektrisk stimulation af sensoriske fibre, fordelingen er mere ensartet, og den gennemsnitlige kantede forskel (99,5 ± 17 grader) er signifikant forskellig (figur 7 d; student t-test, P = 0,012).
Disse data viser, at biocytin mærkning analyse gør det muligt for os at skelne virkningen af forskellige stimuli modulerende astrocytic kobling. Derudover giver kortlægning af de astrocytic netværk i en normaliseret kerne efterfulgt af vektorielle analyse værdifuld information om størrelse og anatomiske organiseringen af disse net.
Figur 1: hele-celle patch-klemme af astrocyte. (A) astrocytter mærket med en læsning af markør sulforhodamine 101 (SR-101) i NVsnpr. En SR-101-mærket astrocyte soma er målrettet med patch pipette (hvide stiplede linje). Skalalinjen = 100 μm. (B) en depolariserende rampe protokol er udført i spænding-klemme (fra -120 til 110mV) for at vurdere astrocyte passive karakteristika. (C) vurderingen af manglen aktionspotentialet fyring i astrocyte ved injektion af nuværende pulser i strøm-clamp tilstand. Dette tal er tilpasset fra Condamine et al. (2018) 1. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: behandling og analyse af astrocytic netværk med ImageJFIJI software. A Z-stakken værk fra den Konfokal imaging af en astrocytic netværk. I vinduet øverst til venstre, Z-stack i ImageJFIJI. (B) baggrund subtraktion proces. På øverst til venstre, subtrahere baggrund vindue i ImageJFIJI. Den stiplede cirkel fremhæver området på billedet hvor effekten af kommandoen Subtraher baggrund er de mere indlysende, når sammenlignet med billedet i A. (C) Remove outliers proces. Denne proces fjerner de små pletter på grund af uspecifik aflejringer af streptavidine koblet til en Alexa 594. De hvide pile viser indbetaling før (figur 2B) og efter (figur 2 c) kommandoen er blevet behandlet. Fjerne outliers vindue i ImageJFIJI i øverste venstre hjørne. (D) eksempel på den slørende effekt, der kan fremstilles af en utilstrækkelig regulering af Fjern outliers parametre. Gule pile viser nogle sløret celler. (E) justere tærskel proces. På øverst til venstre, justere tærskel vindue i ImageJFIJI. Rullepanelerne handle på tærsklen signal justering. (F) gør binære skridt. Billedet er konverteret til en binær fil i ImageJFIJI. Skalalinjen = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: påvisning af celler i astrocytic netværk med ImageJFIJI. (A) eksempel på et binært billede af en astrocytic netværk er fremstillet i ImageJFIJI. Skalalinjen = 100 μm. (B) illustrerer den "påvisning fil" fremstillet efter anvender analyze partikler proces på den binære fil. Figurerne svarer til alle fundne celler med deres tilhørende nummer i rød. (C) venstre del: analysere partikler vindue i ImageJFIJI. Denne funktion registrerer cellerne af netværket i binært billede. Størrelsen af de fundne celler og deres cirkularitet kan justeres. Numre anvendes bør fastsættes af trial and error, indtil der opnås et tilfredsstillende resultat. Højre del: afsløring tabel genereret af analyze partikler proces. X og Y kolonner listen koordinaterne for hver celle, der er registreret i billedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: netværk område analyse og bestemmelse af den lappet celle i ImageJFIJI. (A) ved hjælp af polygonværktøjet i ImageJFIJI, en ROI er spores tilbage omkring klyngen af opdaget celler (rød linje), der bruges til at bestemme arealet af netværket. (B) ROI er tilføjet til ROI Manager. (C) eksempel på en astrocytic netværk hvor den lappet celle (hvid pil) er let identificerbare slående intensiteten af sin biocytin mærkning. (D) eksempel på en astrocytic netværk hvor cellen lappet ikke kunne identificeres, men hvor et område af tættere mærkning klart angiver biocytin indskud. En ROI er udarbejdet omkring dette område og føjet til ROI manager. Dens barycentrum er beregnet og betragtes som den lappet celles placering til brug for vektorielt analyse. Skalalinjen = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Diagram over de forskellige referentials anvendes til astrocytic netværk analyse. Den grå firkant er 4 X billedet med den referentielle punkt 4XR skal justeres med det nederste venstre hjørne af Adobe Illustrator-dokumentet. Den hvide firkant omgivet i orange er 20 X billedet med den referentielle punkt 20XR. Begge billeder er afstemt med hinanden som beskrevet i protokollen. Afgrænsningsrammen rektanglet (blå) definerer NVsnpr (lilla stiplet linje) og skaleres i procent med den referentielle punkt (BR). Theoric midten af den dorsale del af NVsnpr er skematiserede af den mørke blå prik (C). Astrocytic netværket er skematiserede af cellen lappet (sort prik, P) og de vigtigste vektor af den privilegerede retning (rød linje). Hver stiplede sorte linie er vektoren af hver celle i astrocytic netværket. Den kantede forskellen af den astrocytic netværk (α) er vinklen mellem de vigtigste præferentielle orientering af netværket (rød linje) og den sorte linie, der forbinder den lappet astrocyte til kernen teoretiske centrum. Indsatser er en zoom på 20 X billedet viser trekant PCD dannet af NVsnpr (C), den lappet celle, og de vigtigste vektor af præferentiel retning (D) teoretiske centrum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Astrocytic netværk mærket med biocytin i NVsnpr under forskellige betingelser viser forskellige størrelser. (A-C) Til venstre, en skematisk tegning af den eksperimentelle betingelse. I alle forhold, var en enkelt astrocyte mærket af SR-101 indskyde nemlig hele-celle optagelse og fyldt med biocytin (0,2%). Midterste kolonne: mikrofotografier illustrerer de astrocytic net fremstillet under kontrol betingelser (A), efter elektrisk stimulation af Vth tarmkanalen (2 s tog, 40-60 Hz, 10-300 µA, 0,2 ms bælgfrugter) (B); og efter perfusion med en Ca2 +-gratis aCSF (C). Højre kolonne: mikrofotografier illustrerer de astrocytic net fremstillet på de samme betingelser, men i nærværelse af CBX (20 μM) i bad før. Skalalinjen = 100 μm. (D og E) Lodrette søjler diagram repræsenterer antallet af kombineret celler og areal, henholdsvis, af de biocytin-fyldte net af astrocytter under de tre forsøgsbetingelser præsenteret ovenfor (A, B og C) i tilstedeværelse (udklækket) og manglende (fast) CBX (20 ΜM). Data repræsenteres som betyder ± SEM. Multiple sammenligninger (Holm-Sidak test): * = P < 0,05; ** = P < 0,001. Dette tal er tilpasset fra Condamine et al. (2018) 1. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Karakterisering af net i NVsnpr under Ca2 +-gratis aCSF og med elektrisk stimulation af Vth tarmkanalen. (A og B) Venstre: Alle celler mærket i 9 netværk fyldt under perfusion med Ca2 +-gratis aCSF (A) eller i 8 netværk fyldt mens stimulere Vth tarmkanalen (B) afbildes ifølge deres stilling i en teoretisk NVsnpr kerne (grå rektangel). Hvert netværk (og cellerne komponere det) er repræsenteret af en anden farve. Midterste: grænserne for hvert netværk. Prik i hvert område repræsenterer den lappet celle. Højre: repræsentation af vigtigste vektor af præferentiel orientering af hvert netværk. Dot repræsenterer den lappet celle og pil vektor af præferentiel retning. (C og D) Distribution af kantede forskelle mellem de vigtigste vektor af de præferentielle orientering og en lige linje, der forbinder den lappet celle til midten af den dorsale del af NVsnpr (ligger på 25% på den dorsoventral akse og 50% på mediolateral akse) under den to betingelser studerede. Den gennemsnitlige kantede forskel var 39,5 ± 12,7 grader i Ca2 +-gratis aCSF, der angiver en præferentiel orientering mod centrum af kernen og 99,5 ± 17 grader med elektrisk stimulation, der angiver en præferentiel orientering mod den periferien (student t-test, P = 0,012). Dette tal er tilpasset fra Condamine et al. (2018) 1. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| saccharose-aCSF* | mMol |
| Saccharose | 219 |
| KCl | 3 |
| KH2PO4 | 1,25 |
| MgSO4 | 4 |
| NaHCO3 | 26 |
| Dextrose | 10 |
| CaCl2 | 0,2 |
Tabel 1: sammensætningen af saccharose-baseret løsning anvendes til hjernen udskæring. (*) = pH og osmolaritet blev justeret til 7,3-7.4 og 300-320 mosmol/kg, henholdsvis.
| aCSF* | mMol |
| NaCl | 124 |
| KCL | 3 |
| KH2PO4 | 1,25 |
| MgSO4 | 1.3 |
| NaHCO3 | 26 |
| Dextrose | 10 |
| CaCl2 | 1,6 |
Tabel 2: sammensætning af aCSF løsningen anvendes til skive opbevaring og hele-celle optagelse. (*) = pH og osmolaritet blev justeret til 7,3-7.4 og 290-300 mosmol/kg, henholdsvis.
| Interne lappe løsning* | mMol |
| K-gluconat | 140 |
| NaCl | 5 |
| HEPES | 10 |
| EGTA | 0,5 |
| Tris ATP salt | 2 |
| Tris GTP salt | 0,4 |
Tabel 3: sammensætning af den interne løsning til hele-celle optagelses. (*) = pH og osmolaritet blev justeret til 7.2 7.3 og 280-300 mosmol/kg, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der findes en række elektrofysiologiske metoder til at vurdere funktionelle kobling mellem astrocytter23,24. Disse metoder giver imidlertid ikke oplysninger om de anatomiske arrangement af astrocytic netværk. En række undersøgelser har allerede vist, at "dye - eller tracer-kobling", som gjort her, opstår kun i en brøkdel af kombineret celler, der er registreret af elektrofysiologiske metoder25,26,27, tyder på, at den antal celler opdaget med denne metode er undervurderet. Dette er dog stadig den bedste metode til visualisering af kobling. Større dye-kobling er fremstillet ved brug af molekylet røbestoffer mindre end 1-1,2 KDa til permeat gap vejkryds20. Live visualisering af kobling kan udføres ved at overvåge udbredelsen af fluorescerende glukose derivater (2-NBDG) eller en fluorescerende markør (som nogle Alexa farvestoffer eller Lucifer gul)13, men på grund af sin mindre størrelse, biocytin giver bedre resultater og giver mulighed for kvantificering i faste væv. Således skal det bemærkes, at antallet af celler opdaget med denne metode er i høj grad undervurderede. På den anden side kan nogle af cellerne mærkes, ikke på grund af deres kobling, men på grund af udbredelsen af tracer, der har lækket i det ekstracellulære rum. Omfanget af mærkning som følge af lækage kan estimeres i kontrol eksperimenter med bad anvendelser af en gap junction blocker1. Dog kan det antages, at enhver bias på grund af metoden, der ville gælde alle betingelser.
Endelig skal det understreges, at ikke alle koblede celler er astrocytter. Panglial netværk hvor astrocytter er koblet til oligodendrocytes har været beskrevet i flere områder i hjernen, herunder laterale superior oliven8, thalamus16, cortex og hippocampus28. Vores mål var at udvikle en metode til sammenligning af astrocytic netværk afsløret med farvestof-kobling under forskellige betingelser for at vurdere hypotesen om at danner de veldefinerede, karakteristiske funktionelle domæner afsløret af forskellige stimuli. Da i NVsnpr, trigeminus hjernestammen kernen, hvor denne protokol blev gennemført, koblingen mellem astrocytter er meget begrænset under hvile betingelser, det var vigtigt at først udvikle en pålidelig og objektiv metode til at registrere mærket celler. Dette blev opnået med Automatiseret påvisning med ImageJFIJI. Det er undertiden vanskeligt at skelne svagt mærkede celler fra baggrundsstøj. Her, stak imaging og en metode i ImageJFIJI bruges til at forbedre signalet, men baggrundsstøj kan stadig være for højt og føre til data afvisning. I fremtidige undersøgelser, kan afklaring protokoller bruges til at forbedre signal-støj-forhold. Et clearing-protokollen er en interessant metode til afklaring, der bevarer væv morfologi (ingen svind), påvirker ikke lipider og er kompatibel med immunfarvning29. En anden begrænsning i den beskrevne metode er "Vandskel" værktøj bruges til at diskriminere celler, der er for tæt på hinanden. Besigtigelse af fundne celler bør ske, når du bruger dette værktøj.
Hvis astrocytic netværk danne funktionelle domæner, så de kan definere grænserne for en kerne eller bør i det mindste begrænses til grænserne for en kerne. Afslørede netværk kan altid være begrænset inden for en kerne, mere, så hvis de er mindre i størrelse, hvis den lappet astrocyte er i centrum (eller i) kernen. For at teste, hvis astrocytter sidder tæt på grænsen af en cellekerne helst par med andre astrocytter uden for kernen eller sammen med andre i kernen, vi havde brug for til at bestemme den præferentielle retning som farvestoffet spredes fra den lappet astrocyte. Flere andre undersøgelser har behandlet et lignende spørgsmål i tønde cortex, barreloid felter af thalamus, olfaktoriske glomeruli, hippocampus og laterale superior olive, men de fokuserede analyser for det meste på afstand af diffusion af tracer, elektrofysiologiske karakterisering af forskellige typer af astrocytter i funktion af deres lokalisering og udbredelse af farvestof langs Retvinklede akser med hensyn til disse veldefinerede strukturer8,9,10, 13,14,16. Her, brugte vi vektorielt analyse til at bestemme den dominerende retning af tracer spredt, som blev givet af størrelsen og retningen af de normaliserede vigtigste vektor. Små vektorer angiver ikke klart "dominerende" eller præferentielle orientering. Et kritisk trin for vektorielt analyse er evnen til at identificere den lappet astrocyte, der er ikke altid muligt. Et interessant alternativ til at finde den lappet astrocyte er at tilføje en stor (ikke-gap junction permeant) og fixable tracer, ligesom dextrans, at den optagelse løsning. Hvis det ikke er muligt at bestemme den lappet celle eller patch placering, kan det være bedre at udelade disse eksperimenter fra vektor analyse.
Endelig, for at analysere om egenskaberne for netværk alt efter deres placering i kernen, vi havde brug for en metode til at udtrykke deres holdning i en "normaliseret" kerne. Det kun kritiske trin i denne procedure er mulighed for at se klart grænser af kernen i lav forstørrelse billeder (4 X). En enkel løsning på dette problem, er hvis det opstår ofte, at tilføje en standard histologiske farvning til væv behandling før analyse.
Heterogenitet af astrocytter på tværs af områder af hjernen er klart fastlagt, og en voksende mængde af beviser støtter idéen om, at deres specialer er særligt tilpasset til funktionen af kredsløbet, de er indlejret i9, 10,30,31. For at dette kan være sandt, begrænses Inter astrocytic meddelelse til astrocytter forbundet til det samme kredsløb. Bemærkninger støtte denne antagelse er ved at opstå i forskellige hjernen områder men er mere tydelige i områder med grupperet repræsentationer, som sensorisk maps i tønde cortex eller olfaktoriske pære. Men de fleste rapporter om overlapning mellem neuronal og astrocytic maps er beskrivende og kvalitative. De metoder, der er rapporteret her kan bruges til at objektivere disse bemærkninger og udvikle værktøjer til bedre analysere astrocytic netværk efter deres position i et givet kredsløb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde er finansieret af den canadiske institutter for sundhedsforskning, Grants-tildeling nummer: 14392.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
References
- Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
- Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
- Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control? Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
- Verkhratsky, A., Steinhauser, C. Ion channels in glial cells. Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).
- Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neuroscience. 286, 45-59 (2015).
- Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
- Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
- Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
- Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
- Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
- Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
- Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
- Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
- Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
- Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).
- Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).
- Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
- Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
- Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
- Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
- Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
- Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
- Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
- Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).
