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Neuroscience

Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten

Published: October 4, 2018 doi: 10.3791/58116
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central, and Département de Neurosciences, Université de Montréal, 2Faculté de Médecine Dentaire, Université de Montréal

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Organisation der astrocytic Netzwerke zu beurteilen. Das beschriebene Verfahren minimiert Vorspannung um beschreibende Maßnahmen dieser Netze z. B. Zellzahl, Größe, Umgebung und Position innerhalb eines Kerns zu bieten. Anisotropie ist mit einer vektoriellen Analyse bewertet.

Abstract

Es ist immer deutlicher geworden, dass Astrozyten neuronale Funktion nicht nur auf der synaptischen und einzellige Ebene, sondern auch auf der Netzwerkebene modulieren. Astrozyten sind stark miteinander verbunden durch Gap Junctions und Kupplung durch diese Kreuzungen ist dynamisch und stark reguliert. Eine aufstrebende Konzept ist, dass astrocytic Funktionen spezialisiert und an die Funktionen der neuronalen Schaltung angepasst, mit dem sie verbunden sind. Daher sind Methoden zur Messung verschiedener Parameter der astrocytic Netze, die Regeln für ihre Kommunikation und Kupplung besser zu beschreiben und um ihre Funktionen zu verstehen benötigt.

Hier, unter Verwendung der Bildanalyse-Software (zB., ImageJFIJI), wir beschreiben eine Methode zur Analyse konfokale Bilder astrocytic Netzwerke von Farbstoff-Kupplung offenbart. Diese Methoden ermöglichen (1) eine automatisierte und unvoreingenommene Erkennung von markierten Zellen (2) Berechnung der Größe des Netzes, (3) Berechnung der bevorzugte Ausrichtung der Farbstoff innerhalb des Netzwerks zu verbreiten, und (4) Neupositionierung des Netzes innerhalb des Bereichs des Interesses .

Diese Analyse kann zur astrocytic Netzwerke eines bestimmten Gebietes zu charakterisieren, Netzwerke verschiedener Bereiche, die verschiedene Funktionen zugeordnet, oder vergleichen Netzwerke unter verschiedenen Bedingungen, die unterschiedliche Auswirkungen auf Kupplung haben gewonnen. Diese Beobachtungen führen zu wichtigen funktionalen Überlegungen. Zum Beispiel analysieren wir die astrocytic Netzwerken aus einem trigeminus Kern, wo wir zuvor gezeigt haben, daß astrocytic Kupplung entscheidend für die Fähigkeit von Nervenzellen, ihre impulsmuster von Tonika auf rhythmische platzen1wechseln. Durch die Messung der Größe, Entbindung und bevorzugte Ausrichtung der astrocytic Netzwerke in diesem Kern, können wir Hypothesen über funktionelle Domänen erstellen, die sie umschreiben. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass mehrere andere Hirnareale, einschließlich Barrel Cortex, seitliche überlegene Olive, olfaktorische Glomeruli und sensorischen Kerne in den Thalamus und visuellen Kortex, um nur einige zu nennen eine ähnliche Analyse profitieren können.

Introduction

Viele Studien haben beschrieben, wie der Neuron-Astrozyten Dialog eine Ebene der subzellulären oder synaptic in neuronalen Funktionen und synaptische Übertragung auswirken kann. Es ist allgemein bekannt, dass die Astrozyten empfindlich zu den umliegenden neuronalen Aktivität; in der Tat haben sie Rezeptoren für viele Neurotransmitter wie Glutamat, GABA, Acetylcholin und ATP (siehe zuvor veröffentlichten Bewertungen2,3,4). Im Gegenzug verarbeitet astrocytic Ensheath synaptischen Elemente und Einfluss neuronaler Aktivität dort und an extrasynaptic Standorten durch Regulierung der extrazellulären Ionischen Homöostase und Freigabe mehrere Faktoren oder Transmitter wie Glutamat, D-Serin und ATP 5 , 6 , 7.

Die Idee, dass Astrozyten auch neuronale Funktion auf der Netzwerkebene modulieren können hat, Beweise gezeigt, dass astrocytic Kupplung räumlich geregelt ist und neuronalen Segmentierung in Bereichen zeichnet sich durch eine klare anatomische entspricht Abschottung (wie Bereiche mit sensorischen Darstellungen), darauf hinweist, dass Astrozyten koppeln werden an andere Astrozyten dienen die gleiche Funktion anstatt nur diejenigen, die ganz in der Nähe sind. In der seitlichen überlegene Olive orientieren sich zum Beispiel am meisten astrocytic Netzwerke orthogonal zu der tonotopen Achse8, während in den Lauf Kortex oder Olfactoty Glomeruli, Kommunikation zwischen Astrozyten in Fässern oder Glomeruli viel stärker ist und schwächeren zwischen benachbarten,9,10. In beiden Fällen orientieren sich die astrocytic Netzwerke an das Zentrum der Nierenbeckenentzündung oder Lauf9,10.

Wir zeigten kürzlich, dass astrocytic Aktivität neuronale feuern moduliert durch eine Verringerung der Konzentration der extrazellulären Ca2 + ([Ca2 +]e), vermutlich durch die Freisetzung von S100β, Ca2 +-bindende Protein11. Dieser Effekt, der in einer Population von trigeminus Rhythmogenic Neuronen im dorsalen Teil des Trigeminus sensorischen Main Kern (NVsnpr zeigte, gedacht, um eine wichtige Rolle bei der Erzeugung von physiologischen Bewegungen), ergibt sich daraus, dass rhythmische feuern in diesen Neuronen hängt eine persistente Na+ aktuelle, die durch die Verluste von [Ca2 +]e11,12gefördert wird. Rhythmische feuern in diese Neuronen kann "physiologisch" durch Stimulation der Eingaben oder künstliche Verringerung der [Ca2 +]eausgelöst. Weiter zeigten wir, dass astrocytic Kupplung für neuronale rhythmische feuern1erforderlich war. Dies erhöht die Möglichkeit, dass astrocytic Netzwerke umschriebene Funktionsbereiche bilden können, wo neuronaler Aktivität synchronisiert und koordiniert werden können. Um diese Hypothese zu beurteilen, mussten wir zuerst eine Methode um die Organisation dieser Netze innerhalb NVsnpr rigoros zu dokumentieren zu entwickeln.

Frühere Studien zu astrocytic Netzwerke haben vor allem das Ausmaß der Kupplung in Bezug auf die Anzahl von Zellen und die Dichte und die Fläche beschrieben. Versuche, die Form der astrocytic Netzwerke und die Richtung der Farbstoff-Kupplung zu bewerten waren meist durch einen Vergleich der Größe der Netze auf zwei Achsen (X und y) im Fass Kortex9, Hippocampus13,14, durchgeführt 15, Barreloid Felder der Thalamus16, seitliche überlegene Olive8, olfaktorische Glomeruli10und Kortex14. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen unvoreingenommene Grafen von markierten Zellen in einem Netzwerk und eine Abschätzung des Bereichs, den sie abdecken. Wir haben auch Werkzeuge, die bevorzugte Ausrichtung der Kupplung innerhalb eines Netzwerkes zu definieren und zu prüfen, ob die bevorzugte Ausrichtung in Richtung der Mitte des Kerns oder in eine andere Richtung entwickelt. Im Vergleich zu bisher verwendeten Methoden bietet dieses Protokolls ein Mittel zur Beschreibung der Organisation und Ausrichtung der astrocytic Netze in Strukturen wie der dorsalen trigeminus wichtigsten sensorischen Kern, die nicht über eine klare anatomische bekannt Abschottung. In den oben genannten Studien, die Netzwerk-Ausrichtung wird beschrieben als eine Beziehung auf die Form der Struktur selbst die bereits dokumentiert ist (zB., die Barreloid in den Thalamus, Fässer in der Hirnrinde "layers" im Hippocampus und Cortex, Glomeruli in die Riechkolben usw.). Darüber hinaus ermöglicht vektoriellen Analyse für Vergleiche der Kupplung Orientierungen unter verschiedenen Bedingungen aufgedeckt. Um zu analysieren, ob diese Parameter entsprechend der Position des Netzes innerhalb des Zellkerns geändert, entwickelten wir auch eine Methode, um jedes Netzwerk in Bezug auf die Grenzen des Kerns zu ersetzen. Diese Werkzeuge können leicht auf andere Bereiche für Ermittlungsbehörden Netzwerke von gekoppelten Zellen angepasst werden.

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Protocol

Alle Verfahren blieb durch die Canadian Institutes of Health Research-Regeln und wurden von der Université de Montréal, Tierpflege und Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung der Ratte Gehirnscheiben

  1. Bereiten Sie 1 L einer Saccharose-basierten Lösung (Tabelle 1) und 1 L standard künstliches Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit (ACFS) (Tabelle 2).
  2. Blase die Saccharose-basierte Lösung mit einer Mischung aus 95 % O2 und 5 % CO2 (Carbogen) für 30 min vor der Platzierung bei-80 ° C für ca. 30 min, bis die Lösung kalt, aber nicht vollständig gefroren ist. Verwenden Sie dieses eiskalte Saccharose als Zuschnitt Puffer für das Schneiden des Gehirns. Halten Sie es auf Eis, nachdem es aus dem Gefrierfach entfernt wurde.
  3. Blase der ACFS mit Carbogen durch das gesamte Experiment. Verwenden Sie diese Lösung für die Lagerung der Scheibe sowie die perfusing Puffer in dem Patch-Spann- und Biocytin-Füllung der Astrozyten ausgeführt werden. Bereiten Sie eine Stück Erholung hält die Kammer die Gehirnscheiben hinterlegen, sobald sie geschnitten werden.
    Hinweis: Die aufnahmekammer Stück Erholung nach Maß sein könnte und besteht im Wesentlichen aus einem kleinen Brunnen mit einem Netz an der Unterseite ausgesetzt in einem größeren gut, die ACFS voller ist, in denen ein Rohr eingefügt wird, um Carbogen von unten zu bringen.
  4. 15 bis 21 Tage alte Sprague-Dawley Ratten geschlechtsspezifische oder Stamm unvoreingenommen zu verwenden. Betäuben Sie das Tier mit Isofluran (1 mL von Isofluran in einer Narkose Induktion Kammer). Prüfen Sie die Tiefe der Narkose durch sanft Kneifen der Hinterpfote oder Endstück des Tieres.
  5. Enthaupten Sie die Ratte mit einer Guillotine, geschnitten Sie der Schädel mit einer Schere und entfernen Sie schnell das Gehirn aus dem Schädel mit einem flachen Spatel.
  6. Tauchen Sie das Gehirn in die eiskalte Saccharose-basierte Lösung für über 30 s und Transfer (mit Lösung) damit ein Petri dish. Mit einer Rasierklinge entfernen Sie die Teile, die Front- und Seitenzahnbereich in das Gebiet um geschnitten werden, wenn die Querebene schneiden zerschneiden.
  7. Kleben Sie die restlichen Block des Gehirngewebes rostral seinerseits und im Saccharose-basierte Medium mit einem Vibratome Gehirnscheiben (350 µm dick) schneiden. Übertragen Sie anschließend die gesammelten Scheiben in eine Erholung hält Kammer gefüllt mit Carbogenated ACFS bei Raumtemperatur (RT), bis sie bereit sind, verwendet werden (mindestens 1 Stunde für die Wiederherstellung zu ermöglichen).
    Hinweis: Aktuelle Entwicklungen im Bereich ermöglichen längere Inkubationszeit bis zu 24 h Gehirnscheiben in in-vitro- Bedingungen17.

2. Sulforhodamine 101 (SR 101) Kennzeichnung der Astrozyten

  1. Ein Wasserbad auf 34 ° C vorheizen und zwei Stück Inkubation Kammern entgegenbringen. Füllen eines Slice Inkubation Kammern mit einer Lösung aus ACFS 1 μM mit SR-101, und füllen Sie die anderen nur mit ACFS.
  2. Inkubieren Sie die Scheiben in der Inkubation Kammer mit 1 µM SR-101 für 20 min und übertragen Sie dann in der zweiten Inkubation Kammer um zu spülen überschüssige SR-101 aus dem Gewebe. Lassen Sie es 20 min inkubieren oder mehr bei 34 ° C, halten Sie die Inkubation-Kammer, die die Scheiben bei RT bis sie sind18benötigt.

(3) Astrozyten Patchen und Biocytin Füllung

  1. Wählen Sie ein Stück und legen Sie sie in der Aufnahme Kammer des Mikroskops. Patch-Astrozyten, verwenden Sie Elektroden mit einem Widerstand von 4-6MΩ mit einer Kalium-Gluconat-basierten Lösung gefüllt (siehe Tabelle 3).
  2. Unter visuelle Führung und mit einem Mikromanipulator direkte Aufnahme Elektrode in Richtung einer SR 101 beschriftet Astrozyten wie in Abbildung 1dargestellt. Vermeiden Sie Zellen an der Oberfläche des Segments sind eher beschädigt werden oder verloren haben Verbindungen zu benachbarten Zellen.
  3. Zur Vermeidung von Leckagen von Biocytin im Gewebe minimieren den positiven-Luftdruck hinzugefügt, um die Patch-Pipette und wenden Sie es nur, wenn es in der Nähe der Astrozyten, die gepatcht werden (0,1-0,4 mL in einer Spritze 1 ml).
  4. Vor dem Patchen, stellen Sie den Offset von der Pipette und seine Kapazität. Korrigieren Sie für flüssige Verzweigung Potenziale, so genau und präzise Spannung Befehle sind entscheidend für die Experimente19.
  5. Bewegen Sie die Pipette nahe genug, um die Astrozyten, Depression, die durch den positiv-Luftdruck zu beobachten. Dann entfernen Sie den positiven-Luftdruck und langsam einige negativen Druck. Klemmen Sie die Astrozyten zu-70 mV erreicht die Dichtung 100 MΩ. Warten Sie, bis die Dichtung 1-3 GΩ erreicht. Unterdruck bis Einbruch in die Zelle gelten weiterhin. Seien Sie vorsichtig bei der Anwendung von Unterdruck, da Astrozyten sehr zerbrechlich sind.
  6. Die elektrophysiologischen Eigenschaften der gepatchten Zelle zu beurteilen. In Voltage-Clamp Modus durchführen eine ganze Zelle Strom-Spannungs-Protokoll mit einer Rampe Spannung Befehl von 600 ms Dauer von-120 bis + 110 mV. Führen Sie im Strom-Clamp-Modus ein Schritt IV-Protokoll, in dem die Injektion von 1000 ms aktuelle Schritte von 100 pA von-1 bis 1 nA, die Sampling-Rate der gesamten Zelle Aufnahmen 10 kHz ist.
    Hinweis: Astrozyten zeigen einen lineare Strom-Spannungs-Profil ohne jegliche Korrektur (siehe Abbildung 1 b) und kein Aktionspotential abfeuern auf Membran-Depolarisation (Abbildung 1). Die Membran-Ruhepotential (RMP) sollte stabil und nicht positiv - 60mV sein. In einigen Bereichen des Gehirns ist das RMP von Astrozyten mehr hyperpolarisierten als in der NVsnpr.
  7. Erlauben Sie die Biocytin, innerhalb der Astrozyten für 30 min zu verbreiten, während der Durchführung eines Schritt IV Protokoll alle 5 min..
  8. Einfahren Sie und lösen Sie die Patch-Pipette vorsichtig ohne Beschädigung der gepatchten Astrozyten und sofort notieren Sie des Versatzes der Pipette vor der Einnahme von es aus der Aufnahme-Kammer. Subtrahieren Sie diesen Wert aus der Membran möglichen Aufnahmen.
  9. Lassen Sie das Gehirn Slice in der Aufnahme-Kammer für ein Minimum von 15 min (zusätzlich 30 min für die Injektion) ruhen, um Ausbreitung des Tracers aus der gepatchten Astrozyten im gesamten Netzwerk gekoppelten Zellen zu ermöglichen.
    Hinweis: Um ein Netzwerk von gekoppelten Zellen sichtbar zu machen, sollte nur eine einzelne Zelle im Zellkern von Interesse gepatcht werden. Wenn mehrere Versuche erforderlich, um einen erfolgreichen Patch zu erreichen sind, verwerfen des Falls und versuchen, auf der kontralateralen Seite oder in einem anderen Gehirn-Scheibe zu patchen.
  10. Machen Sie eine Markierung oder Schnitt in das Gewebe zu erkennen, welche Seite der Scheibe nach oben zeigt, und übertragen Sie die Scheibe zuerst auf eine Petrischale mit normalen ACFS, dann in eine Lösung von 4 % Paraformaldehyd (PFA). Über Nacht inkubieren Sie die Scheibe bei 4 ° C.
    Achtung: PFA ist extrem schädlich. Verwenden Sie Schutzausrüstung in einem gelüfteten Abzug. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien (Pinsel, Rohre, etc.), die in Kontakt mit PFA wurden die Erholung hält Kammer, Inkubation Kammer oder andere Materialien, die für die Aufnahme der frischen Gewebe nicht kontaktieren.

4. Biocytin Offenbarung

  1. Offenbarung mit fluoreszierenden streptavidine
    1. Das Gehirn waschen Scheiben 2 x 10 min in 0,1 M Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) bei RT Dann zeigen Sie die Biocytin durch Inkubation der Gehirnscheiben mit Streptavidine konjugiert zu einem Fluorophor bei 1/200 Verdünnung mit PBS-Puffer mit 4 % nicht-ionische Reinigungsmittel für 4 h bei RT
    2. Waschen Sie die Gehirnscheiben 3 x 10 min in 0,1 M PBS bei RT und montieren Sie die Abschnitte auf Glas-Objektträger mit einer wässrigen Eindeckmedium. Legen Sie den Seiten, die nach oben, Deckglas injiziert wurden die Folien und versiegeln sie mit Nagellack.
  2. Offenbarung mit DAB
    Hinweis: DAB (3,3-Diaminobenzidine) Offenbarung kann verwendet werden, wenn Fluoreszenz verwendet werden kann. In diesem Fall sollte nur eine Offenbarung Methode für Vergleiche eingesetzt werden.
    1. Waschen die Gehirnscheiben 3 x 10 min in PBS bei RT inkubieren der Scheiben in PBS + H2O2 0,5 % für 1 Stunde bei RT
    2. Spülen Sie die Scheiben 3 x 10 min in PBS bei RT Dann inkubieren Sie die Scheiben in einen Avidin-Biotin Komplex Färbelösung bestehend aus PBS und 0,1 % nicht-ionische Waschmittel + Avidin-Biotin Komplex Peroxidase standard Färbung Kit Reagenzien auf 1/100 für 24 Stunden bei RT
    3. Spülen Sie die Scheiben 3 x 10 min in PBS bei RT, brüten sie in einer Lösung von PBS + 0,05 % für 20 min bei RT, DAB und übertragen Sie sie in eine Lösung von PBS + DAB 0,05 % + H2O2 0,5 %.
      Achtung: DAB ist extrem schädlich. Verwenden Sie Schutzausrüstung in einem gelüfteten Abzug. Die Farbreaktion wird gestoppt, wenn die Scheiben mit PBS-Puffer übertragen werden.
    4. Spülen Sie die Scheiben 5 x 10 min in PBS bei RT, montieren Sie die Abschnitte auf Objektträgern (Gesicht der Seiten, die nach oben injiziert wurden) und auf einer Folie Trocknen Bank über Nacht bei 34 ° c trocknen lassen
    5. Tauchen Sie den Objektträger 1 min. in mehreren Alkohol Bädern zu 70 %, 95 % und 100 % und am Ende mit einem Bad von Xylol für 1 min.
    6. Montieren Sie die Glas-Objektträger mit einem Toluol-basierte Kunstharz Montage Medium. Die Folien Deckgläsern aufsetzen und mit Nagellack versiegeln.

5. Netzwerk-Imaging

  1. Visualisieren der astrocytic Netze mit einem Scan confocal Mikroskop ausgestattet mit 20 X und 4 X Objektive (oder eine entsprechende Ziel, den gesamten Kern zu visualisieren, wo befindet sich das Netzwerk) und ein Laser, der Fluorophor zu erkennen (in diesem Fall ist Alexa-594 verwendet).
  2. Verwenden Sie die 20 X Vergrößerung eine Z-Stapel des Netzes der markierten Zellen. Verwenden Sie eine Auflösung von 800 x 800 Pixel und scan-Geschwindigkeit von 12,5 μs/Pixel.
    Hinweis: Um das gesamte Netzwerk Bild, mehrere Stacks sind in der Regel erforderlich, und die Anzahl der Stapel für das jeweilige Netzwerk angepasst werden muss. Die Auflösung und Scan-Geschwindigkeit kann geändert werden, aber achten Sie darauf, die gleichen Einstellungen verwenden, um alle Daten zu Bild.
  3. Verwenden Sie die 4 X Vergrößerung, Bilder des Netzwerks und des Interessenbereichs zu nehmen.
    Hinweis: Die 4 X Bildgebung dient zur Bestimmung der Netzwerkposition innerhalb des Zellkerns von Interesse. Das Bild immer des gleichen Feldes im Durchlicht. Dieses Bild wird nützlich sein, wenn Sie nicht die Grenze des Kerns in die konfokale Fluoreszenz Bild ermitteln können.

6. die Bildanalyse

  1. Aufbereitung der Daten
    1. Verwenden Sie die Software ImageJFIJI (Laden Sie es auf https://fiji.sc/). Öffnen Sie die Datei und klicken Sie auf "OK" im Fenster "Bio-Formate-Import-Optionen".
    2. Um eine Z-Stapel neu zu definieren, die nur die optische Scheiben benötigt für den letzten Z-Stapel (Abbildung 2A) enthalten soll, klicken Sie auf den "Stack" Knopf in der Werkzeugleiste (zu finden, wählen zuerst Stk | Z-Projekt). Wählen Sie "Max Intensität" in den Projektionstyp festlegen (Abbildung 2A). Speichern Sie die Datei und nennen Sie es "Stapel-Datei".
    3. Wenn die bildgebende Datei mehrere Kanäle enthält, teilen Sie es um nur den Kanal mit der astrocytic Netzwerk-Bildgebung zu sparen (Bild | Farbe | Kanäle aufgeteilt).
    4. Überprüfen Sie die Pixeleinstellungen des Bildes [Bild | Eigenschaften | Pixel (mit "1" für Pixel Dimension)].
    5. Verwenden Sie das Tool subtrahieren Hintergrund (Prozess | Subtrahieren Sie Hintergrund), den Hintergrund der Biocytin Kennzeichnung zu entfernen. Verwenden Sie die Vorschau-Funktion, den rollenden Kugel Radius festzulegen, die in der Regel auf 50 Pixel (Abb. 2 b) festgelegt ist.
    6. Verwenden Sie das Werkzeug entfernen Ausreißer (Prozess | Lärm | Entfernen Sie Ausreißer) wenn es nach dem subtrahieren Hintergrund Schritt erforderlich ist. Wählen Sie "Bright" in der Einstellung "Die Ausreißer" (Abbildung 2). Verwenden Sie die Vorschau-Funktion, um den Radius und Schwellenwert festzulegen. Seien Sie vorsichtig mit diesem Tool, da es die Daten verwischen kann, wie in Abb. 2Ddargestellt.
      Hinweis: Dieses Tool entfernt die kleinen Flecken verursacht unspezifische Ablagerung von Streptavidine (dargestellt durch die weißen Pfeile in Abbildung 2 b und 2 C vor und nach der Behandlung, beziehungsweise).
    7. Passen Sie den Schwellenwert (Bild | Anpassen | Schwelle). Wählen Sie "Standard" und "B & W" Modus (Abb. 2E). Klicken Sie auf "Anwenden".
      Hinweis: Auto-Einstellung kann verwendet werden, aber manuelle Anpassung mit zwei Schieberegler wird bevorzugt. Ziel dieses Schrittes ist es, Lärm bis zum Maximum zu reduzieren, ohne alle markierten Zellen.
    8. Konvertieren Sie das Bild in ein binäres Bild mit dem binären Prozess (Prozess | Binäre | Stellen Sie binär) wie in Abbildung 2Fgezeigt. Speichern Sie die Datei als TIFF-Datei, und nennen Sie es "binäre Datei".
  2. Zellzählung
    1. Überprüfen Sie die Einstellung für die Messfunktion (Analyze | Set-Messung). Wählen Sie die Option "Schwerpunkt".
    2. Verwenden Sie das Tool "Analysieren Partikel" auf die "binäre Datei" (Abbildung 3A) produziert im vorherigen Schritt (Analyze | Analysieren Sie Teilchen) (Abbildung 3 auf der linken Seite). Wählen Sie "Umrisse" in die "Show" Einstellung (Abbildung 3). Dies erzeugt eine neue Datei, die das Ergebnis der Erkennung (Abb. 3 b) zeigt.
    3. Spielen Sie mit den Parametern: Größe (nur Zellen zu erkennen, verwenden Sie Werte zwischen 30 und 6000) und Zirkularität (um zu bestimmen, ein Intervall zwischen 0 und 1, wobei "1" definiert einen perfekten Kreis und "0" eine zufällige Form), die Erkennung (Abbildung 3, Links Teil) zu verfeinern. Führen Sie die Erkennung durch Klicken auf "OK".
      Hinweis: Zwei Tabellen erscheinen nach der Aufdeckung: (1) eine Tabelle mit dem Titel "Zusammenfassung", die die Anzahl der gefundenen Zellen liefert, und (2) eine Tabelle mit dem Titel "Ergebnisse" (Abbildung 3, rechten Teil), bietet die x und y-Koordinaten der einzelnen Zellen.
    4. Kopieren Sie die Werte und fügen Sie sie in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Speichern Sie diese Tabelle unter dem Namen "Erkennung Tisch". Eine Datei mit einem Grundstück von erkannten Zellen erscheinen auch (Abb. 3 b). Speichern Sie diese Datei als TIFF-Datei unter dem Namen "Erkennung File".
    5. Wenn eine Gruppe von 2 oder mehr markierten Zellen im Netzwerk erkannt werden, da eine einzelne Zelle mit dem Analyse-Partikel-Tool weil sie sind zu nah beieinander, verwenden Sie das Tool Wasserscheide (Prozess | Binäre | Wasserscheide) auf das binäre Bild vor der Anwendung die Analyze-Partikel-tool, und wiederholen Sie die Analyze-Partikel-Schritte.
      Hinweis: Die Wasserscheide-Tool erstellt eine Abgrenzung von 1 Pixel breit zwischen den extrem engen Zellen. Eine Zelle Zähler plug-in kann verwendet werden, wenn die Kennzeichnung ist eindeutig und kann manuell durchgeführt werden.
  3. Messfläche astrocytic Netzwerk
    1. Um die Fläche der Netze zu messen, verwenden Sie die Erkennung-Datei mit Bild J.
    2. Verwenden der Polygon-Auswahl-Werkzeug (linker Mausklick auf die Schaltfläche in der Symbolleiste zur Auswahl) zu verfolgen ein Polygon, das alle Zellen verbindet befindet sich in der äußeren Peripherie des Netzes (Abb. 4A). Links klicken Sie, um die Verfolgung des Polygons zu beginnen, und klicken Sie rechts um ihn zu schließen.
      Hinweis: Dieses Polygon wird definiert als einer Region of Interest (ROI) und seine Oberfläche wird gemessen werden, um die Fläche des Netzwerks zu bestimmen.
    3. Öffnen Sie das Fenster Set Messung (Analyze | Messung eingestellt) und wählen Sie die Option "Bereich". Öffnen Sie den ROI-Manager (analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager) (Abbildung 4 b). Dann fügen Sie das vektorisierte Polygon im ROI-Manager durch Klicken auf "Hinzufügen" (Abbildung 4 b) und führen Sie die Messung durch Klicken auf "Maß '' im ROI-Manager.
      Hinweis: Die Flächenmessung wird in einer Tabelle angezeigt und werden in Pixel angegeben. Vergessen Sie nicht, diesen Wert mit der Umrechnungsfaktor für das Mikroskop verwendet, um einen Wert in μm2zu konvertieren.
  4. Bestimmung der wichtigsten Richtungsvektor
    1. Bestimmung der gepatchten Zelle
      1. Öffnen Sie die Stapel-Datei in ImageJFIJI und identifizieren Sie die gepatchte Zelle in der Stapel-Datei basierend auf seiner stärkeren Kennzeichnung Intensität (Abbildung 4). Dann öffnen Sie die Datei mit dem Namen "Erkennung Tisch" in einer Tabellenkalkulationsanwendung und finden Sie die Nummer auf die gepatchte Zelle und die entsprechenden Koordinaten.
      2. Wenn nicht in der Lage, die gepatchte Zelle genau zu bestimmen, umgeben das Gebiet, wo die Kaution in Höhe von Biocytin Dichter in der abgebildeten Netzwerk gekoppelten Zellen, mit dem Polygon-Werkzeug in ImageJFIJI, und beziehen sich auf diese Position wie die gepatchte Zelle (Abbildung 4).
      3. Verwenden Sie den ROI-Manager (analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager). Dann ziehen Sie einen ROI in die gepatchte Zellenposition und fügen Sie es zum ROI-Manager (siehe Abbildung 4 b).
      4. Legen Sie eine Messung (Analyze | Messung eingestellt) und wählen Sie die Option "Schwerpunkt".
      5. Klicken Sie im ROI-Manager auf "Messen", um die Koordinaten der Schwerpunkt des aufgenommenen Bereichs zu erhalten. Verwenden Sie diese Koordinaten als Referenzpunkt für dieses spezifische Netzwerk.
    2. Referentielle Übersetzung
      1. Berechnen Sie die Koordinaten der einzelnen Zellen in Bezug auf die gepatchte Astrozyten, mithilfe der folgenden Formel:
        Equation 1 
        Mit: Equation 2 als die Koordinaten für eine bestimmte Zelle; Equation 3 als die Koordinaten der gepatchten Zelle (oder der referenziellen Punkt des Netzes); und Equation 4 als die Koordinaten für eine bestimmte Zelle in der neuen referenzielle.
        Hinweis: Die Koordinaten der einzelnen Zellen in Bezug auf die gepatchte Astrozyten auszudrücken ist ein wichtiger Schritt bei der Berechnung von Vektoren aus der gepatchten Astrozyten. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie ImageJFIJI verwenden, die die referenzielle für jedes Bild befindet sich in der oberen linken Ecke des Bildes.
    3. Bestimmung der wichtigste Vektor der bevorzugte Ausrichtung
      1. Berechnen Sie die Koordinaten der wichtigsten Vektor der bevorzugte Ausrichtung mit der folgenden Formel:
        Equation 5
        Mit: (Equation 6) als die Koordinaten der wichtigsten Vektor der bevorzugte Ausrichtung; und Equation 7 als die Koordinaten der einzelnen Zellen des Netzwerks erhalten mit der gepatchten Zelle als referenzielle.
        Hinweis: Für jede Zelle im Netzwerk wird ein Vektor relativ zu den Koordinaten der gepatchten Astrozyten bestimmt. Der wichtigste Vektor der bevorzugte Ausrichtung des Netzwerks ist die Summe aller dieser Vektoren.
      2. Teilen Sie die Länge der wichtigste Vektor (bereitgestellt durch die Koordinaten mit Hilfe der oben genannten Formel entnommen) durch die Anzahl der Zellen in das Netzwerk minus eins (da die Koordinaten der gepatchten Zelle nicht enthalten sind), um die Werte zu normalisieren und ermöglichen Vergleiche zwischen Netzwerken. Eine schematische Darstellung dieser Analyse ist in Abbildung 5dargestellt.
  5. Platzierung der analysierten Netzwerke im Zellkern von Interesse
    1. Ausrichtung der 20 X und 4 X Bilder
      1. Um die Position der einzelnen Netzwerke im Zellkern von Interesse (NVsnpr) zu bestimmen, verwenden Sie das 4 X Bild. 4 X Bild mit einem Vektor-Bild-Editor zu öffnen.
      2. Wählen Sie 4 X Bild und ändern Sie seine Größe mit 5 multipliziert. Die Dimension-Fenster befindet sich im rechten Teil der oberen horizontalen Symbolleiste. Zum Beispiel für einen 4 X Bild, das bei 800 x 800 Pixel abgetastet wurden, ändern die Abtastauflösung auf 4000 x 4000 Pixel (um das Arbeitsgerät in Pixel festzulegen, gehen Sie zu "Dokument einrichten" unter der Registerkarte "Datei": Datei | Dokument einrichten). Exportieren Sie die Datei im TIFF-Format und Name es 4 X "verkleinert".
      3. Richten Sie die linke obere Ecke des Bildes mit der linken unteren Ecke des Adobe Illustrator-Dokument.
        Hinweis: Die Software bietet Koordinaten von einem referenzielle Punkt unten links.
      4. Öffnen Sie das 20 X-Bild des Netzwerks. Verwenden Sie '' binäre Datei '' oder '' Erkennung Datei '', weil sie leichter zu richten sind. Dann spielen mit dem Deckkraft-Werkzeug auf die '' binäre Datei '' 20 X-Image mit der Größe 4 X ausrichten Bild.
        Hinweis: Die Deckkraft-Tool ist in der oberen horizontalen Symbolleiste.
      5. Wenn die Ausrichtung ist, wählen halten Sie das Pipette-Werkzeug zu, so dass das Messwerkzeug erscheint und wählen sie in der linken Seitenleiste.
      6. Verwenden das Werkzeug "Messen", klicken Sie auf der linken oberen Ecke des der 20 X Bild, um die Koordinaten der 20 X referenzielle verweisen auf die Größe 4 X Bild.
        Hinweis: Diese Koordinaten, die als die 20 X referentielle (20XR in Abbildung 5) bezeichnet werden, ist nützlich für die Position der einzelnen Netzwerke auf eine schematische Zeichnung des Kerns zum Ausdruck zu bringen.
    2. Normalisierung des Kerns von Interesse
      Hinweis: Um die Daten zusammenzufassen, ist eine Normalisierung des Kerns (NVsnpr) als Rechteck verwendet. Die Schritte sind im folgenden beschrieben.
      1. Öffnen Sie 4 X Größe Datei in ImageJFIJI und verwenden Sie das Polygon-Werkzeug, um den Kern (NVsnpr) umgeben. Verwenden Sie das Bild mit Durchlicht, wenn die Grenzen des Kerns nicht gesehen werden können; in diesem Fall, denken Sie daran, es zuerst die Größe.
      2. Öffnen Sie den ROI-Manager, und fügen Sie die gezogenen ROI. "Set Measurement" wählen Sie die Option '' Bounding Rectangle''.
        Hinweis: Die Option "Bounding Rectangle" berechnet das kleinste Rechteck um den gezeichneten Kern.
      3. Klicken Sie auf "Messen".
        Hinweis: Erscheint eine Tabelle mit BX und BY, die Koordinaten der oberen linken Ecke des Rechtecks: '' Rechteck Position'' und bietet die Breite und Höhe. BX und BY sind die Koordinaten des umschließenden Rechtecks referenzielle als bezeichneten Equation 8 und Equation 9 .
    3. Ausdruck jeder Netzwerk-Position in der normalisierten Kern
      1. Express die Koordinaten der einzelnen Zellen mit dem 4 X referentielle (Schwarzes Quadrat in Abbildung 5) mithilfe der folgenden Formel:
        Equation 10
        Wo: Equation 11 sind die Zellenkoordinaten mit dem 4 X referenzielle; Equation 12 sind die Zellkoordinaten mit 20 X referentielle (orangefarbenes Quadrat in Abbildung 5); und Equation 13 sind die Koordinaten der 20 X referenzielle Punkt im 4 X Bild (20XR).
      2. Express die Zellkoordinaten in das umschließende Rechteck referentielle (blau in Abbildung 5) mithilfe der folgenden Formel:
        Equation 14
        Wo: Equation 15 sind die Zelle das umschließende Rechteck referenzielle koordiniert; Equation 16 sind die Zellkoordinaten in der 4 X referenzielle; und Equation 17 sind die Koordinaten des umschließenden Rechtecks referenzielle im 4 X Bild.
      3. Transformieren Sie die Zellkoordinaten in das umschließende Rechteck referentielle, der Prozentsatz der Breite und Höhe des umschließenden Rechtecks mithilfe der folgenden Formel:
        Equation 18
        Wo: Equation 19 sind die Zelle in den Prozentsatz der Breite und Höhe des umschließenden Rechtecks koordiniert; Equation 20 sind die Zelle das umschließende Rechteck referenzielle koordiniert; Equation 21 ist die Breite des umschließenden Rechtecks gemessen oberhalb des Protokolls; und Equation 22 ist die Höhe des umschließenden Rechtecks gemessen oben im Protokoll.
      4. Um die Netze auf der gleichen Figur darzustellen, berücksichtigen Sie die Ausrichtung des Segments (links oder rechts). Um die Daten zu standardisieren, die referenzielle auf der linken Seite der Scheibe anliegt. Übertragen Sie das Koordinatennetz der rechten Seite auf der linken Seite anhand der folgenden Formel nur für X-Koordinaten:
        Equation 23
        Wo: Equation 24 ist die X-Koordinate auf der rechten Seite der Scheibe; und Equation 25  ist die neue X-Koordinate auf der linken Seite der Scheibe in die referenzielle ausgedrückt.
        Hinweis: Alternativ, spiegeln das Bild im ImageJFIJI vor der Analyse (Bild | Transformieren | Horizontal spiegeln Sie).
      5. Die Koordinaten der wichtigsten Vektor der bevorzugte Ausrichtung zum Ausdruck bringen, die gleichen Schritte mit den Zellkoordinaten (Schritte 6.5.3.1, 6.5.3(4)).
        Hinweis: Der Ausdruck der Koordinaten in Prozenten ermöglicht eine Zusammenstellung der Daten als einem einzigen Grundstück, in dem der Kern (NVsnpr) als ein Rechteck ausgebildet ist.
  6. Studie über die Winkeldifferenz der wichtigste Vektor der Vorzugsrichtung
    Hinweis: Die Winkeldifferenz eines astrocytic Netzwerks wird verwendet, um festzustellen, ob die bevorzugte Ausrichtung in Richtung der Mitte des Kerns von Interesse ist. Berechnen Sie die Winkeldifferenz (α in Abbildung 5), ist der Winkel zwischen der wichtigste Vektor der Vorzugsrichtung des Netzes (PD, rote Linie in Abbildung 5) und die Verbindungslinie zwischen P, C, gelten Sie die Al-Kashi-Theorem in das Dreieck PDC (siehe INSET Abbildung 5 und Ergänzende Methoden).
    1. Berechnen Sie zunächst, die unterschiedlichen Längen der Anwendung des Satzes von Pythagoras in eine kartesische referenzielle mit folgender Gleichung:
      Equation 26
      Wo: die Koordinaten von P und C sind Equation 27 und Equation 28 , bzw. in das umschließende Rechteck referentielle (oben berechneten).
    2. Bestimmen Sie die Winkeldifferenz in Bogenmaß mithilfe der folgenden Formel:
      Equation 29
    3. Die Winkeldifferenz in Grad (z. B. mit der Grad-Funktion in Excel Software) zu konvertieren.
    4. Kompilieren Sie die eckige Unterschiede durch plotten sie in vertikale Balkendiagramme (Abbildung 7 und 7 D) und festzustellen Sie, ob eine bevorzugte Ausrichtung der astrocytic Netzwerke.

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Representative Results

Kopplung zwischen Zellen im Gehirn ist nicht statisch, sondern eher dynamisch geregelten von vielen Faktoren ab. Beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um astrocytic Netzwerke offenbart unter verschiedenen Bedingungen zu analysieren und zu verstehen, ihre Organisation in NVsnpr. Diese Ergebnisse wurden bereits veröffentlichten1. Wir Biocytin Füllung der einzelnen Astrozyten im dorsalen Teil des NVsnpr in drei verschiedenen Bedingungen durchgeführt: im Ruhezustand (im Steuerelement Bedingungen in Ermangelung jeder Stimulation), in Ca2 +-kostenlose Bedingungen und Anschluss an die elektrische Stimulation der sensorischen Fasern, die in den Zellkern zu projizieren. Die experimentellen Einstellungen für die Biocytin Füllung der Astrozyten für jede Bedingung werden in die linke Seite der Abbildung 6A-Cdargestellt.

Netzwerke von Biocytin-markierten Zellen im Steuerelement Bedingungen beobachtet wurden und bestätigt einen basalen Zustand der Zelle Kopplung zwischen NVsnpr Astrozyten in Ruhe. In 11 getesteten Fällen zeigte Biocytin Diffusion Netzwerke bestehend aus 11 ± 3 Zellen (mittleren Bereich in Abbildung 6A, Abbildung 6) erstreckt sich über eine Fläche von 34737 ± 13254 µm2 (Abb. 6E). Carbenoxolon (CBX, 20 μM), eine unspezifische Blocker von Gap Junctions, wurde in einer unabhängigen Gruppe von Experimenten verwendet, um sicherzustellen, dass die beobachteten Beschriftung war ein Ergebnis von Biocytin Diffusion durch Gap Junctions und nicht-Aufnahme durch die Zellen des Biocytin, die auslaufen könnten in den extrazellulären Raum aus der positiven Druck auf die Patch-Pipette vor dem Patchen. Bad Anwendung der CBX reduziert die Anzahl der markierten Zellen zu 2 ± 0,5 Zellen (Rechte Abbildung in Abbildung 6A, Abbildung 6; Iman-Conover Methode, P = 0,016; Holm-Sidak-Test, P = 0,010) und das Gebiet von Biocytin verteilt auf 2297 ± 1726 µm2 (Abbildung 6E; Iman-Conover Methode, P = 0,0009; Holm-Sidak-Test, P = 0,025).

Die Wirkung von Kalzium Entfernung vom Medium auf die NVsnpr astrocytic Netzwerke wurde getestet, da niedrige extrazelluläre Kalziumkonzentration bekannt ist, Therapien und Gap Junctions20,21,22, und es öffnen kann verwendet werden als massive und gleichmäßige Anregung zu öffnen, die synzytien und Tracer Diffusion durch Gap Junctions zu maximieren. Die astrocytic Netzwerke, die in Ca2 +offenbart wurden-freien Bedingungen (n = 10) zeigte eine größere Anzahl von Zellen als die Netze offenbart bei Kontrolle mit 37 ± 10 markiert Zellen (mittleren Bereich in Abbildung 6, Abbildung 6; Iman-Conover Methode, P = 0,016; Holm-Sidak-Test, P < 0,001) auf einer Fläche von 108123 ± 27450 μm2 (mittleren Bereich in Abbildung 6, Abbildung 6E; Iman-Conover Methode, P = 0.009; Holm-Sidak-Test, P = 0,001).

Im Vergleich zu der vollständigen Entfernung des Kalziums aus dem Medium, ist elektrischer Stimulation des afferenten Inputs in den Zellkern von Interesse ein physiologischer Stimulus, der direkt die neuronale Schaltkreise von Interesse ist. Somit bieten die Ergebnisse aus dieser Art von Manipulation aussagekräftige Informationen über die funktionellen Auswirkungen der astrocytic Netzwerke beobachtet. Zum Beispiel Eingabe von zwei verschiedene Wege führen auf verschiedene Effekte auf den basalen Zustand der Zellen in einem bestimmten Gebiet Kupplung, oder es kann Kopplung zwischen Astrozyten in verschiedene Unterteilungen des Kerns zu entlocken. In unserer Schaltung, elektrischer Stimulation der sensorischen Fasern, die um die NVsnpr mit 2-Sekunden-Züge von 0,2 ms Projekt Impulse bei 40-60 Hz (n = 11) produziert eine Erhöhung der Kupplung zwischen NVsnpr Astrozyten, bezogen auf die unstimulierte Bedingungen, mit 23 ± 6 Zellen (mittleren Bereich in Abbildung 6 b, Abbildung 6; Iman-Conover Methode, P = 0,016; Holm-Sidak-Test, P = 0,012) breitet sich über eine Fläche von 814174 ± 15270 μm2 (mittleren Bereich in Abbildung 6 b, 6E herauszufinden; Iman-Conover Methode, P = 0.009; Holm-Sidak-Test, P = 0,004).

Die Auswirkungen dieser beiden Arten von Stimulation, die Entfernung von Kalzium aus dem Medium und die elektrische Stimulation von afferenten Inputs sind alle durch CBX gestört. Die astrocytic Netzwerke in diesem Zustand besteht nur 5 ± 1 Zellen in Ca2 +-kostenlose ACFS (rechten Bereich in Abbildung 6, Abbildung 6; n = 4; Iman-Conover Methode, P = 0,016; Holm-Sidak-Test, P < 0,001) und 9 ± 2 Zellen mit Stimulation der sensorischen Fasern (rechten Bereich in Abbildung 6 b, Abbildung 6; n = 6; Iman-Conover Methode, P = 0,016; Holm-Sidak-Test, P = 0,023). Die Netzwerk-Flächen wurden ebenfalls reduziert 17987 ± 9843 µm2 mit Ca2 +-kostenlose ACFS (Abbildung 6E; n = 4; Iman-Conover Methode, P = 0.009; Holm-Sidak-Test, P = 0,004) und 39379 ± 11014 µm2 mit Stimulation der sensorischen Fasern (Abbildung 6E; n = 6; Iman-Conover Methode, P = 0.009; Holm-Sidak-Test, P = 0,055).

Anatomische Analyse wurde durchgeführt, nur in Fällen, wo die NVsnpr Grenzen auf 4 X Bildgebung, klar definiert werden konnte, das war der Fall für 9 von 10 Netzwerke gewonnen, mit Ca2 +-kostenlose ACFS und 8 von 11 Netzwerke mit elektrischer Stimulation erhalten. Plotten aller analysierten astrocytic Netze auf eine theoretische NVnspr zeigt, dass die meisten Zellen besteht in den Netzen innerhalb der Kern-Grenzen (Abbildungen 7A und 7 b, linken und mittleren Platten) beschränkt waren. Unter Ca2 +-kostenlose ACFS 4 von 9 astrocytic Netzwerke verbreiten außerhalb der NVsnpr in Richtung der motorischen Kern befindet sich medial zu den NVsnpr. In diesen 4 Fällen beschränkten sich die überwiegende Mehrheit der markierten Zellen in den Zellkern. Die Netze der markierten Zellen mit elektrischer Stimulation der sensorischen Fasern gewonnen wurden stärker eingeschränkt. Nur 2 Netze erstreckte sich über die Kern-Grenzen, in denen man über die Mediodorsal Grenze in den seitlichen Supratrigeminal Bereich (dunkel grünen Netzwerk in Abbildung 7 b, linken und mittleren Platten) verbreitet. Im zweiten Fall gekreuzt 2 Astrozyten im roten Netz (Abb. 7 b, linken und mittleren Platten) in den ventralen Teil der NVsnpr.

Die vektorielle Analyse für die astrocytic Netzwerke bevorzugte Ausrichtung (Rechte Abbildung in Abbildung 7A und 7 b) produziert unterschiedliche Ergebnisse je nach den Stimulus verwendet. In der Tat für den astrocytic Netzwerken beobachtet mit Ca2 +-kostenlose ACFS waren alle bis auf eines der Vektoren der bevorzugte Orientierung auf der Mitte der NVsnpr ausgerichtet. Allerdings waren die bevorzugte Ausrichtung Vektoren für die astrocytic Netze mit elektrischer Stimulation beobachtet, meist an die Grenzen des Kerns orientiert. Dies spiegelt sich durch die berechnete eckige Unterschiede in bevorzugte Ausrichtung zwischen den astrocytic Netzwerken erhalten mit Ca2 +-kostenlose ACFS und denen, die mit elektrischer Stimulation der sensorischen Fasern. Unter Ca2 +-kostenlose ACFS vertikale Balkendiagramme der Verteilung der Winkeldifferenz zeigte, dass die meisten der Netzwerke von markierten Zellen eine Winkeldifferenz zwischen 0 und 40 Grad, mit einem Mittelwert von Winkeldifferenz von 39,5 ± 12,7 Grad ( Abbildung 7). Mit elektrischer Stimulation der sensorischen Fasern, die Verteilung ist gleichmäßiger und die mittlere Winkeldifferenz (99,5 ± 17 Grad) unterscheidet sich deutlich (Abb. 7; Student t-Test, P = 0,012).

Diese Daten zeigen, dass Biocytin Kennzeichnung Analyse ermöglicht uns, die Auswirkungen der unterschiedlichen Stimuli modulierende astrocytic Kupplung zu unterscheiden. Darüber hinaus liefert Zuordnung der astrocytic Netze in einem normalisierten Kern gefolgt von vektoriellen Analyse wertvolle Informationen über Größe und anatomische Organisation dieser Netzwerke.

Figure 1
Abbildung 1: Whole-Cell Patch-Clamp der Astrozyten. (A) Astrozyten beschriftet mit einer Beladung von Marker Sulforhodamine 101 (SR 101) in NVsnpr. Ein SR-101-Label Astrozyten Soma richtet sich mit der Patch-Pipette (weiße gestrichelte Linie). Maßstabsleiste = 100 μm. (B) ein depolarisierende Rampe-Protokoll wird in Voltage-Clamp (von-120 bis 110mV) zur Beurteilung der Astrozyten passive Eigenschaften durchgeführt. (C) Bewertung des Mangels an Aktionspotential brennen in den Astrozyten durch Injektion von Stromimpulse im Strom-Clamp-Modus. Diese Zahl ist von Condamine Et al. (2018) 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Behandlung und Analyse astrocytic Netzwerke mit ImageJFIJI-Software. (A) Z-Stapel Kreation aus der konfokalen Abbildung eines astrocytic Netzwerks. Am oberen linken, Z-Stapel Fenster in ImageJFIJI. (B) Hintergrund-Subtraktion. Am oberen linken subtrahieren Sie Hintergrundfenster im ImageJFIJI. Die gestrichelte Kreis betont den Bereich auf dem Bild, wo die Wirkung des Befehls subtrahieren Hintergrund das noch deutlicher, wenn ist, das Bild in A. (C) Remove Ausreißer Prozess gegenüber. Dieser Vorgang entfernt die kleinen Flecken durch unspezifische Ablagerungen von Streptavidine, gekoppelt an eine Alexa-594. Die weißen Pfeile zeigen die Anzahlung vor (Abb. 2 b) und nach (Abbildung 2) der Befehl abgearbeitet wurde. In der oberen linken Ausreißer Fenster in ImageJFIJI entfernt. (D) Beispiel für den Effekt, der durch eine unzureichende Anpassung der Parameter entfernen Ausreißer produziert werden kann. Gelbe Pfeile zeigen einige unscharfen Zellen. (E) Schwelle Prozess einstellen. Am oberen linken passen Sie Schwelle Fenster in ImageJFIJI an. Die Bildlaufleisten handeln auf der Schwelle Signalanpassung. (F) binäre Schritt zu machen. Das Bild wird in eine binäre Datei in ImageJFIJI umgewandelt. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Erkennung von Zellen in astrocytic Netzwerke mit ImageJFIJI. (A) Beispiel für ein binäres Abbild eines astrocytic Netzwerks in ImageJFIJI erhalten. Maßstabsleiste = 100 μm. (B) zeigt die "Erkennung Datei" nach dem Auftragen des Analyze Partikel Prozess auf die Binär-Datei erhalten. Die Formen entsprechen den erkannten Zellen mit ihrer zugeordneten Nummer in rot. (C) Linker Teil: Partikel Fenster in ImageJFIJI zu analysieren. Diese Funktion erkennt die Zellen des Netzes in das binäre Bild. Die Größe der gefundenen Zellen und ihrer Zirkularität kann angepasst werden. Zahlen verwendet werden sollte durch Versuch und Irrtum festgelegt werden, bis ein zufriedenstellendes Ergebnis erreicht ist. Rechter Teil: Erkennung Tabelle von Analyze Partikel Prozess generiert. X und Y Spalten enthalten die Koordinaten der einzelnen Zellen im Bild erkannt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Bereich Netzwerkanalyse und Bestimmung der gepatchten Zelle in ImageJFIJI. (A) verwenden, die das Polygon-Werkzeug in ImageJFIJI, einem ROI um die Ansammlung von verfolgt wird erkannt Zellen (rote Linie), die verwendet werden, um die Fläche des Netzwerks zu bestimmen. (B) der ROI ist in den ROI-Manager hinzugefügt. (C) Beispiel für eine astrocytic Netzwerk, in dem die gepatchte Zelle (weißer Pfeil) wegen der markanten Intensität seiner Biocytin Beschriftung leicht erkennbar ist. (D) Beispiel für eine astrocytic Netzwerk wo die gepatchte Zelle nicht identifiziert werden konnten, aber wo eine Fläche von Dichter Kennzeichnung eindeutig Biocytin Ablagerungen gibt. Ein ROI ist in dieser Gegend gezogen und die ROI-Manager hinzugefügt. Seinen Schwerpunkt berechnet und als die Position der gepatchten Zelle für vektoriellen Analyse betrachtet. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Schematische Darstellung der verschiedenen Referentials für die Analyse der astrocytic Netzwerke verwendet. Das graue Quadrat ist das 4 X-Bild mit der referenziellen Punkt 4XR an der linken unteren Ecke des Adobe Illustrator-Dokuments ausgerichtet werden. Das weiße Quadrat umgeben in Orange ist das 20 X Bild mit der referenziellen Punkt 20XR. Beide Bilder sind aufeinander abgestimmt, wie im Protokoll beschrieben. Das umschließende Rechteck (blau) NVsnpr (lila gestrichelte Linie) definiert und wird in Prozent mit der referenziellen Punkt (BR) skaliert. Das Gewäsche Zentrum der dorsalen Teil des NVsnpr ist durch den dunklen blauen Punkt (C) schematisiert. Das astrocytic Netzwerk ist durch die gepatchte Zelle (schwarzer Punkt, P) schematisiert und der wichtigste Vektor der Vorzugsrichtung (rote Linie). Jede gestrichelte Linie ist der Vektor der einzelnen Zellen des astrocytic Netzwerks. Die Winkeldifferenz der astrocytic Netzwerk (α) ist der Winkel zwischen der wichtigsten bevorzugte Ausrichtung des Netzes (rote Linie) und die schwarze Linie, die die gepatchte Astrozyten mit der theoretischen Mitte des Kerns verbindet. Einschub ist ein Zoom 20 X-Bild zeigt das Dreieck PCD von der theoretischen Mitte der NVsnpr (C), die gepatchte Zelle und der wichtigste Vektor der Vorzugsrichtung (D) gebildet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Astrocytic Netzwerke mit Biocytin in NVsnpr unter verschiedenen Bedingungen zeigen verschiedene Größen beschriftet. (A-C) Auf der linken Seite eine schematische Zeichnung der experimentellen Bedingung. Unter allen Bedingungen war ein einziges Astrozyten gekennzeichnet durch SR-101 gezielt für die gesamte Zelle Aufnahme und gefüllt mit Biocytin (0,2 %). Mittlere Spalte: Mikrofotos illustrieren die astrocytic Netzwerke unter Kontrolle erhalten Bedingungen (A), nach der elektrischen Stimulation des Vth Trakt (2 s Bahn, 40-60 Hz, 10-300 µA, 0,2 ms Pulse) (B); und nach der Perfusion mit einer Ca2 +-kostenlose ACFS (C). Rechte Spalte: Mikrofotos zur Veranschaulichung der astrocytic Netze erhalten unter den gleichen Bedingungen, aber in Anwesenheit von CBX (20 μM) in der Badewanne vor. Maßstabsleiste = 100 μm. (D und E) Vertikale Balken Diagramm der darstellt gekoppelt Zellen und die Fläche der Biocytin gefüllt Netze der Astrozyten unter den drei experimentellen Bedingungen oben vorgestellten (A, B und C) in der Gegenwart (schraffiert) und fehlender (massiv) CBX (20 ΜM). Daten werden dargestellt als ± SEM Multiple Vergleiche (Holm-Sidak Test) bedeuten: * = P < 0,05; ** = P < 0,001. Diese Zahl ist von Condamine Et al. (2018) 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Charakterisierung der Netzwerke im NVsnpr unter Ca2 +-kostenlose ACFS und mit elektrischer Stimulation des Traktes Vth . (A und B) Links: Alle Zellen mit der Bezeichnung in 9 Netzwerke gefüllt unter Perfusion mit Ca2 +-freie ACFS (A) oder in 8 Netze gefüllt und regt die Vth -Darm-Trakt (B) sind entsprechend ihrer Position in einem theoretischen NVsnpr Kern (graues Rechteck) aufgetragen. Jedes Netzwerk (und die Zellen komponieren) werden durch eine andere Farbe dargestellt. Mitte: Grenzen jedes Netzwerks. Der Punkt in jedem Bereich darstellt der gepatchte Zelle. Rechts: Darstellung der wichtigsten Vektor der bevorzugte Ausrichtung jedes Netzwerks. Der Punkt symbolisiert die gepatchte Zelle und der Pfeil der Vektor der Vorzugsrichtung. (C und D) Verteilung der eckigen Unterschiede zwischen der wichtigste Vektor der bevorzugte Orientierung und eine gerade Linie verbindet die gepatchte Zelle in der Mitte des dorsalen Teil des NVsnpr (befindet sich bei 25 % auf die dorsoventral Achse und 50 % auf der Mediolateral Achse) unter der zwei Bedingungen untersucht. Die mittlere Winkeldifferenz war 39,5 ± 12,7 Grad in Ca2 +-kostenlose ACFS, zeigt eine bevorzugte Ausrichtung in Richtung Zentrum der Nucleus und 99.5 ± 17 Grad mit elektrischer Stimulation, zeigt eine bevorzugte Ausrichtung auf die Peripherie (Student t-Test, P = 0,012). Diese Zahl ist von Condamine Et al. (2018) 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Saccharose-ACFS* mMol
Saccharose 219
KCl 3
KH2PO4 1.25
MgSO4 4
Nahco33 26
Dextrose 10
CaCl2 0,2

Tabelle 1: Zusammensetzung der Saccharose-basierte Lösung verwendet für das Schneiden von Gehirn. (*) = pH und Osmolarität wurden angepasst, um 7,3-7,4 und 300-320 50er/kg, beziehungsweise.

ACFS* mMol
NaCl 124
KCL 3
KH2PO4 1.25
MgSO4 1.3
Nahco33 26
Dextrose 10
CaCl2 1.6

Tabelle 2: Zusammensetzung der ACFS Lösung für Slice Speicherung und Aufnahme der gesamten Zelle verwendet. (*) = pH und Osmolarität wurden angepasst, um 7,3-7,4 und 290-300 50er/kg, beziehungsweise.

Interne Patch Lösung* mMol
K-Gluconat 140
NaCl 5
HEPES 10
EGTA 0,5
Tris ATP Salz 2
Tris GTP Salz 0,4

Tabelle 3: Zusammensetzung der internen Lösung für die gesamte Zelle Aufzeichnung verwendet. (*) = pH und Osmolarität wurden angepasst, um 7,2 7,3 und 280-300 50er/kg, beziehungsweise.

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Discussion

Es gibt eine Reihe von elektrophysiologischen Methoden um funktionelle Kopplung zwischen Astrozyten23,24zu beurteilen. Diese Methoden bieten jedoch keine Informationen über die anatomische Anordnung der astrocytic Netzwerke. Eine Reihe von Studien haben bereits gezeigt, dass "Farbstoff - oder Tracer-Kupplung", wie hier, nur in einem Bruchteil der auftritt verbunden Zellen, die durch elektrophysiologische Methoden25,26,27, darauf hindeutet, dass erkannt werden die Anzahl der Zellen, die mit dieser Methode erkannt wird unterschätzt. Dies ist jedoch immer noch die beste Methode zur Visualisierung der Kupplung. Größere Farbstoff-Kupplung wird erreicht, wenn Molekül Tracer kleiner als 1-1,2 KDa mit Gap Junctions20durchdringen. Live Visualisierung der Kopplung kann durch die Überwachung der Verbreitung von fluoreszierenden Glukose Derivate (2-NBDG) oder einen fluoreszierenden Marker (wie einige Alexa Farbstoffe oder Luzifer gelb)13durchgeführt werden, aber aufgrund seiner geringeren Größe Biocytin liefert bessere Ergebnisse und ermöglicht eine Quantifizierung im festen Gewebe. So ist darauf hinzuweisen, dass die Anzahl der Zellen, die mit dieser Methode erkannt weitgehend unterschätzt wird. Auf der anderen Seite können einige der Zellen markiert werden, nicht wegen deren Kopplung, sondern wegen der Aufnahme von Tracer, die in den extrazellulären Raum zugespielt hat. Das Ausmaß der Kennzeichnung infolge Leckage kann in Experimente mit Bad-Anwendungen eine Gap Junction Blocker1abgeschätzt werden. Allerdings ist auszugehen, dass Verzerrung aufgrund der Methode für alle Bedingungen gelten würde.

Zu guter Letzt sollte betont werden, dass nicht alle gekoppelte Zellen Astrozyten. Panglial Netzwerke wo Astrozyten, Oligodendrozyten gekoppelt sind wurden in mehreren Hirnregionen, einschließlich der seitlichen überlegene Olive8, Thalamus16Kortex und Hippocampus28beschrieben. Unser Ziel war es, eine Methode für den Vergleich astrocytic offenbart mit Farbstoff-Kupplung unter verschiedenen Bedingungen, die Hypothese zu bewerten, dass sie klar definierte, unverwechselbaren Funktionsbereiche durch verschiedene Reize enthüllt bilden Netzwerke zu entwickeln. Da in NVsnpr, Nucleus trigeminus Hirnstamm, in denen dieses Protokoll durchgeführt wurde, Kopplung zwischen Astrozyten sehr begrenzt ist unter Bedingungen ruhen, war es wichtig, eine zuverlässige und objektive Methode, um die markierte Zellen erkennen zuerst zu entwickeln. Dies gelang mit der automatischen Erkennung mit ImageJFIJI. Es ist manchmal schwierig, schwach markierte Zellen von Hintergrundgeräuschen zu unterscheiden. Hier, kann Stack Bildgebung und eine Methode in ImageJFIJI werden verwendet, um das Signal zu verstärken, Hintergrundgeräusche jedoch noch zu hoch und zu Daten Ablehnung führen. In zukünftigen Studien können Klärung Protokolle verwendet werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Ein Clearing-Protokoll ist eine interessante Methode zur Klärung, die Morphologie der Gewebe (kein schrumpfen) bewahrt, hat keinen Einfluss auf die Lipide und ist kompatibel mit Immunostaining29. Eine weitere Einschränkung des beschriebenen Verfahrens ist das "Watershed"-Werkzeug verwendet, um Zellen zu unterscheiden, die zu nah an einander. Sichtprüfung der erkannten Zellen sollte durchgeführt werden, wenn Sie dieses Tool verwenden.

Astrocytic Netzwerke Funktionsbereiche bilden, dann sie können definieren die Grenzen eines Zellkerns oder sollte zumindest auf die Grenzen eines Zellkerns beschränkt werden. Offenbart, Netzwerke können immer beschränkt bleiben, sondern innerhalb eines Zellkerns mehr, wenn sie kleiner sind, wenn die gepatchte Astrozyten in der Mitte (oder innen) ist der Kern. Um zu testen ob Astrozyten sitzen in der Nähe von der Grenze eines Zellkerns vorzugsweise mit anderen Astrozyten außerhalb des Zellkerns oder mit anderen innerhalb des Zellkerns koppeln, mussten wir die Vorzugsrichtung bestimmen, denen der Farbstoff aus der gepatchten Astrozyten verbreiten. Zahlreiche andere Studien haben ein ähnliches Problem im Fass Kortex, Barreloid Felder des Thalamus, olfaktorische Glomeruli, Hippocampus und seitlichen überlegene Olive angesprochen, aber sie konzentriert Analysen vor allem auf die Entfernung der Diffusion des Tracers, Elektrophysiologische Charakterisierung der verschiedenen Arten von Astrozyten in Abhängigkeit von ihrer Lokalisation und Ausbreitung des Farbstoffes orthogonalen Achsen in Bezug auf diese klar definierte Strukturen8,9,10, 13,14,16. Hier haben wir vektorielle Analyse bestimmen die dominante Richtung der Tracer zu verbreiten, die Größe und Ausrichtung des normalisierten wichtigsten Vektors erteilt wurde. Kleine Vektoren zeigen keine eindeutigen "dominant" oder bevorzugte Ausrichtung. Ein entscheidender Schritt für die vektorielle Analyse ist die Fähigkeit, genau zu identifizieren, die gepatchte Astrozyten, was nicht immer möglich ist. Eine interessante Alternative, um die gepatchte Astrozyten zu finden ist das eine große (nicht-Gap Kreuzung permeationsfähigen) hinzufügen und fixierbar Tracer, wie Dextrans, um die Aufnahmelösung. Wenn es nicht möglich, die gepatchte Zelle oder Patch-Speicherort zu bestimmen ist, kann es besser um diese Experimente aus der Vektorrechnung zu vernachlässigen sein.

Schließlich, um zu analysieren, ob Eigenschaften von Netzwerken entsprechend ihrer Position in den Zellkern variiert, brauchten wir eine Methode, um ihre Position in einem "normalisierten" Kern zum Ausdruck bringen. Der einzige kritische Schritt in diesem Verfahren ist die Fähigkeit, klar zu sehen, die Grenzen des Kerns in den Bildern geringer Vergrößerung (4 X). Eine einfache Lösung für dieses Problem, ist wenn es häufig vorkommt Gewebe Verarbeitung vor der Analyse eine standard histologische Färbung hinzu.

Heterogenität der Astrozyten in Hirnregionen ist eindeutig festgelegt, und eine wachsende Zahl von beweisen unterstützt das Konzept, das ihre Spezialisierungen für die Funktion der Schaltung besonders angepasst sind, dass sie in9, eingebettet sind 10,30,31. Für dieses um wahr zu sein sollte Inter astrocytic Kommunikation auf Astrozyten, die verbunden sind mit der gleichen Schaltung begrenzt. Beobachtungen unterstützen diese Annahme entstehen in verschiedenen Gehirnregionen sind aber deutlicher in Bereichen mit gruppierten Darstellungen, wie sensorische Karten im Fass Kortex oder Riechkolben. Allerdings sind die meisten Berichte von Überschneidungen zwischen neuronalen und astrocytic Karten beschreibenden und qualitative. Die Methoden berichtet hier können verwendet werden, um diese Beobachtungen zu objektivieren und entwickeln Tools zur astrocytic Netze entsprechend ihrer Position in einem bestimmten Stromkreis besser zu analysieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird finanziert durch Canadian Institutes of Health Research, Grant/Prämiennummer: 14392.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Chemicals S671-3
KCl Fisher Chemicals P217-500
KH2PO4 Fisher Chemicals P285-500
MgSO4 Fisher Chemicals M65-500
NaHCO3 Fisher Chemicals S233-500
C6H12O6 Dextrose anhydrous Fisher Chemicals D16-500
CaCl2 dihydrated Sigma C70-500
Sucrose Sigma S9378
D-gluconic acid potassium salt Sigma G45001
MgCl2 anhydrous Sigma M8266
HEPES Sigma H3375
EGTA Sigma E4378
ATPTris Salt Sigma A9062
GTPTris Salt Sigma G9002
Biocytin Sigma B4261
Carbenoxolone disodium salt Sigma C4790
avidin-biotin complex : ABC kit Vestor laboratories PK-4000
Streptavidine-alexa 594 Molecular Probes S11227
Triton Fisher Chemicals BP151-500
Xylene Fisher Chemicals X5-1
Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount Fisher Chemicals SP15-100
Slide Drying Bench Fisherbrand 11-474-470
Vibratome Leica VT 1000S
Microscope cover glass Fisherbrand 12-544A
Microscope slide ColorFrost Fisherbrand 12-550-413
PFA Fisherchemicals 04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope Olympus
40X water-immersion lens Olympus LUMPLFLN40XW
20X water-immersion lens Olympus XLUMPLFL20XW
4X water-immersion lens Olympus XLFLUOR4X/340
Micropipette puller Sutter Instrument P97
Micromanipulator Sutter Instrument MP 225
Camera CCD Sony CX-ST50
Black and white monitor Sony SSM-125
Digidata Molecular devices 1322A
Patch Clamp amplifier Axon instrument Mulitclamp 700A
Electrophysiology acquisition software Molecular devices pClamp 8
Electrophysiology analysis software Molecular devices Clampfit 8
Imaging analysis software ImageJFIJI Open source software. FIJI version including plug in package.
Vector image editor Adobe Illustrator CS4
Spreadsheet application Microsoft Office Excel 2010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurowissenschaften Ausgabe 140 Astrozyten Kupplung Netzwerke vektorielle Analyse Biocytin bevorzugte Ausrichtung anatomische Organisation
Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten
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Condamine, S., Verdier, D., Kolta,… More

Condamine, S., Verdier, D., Kolta, A. Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes. J. Vis. Exp. (140), e58116, doi:10.3791/58116 (2018).

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