Summary
Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de organisatie van de astrocytic netwerken. De beschreven methode minimaliseert bias om beschrijvende maatregelen van deze netwerken zoals cellen, grootte, ruimte en positie binnen een kern. Anisotropie is beoordeeld met een vectoriële analyse.
Abstract
Het steeds duidelijker dat astrocyten neuronale functie niet alleen de synaptic en eencellige niveau, maar ook op netwerkniveau moduleren geworden. Astrocyten zijn sterk met elkaar verbonden via gap kruispunten en koppeling door middel van deze kruispunten is dynamisch en sterk gereguleerde. Een opkomende concept is dat astrocytic functies zijn gespecialiseerd en aangepast aan de functies van de neuronale circuit waaraan ze gekoppeld zijn. Methoden voor het meten van verschillende parameters van astrocytic netwerken zijn daarom nodig om de regels inzake hun communicatie en het koppelen van beter te beschrijven en te begrijpen verder hun functies.
Hier, met behulp van de software van de analyse van de afbeelding (bijv., ImageJFIJI), beschrijven we een methode voor het analyseren van de confocal beelden van astrocytic netwerken geopenbaard door kleurstof-koppeling. Deze methoden voldoende zijn voor de detectie van 1) een geautomatiseerde en onbevooroordeelde van gelabelde cellen, 2) de berekening van de grootte van het netwerk, 3) berekening van het preferentiële oriëntatie van kleurstof verspreiden binnen het netwerk, en 4) herpositionering van het netwerk binnen het interessegebied .
Deze analyse kan worden gebruikt voor karakteriseren astrocytic netwerken van een bepaald gebied, vergelijken van netwerken van verschillende gebieden gekoppeld aan verschillende functies of netwerken die zijn verkregen onder verschillende omstandigheden die verschillende gevolgen voor koppeling hebben vergelijken. Deze opmerkingen kunnen leiden tot belangrijke functionele overwegingen. Bijvoorbeeld, analyseren we de astrocytic netwerken van de celkern, waar we eerder hebben aangetoond dat er sprake is van essentieel belang voor het vermogen van de neuronen te schakelen hun afvuren patronen van tonic op ritmische barst1astrocytic koppeling. Door het meten van de omvang, opsluiting en preferentiële afdrukstand van astrocytic netwerken in deze kern, kunnen we bouwen hypothesen over functionele domeinen die zij omschrijven. Meerdere studies suggereren dat verschillende andere hersengebieden, met inbegrip van het vat cortex, laterale superieure olijf-, olfactorische glomeruli, en zintuiglijke kernen in de thalamus en de visuele cortex, wat te noemen, van een soortgelijke analyse profiteren kunnen.
Introduction
Vele studies hebben beschreven hoe de neuron-Astrocyt dialoog op een sub cellulaire of synaptic niveau kan gevolgen hebben in neuronale functies en synaptische transmissie. Het is reeds lang gevestigd dat de astrocyten gevoelig zijn aan het omringen van neuronale activiteit; in feite, hebben ze receptoren voor vele neurotransmitters, met inbegrip van glutamaat, GABA acetylcholine en ATP (zie eerder gepubliceerde beoordelingen2,3,4). In ruil daarvoor verwerkt astrocytic ensheath synaptic elementen en invloed Neuronale activiteit beide er en extrasynaptic plaatsen door regulering van de extracellulaire Ionische homeostase en het vrijgeven van verschillende factoren of zenders zoals glutamaat, D-serine en ATP 5 , 6 , 7.
Het idee dat de astrocyten ook neuronale functie op netwerkniveau kunnen moduleren is ontstaan, met bewijs dat astrocytic koppeling is ruimtelijk gereguleerd en komt met de neuronale segmentatie in gebieden gekenmerkt door een duidelijke anatomische overeen Brandcompartimentering (zoals gebieden met sensorische vertegenwoordigingen), die aangeeft dat de astrocyten zullen koppelen aan andere astrocyten dienen dezelfde functie in plaats van alleen die dicht in de buurt. In de laterale superieure olive, bijvoorbeeld, zijn meest astrocytic netwerken gericht orthogonaal op de tonotopic as8, overwegende dat communicatie tussen de astrocyten in het vat cortex of olfactoty glomeruli, veel sterker in vaten of glomeruli en zwakker tussen aangrenzende degenen9,10. In beide gevallen zijn de astrocytic netwerken gericht op het midden van de glomerule of vat9,10.
We onlangs bleek dat de astrocytic activiteit neuronale afvuren moduleert door het verlagen van de concentratie van extracellulaire Ca2 + ([Ca2 +]e), vermoedelijk door de vrijlating van S100β, een Ca2 +-bindende eiwit11. Dit effect, die werd aangetoond in een populatie van de rhythmogenic neuronen in het dorsale deel van de de belangrijkste zintuiglijke nucleus (NVsnpr, dacht dat een belangrijke rol in de generatie van Triggerpunten bewegingen), het gevolg van het feit dat ritmische afvuren in deze neuronen is afhankelijk van een persistent nb+ huidige die wordt bevorderd door afname van [Ca2 +]e11,12. Ritmische afvuren in deze neuronen kan "fysiologisch" ontlokte worden door stimulatie van hun ingangen of kunstmatige verlaging van [Ca2 +]e. We verder bleek dat astrocytic koppeling vereist voor neuronale ritmische vuren1. Dit gewag gemaakt van de mogelijkheid dat astrocytic netwerken omgeschreven functionele domeinen waar Neuronale activiteit kan worden gesynchroniseerd en gecoördineerd kunnen vormen. Om te beoordelen deze hypothese, moesten we eerst het ontwikkelen van een methode om te rigoureus het documenteren van de organisatie van deze netwerken binnen NVsnpr.
Eerdere studies op astrocytic netwerken hebben meestal de omvang van de koppeling in termen van aantal cellen en de dichtheid en het verdragsgebied beschreven. Pogingen om de vorm van astrocytic netwerken en de richting van kleurstof-koppeling te evalueren werden vooral uitgevoerd door vergelijking van de grootte van de netwerken langs twee assen (x en y) in het vat cortex9, hippocampus13,14, 15, barreloid velden van de thalamus16, laterale superieure olijf8, olfactorische glomeruli10en cortex14. De hier beschreven methoden inschakelen onbevooroordeelde graven van gelabelde cellen in een netwerk en een schatting van het terrein dat ze bestrijken. We ook ontwikkeld instrumenten de voorkeur richting van koppeling binnen een netwerk te definiëren en te beoordelen of de gewenste afdrukstand naar het centrum van de kern of in een andere richting is. In vergelijking met de eerder gebruikte methoden biedt dit protocol een manier om te beschrijven van de organisatie en de oriëntatie van de astrocytic netwerken in structuren zoals de dorsale trigeminal belangrijkste zintuiglijke kern die nog geen een duidelijke anatomische bekend overheidsdepartementen. In de bovenstaande studies, de oriëntatie van het netwerk wordt beschreven als een relatie aan de vorm van de structuur zelf, die is al gedocumenteerd (bv., de barreloid in de thalamus, vaten in de cortex, lagen in de hippocampus en de cortex, de glomeruli in de bulbus olfactorius, enz.). Daarnaast voorziet het vectoriële analyse vergelijkingen oriëntaties onthuld onder verschillende omstandigheden te koppelen. Als u wilt analyseren of deze parameters gewijzigd volgens het standpunt van het netwerk binnen de kern, ontwikkelden we ook een methode ter vervanging van elk netwerk met betrekking tot de grenzen van de kern. Deze hulpprogramma's kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere gebieden voor behandelende netwerken van gekoppelde cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek regels abode en door de Universiteit van Montreal dierenverzorgers en gebruik Comité zijn goedgekeurd.
1. voorbereiding van de Rat hersenen segmenten
- Bereiden 1 L van een sacharose gebaseerde oplossing (tabel 1) en 1 L voor standaard kunstmatige cerebrale-spinal fluid (aCSF) (tabel 2).
- Bubble de sacharose gebaseerde oplossing met een mengeling van 95% O2 en 5% CO2 (carbogen) voor 30 min. alvorens het in-80 ° C gedurende ongeveer 30 minuten, totdat de oplossing koud, maar niet volledig bevroren is. Gebruik deze ijskoude sacharose als de buffer snijden voor het snijden van de hersenen. Houd het op ijs, zodra het is verwijderd uit de diepvries.
- Bubble de aCSF met carbogen door het hele experiment. Gebruik deze oplossing voor segment-opslag en als de perfusing buffer waarin de patch-klemmen en biocytin-vullen van astrocyten zal worden uitgevoerd. Voorbereiden van een segment herstel bedrijf kamer te storten van de segmenten van de hersenen, zodra zij zijn gesneden.
Opmerking: Het segment herstel bedrijf kamer kan op maat gemaakt en bestaat hoofdzakelijk uit een kleine goed met een gaas aan de onderkant opgeschort in een grotere Nou dat is gevuld met aCSF, waarin een buis wordt ingevoegd om de carbogen van de bodem. - Gebruik van 15 tot 21-dagen oude Sprague-Dawley ratten zonder seks - of stam-specifieke vooringenomenheid. Anesthetize van het dier met Isofluraan (1 mL van Isofluraan in een verdoving inductie kamer). Controleer of de diepte van de verdoving door zachtjes knijpen de achterste poot of de staart van het dier.
- Decapitate de rat met behulp van een guillotine, snijd de schedel met een schaar en snel verwijderen van de hersenen van de schedel met een platte spatel.
- Dompel de hersenen in de ijskoude sacharose gebaseerde oplossing voor over 30 s en overdracht het (met de oplossing) een petri schotel. Met een scheermesje, het verwijderen van de delen die zijn anterior en posterior naar het gebied te worden gesegmenteerd, als snijden in het dwarsvlak plakjes.
- Lijm het resterende blok van hersenweefsel rostraal kwartslag en overgaan tot de hersenen segmenten (350 µm dik) snijden in het sacharose gebaseerde medium met behulp van een vibratome. Breng de verzamelde segmenten in een herstel bedrijf kamer gevuld met carbogenated aCSF bij kamertemperatuur (RT) totdat ze klaar om te worden gebruikt (toestaan ten minste 1 uur voor herstel).
Opmerking: Recente ontwikkelingen in het veld toe dat langdurige incubatie tot 24u van hersenen segmenten in in vitro voorwaarden17.
2. Sulforhodamine 101 (SR-101) etikettering van astrocyten
- Verwarm een waterbad tot 34 ° C en plaats twee segment incubatie kamers in het. Vul één van de kamers van de incubatie segment met een oplossing van aCSF met 1 μM SR-101, en vul de andere alleen met aCSF.
- Incubeer de segmenten in het cupje van de incubatie met de 1 µM SR-101 voor 20 min en dan overdracht hen in de tweede incubatie kamer te spoelen van overtollige SR-101 van het weefsel. Laat het Incubeer gedurende 20 min of meer bij 34 ° C, dan houd het cupje van de incubatie met de plakjes op RT totdat ze18nodig.
3. Astrocyt patchen en Biocytin vullen
- Selecteer een segment en plaats deze in de zaal van de opname van de Microscoop. Patch astrocyten, elektroden met een weerstand van 4-6MΩ wanneer gevuld met een kalium-gluconaat-gebaseerde oplossing gebruikt (Zie tabel 3).
- Direct onder de visuele begeleiding en met behulp van een micromanipulator, de elektrode van de opname naar een SR-101-geëtiketteerden Astrocyt, zoals afgebeeld in Figuur 1. Vermijd het gebruik cellen gelegen aan het oppervlak van het segment, aangezien ze meer kans om te worden beschadigd of verloren verbindingen naar aangrenzende cellen.
- Om te voorkomen lekkage van biocytin in het weefsel, minimaliseren van de overdruk toegevoegd aan de patch pipet en toe te passen alleen wanneer het is dicht bij de Astrocyt die zal worden versteld (0.1-0.4 mL in een spuit van 1 mL).
- Aanpassen voordat het patchen, de verschuiving van de pipet en haar capaciteit. Corrigeren voor vloeibare junction potentials, zoals nauwkeurige en precieze spanning opdrachten cruciaal voor de experimenten19 zijn.
- Verplaats de pipet dicht genoeg bij de Astrocyt te observeren depressie veroorzaakt door de overdruk. Vervolgens verwijderen van de overdruk en langzaam enkele negatieve druk uitoefenen. Klem de Astrocyt te-70 mV wanneer het zegel 100 MΩ bereikt. Wacht totdat het zegel 1-3 GΩ bereikt. Blijven toepassen van negatieve druk tot breken in de cel. Wees voorzichtig bij het toepassen van negatieve druk, aangezien de astrocyten zijn erg kwetsbaar.
- Beoordelen de elektrofysiologische eigenschappen van de herstelde cel. Voer een geheel-cel stroom-spanning-protocol met een helling spanning opdracht van 600 ms duur variërend van-120 tot +110 in spanning-clamp modus, mV. Uitvoeren in de modus van current-clamp, een stap IV-protocol waarin de injectie van 1000 ms huidige stappen van 100 pA van -1 tot 1 nA, de samplefrequentie voor de opnames van de gehele-cel 10 kHz is.
Opmerking: Astrocyten Toon een lineaire stroom-spanning-profiel zonder enige vorm van rectificatie (zoals weergegeven in figuur 1B) en geen actiepotentiaal afvuren op membraan depolarisatie (Figuur 1 c). De rustpotentiaal membraan (RMP) moet stabiel en niet positief te - 60mV. In sommige hersengebieden is de RMP van astrocyten meer hyperpolarized dan in de NVsnpr. - Laat de biocytin te verspreiden binnen de Astrocyt gedurende 30 minuten tijdens het uitvoeren van een stap IV protocol elke 5 min.
- Intrekken en loskoppelen van de patch pipet zorgvuldig zonder beschadiging van de herstelde Astrocyt en onmiddellijk kennis te nemen van de verschuiving van de pipet alvorens het uit de zaal opnemen. Aftrekken die waarde van de potentiële opnamen van de membraan.
- Laat het segment van de hersenen tot rust in de zaal van de opname voor een minimum van 15 min (naast de 30 min voor injectie) zodat de verspreiding van de tracer van de herstelde Astrocyt tot het hele netwerk van gekoppelde cellen.
Opmerking: Om te onthullen van een netwerk van gekoppelde cellen, slechts een enkele cel moet worden versteld in de kern van belang. Als meerdere pogingen nodig met het oog op een succesvolle patch zijn, negeren het geval en proberen patch aan de contralaterale zijde of in een ander segment van de hersenen. - Maken van een merk of een insnijding in het weefsel te identificeren welke kant van het segment naar boven zijn gericht, en het segment eerst overbrengen in een petrischaal met normale aCSF, vervolgens in een oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA). Incubeer het segment bij 4 ° C's nachts.
Let op: PFA is uiterst schadelijk. Het gebruiken van beschermende uitrusting in een geventileerde kap. Ervoor zorgen dat alle materiaal (borstels, buizen, enz.) die in contact met PFA zijn Contacteer niet het herstel kamer, incubatie kamer, of andere materialen die worden gebruikt voor het opnemen van het verse weefsel.
4. Biocytin openbaring
- Openbaring met fluorescerende streptavidine
- Wash de hersenen plakjes 2 x 10 min in 0,1 M fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) op RT. Vervolgens het onthullen van de biocytin door de segmenten van de hersenen aan het broeden met streptavidine geconjugeerd met een fluorophore bij verdunning van 1/200 in PBS met 4% niet-ionogene wasmiddel voor 4 uur op RT.
- Wassen van de hersenen segmenten 3 x 10 min in 0,1 M PBS op RT en bevestig de secties op glas dia's met behulp van een waterige montage medium. Plaats de zijkanten die werden geïnjecteerd omhoog, dekglaasje aan de dia's en verzegelen met nagel-vernis.
- Openbaring met DAB
Opmerking: Openbaring van DAB (3,3-diaminobenzidine) kan worden gebruikt wanneer fluorescentie kan niet worden gebruikt. In dit geval moet slechts één revelatie methode worden gebruikt voor het maken van vergelijkingen.- Wassen de hersenen segmenten 3 x 10 min in PBS op RT. Incubeer segmenten van PBS + H2O2 0,5% gedurende 1 uur bij RT.
- De segmenten 3 x 10 min spoelen in PBS op RT. Vervolgens, Incubeer de segmenten in een avidin-Biotine complexe kleurstofoplossing bestaat uit PBS en 0,1% niet-ionogene wasmiddel + avidin-Biotine complexe peroxidase standaard kleuring kit reagentia bij 1/100 voor 24 uur op RT.
- De segmenten 3 x 10 min spoelen in PBS op RT, broeden ze in een oplossing van PBS + 0,05% voor 20 min op RT, schar en ze vervolgens overbrengen naar een oplossing van PBS + schar 0.05% + H2O2 0,5%.
Let op: DAB is uiterst schadelijk. Het gebruiken van beschermende uitrusting in een geventileerde kap. De reactie van kleur wordt gestopt wanneer de segmenten worden overgebracht in PBS. - Spoel de plakjes 5 x 10 min in PBS op RT, monteren van de secties op glas dia's (onder ogen zien van de kanten die naar boven werden ingespoten) en laat ze drogen op een dia drogen Bank 's nachts bij 34 ° C.
- Onderdompelen van het glas-dia's gedurende 1 min. in verschillende baden van de alcohol aan 70%, 95% en 100%, en het einde met een bad van xyleen voor 1 min.
- Monteer de glas dia's met behulp van een op basis van tolueen kunsthars montage medium. Coverslips plaats op de dia's en verzegelen met nagel vernis.
5. netwerk-Imaging
- Visualiseren van de astrocytic netwerken met behulp van een scanning confocal microscoop uitgerust met 20 X en 4 X doelstellingen (of een passende doelstelling te visualiseren van de gehele kern, waar het netwerk zich bevindt) en een laser te sporen van de fluorophore (in dit geval, Alexa-594 is gebruikt).
- Gebruik de 20 X vergroting te maken van een z-stapel van het netwerk van gelabelde cellen. Kiest u een resolutie van 800 x 800 pixels en scansnelheid van 12,5 µs/pixel.
Opmerking: Om het beeld het hele netwerk, veelvoudige stapels worden meestal geopend, en het aantal stacks moet worden aangepast voor elk netwerk. De resolutie en scan snelheid kan worden gewijzigd, maar zorg ervoor dat u dezelfde instellingen worden gebruikt om het imago van alle gegevens. - Gebruik de 4 X vergroting om beelden van het netwerk en de regio van belang te nemen.
Opmerking: De 4 X beeldvorming wordt gebruikt om te bepalen van het standpunt van het netwerk in de kern van belang. Altijd het imago van hetzelfde veld in doorvallend licht. Dit beeld zal nuttig zijn als u niet de rand van de kern in de confocal fluorescente afbeelding zijn.
6. de beeldanalyse
- Gegevensvoorbereiding
- Gebruik van de software ImageJFIJI (download het bij https://fiji.sc/). Open het bestand en klik op OK in het venster "Opties voor Bio-formaten importeren".
- Als u wilt definiëren een z-stack die alleen de optische segmenten die nodig zijn voor de definitieve z-stack (figuur 2A bevatten zal), klik op de "Stack"-knop in de werkbalk (om te zoeken, selecteert u eerst stk | Z-Project). Selecteer "Max intensiteit" in de projectie type overlappingseenheid (figuur 2A). Sla het bestand en noem deze "stack bestand".
- Als het grafische bestand verschillende kanalen bevat, splitsen om te besparen alleen het kanaal met de beeldvorming van de astrocytic netwerk (afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen).
- Controleer de instellingen van de pixel van de afbeelding [afbeelding | Eigenschappen | Pixel (met "1" voor pixel dimensie)].
- Hulpprogramma voor het aftrekken achtergrond (proces | Aftrekken achtergrond) om de achtergrond van biocytin etikettering te verwijderen. Gebruik de preview-functie te stellen de rolstraal bal, die over het algemeen is ingesteld op 50 pixels (figuur 2B).
- Hulpprogramma voor het verwijderen uitschieters (proces | Lawaai | Verwijder uitschieters) zo nodig na het aftrekken achtergrond stap. Selecteer "Bright" in de "Die uitschieters"-instelling (figuur 2C). Gebruik de preview-functie te stellen de straal en drempel. Wees voorzichtig met dit hulpmiddel, aangezien het kan het vervagen van de gegevens, zoals weergegeven in figuur 2D.
Opmerking: Dit hulpprogramma verwijdert de kleine vlekken veroorzaakt door aspecifieke afzettingen van streptavidine (zoals aangegeven door de witte pijlen in figuur 2B en 2 C vóór en na de behandeling, respectievelijk). - De drempel aanpassen (afbeelding | Aanpassen | Drempel). Selecteer "Default" en "B & W" modus (figuur 2E). Klik op "Apply".
Opmerking: Auto-aanpassing kan worden gebruikt, maar handmatig aanpassen met de twee schuifbars voorkeur. Het doel van deze stap is ter vermindering van lawaai maximaal zonder verlies van gelabelde cellen. - De afbeelding omzetten in een binaire afbeelding met het gereedschap binaire proces (proces | Binaire | Zorg Binary) zoals aangegeven in figuur 2F. Sla het bestand op als een TIFF-bestand en noem deze "binair bestand".
- Cel tellen
- Controleer de instelling van de functie (Analyze | Set meting). Selecteer de optie "Zwaartepunt".
- Hulpprogramma voor "Analyseren Particles" op de "binaire file" (figuur 3A) geproduceerd in de vorige stap (Analyze | Analyze deeltje) (Figuur 3 c aan de linkerkant). Selecteer "Omtrekken" in de instelling van de "Show" (Figuur 3 c). Dit genereert een nieuw bestand dat het resultaat van de opsporing (figuur 3B toont).
- Spelen met de parameters: grootte (wilt detecteren alleen cellen waarden tussen 30 en 6000 gebruiken) en cirkelvormigheid (om te bepalen van een interval tussen 0 tot 1, waar "1" definieert een perfecte cirkel en "0" een willekeurige vorm) om te verfijnen de detectie (Figuur 3 c, verliet gedeelte). Voer de detectie door op "OK" te klikken.
Opmerking: Twee tabellen verschijnt na de detectie: 1) een tabel met een adellijke titel "Samenvatting", waarmee het aantal gedetecteerde cellen, en 2) een tabel met een adellijke titel "Resultaten" (Figuur 3 c, rechtergedeelte) waarmee de x - en y-coördinaten van elke cel. - De waarden kopiëren en plak ze in een spreadsheetprogramma. Sla deze tabel onder de naam "detectie tafel". Een bestand met een perceel van gedetecteerde cellen verschijnt ook (figuur 3B). Dit bestand opslaan als een TIFF-bestand onder de naam "detectie file".
- Als een groep van 2 of meer gelabelde cellen in het netwerk worden gedetecteerd als een enkele cel met het gereedschap analyseren deeltjes omdat ze te dicht bij elkaar, gebruiken de waterscheiding (proces | Binaire | Watershed) op het binaire beeld alvorens het analyseren deeltjes gereedschap, en het analyseren deeltjes stappen opnieuw uitvoeren.
Opmerking: De waterscheiding tool maakt een afbakening van 1 pixel breed tussen zeer nauwe cellen. Een cel teller plug-in kan worden gebruikt wanneer labeling ondubbelzinnig is en kan handmatig worden uitgevoerd.
- Astrocytic netwerk oppervlakte te meten
- Voor het meten van de oppervlakte van de netwerken, het gebruik van het bestand van de detectie met behulp van Image J.
- Gebruik het gereedschap Veelhoek (linker klik op de knop in de werkbalk om deze te selecteren) te traceren een veelhoek die alle cellen verbindt in de externe periferie van het netwerk (figuur 4A gelegen). Klik met de linkermuisknop om te beginnen met het traceren van de veelhoek, en klik met de rechtermuisknop om het te sluiten.
Opmerking: Deze veelhoek zal worden gedefinieerd als een regio van belang (ROI) en arbied zullen worden gemeten om te bepalen van de oppervlakte van het netwerk. - Open het venster instellen meting (Analyze | Set meting) en selecteer de optie "Ruimte". Open de ROI-Manager (analyseren | Tools | ROI Manager) (figuur 4B). Vervolgens de getraceerde veelhoek in de ROI-beheer toevoegen door te klikken op '' toevoegen '' (figuur 4B) en de meting uitvoeren door te klikken op '' maatregel '' in de Manager van de ROI.
Opmerking: Het gemeten oppervlak wordt weergegeven in een tabel en worden uitgedrukt in pixels. Vergeet niet om te zetten van deze waarde met de omrekeningsfactor voor de Microscoop gebruikt om een waarde in μm2te verkrijgen.
- Bepaling van de hoofdrichting vector
- Bepaling van de herstelde cel
- Open het bestand stack in ImageJFIJI en identificeren van de herstelde cel in het bestand van de stapel op basis van de sterkere labeling intensiteit (figuur 4C). Vervolgens opent u het bestand met de naam "detectie"-tabel in een spreadsheetprogramma en vinden het nummer dat is gekoppeld aan de herstelde cel en de bijbehorende coördinaten.
- Als niet in staat om nauwkeurig de herstelde cel rond het gebied waar de storting van biocytin dichtere in het verbeelde netwerk van gekoppelde cellen is, met behulp van het gereedschap Veelhoek in ImageJFIJI, en verwijzen naar deze positie als die van de herstelde cel (Figuur 4 d).
- De Manager van de ROI gebruiken (analyseren | Tools | ROI Manager). Vervolgens tekent u een ROI in de herstelde cellocatie en toevoegen naar de ROI-Manager (Zie figuur 4B).
- Instellen van een meting (Analyze | Set meting) en selecteer de optie "Zwaartepunt".
- In de Manager van de ROI, klik op "Maatregel" om de coördinaten van het zwaartepunt van de overgetrokken ruimte. Gebruik deze coördinaten als het referentiepunt voor dit specifieke netwerk.
- Referentiële vertaling
- Bereken de coördinaten van elke cel in verwijzing naar de versteld Astrocyt met behulp van de volgende formule:
Met:
als de coördinaten voor een bepaalde cel; 
als de coördinaten van de herstelde cel (of de referentiële punt van het netwerk); en 
als de coördinaten voor een bepaalde cel in de nieuwe referentiële.
Opmerking: De coördinaten van elke cel in verwijzing naar de versteld Astrocyt uitdrukken is een belangrijke stap bij de berekening van de vectoren van de herstelde Astrocyt. Wees voorzichtig met het gebruik van ImageJFIJI die de referentiële voor elke afbeelding bevindt zich in de linkerbovenhoek van de afbeelding.
- Bereken de coördinaten van elke cel in verwijzing naar de versteld Astrocyt met behulp van de volgende formule:
- Bepaling van de voornaamste vector van preferentiële oriëntatie
- Bereken de coördinaten van de voornaamste vector van preferentiële oriëntatie met de volgende formule:
Met: (
) als de coördinaten van de voornaamste vector van preferentiële oriëntatie; en 
als de coördinaten van elke cel van het netwerk verkregen met de herstelde cel als referentiële.
Opmerking: Voor elke cel in het netwerk, een vector wordt bepaald ten opzichte van de coördinaten van de herstelde Astrocyt. De voornaamste vector van preferentiële oriëntatie van het netwerk is de som van alle deze vectoren. - De lengte van de belangrijkste vector (geleverd door de coördinaten die zijn verkregen met behulp van de bovenstaande formule) delen door het aantal cellen in het netwerk min één (omdat de coördinaten van de herstelde cel niet inbegrepen zijn), het normaliseren van de waarden en het inschakelen van vergelijkingen tussen netwerken. Een schematische weergave van deze analyse wordt weergegeven in Figuur 5.
- Bereken de coördinaten van de voornaamste vector van preferentiële oriëntatie met de volgende formule:
- Bepaling van de herstelde cel
- Plaatsing van de geanalyseerde netwerken in de kern van belang
- Uitlijning van de 20 X en 4 X beelden
- Om te bepalen van de positie van elk netwerk in de kern van belang (NVsnpr), de 4 X-afbeelding te gebruiken. Open de afbeelding die 4 X met een vector afbeeldingseditor.
- Selecteer de 4 X-afbeelding en het formaat wijzigen door het te vermenigvuldigen met 5. Het venster dimensie is gelegen in het rechterdeel van de bovenste horizontale werkbalk. Bijvoorbeeld, voor een 4 X-image die heeft zijn bemonsterd op 800 x 800 pixels, de bemonstering resolutie tot 4000 x 4000 pixels te wijzigen (als u wilt instellen van de werkende eenheid in pixels, ga naar "Instellingen" onder het tabblad bestand: bestand | Documentinstelling). Het exporteren van het bestand in de TIFF-indeling en naam het "formaat 4 X".
- Uitlijnen op de linker bovenhoek van de afbeelding met de linkerbenedenhoek van de Adobe Illustrator-document.
Opmerking: De software biedt coordinaten uit een referentiële punt linksonder. - Open de 20 X afbeelding van het netwerk. Gebruik de '' binair bestand '' of '' detectie bestand '' omdat ze gemakkelijker uitlijnen. Dan spelen met de dekking-tool op de '' binair bestand '' van de 20 X afbeelding uitlijnen met het opnieuw formaat 4 X beeld.
Opmerking: Het gereedschap van de dekking is in de bovenste horizontale werkbalk. - Als de uitlijning is, selecteer Houd het gereedschap Pipet zodat het gereedschap Meetlat wordt weergegeven en selecteert u deze in de linker werkbalk.
- Gebruik het gereedschap Meetlat te klikken op de linker bovenhoek van de 20 X afbeelding om de coördinaten van de 20 X referentiële wijzen op de gewijzigde 4 X beeld.
Opmerking: Deze coördinaten, die worden aangeduid als de 20 X referentiële (20XR in Figuur 5), nuttig zal zijn voor het uitdrukken van de positie van elk netwerk op een schematische tekening van de kern.
- Normalisering van de kern van belang
Opmerking: Om de gegevens samengevat, een normalisatie van de kern (NVsnpr) als een rechthoek wordt gebruikt. De stappen worden hieronder beschreven.- De 4 X gewijzigd bestand openen in ImageJFIJI, en gebruik het gereedschap Veelhoek te omringen de kern (NVsnpr). Gebruik de beeld met doorvallend licht als de grenzen van de kern zijn niet in staat om gezien te worden; in dat geval moet eerst de grootte ervan.
- Open de ROI-Manager en het toevoegen van de getekende ROI. Selecteer in "Set Measurement", de optie '' omsluitende rechthoek ''.
Opmerking: De optie "Omsluitende rechthoek" berekent de kleinste rechthoek rond de getekende kern. - Klik op "Maatregel".
Opmerking: Wordt een tabel weergegeven met BX en BY, de coördinaten van de linkerbovenhoek van de rechthoek: '' rechthoek positie '' en biedt de breedte en hoogte. BX en door zijn de coördinaten van de rechthoek referentiële die worden aangeduid als
en 
.
- Uitdrukking van de positie van elk netwerk in de genormaliseerde kern
- Express de coördinaten van elke cel met de 4 X referentiële (zwarte vierkantje in Figuur 5) met de volgende formule:
Waar:
zijn de celcoördinaten met de 4 X referentiële; 
zijn de celcoördinaten met de 20 X referentiële (oranje vierkantje in Figuur 5); en 
zijn de coördinaten van de 20 X referentiële punt in de 4 X-image (20XR). - Express de celcoördinaten in de referentiële rechthoek (blauw in Figuur 5) met de volgende formule:
Waar:
zijn de cel in de rechthoek referentiële coördinaten; 
zijn de celcoördinaten in de 4 X referentiële; en 
zijn de coördinaten van de rechthoek referentiële in het 4 X beeld. - Transformeren de celcoördinaten in de rechthoek referentiële aan het percentage van de breedte en hoogte van de rechthoek met de volgende formule:
Waar:
zijn de cel in het percentage van de breedte en hoogte van de rechthoek coördinaten; 
zijn de cel in de rechthoek referentiële coördinaten; 
is de breedte van de rechthoek gemeten boven in het protocol; en 
is de hoogte van de rechthoek gemeten boven in het protocol. - Te vertegenwoordigen alle netwerken op hetzelfde cijfer, rekening houden met de richting van het segment (links of rechts). Om te standaardiseren van de gegevens, wordt de referentiële toegepast op de linkerkant van het segment. De coördinaten van het netwerk van de rechterkant naar de linkerkant door de volgende formule toe te passen alleen voor x-coördinaten overbrengen
Waar:
is de x-coördinaat van de rechterkant van het segment; en 
is de nieuwe x-coördinaat uitgedrukt in de referentiële aan de linkerzijde van het segment.
Opmerking: U kunt ook de afbeelding in ImageJFIJI vóór de analyse spiegel (afbeelding | Transformeren | Horizontaal spiegelen). - Als u de coördinaten van de voornaamste vector van preferentiële oriëntatie uitdrukken, dezelfde stappen met de celcoördinaten (stappen 6.5.3.1 tot 6.5.3.4).
Opmerking: De uitdrukking van de coördinaten in percentages kunt een compilatie van de gegevens als een enkele complot waarin de kern (NVsnpr) is ontworpen als een rechthoek.
- Express de coördinaten van elke cel met de 4 X referentiële (zwarte vierkantje in Figuur 5) met de volgende formule:
- Uitlijning van de 20 X en 4 X beelden
- Studie van het hoekige verschil tussen de voornaamste vector van preferentiële richting
Opmerking: De hoekige verschil van een astrocytic netwerk wordt gebruikt om te bepalen of de preferentiële oriëntatie naar het midden van de kern van belang. Voor het berekenen van de hoekige verschil (α in Figuur 5), dat is de hoek tussen de voornaamste vector van preferentiële richting van het netwerk (PD, rode lijn in Figuur 5) en de lijn P verbinden met C, de stelling van Al-Kashi toepassen in de driehoek PDC (Zie inzet van Figuur 5 en Aanvullende methoden).- Bereken eerst de verschillende lengtes met behulp van de toepassing van de stelling van Pythagoras in een Cartesiaans referentiële met behulp van de volgende vergelijking:
Waar: de coördinaten van P en C zijn
en 
, respectievelijk in de rechthoek referentiële (berekend boven). - Bepaal het hoekige verschil in radialen met de volgende formule:
- Converteer het hoekige verschil in graden (bijvoorbeeld met de functie graden in Excel software).
- Compileer alle hoekige verschillen door het uitzetten van hen in verticale staafdiagrammen (Figuur 7 c en 7 D) en nagaan of er een preferentiële sturing van de astrocytic netwerken.
- Bereken eerst de verschillende lengtes met behulp van de toepassing van de stelling van Pythagoras in een Cartesiaans referentiële met behulp van de volgende vergelijking:
als de coördinaten voor een bepaalde cel; 
als de coördinaten van de herstelde cel (of de referentiële punt van het netwerk); en 
als de coördinaten voor een bepaalde cel in de nieuwe referentiële.
) als de coördinaten van de voornaamste vector van preferentiële oriëntatie; en 
als de coördinaten van elke cel van het netwerk verkregen met de herstelde cel als referentiële.
en 
.
zijn de celcoördinaten met de 4 X referentiële; 
zijn de celcoördinaten met de 20 X referentiële (oranje vierkantje in Figuur 5); en 
zijn de coördinaten van de 20 X referentiële punt in de 4 X-image (20XR).
zijn de cel in de rechthoek referentiële coördinaten; 
zijn de celcoördinaten in de 4 X referentiële; en 
zijn de coördinaten van de rechthoek referentiële in het 4 X beeld.
zijn de cel in het percentage van de breedte en hoogte van de rechthoek coördinaten; 
zijn de cel in de rechthoek referentiële coördinaten; 
is de breedte van de rechthoek gemeten boven in het protocol; en 
is de hoogte van de rechthoek gemeten boven in het protocol.
is de x-coördinaat van de rechterkant van het segment; en 
is de nieuwe x-coördinaat uitgedrukt in de referentiële aan de linkerzijde van het segment.
en 
, respectievelijk in de rechthoek referentiële (berekend boven).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Koppeling tussen de cellen in de hersenen is niet statisch maar veeleer dynamisch gereguleerd door vele factoren. De beschreven methoden werden ontwikkeld astrocytic netwerken onthuld onder verschillende omstandigheden analyseren en begrijpen van hun organisatie in NVsnpr. Deze resultaten zijn reeds gepubliceerd1. We biocytin vullen van enkele astrocyten in het dorsale deel van de NVsnpr in drie verschillende omstandigheden uitgevoerd: in rust (in controlevoorwaarden in de afwezigheid van elke stimulatie), in Ca2 +-gratis voorwaarden, en na de elektrische stimulatie van sensorische vezels dat aan de kern project. De experimentele instellingen voor het vullen van de biocytin van astrocyten voor elke voorwaarde worden geïllustreerd in de linker zijkanten van figuur 6A-C.
Netwerken van biocytin-label cellen werden waargenomen in controlevoorwaarden en een basale staat van cel koppeling tussen NVsnpr astrocyten onbeweeglijk bevestigd. 11 geteste ingeval toonde biocytin verspreiding netwerken bestaande uit 11 ± 3 cellen (middelste paneel in figuur 6A, figuur 6D) uit te breiden over een oppervlakte van 34737 ± 13254 µm2 (Figuur 6 sexies). Carbenoxolon (CBX, 20 μM), een niet-specifieke Bloqueur van kloof kruispunten, werd gebruikt in een onafhankelijke set experimenten om ervoor te zorgen dat de waargenomen labelen was een resultaat van biocytin verspreiding via gap kruispunten en ICT wordt niet door de cellen van biocytin, die kunnen lekken in de extracellulaire ruimte van de positieve druk toegepast op de pipet patch voorafgaand aan patchen. Bad toepassing van CBX verminderde het aantal gelabelde cellen naar 2 ± 0.5 cellen (rechterdeel in figuur 6A, figuur 6D; Iman-Conover methode, P = 0.016; Holm-Sidak test, P = 0.010) en het gebied van de biocytin uitbreiden tot 2297 ± 1726 µm2 (6E cijfer; Iman-Conover methode, P = 0.0009; Holm-Sidak test, P = 0,025).
Het effect van calcium verwijdering uit het medium op de NVsnpr astrocytic netwerken werd getest omdat lage extracellulaire calcium concentratie is bekend zijn met het openen van connexins en kloof kruispunten20,21,22, en het kan worden gebruikt Als een massale en uniforme stimulans voor het openstellen van de syncytium en tracer verspreiding via gap kruispunten te maximaliseren. De astrocytic netwerken die werden geopenbaard in Ca2 +-gratis voorwaarden (n = 10) toonde een groter aantal cellen dan de netwerken geopenbaard in controlevoorwaarden, met 37 ± 10 label cellen (middelste paneel in Figuur 6 c, figuur 6D; Iman-Conover methode, P = 0.016; Holm-Sidak test, P < 0.001) met een oppervlakte van 108123 ± 27450 μm2 (middelste paneel in Figuur 6 c, 6E cijfer; Iman-Conover methode, P = 0.009; Holm-Sidak test, P = 0,001).
Vergeleken met de volledige verwijdering van calcium uit het medium, is elektrische stimulatie van afferent ingangen aan de kern van belang een meer fysiologische stimulans waarbij direct de neuronale circuit van belang. Bijgevolg kunnen de resultaten van dit soort manipulatie bieden zinvolle informatie over de functionele gevolgen van de astrocytic netwerken waargenomen. Bijvoorbeeld, twee verschillende routes-ingang kan leiden tot verschillende effecten over de basale stand van cellen koppelen in een bepaald gebied, of het kan uitlokken koppeling tussen astrocyten in verschillende onderverdelingen van de kern. In onze schakeling, elektrische stimulatie van de sensorische vezels dat project aan de NVsnpr met behulp van 2 seconden treinen van 0,2 ms pulsen bij 40-60 Hz (n = 11) een stijging van de koppeling tussen NVsnpr astrocyten, ten opzichte van de ongestimuleerde voorwaarden, met 23 ± 6 cellen geproduceerd (middelste paneel in figuur 6B, figuur 6D; Iman-Conover methode, P = 0.016; Holm-Sidak test, P = 0,012) uitspreiden over een oppervlakte van 814174 ± 15270 μm2 (middelste paneel in figuur 6B, 6E cijfer; Iman-Conover methode, P = 0.009; Holm-Sidak test, P = 0.004).
De gevolgen van deze twee soorten stimulatie, de verwijdering van calcium uit het medium, en de elektrische stimulatie van afferent ingangen, zijn alle verstoord door CBX. De astrocytic netwerken in deze toestand bestaat slechts 5 ± 1 cellen in Ca2 +-gratis aCSF (juiste paneel in Figuur 6 c, figuur 6D; n = 4; Iman-Conover methode, P = 0.016; Holm-Sidak test, P < 0.001) en 9 ± 2 cellen met sensorische vezels stimulatie (rechter paneel in figuur 6B, figuur 6D; n = 6; Iman-Conover methode, P = 0.016; Holm-Sidak test, P = 0.023). De oppervlakten van netwerk werden ook teruggebracht tot 17987 ± 9843 µm2 met Ca2 +-gratis aCSF (Figuur 6 sexies; n = 4; Iman-Conover methode, P = 0.009; Holm-Sidak test, P = 0.004) en naar 39379 ± 11014 µm2 met sensorische vezels stimulatie (Figuur 6 sexies; n = 6; Iman-Conover methode, P = 0.009; Holm-Sidak test, P = 0.055).
Anatomische analyse werd uitgevoerd alleen in gevallen waar de NVsnpr grenzen duidelijk kunnen worden gedefinieerd op 4 X imaging, dat was het geval voor 9 van de 10 netwerken verkregen met Ca2 +-gratis aCSF en 8 van de 11 netwerken verkregen met elektrische stimulatie. Plotten van alle geanalyseerde astrocytic netwerken op een theoretische NVnspr blijkt dat de meeste cellen bestaat in de netwerken zijn beperkt binnen de grenzen van de nucleus (cijfers 7A en 7B, linker- en middelste panelen). Onder Ca2 +-gratis aCSF, 4 van de 9 astrocytic netwerken verspreiding buiten de NVsnpr in de richting van de motor kern mediaal gelegen aan de NVsnpr. In deze 4 gevallen, waren de overgrote meerderheid van de gelabelde cellen beperkt tot de kern. De netwerken van gelabelde cellen verkregen met elektrische stimulatie van de sensorische vezels waren meer beperkt. Slechts 2 netwerken uitgebreid over de grenzen van de nucleus, waarin een verdeeld over de grens mediodorsal naar het gebied van de laterale supratrigeminal (donker groen netwerk in figuur 7B, linker- en middelste panelen). In het tweede geval, 2 astrocyten in het rode netwerk (figuur 7B, linker- en middelste panelen) stak in het ventrale gedeelte van de NVsnpr.
De vectoriële analyse voor de preferentiële oriëntatie van astrocytic netwerken (rechter paneel in figuur 7A en 7B) geproduceerd verschillende resultaten, afhankelijk van de stimulus gebruikt. Inderdaad, voor de astrocytic netwerken waargenomen met Ca2 +-vrije aCSF, allen behalve één van de vectoren van preferentiële oriëntatie waren gericht op het midden van de NVsnpr. Echter, voor de astrocytic netwerken waargenomen met elektrische stimulatie, de preferentiële oriëntatie-vectoren waren meestal gericht op de grenzen van de kern. Dit wordt weerspiegeld door de berekende hoekige verschillen in preferentiële richting tussen de astrocytic netwerken verkregen met Ca2 +-gratis aCSF en verkregen met elektrische stimulatie van de sensorische vezels. Onder Ca2 +-gratis aCSF, de verticale bar grafieken van de verdeling van hoekige verschil bleek dat de meeste van de netwerken van gelabelde cellen een hoekige verschil tussen de 0 en 40 graden, met een gemiddelde van hoekige verschil van 39,5 ± 12.7 graden ( hebben Figuur 7 c). Met elektrische stimulatie van sensorische vezels, de verdeling is meer uniform, en het gemiddelde hoekige verschil (99.5 ± 17 graden) is beduidend anders (figuur 7D; student t-test, P = 0,012).
Deze gegevens laten zien dat biocytin labeling analyse laat ons toe om de effecten van verschillende stimuli modulerende astrocytic koppeling onderscheiden. Bovendien, toewijzing van de astrocytic netwerken in de kern van een genormaliseerde gevolgd door vectoriële analyse biedt waardevolle informatie over de omvang en de anatomische organisatie van deze netwerken.
Figuur 1: geheel-cel patch-clamp van Astrocyt. (A) astrocyten aangeduid met een lading van de marker sulforhodamine 101 (SR-101) in NVsnpr. Een SR-101-geëtiketteerden Astrocyt soma is gericht met de patch Pipet (witte gestippelde lijn). Schaal bar = 100 μm. (B) een depolarizing oprit-protocol wordt uitgevoerd in spanning-clamp (van-120 tot 110mV) om te beoordelen van de Astrocyt passieve kenmerken. C beoordeling van het ontbreken van een actiepotentiaal afvuren in de Astrocyt door injectie van huidige pulsen in current-clamp modus. Dit percentage is aangepast van Condamine et al. (2018) 1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: behandeling en analyse van astrocytic netwerken met ImageJFIJI software. (A) Z-Stack creatie van de confocal beeldvorming van een astrocytic netwerk. In het venster linksboven, Z-stack in ImageJFIJI. (B) achtergrond aftrekken proces. Aftrekken in de linkerbovenhoek, venster van de achtergrond in ImageJFIJI. De gestippelde cirkel legt de nadruk op het gebied in de afbeelding waar het effect van de opdracht Afsplitsen achtergrond het meer voor de hand wanneer is ten opzichte van de afbeelding in A. (C) Remove uitschieters proces. Dit proces wordt de kleine vlekken als gevolg van aspecifieke afzettingen van streptavidine gekoppeld aan een Alexa 594 verwijderd. De witte pijlen geven de storting vóór (figuur 2B) en na (figuur 2C) de opdracht is verwerkt. In de linkerbovenhoek, uitschieters venster in ImageJFIJI te verwijderen. (D) voorbeeld van het vervagende effect dat kan worden geproduceerd door een gebrekkige aanpassing van de parameters van de uitschieters verwijderen. Gele pijlen wijzen cellen aan sommige wazig. (E) drempel proces aanpassen. Pas in de linkerbovenhoek, drempel venster in ImageJFIJI. De schuifbalken handelen over de drempel signaal aanpassing. (F) het maken van binaire stap. De afbeelding wordt omgezet in een binair bestand in ImageJFIJI. Schaal bar = 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: detectie van cellen in astrocytic netwerken met ImageJFIJI. (A) voorbeeld van een binaire beeld van een astrocytic netwerk verkregen in ImageJFIJI. Schaal bar = 100 μm. (B) illustreert de "detectie file" verkregen na toepassing van het proces van de deeltjes analyseren op het binaire bestand. De shapes komen overeen met alle gedetecteerde cellen met hun bijbehorende nummers in het rood. (C) deel links: analyseren van deeltjes venster in ImageJFIJI. Deze functie detecteert de cellen van het netwerk in de binaire beeldoverdracht. De grootte van de gedetecteerde cellen en hun cirkelvormigheid kan worden aangepast. Nummers worden gebruikt, moeten worden vastgesteld met trial-and-error tot een bevredigend resultaat is bereikt. Deel rechts: detectie tabel gegenereerd door het proces van de deeltjes analyseren. X- en Y-kolommen lijst de coördinaten van elke cel gedetecteerd in de afbeelding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: netwerk gebied analyse en vaststelling van de herstelde cel in ImageJFIJI. (A) gebruik die het gereedschap Veelhoek in ImageJFIJI, een ROI is getraceerd rond het cluster van gedetecteerd cellen (rode lijn) die worden gebruikt voor het bepalen van de oppervlakte van het netwerk. (B) de ROI is naar de ROI-Manager toegevoegd. (C) voorbeeld van een astrocytic netwerk waarin de herstelde cel (witte pijl) gemakkelijk herkenbaar vanwege de opvallende intensiteit van haar biocytin labeling is. (D) voorbeeld van een astrocytic netwerk waar de herstelde cel niet kon worden geïdentificeerd, maar waarbij een oppervlakte van dichtere labeling duidelijk biocytin deposito's aangeeft. Een ROI is getrokken rond dit gebied en toegevoegd aan de manager van de ROI. Haar zwaartepunt is berekend en beschouwd als de positie van de herstelde cel voor vectoriële analyse te gebruiken. Schaal bar = 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Diagram van de verschillende referentiesysteem gebruikt voor analyse van de astrocytic netwerken. Het grijze vierkant is het 4 X beeld met de referentiële punt 4XR moeten worden uitgelijnd met de linker benedenhoek van de Adobe Illustrator-document. De wit vierkant omgeven in oranje is het 20 X beeld met de referentiële punt 20XR. Beide beelden zijn uitgelijnd met elkaar, zoals beschreven in het protocol. De rechthoek (blauwe) NVsnpr (paarse stippellijn) definieert en wordt geschaald in procenten met de referentiële punt (BR). De theorie center van het dorsale deel van NVsnpr is geschematiseerde met de donker blauwe stip (C). Het astrocytic netwerk is geschematiseerde door de herstelde cel (zwarte stip, P) en de voornaamste vector van de preferentiële richting (rode lijn). Elke zwarte stippellijn is de vector van elke cel van het astrocytic netwerk. Het hoekige verschil van het astrocytic netwerk (α) is de hoek tussen de belangrijkste preferentiële oriëntatie van het netwerk (rode lijn) en de zwarte lijn die de gepatchte Astrocyt met het theoretische midden van de kern verbindt. Inzet is een zoom van de 20 X afbeelding toont van de driehoek gevormd door het theoretische midden van de voornaamste vector van preferentiële richting (D), de NVsnpr (C) en de herstelde cel PCD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Astrocytic netwerken aangeduid met biocytin in NVsnpr onder verschillende omstandigheden verschillende maten tonen. (A-C) Aan de linkerkant, een schematische tekening van de experimentele conditie. In alle omstandigheden, was een enkele Astrocyt gelabeld door SR-101 gericht voor geheel-cel opnemen en gevuld met biocytin (0,2%). Middelste kolom: photomicrographs ter illustratie van de astrocytic netwerken verkregen onder controle voorwaarden (A), na elektrische stimulatie van het darmstelsel Vth (2 s treinen, 40-60 Hz, met 10-300 µA, 0,2 ms pulsen) (B); en na perfusie met een Ca2 +-gratis aCSF (C). Rechterkolom: photomicrographs ter illustratie van de astrocytic netwerken verkregen onder dezelfde voorwaarden, maar in het bijzijn van CBX (20 μM) in Bad voorafgaande. Schaal bar = 100 μm. (D en E) Verticale balken grafiek die het aantal van combinatie cellen en de oppervlakte, respectievelijk van de netwerken van biocytin gevulde van astrocyten onder de drie proefomstandigheden hierboven (A, B en C) in de aanwezigheid (gearceerde) en gebrek aan (ononderbroken) CBX (20 ΜM). Gegevens zijn vertegenwoordigd zoals bedoel ± SEM. meerdere vergelijkingen (Holm-Sidak test): * = P < 0.05; ** = P < 0,001. Dit percentage is aangepast van Condamine et al. (2018) 1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Karakterisering van netwerken in NVsnpr onder Ca2 +-gratis aCSF en met elektrische stimulatie van het darmstelsel Vth . (A en B) Links: Alle cellen in 9 netwerken het label gevuld onder perfusie met Ca2 +-gratis aCSF (A) of in 8 netwerken gevuld terwijl het stimuleren van de Vth tractus (B) zijn uitgezet volgens hun positie op een theoretische NVsnpr nucleus (grijze rechthoek). Elk netwerk (en de cellen die het componeren) wordt vertegenwoordigd door een andere kleur. Midden: grenzen van elk netwerk. De stip in elk gebied voorstelt de herstelde cel. Rechts: vertegenwoordiging van de voornaamste vector van preferentiële oriëntatie van elk netwerk. De stip vertegenwoordigt de herstelde cel en de pijl de vector van preferentiële richting. (C en D) Distributie van hoekige verschillen tussen de voornaamste vector van de preferentiële oriëntatie en een rechte lijn tussen de herstelde cel naar het midden van het dorsale deel van NVsnpr (gelegen op 25% op de dorsoventral as en 50% op de as mediolateral) onder de twee voorwaarden studeerde. Het gemiddelde hoekige verschil was 39,5 ± 12.7 graden in Ca2 +-vrije aCSF, die aangeeft dat een preferentiële gerichtheid op het centrum van de kern en 99.5 ± 17 graden met elektrische stimulatie, met vermelding van een preferentiële gerichtheid op de periferie (student t-test, P = 0,012). Dit percentage is aangepast van Condamine et al. (2018) 1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| sucrose-aCSF* | mMol |
| Sacharose | 219 |
| KCl | 3 |
| KH2PO4 | 1,25 |
| MgSO4 | 4 |
| NaHCO3 | 26 |
| Dextrose | 10 |
| CaCl2 | 0.2 |
Tabel 1: samenstelling van de sucrose-gebaseerde oplossing gebruikt voor het snijden van de hersenen. (*) = pH en osmolariteit werden aangepast aan 7.3-7.4 en 300-320 mosmol/kg, respectievelijk.
| aCSF* | mMol |
| NaCl | 124 |
| KCL | 3 |
| KH2PO4 | 1,25 |
| MgSO4 | 1.3 |
| NaHCO3 | 26 |
| Dextrose | 10 |
| CaCl2 | 1.6 |
Tabel 2: samenstelling van de aCSF oplossing gebruikt voor opslag van het segment en geheel-cel opnemen. (*) = pH en osmolariteit werden aangepast aan 7.3-7.4 en 290-300 mosmol/kg, respectievelijk.
| Interne patch oplossing* | mMol |
| K-gluconaat | 140 |
| NaCl | 5 |
| HEPES | 10 |
| EGTA | 0,5 |
| Tris ATP zout | 2 |
| Tris GTP zout | 0.4 |
Tabel 3: samenstelling van de interne oplossing gebruikt voor geheel-cel opnemen. (*) = pH en osmolariteit werden aangepast aan 7.2-7.3 en 280-300 mosmol/kg, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er bestaan een aantal elektrofysiologische methoden voor de beoordeling van functionele koppeling tussen astrocyten23,24. Deze methoden geven echter geen informatie over de anatomische indeling van de astrocytic netwerken. Een aantal studies hebben reeds aangetoond dat "kleurstof - of tracer-koppeling", zoals gedaan hier, alleen op in een fractie van combinatie van cellen die zijn gedetecteerd door elektrofysiologische methoden25,26,27 treedt, suggereren dat het aantal cellen met deze methode ontdekt wordt onderschat. Dit is echter nog steeds de beste methode voor visualisatie van de koppeling. Meer kleurstof-koppeling wordt verkregen bij het gebruik van molecuul traceurs kleiner dan 1-1.2 KDa te doordringen van de kloof kruispunten20. Live visualisatie van koppeling kan worden uitgevoerd door monitoring van de verspreiding van fluorescerende glucose derivaten (2-NBDG) of een fluorescerende marker (zoals sommige Alexa kleurstoffen of Lucifer gele)13, maar vanwege de kleinere omvang, biocytin levert betere resultaten en kwantificering in vaste weefsel voorziet. Aldus, moet opgemerkt worden dat het aantal cellen met deze methode ontdekt grotendeels onderschat wordt. Aan de andere kant, sommige van de cellen kan worden met het label niet vanwege hun koppeling, maar vanwege de opname van tracer die heeft gelekt in de extracellulaire ruimte. De omvang van de etikettering als gevolg van lekkage kan worden geraamd in controle experimenten met bad toepassingen van een gap junction blocker1. Echter kan worden aangenomen dat vooringenomenheid als gevolg van de methode voor alle voorwaarden gelden zou.
Tot slot benadrukt moet worden dat niet alle gekoppelde cellen astrocyten zijn. Panglial netwerken waar de astrocyten zijn gekoppeld aan oligodendrocyten zijn beschreven in verschillende hersengebieden, waaronder de laterale superieure olijf8, thalamus16, cortex en hippocampus28. Ons doel was het ontwikkelen van een methode astrocytic netwerken onthuld met kleurstof-koppeling onder verschillende omstandigheden te beoordelen van de hypothese dat ze duidelijk omschreven, kenmerkende functionele domeinen geopenbaard door verschillende prikkels vormen te vergelijken. Aangezien in de NVsnpr, de kern van de hersenstam waarin dit protocol werd uitgevoerd, is de koppeling tussen de astrocyten zeer beperkt onder voorwaarden rusten, was het belangrijk om eerst het ontwikkelen van een betrouwbare en onbevooroordeelde methode voor het detecteren van gelabelde cellen. Dit werd bereikt met geautomatiseerde detectie met ImageJFIJI. Het is soms moeilijk te onderscheiden van flauw gelabelde cellen van achtergrondgeluiden. Hier, kan stapel beeldvorming en een methode in ImageJFIJI worden gebruikt ter verbetering van het signaal, maar achtergrondgeluiden nog steeds te hoog en leiden tot afwijzing van de gegevens. In toekomstige studies, kunnen verduidelijking protocollen worden gebruikt ter verbetering van de signal-to-noise verhouding. Een clearing-protocol is een interessante methode van verduidelijking dat weefsel morfologie (geen krimp) behoudt, heeft geen invloed op lipiden en is compatibel met immunokleuring29. Een andere beperking van de beschreven methode is het "stroomgebied" gereedschap gebruikt om cellen die te dicht bij elkaar. Visueel onderzoek van gedetecteerde cellen moet gebeuren bij het gebruik van dit hulpprogramma.
Als astrocytic netwerken functionele domeinen vormen, dan moet zij kunnen bepalen de begrenzing van een nucleus of dient ten minste te worden beperkt tot de grenzen van een kern. Geopenbaard netwerken kunnen altijd worden beperkt binnen een kern, meer zo wanneer zij kleiner in grootte, als de herstelde Astrocyt is in het centrum (of binnen) de kern. Om te testen of de astrocyten zitten bij voorkeur in de buurt van de rand van de kern van een koppel met andere astrocyten buiten de kern of samen met anderen binnen de kern, die we nodig hadden om te bepalen van de preferentiële richting waarover de kleurstof uit de herstelde Astrocyt verspreidt. Verschillende andere studies hebben aangepakt een soortgelijk probleem in de velden van de barreloid van de thalamus, olfactorische glomeruli, hippocampus en laterale superieure olijf, vat cortex, maar ze gericht analyses meestal op de afstand van verspreiding van de tracer, elektrofysiologische karakterisatie van verschillende types van astrocyten in functie van hun lokalisatie en verspreiding van kleurstof langs orthogonale assen met betrekking tot deze welomschreven structuren8,9,10, 13,14,16. Hier, we vectoriële analyse gebruikt om te bepalen van de dominerende richting van tracer verspreid, die werd gegeven door het paginaformaat en de afdrukstand van de genormaliseerde belangrijkste vector. Kleine vectoren geven geen duidelijk "dominant" of preferentiële oriëntatie. Een cruciale stap voor de vectoriële analyse is de mogelijkheid om nauwkeurig identificeren de herstelde Astrocyt, die is niet altijd mogelijk. Een interessant alternatief voor het vinden van de herstelde Astrocyt is het toevoegen van een grote (niet-gap junction permeant) en corrigeerbare tracer, zoals dextrans, aan de opnameoplossing. Als het niet mogelijk om de herstelde cel of patchlocatie in is, is het mogelijk beter om het weglaten van deze experimenten uit de vectoranalyse.
Tot slot, om te analyseren of eigenschappen van netwerken gevarieerd volgens hun locatie in de kern, moesten we een methode om hun standpunt in de kern van een "genormaliseerde". De alleen bij kritieke stap in deze procedure is de mogelijkheid om de grenzen van de kern in de lage vergroting beelden (4 X) duidelijk te zien. Een eenvoudige oplossing voor dit probleem, is als het gebeurt vaak, het toevoegen van een standaard histologische verkleuring aan weefsel verwerking vóór analyse.
Heterogeniteit van astrocyten over hersengebieden duidelijk is aangetoond, en een groeiende hoeveelheid bewijs ondersteunt het concept dat hun specialisaties met name geschikt voor de functie van het circuit zijn dat ze zijn ingebed in9, 10,30,31. Voor dit om waar te zijn, moet Inter astrocytic mededeling worden beperkt tot de astrocyten gekoppeld aan hetzelfde circuit. Opmerkingen ter ondersteuning van deze veronderstelling zijn opkomende in verschillende hersengebieden maar duidelijker zijn in gebieden met geclusterde vertegenwoordigingen, zoals zintuiglijke kaarten in de cortex van het vat of de bulbus olfactorius. Echter, de meeste rapporten van overlap tussen de neuronale en astrocytic kaarten zijn beschrijvende en kwalitatieve. De methoden gemeld hier inzetbaar te objectiveren van deze opmerkingen en hulpmiddelen voor het beter analyseren astrocytic netwerken volgens hun positie in een bepaald circuit te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek, Grant/Award nummer: 14392.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
References
- Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
- Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
- Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control? Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
- Verkhratsky, A., Steinhauser, C. Ion channels in glial cells. Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).
- Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neuroscience. 286, 45-59 (2015).
- Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
- Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
- Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
- Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
- Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
- Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
- Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
- Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
- Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
- Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).
- Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).
- Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
- Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
- Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
- Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
- Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
- Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
- Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
- Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).
