Neuroscience

ניתוח של גודל, צורה, כיוון של רשתות של האסטרוציטים בשילוב

Published: October 4, 2018 doi: 10.3791/58116

Steven Condamine¹, Dorly Verdier¹, Arlette Kolta^1,2

¹Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central, and Département de Neurosciences, Université de Montréal, ²Faculté de Médecine Dentaire, Université de Montréal

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את הארגון של רשתות astrocytic. השיטה המתוארת ממזער הטיה לספק מדדים תיאוריים של רשתות אלה כגון ספירת תאים, גודל, שטח, מיקום בתוך גרעין. . בנוגע למקורו שקובעת עם ניתוח וקטורי.

Abstract

זה הפך ליותר ויותר ברורה האסטרוציטים לווסת את תפקוד לא רק ברמות סינפטית, תא בודד, אלא גם ברמת הרשת. האסטרוציטים חריפה מחוברים אחד לשני דרך צמתי הפער והוא צימוד דרך יפלו דינמי ומוסדרת מאוד. קונספט המתעוררים הוא פונקציות astrocytic מיוחדים ומותאמים לפונקציות של מעגל עצביים שאליו הן משויכות. לכן, שיטות למדידת פרמטרים שונים של רשתות astrocytic נחוצים יותר לתאר את הכללים המסדירים את התקשורת שלהם, מצמד, להבין עוד יותר את הפונקציות שלהם.

כאן, שימוש בתוכנת ניתוח התמונה (למשל., ImageJFIJI), אנו מתארים שיטה לניתוח תמונות קונאפוקלית של רשתות astrocytic חשף זיווגו-צבע. שיטות אלה מאפשרים 1) האוטומטי לא משוחד זיהוי, של תאים עם תוויות, 2) חישוב של הגודל של הרשת, 3) חישוב כיוון מועדף של צבע להתפשט בתוך הרשת, ההגדלה והמיקום 4) של הרשת בתוך האזור בעל עניין .

ניתוח זה יכול לשמש כדי לאפיין את רשתות astrocytic של אזור מסויים, להשוות רשתות של אזורים שונים הקשורים לפונקציות שונות או להשוות רשתות שהושגו בתנאים שונים כי יש השפעות שונות על צימוד. תצפיות אלה עלולה להוביל חשוב בשיקולים פונקציונליים. למשל, אנחנו מנתחים את הרשתות astrocytic של גרעין טריגמינל, איפה אנחנו בעבר הראו כי צימוד astrocytic הוא חיוני עבור היכולת של נוירונים לעבור על דפוסי הירי של טוניק המתפרצת קצבית¹. על ידי מדידת את גודל, כליאה, וכיוון מועדף של רשתות astrocytic בגרעין הזה, נוכל לבנות השערות לגבי התחומים הפונקציונליים הם circumscribe. מספר מחקרים מראים כי מספר המוח בתחומים אחרים, כולל חבית, זית מעולה לרוחב, חוש הריח glomeruli ולשגר את הגרעינים חושית תלמוס, קליפת הראייה, שם כמה, עשויה להועיל ניתוח דומה.

Introduction

מחקרים רבים תיארו איך הדיאלוג נוירון-אסטרוציט ברמה התאית תת או סינפטית יכול להיות השלכות פונקציות עצביים, העברה סינפטית. היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים רגישים סביב פעילות. עצבית; למעשה, יש להם רצפטורים של נוירוטרנסמיטורים רבים כולל גלוטמט, גאבא, אצטילכולין ו- ATP (ראה הדעת שפורסמו בעבר-²^,-³^,-⁴). בתמורה, astrocytic תהליכים אלמנטים סינפטית ensheath וגם פעילות. עצבית השפעה, באתרים extrasynaptic על ידי ויסות הומאוסטזיס יוניים חוץ-תאית ושחרור מספר גורמים או משדרי כגון גלוטמט, D-סרין ו- ATP ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷.

הרעיון כי האסטרוציטים יכול גם לווסת תפקוד ברמת הרשת התפתחה, עם ראיות כי צימוד astrocytic במרחב מוסדר, מקביל פילוח העצבית באזורים מאופיין אנטומי ברור מידור (כמו אזורים עם ייצוגים חושית), המציין כי האסטרוציטים נשלים כדי אחרים האסטרוציטים המשרתים את אותה הפונקציה ולא רק על אלה נמצאים בקרבת מקום. בזית מעולה לרוחב, למשל, רשתות astrocytic ביותר הם שכיוונו orthogonally על ציר ' tonotopic '⁸, ואילו glomeruli קליפת או olfactoty חבית, תקשורת בין האסטרוציטים הוא הרבה יותר חזק בתוך חביות או glomeruli חלש יותר בין סמוכים אלה⁹^,¹⁰. בשני המקרים, הרשתות astrocytic הם שכיוונו לכיוון מרכז ה glomerule או חבית⁹^,¹⁰.

לאחרונה הראינו כי פעילות astrocytic ממיקרו עצביים ירי על ידי הפחתת הריכוז של Ca חוץ-תאית^{2 +} ([Ca^{2 +}]_e), ככל הנראה דרך שחרורו של S100β, Ca^{2 +}-איגוד חלבון¹¹. את האפקט הזה, שבו הודגם על אוכלוסיה של rhythmogenic טריגמינל נוירונים בחלק הגבי של חושי הראשי טריגמינל גרעין (NVsnpr, חשב לשחק תפקיד חשוב דור של תנועות masticatory), נובעת מהעובדה כי ירי קצבית בנוירונים אלו תלוי עקשן Na⁺ הנוכחי זה מקודם על ידי ירידות של [Ca^{2 +}]_e¹¹^,¹². ירי קצבית בנוירונים אלו יכולים להיות שהפיק ". פיזיולוגית" גירוי של תשומות שלהם או ירידה מלאכותית של [Ca^{2 +}]_e. בהמשך הראינו כי צימוד astrocytic היה נדרש עבור ירי קצבית עצביים¹. זה העלה את האפשרות כי רשתות astrocytic עלולה להיווצר חוסם תחומים פונקציונליים בו פעילות. עצבית יכול להיות מסונכרנת ומתואמת. כדי להעריך את השערה זו, נזקקנו קודם לפתח שיטה לתעד בקפדנות את הארגון של רשתות אלה בתוך NVsnpr.

מחקרים קודמים ברשתות astrocytic תיארו בעיקר את מידת צימוד מבחינת מספר הטלפון הנייד ואת צפיפות אזור מכוסה. ניסיונות כדי להעריך את הצורה של רשתות astrocytic ואת הכיוון של צבע-מצמד בוצעו בעיקר על-ידי השוואת גודל רשתות לאורך שני צירים (x ו- y) ב חבית קליפת⁹, ההיפוקמפוס¹³^,¹⁴^, ¹⁵, barreloid שדות של התלמוס¹⁶, לרוחב זית מעולה⁸, חוש הריח glomeruli¹⁰, קליפת¹⁴. בשיטות המתוארות כאן מאפשרים עבירות לא משוחדת של תאים עם תוויות ברשת הערכה של האזור שהם מכסים. פיתחנו גם כלים כדי להגדיר את הכיוון המועדף של צימוד בתוך רשת וכדי להעריך אם הכיוון המועדף הוא לכיוון המרכז של הגרעין או בכיוון אחר. לעומת שיטות השתמשו בעבר, פרוטוקול זה מספק אמצעים כדי לתאר את הארגון ואת כיוון ההדפסה של רשתות astrocytic במבנים כמו הגבי טריגמינל גרעין החישה העיקריים שאין ידוע אנטומי ברור מידור. במחקרים לעיל, כיוון רשת מתואר יחסים לפי צורת המבנה עצמו אשר מתועדת כבר (למשל., barreloid של התלמוס, חביות בקליפת, שכבות ההיפוקמפוס, קליפת המוח, glomeruli ב הריח הנורה, וכו '). בנוסף, מאפשרת ניתוח וקטורי להשוואות מצמד אוריינטציות חשף בתנאים שונים. כדי לנתח אם פרמטרים אלה משתנה בהתאם למיקום של הרשת בתוך הגרעין, גם פיתחנו שיטה כדי להחליף את כל רשת ביחס לגבולות של הגרעין. כלים אלה ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים לרשתות החקירה של תאים בשילוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים abode לפי הכללים הקנדי מכוני הבריאות מחקר ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מאוניברסיטת מונטריאול ועל שימוש הוועדה.

1. הכנת פרוסות המוח של עכברוש

להכין 1 ליטר של פתרון מבוסס-סוכרוז (טבלה 1) 1 ליטר של נוזל מוחי-שדרתית מלאכותי רגיל (כלנית חדד) (טבלה 2).
בועה הפתרון מבוסס-סוכרוז עם שילוב של 95% O₂ ו 5% CO₂ (carbogen) במשך 30 דקות לפני הנחת ב-80 מעלות צלזיוס למשך כ- 30 דקות, עד הפתרון הוא קר אבל לא קפוא לחלוטין. להשתמש סוכרוז הקר הזה המאגר חיתוך שמגיע של המוח. לשמור זה על הקרח לאחר שהוסר מהמקפיא.
בועה של כלנית חדד עם carbogen דרך הניסוי כולו. השתמש פתרון זה לאחסון פרוסה כמו המאגר perfusing בו מחבר תיקון-חובק למעקה ואת biocytin-מילוי האסטרוציטים יבוצעו. להכין החלמה פרוסה מחזיק קאמרית להפקיד את פרוסות המוח ברגע שהם נחתכים.
הערה: תא המעצר פרוסה שחזור יכול להיות בהזמנה אישית, מורכב בעיקרו של דבר אחד טוב קטן עם רשת שינוי בחלק התחתון הושעו בבאר גדול זה מתמלא כלנית חדד, שבה מוכנס צינור להביא carbogen מלמטה.
השתמש כדי 21 יום-בת 15 חולדות ספראג-Dawley ללא כל הטיה ספציפיים מין או זן. עזים ומתנגד החיה עם איזופלוריין (1 מ"ל של איזופלוריין בתא אינדוקציה הרדמה). בדוק את עומק הרדמה על ידי בעדינות צובט את כפה האחוריות או הזנב של החיה.
לערוף את החולדה באמצעות גיליוטינה, לחתוך את הגולגולת שלו עם מספריים, ולהסיר במהירות במוח הגולגולת עם מרית שטוחה.
טובלים את המוח בפתרון מבוסס-סוכרוז קר כקרח עבור 30 s ועל העברת זה (עם הפתרון) פטרי צלחת. עם סכין גילוח, להסיר את החלקים שאינם anterior ואת אחורי לאזור כדי להיות למחלקה, אם חיתוך פרוסות ב מישור רוחבי.
הדבק את הבלוק הנותרים של רקמת המוח על צידה rostral והמשך חותכים פרוסות המוח (בעובי 350 מיקרומטר) במדיום מבוססי סוכרוז באמצעות vibratome. לאחר מכן, להעביר את הפרוסות שנאספו בבית החלמה מחזיק חדר מלא עם חנה המבר carbogenated בטמפרטורת החדר (RT) עד שהם יהיו מוכנים לשמש (אפשר לפחות שעה עבור שחזור).
הערה: ההתפתחויות האחרונות בתחום לאפשר דגירה ממושך עד 24 שעות של פרוסות המוח in vitro תנאים¹⁷.

2. Sulforhodamine 101 (SR-101) תיוג של האסטרוציטים

מראש בחום באמבט מים עד 34 מעלות צלזיוס, מקום שני תאי הדגירה פרוסה בו. מילוי באחד התאים הדגירה פרוסה עם פתרון של חנה המבר המכיל 1 μM SR-101, ולמלא אחר רק עם חנה המבר.
דגירה הפרוסות בחדר דגירה המכיל את 1 מיקרומטר SR-101 20 דקות, ואז להעביר אותם לתוך הדגירה השני קאמרית שוטפת עודף SR-101 מתוך הרקמה. תן לזה תקופת דגירה של 20 דקות או יותר ב 34 מעלות, ואז לשמור תא הדגירה המכיל את הפרוסות ב RT עד שהם זקוקים¹⁸.

3. תיקון אסטרוציט ו Biocytin מילוי

בחרו פרוסה ולמקם אותו בחדרו הקלטה של המיקרוסקופ. תיקון האסטרוציטים, השתמש אלקטרודות עם התנגדות של 4-6MΩ כאשר מלא עם פתרון מבוסס-אשלגן-gluconate (ראו טבלה 3).
תחת הנחיה חזותית ושימוש של micromanipulator, לכוון האלקטרודה הקלטה לכיוון אסטרוציט SR-101-מתויג כמוצג באיור1. הימנע תאים נמצא על פני השטח של הפרוסה, שכן הם נוטים יותר פגום או איבדו חיבורים לתאים שכנים.
כדי למנוע דליפה של biocytin ברקמה, להקטין את הלחץ חיובי נוסף על פיפטה תיקון ולהחיל אותו רק כאשר הוא קרוב אסטרוציט זה להיות מטולא (0.1-0.4 מ ל מזרק של 1 מ"ל).
לפני תיקון, כוונון ההיסט של פיפטה, קיבוליות שלה. תקן עבור פוטנציאל צומת נוזלי, כמו פקודות מתח ומדויקים הם קריטיים ניסויים¹⁹.
הזז פיפטה קרוב מספיק אסטרוציט להתבונן דיכאון גורם לחץ חיובי. לאחר מכן, להסיר את הלחץ, לאט לאט החל לחץ שלילי. מהדק את אסטרוציט ל-70 mV החותם מגיע ל 100 MΩ. המתן עד החותם מגיע ל 1-3 GΩ. להמשיך להפעיל לחץ שלילי עד לפרוץ לתוך התא. להיזהר בעת הפעלת לחץ שלילי, מאחר האסטרוציטים הם מאוד שבירים.
להעריך את המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של התא תוקנו. במצב מתח-קלאמפ, לבצע פרוטוקול זרם-מתח התא כולו עם פקודה מתח סוללה של משך 600 ms ועד-120 +110 mV. במצב הנוכחי-קלאמפ, לבצע נוהל שלב IV בהן ההזרקה של 1000 ms הנוכחי צעדים של הרשות הפלסטינית 100 מ-1 ל נה 1, קצב הדגימה של ההקלטות כל תא הוא 10 קילו-הרץ.
הערה: האסטרוציטים הצג פרופיל זרם-מתח לינארית ללא כל סוג של תיקון (כפי שמוצג באיור 1B), אין פוטנציאל פעולה ירי על קרום דפולריזציה (איור 1C). פוטנציאל הממברנה בזמן מנוחה (RMP) צריך להיות יציב וטוב לא ל- 60mV. באזורים מסוימים במוח, RMP של האסטרוציטים היא יותר hyperpolarized מאשר ב- NVsnpr.
אפשר את biocytin לנטרל בתוך אסטרוציט למשך 30 דקות בעת ביצוע שלב IV פרוטוקול בכל 5 דקות.
. משכי לנתק את פיפטה תיקון בזהירות מבלי להזיק את אסטרוציט תוקנו, מיד שימו לב ההיסט של פיפטה לפני שלקחתי אותה מחוץ לחדר ההקלטה. לחסר ערך זה מ ההקלטות פוטנציאל הממברנה.
להשאיר את הפרוסה למוח לנוח בבית הבליעה הקלטה למשך לפחות 15 דקות (בנוסף 30 דקות להזרקה) כדי לאפשר הפצת רכיב המעקב מ אסטרוציט תוקנו רשת שלמה של תאים בשילוב.
הערה: כדי לחשוף את רשת של תאים בשילוב, רק תא אחד צריך להיות מטולא בגרעין של ריבית. אם נסיונות מרובים נדרשות כדי להשיג תקופה מוצלחת, למחוק את המקרה ולנסות תיקון בצד contralateral או בפרוסה נוספת של המוח.
הפיכת מארק או חתך ברקמת לזהות באיזה צד של הפרוסה פונה כלפי מעלה, להעביר את הפרוסה הראשונה צלחת פטרי המכילות חנה המבר נורמלי, ואז לתוך פתרון של 4% paraformaldehyde (PFA). דגירה הפרוסה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
התראה: PFA מזיק מאוד. השימוש בציוד המגן בשכונה מאוורר. ודא כי כל החומרים (מברשות, צינורות, וכו ') שהיו בקשר עם מחברים אל תצור קשר עם התאוששות מחזיק קאמרית, דגירה קאמרית או חומרים אחרים המשמש להקלטת הרקמה טריים.

4. Biocytin ההתגלות

התגלות עם פלורסנט streptavidine
1. שטיפת המוח פרוסות 2 x 10 min ב- 0.1 M פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS) ב RT. לאחר מכן, לחשוף את biocytin על ידי המקננת את פרוסות המוח עם streptavidine מצומדת fluorophore-דילול 1/200 ב- PBS עם 4% דטרגנט ללא יונית במשך 4 שעות ב- RT.
2. לשטוף את פרוסות המוח 3 x 10 min ב- 0.1 M PBS ב RT והר הסעיפים בשקופיות זכוכית באמצעות בינוני של הרכבה מימית. מקם הצדדים הוזרקו כלפי מעלה, coverslip השקופיות ולאחר לאטום אותם-הלק.
התגלות עם DAB
הערה: התגלות DAB (3,3-diaminobenzidine) ניתן להשתמש כאשר אין אפשרות להשתמש קרינה פלואורסצנטית. במקרה זה, שיטה ההתגלות היחיד צריך להיות מועסק עבור ביצוע השוואות.
1. תשטוף פרוסות המוח 3 x 10 min ב- PBS ב RT. דגירה הפרוסות ב- PBS + H₂O₂ 0.5% למשך שעה-RT.
2. לשטוף את פרוסות 3 x 10 min ב- PBS ב RT. לאחר מכן, דגירה הפרוסות ב אבידין-ביוטין מורכבים מכתימים פתרון מורכב PBS ו דטרגנט ללא יונית 0.1% + אבידין-ביוטין peroxidase מורכבים סטנדרטי מכתימים ערכת ריאגנטים ב- 1/100 למשך 24 שעות-RT.
3. לשטוף את פרוסות 3 x 10 min ב- PBS ב RT, דגירה אותם בפתרון של PBS + כי אמחה קלות 0.05% במשך 20 דקות ב- RT, ולא להעביר אותם לתוך פתרון של PBS + כי אמחה קלות 0.05% + H₂O₂ 0.5%.
  התראה: DAB מזיק מאוד. השימוש בציוד המגן בשכונה מאוורר. התגובה צבע מופסק כאשר הפרוסות מועברים ב- PBS.
4. לשטוף את הפרוסות 5 x 10 min ב- PBS ב RT, הר הסעיפים בשקופיות זכוכית (פנים את הצדדים הוזרקו כלפי מעלה) ולתת להן להתייבש בשקופית ייבוש ספסל בן לילה ב 34 מעלות צלזיוס.
5. להטביע את השקופיות זכוכית עבור 1 דקות בכמה אמבטיות אלכוהול 70%, 95%, ו- 100%, ובסוף עם אמבט של קסילן עבור 1 דקות.
6. הר בשקופיות זכוכית באמצעות מבוססי טולואן שרף סינתטי הרכבה בינונית. מקום coverslips בשקופיות, לסמנם עם הלק.

5. רשת הדמיה

דמיינו את הרשתות astrocytic באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה מצויד 20 X 4 X מטרות (או אובייקטיבית המתאים כדי להמחיש את הגרעין כולו שבו ממוקם ברשת) ו לייזר כדי לזהות את fluorophore (במקרה זה, אלקסה-594 הוא בשימוש).
להשתמש ההגדלה 20 X z-בערימה של הרשת של תאים עם תוויות. השתמש ברזולוציה של 800 x 800 פיקסלים, לסרוק במהירות של 12.5 μs לפיקסל.
הערה: על מנת דמות כל הרשת, ערימות מרובות נדרשים בדרך כלל ולאחר מספר ערימות צריך להיות מותאם עבור כל רשת. מהירות סריקה של רזולוציה ניתן לשינוי, אך הקפד להשתמש באותן ההגדרות של כל נתוני תמונה.
השתמש ההגדלה X 4 תמונות של הרשת, אזור בעל עניין.
הערה: 4 X הדמיה משמש כדי לקבוע את מיקום הרשת בתוך הגרעין של עניין. תמיד תמונה באותו השדה באור המשודרת. הדימוי הזה יהיה שימושי אם אתה לא יכול לקבוע את הגבול של הגרעין בתמונה פלורסנט קונפוקלי.

6. ניתוח תמונות

הכנת הנתונים
1. להשתמש בתוכנה ImageJFIJI (להוריד אותו ב- https://fiji.sc/). פתח את הקובץ ולחץ על OK בחלון "ביו-תבניות ייבוא אפשרויות".
2. להגדיר מחדש את z-מחסנית שיכיל רק את הפרוסות אופטי עבור סופי z-המחסנית (איור 2 א), לחץ על הידית "מחסנית" בסרגל הכלים (כדי למצוא, בחר תחילה stk | פרויקט Z). בחר "מקס אינטנסיביות" הסוג הקרנה הגדרת (איור 2 א). שמור את הקובץ, שם "מחסנית קובץ".
3. אם קובץ הדמיה מכיל מספר ערוצים, נתחלק לשמר רק את הערוץ עם ההדמיה רשת astrocytic (תמונה | צבע | פצל ערוצים).
4. בדוק את הגדרות הפיקסל של התמונה [תמונה | מאפייני | פיקסל (עם "1" עבור ממד פיקסל)].
5. השתמש בכלי רקע הפחת (תהליך | להחסיר רקע) כדי להסיר את הרקע של biocytin תוויות. השתמש בפונקציה תצוגה מקדימה כדי להגדיר את רדיוס הכדור מתגלגל, אשר מוגדר בדרך כלל 50 פיקסלים (איור 2B).
6. השתמש בכלי ליניאריים הסרה (תהליך | רעש | להסיר ליניאריים) אם נדרש בעקבות הצעד רקע הפחת. בחר "ברייט" בהגדרת "אשר ליניאריים" (איור 2C). השתמש בפונקציה תצוגה מקדימה כדי לקבוע את רדיוס הסף. להיזהר עם הכלי הזה, מאז זה עשוי לטשטש את הנתונים, כפי שמוצג באיור 2D.
  הערה: כלי זה מסיר את הנקודות קטנים הנגרמת על ידי פיקדונות לא ספציפי של streptavidine (כפי שמוצג על ידי החצים הלבנים להבין 2B ו 2 C לפני ואחרי טיפול, בהתאמה).
7. התאם את הסף (תמונה | התאם | מפתן). בחר במצב "ברירת מחדל" ו- "B & W" (2E איור). לחץ על "החל".
  הערה: כוונון אוטומטי יכול לשמש, אך התאמה ידנית עם מייצגי המחוון שני הוא מועדף. מטרת שלב זה היא כדי להפחית את הרעש למקסימום מבלי לאבד תאים עם תוויות.
8. המירו את התמונה לתוך תמונה בינארית באמצעות הכלי תהליך בינארי (תהליך | בינארית | להפוך בינארי) כפי שמוצג באיור 2F. שמור את הקובץ כקובץ TIFF ולכנותו "קובץ בינארי".
סופר תא
1. בדוק את ההגדרה של הפונקציה מידה (נתח | הגדר מדידה). בחר באפשרות "Centroid".
2. השתמש בכלי "חלקיקים לנתח" על "קובץ בינארי" (איור 3 א) המיוצר בשלב הקודם (נתח | לנתח את החלקיקים) (3C איור משמאל). בחר "מתאר" בהגדרת "להראות" (איור 3C). יוצר קובץ חדש המציג את תוצאת הזיהוי (איור 3B).
3. לשחק עם הפרמטרים: גודל (כדי לזהות רק תאים, השתמש בערכים בין 30 ל 6000) ואת מעגליות (כדי לקבוע פרק זמן בין 0 ל- 1, אשר "1" מגדיר את מעגל מושלם ו- "0" צורה אקראית) כדי לחדד את הזיהוי (איור 3C, נשאר חלק). הפעל הזיהוי על-ידי לחיצה על "אישור".
  הערה: שתי הטבלאות יופיעו בעקבות הזיהוי: 1) תחת הכותרת "Summary" המספק את מספר התאים שאותרו, וטבלת 2) תחת הכותרת "תוצאות" (איור 3C, החלק הנכון) המספק את הקואורדינטות x ו- y של כל תא.
4. להעתיק את הערכים ולהדביק אותם לתוך יישום גליונות אלקטרוניים. שמור את השולחן הזה תחת השם "זיהוי השולחן". קובץ עם מגרש של תאים שזוהו יופיעו גם (איור 3B). שמור את הקובץ כקובץ TIFF תחת השם "איתור הקובץ".
5. אם קבוצת תאים 2 או יותר שכותרתו ברשת מזוהים כפי תא בודד באמצעות הכלי חלקיקים נתח כי הם קרוב מדי אחד לשני, השתמש בכלי קו פרשת המים (תהליך | בינארית | קו פרשת המים) על התמונה בינארי לפני החלת החלקיקים נתח כלי, ובצע את השלבים חלקיקים נתח.
  הערה: הכלי קו פרשת המים יוצר של תיחום רחב בין תאים מאוד קרוב 1 פיקסל. פחית plug-in של מונה תא לשמש כאשר תיוג הוא חד משמעי, יכול להתבצע באופן ידני.
מדידת שטח רשת astrocytic
1. כדי למדוד את פני השטח של הרשתות, להשתמש בקובץ ה-זיהוי באמצעות תמונה ג'
2. השתמש בכלי בחירה מצולע (שמאל לחץ על הלחצן בסרגל כלי כדי לבחור בו) לאתר מצולע שמחבר את כל התאים הממוקמים בפריפריה חיצוני של הרשת (איור 4A). שמאל לחץ כדי להתחיל מעקב את המצולע, לחץ לחיצה ימנית כדי לסגור אותו.
  הערה: מצולע זו תוגדר כאזור עניין (ROI), פני השטח שלו נמדד כדי לקבוע את פני השטח של הרשת.
3. פתח את החלון מדידה set (נתח | לקבוע מדידה) ובחר באפשרות "אזור". פתח את מנהל רועי (לנתח | כלים | רועי מנהל) (איור 4B). לאחר מכן, להוסיף את המצולע עקיבה במנהל רועי על-ידי לחיצה על "הוסף" (איור 4B) ולהפעיל את המדידה על ידי לחיצה על ' מידה ' במנהל רועי.
  הערה: מדידת השטח יופיע בטבלה ולא להתבטא פיקסלים. אל תשכחו להמיר את הערך הזה עם הגורם ההמרה עבור המיקרוסקופ משמש כדי לקבל ערך μm².
הנחישות של וקטור הכיוון העיקרי
1. הנחישות של התא מתוקנת
  1. פתח את הקובץ מחסנית ב ImageJFIJI ולזהות את התא תוקנו בקובץ מחסנית בהתבסס על בעוצמתה תיוג חזק (איור 4C). לאחר מכן, פתח את הקובץ בשם "זיהוי שולחן" ביישום גיליונות אלקטרוניים, למצוא את מספר התא תוקנו והקואורדינטות המתאימים שלו.
  2. אם אין אפשרות לקבוע באופן מדויק את התא תוקנו, המקיפים את האזור שבו ההפקדה של biocytin היא צפופה ברשת תמונה של תאים בשילוב, שימוש בכלי מצולע ב ImageJFIJI, והפנה לתנוחה הזאת כמו זה של התא תוקנו (איור 4D).
  3. השתמש במנהל ROI (לנתח | כלים | רועי מנהל). לאחר מכן, לצייר רועי במיקום התא תוקנו ולהוסיף אותו למנהל ROI (ראה איור 4B).
  4. הגדר מדידה (נתח | לקבוע מדידה) ובחר באפשרות "Centroid".
  5. במנהל רועי, לחץ על "מדד" כדי להשיג את הקואורדינטות של centroid האזור לעקוב אחריו. השתמש הקואורדינטות כנקודת התייחסות ברשת ספציפית זו.
2. תרגום הקשרים
  1. לחשב את הקואורדינטות של כל תא בהקשר אסטרוציט תוקנו באמצעות הנוסחה הבאה:
    
    עם: כמו קואורדינטות תא נתון; כמו הקואורדינטות של התא תוקנו (או נקודת הקשרים של הרשת); כמו קואורדינטות תא נתון החדשה הקשרים.
    הערה: לבטא את נקודות הציון של כל תא בהקשר אסטרוציט תוקנו היא צעד חשוב לחישוב וקטורים מ אסטרוציט תוקנו. להיזהר בעת שימוש ImageJFIJI הקשרים עבור כל תמונה הממוקם בפינה השמאלית העליונה של התמונה.
3. הנחישות של וקטור הראשי כיוון מועדף
  1. לחשב את הקואורדינטות של וקטור הראשי של כיוון מועדף עם הנוסחה הבאה:
    
    עם: () כמו הקואורדינטות של וקטור הראשי של כיוון מועדף; כמו נקודות הציון של כל תא של הרשת שהושג עם תוקנו תא כמו הקשרים.
    הערה: עבור כל תא ברשת, וקטור נקבע באופן יחסי הקואורדינטות של אסטרוציט תוקנו. וקטור הראשי של כיוון מועדף של הרשת הוא הסכום של כל וקטורים אלה.
  2. לחלק את אורך הווקטור הראשי (שמספק את נקודות הציון המתקבל באמצעות הנוסחה לעיל) על ידי מספר התאים ברשת מינוס אחד (מאז הקואורדינטות של התא תוקנו אינם כלולים), לנרמל את הערכים ולאפשר השוואות בין רשתות. מבט סכמטי של ניתוח זה מוצג באיור5.
השמה של רשתות שנותחה בגרעין של ריבית
1. היישור של 20 X ותמונות X 4
  1. כדי לקבוע את המיקום של כל רשת בגרעין של הריבית (NVsnpr), להשתמש בתמונה X 4. פתחו את התמונה X 4 באמצעות עורך תמונות וקטור.
  2. בחר בתמונה X 4 ושנה את גודלה על-ידי הכפלת זה 5. חלון ממד ממוקם בחלק הנכון של הכלים האופקי העליון. למשל, עבור תמונת X 4 יש כבר לטעום-800 x 800 פיקסלים, לשנות את הרזולוציה הדגימה 4000 x 4000 פיקסלים (כדי להגדיר את יחידת עבודה בפיקסלים, עבור אל 'הגדרות מסמך' תחת הכרטיסיה קובץ: קובץ | הגדרות מסמך). לייצא את הקובץ בתבנית TIFF והשם "הגודל שלה 4 X".
  3. יישר את הפינה השמאלית העליונה של התמונה עם הפינה הימנית התחתונה של המסמך Adobe Illustrator.
    הערה: התוכנה מספקת קואורדינטות נקודה הקשרים בפינה השמאלית התחתונה.
  4. פתחו את התמונה X 20 של הרשת. השתמש ' קובץ בינארי ' או 'איתור הקובץ ' כי הם יותר קל ליישר. לאחר מכן, לשחק בעזרת הכלי ' אטימות ' על 'הקובץ הבינארי ' של התמונה X 20 כדי ליישר אותו עם 4 מחדש בגודל X התמונה.
    הערה: הכלי אטימות נמצא סרגל הכלים האופקי העליון.
  5. כאשר היישור, בחר, להחזיק את הכלי פיפטה כך מופיע בכלי מדידה ולאחר בחירתו בסרגל הכלים השמאלי.
  6. שימוש בכלי מדידה כדי ללחוץ על הפינה השמאלית העליונה של התמונה X 20 כדי לקבל את נקודות הציון של ה-20 X הקשרים הצבע על גבי 4 שגודלה השתנה X התמונה.
    הערה: הקואורדינטות, אשר מכונים את 20 X הקשרים (20XR באיור5), יהיה שימושי עבור לבטא את המיקום של כל רשת על שרטוט ציור של הגרעין.
2. נורמליזציה של גרעין עניין
  הערה: כדי לסכם את הנתונים, נורמליזציה של הגרעין (NVsnpr) כמלבן משמש. השלבים שיפורטו להלן.
  1. לפתוח את 4 X קובץ שגודלה השתנה ב- ImageJFIJI, והשתמש בכלי מצולע כדי להקיף את הגרעין (NVsnpr). להשתמש בתמונה עם אור המשודרת אם הגבולות של הגרעין אינם מסוגלים לראות; בכל מקרה, זכור את גודלה קודם.
  2. פתח את מנהל רועי ולהוסיף את רועי מצוירות. במדידה"להגדיר", בחר באפשרות ' מלבן תוחמת '.
    הערה: האפשרות "תיבה תוחמת מלבן" מחשבת את המלבן הקטן ביותר מסביב לגרעין מצוירות.
  3. לחץ על "מידה".
    הערה: מופיעה טבלה עם BX ו ב, הקואורדינטות של הפינה השמאלית העליונה של המלבן: ' מלבן עמדה ' מספקת את הרוחב והגובה. BX ו ב הם הקואורדינטות של המלבן התוחם הקשרים אשר מכונים , .
3. ביטוי לכל תפקיד הרשת בגרעין מנורמל
  1. לבטא את נקודות הציון של כל תא עם 4 X הקשרים (ריבוע שחור באיור5) באמצעות הנוסחה הבאה:
    
    איפה: הן הקואורדינטות תא עם 4 X הקשרים; הציון תא עם 20 X הקשרים (ריבוע כתום באיור5); ו הציון מתוך 20 X נקודת הקשרים בתמונה X 4 (20XR).
  2. לבטא את הקואורדינטות תא בתוך המלבן התוחם הקשרים (כחול באיור5) באמצעות הנוסחה הבאה:
    
    איפה: הם התא מרכזת בתוך המלבן התוחם הקשרים; הן נקודות הציון של התא ב- 4 X הקשרים; הם הקואורדינטות של המלבן התוחם הקשרים בתמונה X 4.
  3. להפוך את הקואורדינטות תא בתוך המלבן התוחם הקשרים על האחוז של הרוחב והגובה של המלבן התוחם באמצעות הנוסחה הבאה:
    
    איפה: הם התא מרכזת את אחוז רוחב וגובה של המלבן התוחם; הם התא מרכזת בתוך המלבן התוחם הקשרים; הרוחב של המלבן התוחם נמדד מעל הפרוטוקול; ו הגובה של המלבן התוחם נמדד לעיל בפרוטוקול.
  4. כדי לייצג כל הרשתות על אותה דמות, לקחת בחשבון את הכיוון של הפרוסה (בצד שמאל או ימין). כדי לתקנן את הנתונים, הקשרים מוחל על הצד השמאלי של הפרוסה. להעביר את רשת הקואורדינטות של הצד הימני בצד שמאל על-ידי החלת את הנוסחה הבאה רק קואורדינטות ה-x:
    
    איפה: הוא קואורדינטת ה-x בצד ימין של הפרוסה; ו חדשה שבאה לידי ביטוי שלמות הקשרים על הצד השמאלי של הפרוסה קואורדינטת x.
    הערה: לחלופין, ראי את התמונה ImageJFIJI לפני הניתוח (תמונה | שינוי צורה | להפוך אופקית).
  5. כדי לבטא את הקואורדינטות של וקטור הראשי של כיוון מועדף, בצע את השלבים באותו תא הציון (שלבים 6.5.3.1 כדי 6.5.3.4).
    הערה: הביטוי של נקודות הציון באחוזים מאפשר אוסף של הנתונים כמו מגרש יחיד שבו הגרעין (NVsnpr) תוכנן כמלבן.
חקר ההבדל זוויתי של וקטור הראשי של כיוון מועדף
הערה: ההבדל זוויתי של רשת astrocytic משמש כדי לקבוע אם ומגמתו מועדף לכיוון המרכז של הגרעין של עניין. כדי לחשב את ההפרש זוויתי (α באיור5), אשר היא הזווית בין הווקטור הראשי של כיוון מועדף של הרשת (PD, אדום קו באיור5) לבין הקו מתחבר P C, להחיל את משפט באל-קאשי לתוך המשולש PDC (ראה שיבוץ של איור 5 ושיטות משלים).
1. ראשית, לחשב באורכים שונים באמצעות היישום של פיתגורס לתוך קרטזית הקשרים באמצעות המשוואה הבאה:
  
  : איפה הקואורדינטות של P ו- C , , בהתאמה, בתוך המלבן התוחם הקשרים (החישוב לעיל).
2. לקבוע את ההבדל זוויתי ברדיאנים באמצעות הנוסחה הבאה:
3. להמיר את ההבדל זוויתי במעלות (למשל, באמצעות הפונקציה מעלות בתוכנת Excel).
4. לקמפל את כל ההבדלים זוויתי ידי אותם בתרשימי עמודות אנכיות (איור 7C ו 7 D) ולקבוע אם יש כיוון מועדף של רשתות astrocytic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צימוד בין תאים במוח אינו סטטי אלא מעדיף באופן דינמי מוסדר על ידי גורמים רבים. בשיטות המתוארות פותחו כדי לנתח רשתות astrocytic חשף בתנאים שונים, כדי להבין את הארגון שלהם ב- NVsnpr. תוצאות אלו היו כבר פורסם¹. ביצענו biocytin מילוי האסטרוציטים יחיד בחלק הגבי של NVsnpr של שלושה מצבים שונים: במנוחה (בתנאי שליטה בהיעדר כל גירוי), ב- Ca^{2 +}-ללא תנאים, ובעקבות גירוי חשמלי של סיבי חישה המקרינים את הגרעין. ההגדרות ניסיוני עבור מילוי biocytin האסטרוציטים עבור כל תנאי מומחשים הצד השמאלי של איור 6A-C.

רשתות של תאים התווית על-ידי biocytin נצפו בתנאי בקרה ואישר מדינה הבזליים של תא צימוד בין NVsnpr האסטרוציטים במנוחה. 11 המקרים שנבדקו, דיפוזיה biocytin הראה רשתות מורכב 11 ± 3 תאים (האמצעי לוח ב 6A איור, איור 6D) הארכת על פני שטח של 34737 ± 13254 מיקרומטר² (איור 6E). Carbenoxolone (CBX, 20 μM), חוסם שאינם ספציפיים של צמתי הפער, היה בשימוש ערכה עצמאית של ניסויים על מנת להבטיח כי נצפתה תיוג היה תוצאה של biocytin דיפוזיה דרך צמתים הפער וכן לא ספיגת על ידי התאים של biocytin, אשר יכולה לדלוף לחלל חוץ-תאי הלחץ חיובי המוחל על פיפטה תיקון לפני תיקון. אמבט היישום של CBX הופחת מספר תאים עם תוויות ± 0.5 2 תאים (לוח נכון ב 6A איור, איור 6D; שיטת אימאן-Conover, P = 0.016; מבחן Holm-Sidak, P = 0.010) אזור biocytin להתפשט 2297 ± 1726 מיקרומטר²(איור 6E; שיטת אימאן-Conover, P = 0.0009; מבחן Holm-Sidak, P = 0.025).

ההשפעה של הסרת סידן של המדיום על NVsnpr רשתות astrocytic נבדקה כי ריכוז נמוך של סידן חוץ-תאית ידוע להיפתח connexins הפער צמתי²⁰^,²¹^,²², וזה יכול לשמש כמו גירוי מאסיבי ולא אחיד כדי לפתוח את syncytium ולמקסם את חיצי מעקב דיפוזיה דרך צמתים הפער. הרשתות astrocytic שנתגלו ב- Ca^{2 +}-ללא תנאים (n = 10) הראו מספר גדול יותר של תאים מאשר הרשתות חשף בתנאי בקרה, עם תאים ± 10 שכותרתו 37 (לוח האמצעי ב- 6C איור, איור 6D; שיטת אימאן-Conover, P = 0.016; מבחן Holm-Sidak, P < 0.001) המשתרע על שטח של 108123 ± 27450 μm²(לוח האמצעי ב- 6C איור, איור 6E; שיטת אימאן-Conover, P = 0.009; מבחן Holm-Sidak, P = 0.001).

בהשוואה הסרה מלאה של סידן של המדיום, גירוי חשמלי של תשומות מביא את הגרעין של עניין הוא גירוי פיזיולוגי יותר המערבת ישירות את המעגלים עצביים של ריבית. כתוצאה מכך, התוצאות של זה סוג של מניפולציה יכולים לספק מידע בעל משמעות לגבי ההשלכות פונקציונלי של הרשתות astrocytic נצפתה. למשל, קלט מהמשתמש שני מסלולים שונים עלול להוביל השפעות שונות על המדינה הבזליים של תאים צימוד באזור נתון, או זה עשוי להפיק צימוד בין האסטרוציטים ב מחוזות נפרדים של הגרעין. במעגל שלנו, גירוי חשמלי של סיבי החישה זה פרוייקט NVsnpr באמצעות רכבות 2 שניות של 0.2 ms פולסים ב 40-60 הרץ (n = 11) המיוצר עלייה בשואת בין האסטרוציטים NVsnpr, ביחס לתנאים unstimulated, עם 23 ± 6 תאים (לוח האמצעי ב- 6B איור, איור 6D; שיטת אימאן-Conover, P = 0.016; מבחן Holm-Sidak, P = 0.012) מתפשט על פני שטח של 814174 ± 15270 μm²(לוח האמצעי איור 6B, איור 6E; שיטת אימאן-Conover, P = 0.009; מבחן Holm-Sidak, P = 0.004).

השפעות אלו שני סוגים של גירוי, הסרת סידן של המדיום, ואת גירוי חשמלי של תשומות מביא, נמצאים כל מובסים CBX. הרשתות astrocytic במצב הזה מורכב רק 5 תאים ± 1 ב Ca^{2 +}-חנה המבר חינם (לוח נכון ב- 6C איור, איור 6D; n = 4; שיטת אימאן-Conover, P = 0.016; מבחן Holm-Sidak, P < 0.001) 9 ± 2 תאים עם גירוי סיבי חישה (לוח נכון ב- 6B איור, איור 6D; n = 6; שיטת אימאן-Conover, P = 0.016; מבחן Holm-Sidak, P = 0.023). רשת פני שטחים הצטמצם גם 17987 מיקרומטר ± 9843² עם Ca^{2 +}-חנה המבר חינם (איור 6E; n = 4; שיטת אימאן-Conover, P = 0.009; מבחן Holm-Sidak, P = 0.004) וכדי 39379 מיקרומטר ± 11014² עם גירוי סיבי חישה (איור 6E; n = 6; שיטת אימאן-Conover, P = 0.009; מבחן Holm-Sidak, P = 0.055).

ניתוח אנטומי בוצעה רק במקרים שבו הגבולות NVsnpr יכול להיות מוגדרים בבירור על 4 X הדמיה, אשר הושג המקרה עבור רשתות 9 מתוך 10 עם Ca^{2 +}-חנה המבר חינם ורשתות 8 מתוך 11 שהושג עם גירוי חשמלי. התוויית של כל הרשתות astrocytic שנותחה על NVnspr תיאורטיים מראה כי רוב התאים כללה את רשתות הוגבלו בתוך גבולות גרעין (דמויות 7 א ו 7 ב, לוחות הימנית והאמצעית). תחת Ca^{2 +}-כלנית חדד בחינם, רשתות astrocytic 4 מתוך 9 התפשט אל מחוץ NVsnpr בכיוון של גרעין המנוע ממוקם medially NVsnpr. במקרים אלה 4, הרוב המכריע של התאים עם תוויות הוגבלו את הגרעין. הרשתות של תאים עם תוויות שהושג עם גירוי חשמלי של סיבי החישה היו מוגבלים יותר. רק 2 רשתות על פני גבולות גרעין, שבו אחד להפיץ הגבול mediodorsal לאזור supratrigeminal הלטראלי (רשת ירוק כהה ב איור 7 ב, לוחות הימנית והאמצעית). במקרה השני, האסטרוציטים 2 ברשת אדום (איור 7 ב, לוחות הימנית והאמצעית) נכנסו לחלק הגחוני NVsnpr.

ניתוח וקטורי ברשתות astrocytic מועדף האוריינטציה (נכון לוח איור 7 א ו 7 ב) הפיק תוצאות שונות בהתאם הגירוי נעשה שימוש. אכן, עבור הרשתות astrocytic נצפתה עם Ca^{2 +}-חנה המבר חינם, כל פרט לאחד הווקטורים כיוון מועדף היו אוריינטציה לכיוון מרכז NVsnpr. עם זאת, עבור הרשתות astrocytic נצפתה עם גירוי חשמלי, כיוון מועדף הווקטורים היו בעיקר ומיועדת הגבולות של הגרעין. זה משתקף על ידי ההבדלים זוויתי מחושב בכיוון מועדף בין הרשתות astrocytic שהושג עם Ca^{2 +}-חינם חנה המבר ואלה שהושג עם גירוי חשמלי של סיבי החישה. תחת Ca^{2 +}-חנה המבר חינם, תרשימי אנכי של ההתפלגות של הפרש זוויתי הראה כי רוב הרשתות של תאים עם תוויות יש הבדל זוויתי של בין 0 ל- 40 מעלות, עם ממוצע של הבדל זוויתי של 39.5 ± מעלות 12.7 ( איור 7C). עם גירוי חשמלי של סיבי חישה, ההתפלגות הוא אחיד, ההבדל זוויתי רשע (99.5 ± 17 מעלות) היא שונה באופן משמעותי (איור 7D; תלמיד מבחן t, P = 0.012).

נתונים אלו מראים את biocytin תיוג ניתוח מאפשרת לנו להבחין את ההשפעות של גירויים שונים להתכוונן צימוד astrocytic. יתר על כן, מיפוי של הרשתות astrocytic גרעין מנורמל שלאחריה יבוא ניתוח וקטורי מספק מידע חשוב על הגודל ועל הארגון האנטומי של רשתות אלה.

איור 1: תאים כל תיקון-קלאמפ של אסטרוציט. (א) האסטרוציטים המסומנת טעינה של sulforhodamine סמן 101 (SR-101) ב- NVsnpr. Soma אסטרוציט SR-101-שכותרתו ' מכוון עם פיפטה תיקון (קו מקווקו לבן). סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) פרוטוקול הרמפה depolarizing מתבצע במתח-קלאמפ (מ-120 ל 110mV) כדי להעריך את מאפייני פסיבי אסטרוציט. (ג) הערכה של חוסר של פוטנציאל הפעולה ירי ב אסטרוציט על ידי זריקה של פולסים הנוכחי במצב הנוכחי-קלאמפ. נתון זה ממאמרו של לה קונדמין. et al. (2018) ¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: טיפול וניתוח של רשתות astrocytic עם תוכנת ImageJFIJI. (א) Z-מחסנית של יצירת ההדמיה קונאפוקלית של רשת astrocytic. ליד החלון Z-מחסנית השמאלית העליונה, ב- ImageJFIJI. (ב) רקע תהליך חיסור. ב השמאלית העליונה, להחסיר רקע חלון ב- ImageJFIJI. המעגל מנוקד מדגיש את האזור בתמונה איפה השפעת הפקודה רקע הפחת בעת ברורה יותר לעומת התמונה בתהליך ליניאריים א (ג) הסרה. תהליך זה מסיר המקומות קטן עקב לא ספציפי פיקדונות streptavidine מצמידים 594 אלקסה. החצים הלבנים להראות את הפיקדון לפני (איור 2B), לאחר (איור 2C) תועדה בפקודה. בפינה השמאלית העליונה, להסיר ליניאריים חלון ב- ImageJFIJI. (ד) דוגמה של אפקט blurring זה יכול להיות מיוצר על ידי הסתגלות לקויה מהפרמטרים ליניאריים הסרה. חיצים צהובים מראים כמה תאים מטושטשת. (ה) להתאים את תהליך הסף. ב השמאלית העליונה, להתאים את סף חלון ב- ImageJFIJI. פסי הגלילה לפעול על ההתאמה אות הסף. (ו) לעשות צעד בינארי. התמונה מומרת לתוך קובץ בינארי ב- ImageJFIJI. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: זיהוי של תאים ברשתות astrocytic עם ImageJFIJI. (א) דוגמה של תמונה בינארי של רשת astrocytic ב ImageJFIJI. סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) מתארת את "קובץ זיהוי" שהושג לאחר החלת תהליך חלקיקים נתח על הקובץ הבינארי. הצורות תואמות כל התאים שזוהו עם המספר שלהם משויכות באדום. (ג) השאיר חלק: לנתח חלקיקים חלון ב- ImageJFIJI. פונקציה זו מזהה את התאים של הרשת בתמונה בינארי. ניתן להתאים את גודל התאים שאותרו ואת מעגליות שלהם. מספרים כדי לשמש צריך להיות מוגדר על-ידי משפט--שגיאה עד תוצאה משביעת רצון, מתקבל. נכון חלק: זיהוי טבלה שנוצרו על ידי התהליך חלקיקים נתח. עמודות X ו- Y ברשימה את נקודות הציון של כל תא זוהה בתמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: רשת אזור הניתוח והנחישות של התא תוקנו ב- ImageJFIJI. (א) שימוש בכלי מצולע ב- ImageJFIJI, רועי נמצא במעקב בסביבת האשכול זיהה תאים (הקו האדום) שישמש כדי לקבוע את פני השטח של הרשת. (ב) רועי נוסף לתוך למנהל ROI. (ג) דוגמה של רשת astrocytic שבו התא תוקנו (חץ לבן) הוא קל לזיהוי בגלל עוצמת הבולט שלה biocytin תיוג. (ד) דוגמה של רשת astrocytic לא היתה אפשרות לזהות את התא מתוקנת, אבל איפה אזור צפוף תיוג בבירור מצביע על פיקדונות biocytin. רועי הוא נמשך באזור הזה והוסיף מנהל רועי. Centroid שלו מחושב, נחשב את המיקום של התא תוקנו לשימוש עבור ניתוח וקטורי. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: תרשים של referentials שונים המשמש לניתוח רשתות astrocytic. הריבוע האפור הוא התמונה X 4 עם 4XR שלמות הקשרים נקודת ייושר בפינה השמאלית התחתונה של המסמך Adobe Illustrator. הריבוע הלבן מוקף ב orange היא התמונה X 20 עם 20XR שלמות הקשרים נקודה. גם תמונות מיושרים אחד עם השני, כמפורט בפרוטוקול. המלבן התוחם (כחול) מגדיר NVsnpr (קו סגול מקווקו), תוגדל באחוזים עם נקודת הקשרים (BR). המרכז תיאורטי של החלק הגבי של NVsnpr הוא schematized על ידי הנקודה הכחולה כהה (C). הרשת astrocytic הוא schematized על ידי התא תוקנו (נקודה שחורה, P), וקטור הראשי של כיוון מועדף (הקו האדום). כל קו מקווקו שחור הוא הוקטור של כל תא של הרשת astrocytic. ההבדל זוויתי של הרשת astrocytic (α) היא הזווית בין הקו השחור שמחבר את אסטרוציט תוקנו למרכז תיאורטי של הגרעין כיוון מועדף הראשי של הרשת (הקו האדום). שיבוץ היא פתאומית של התמונה X 20 מציג את המשולש יהלומים שהוקמה על ידי מרכז תיאורטי NVsnpr (C) את התא תוקנו, הווקטור הראשי של כיוון מועדף (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6: רשתות Astrocytic המסומנת biocytin ב NVsnpr בתנאים שונים מציג בגדלים שונים- (א-ג) משמאל, שרטוט סכמטי של התנאי ניסיוני. בכל תנאי אסטרוציט יחיד עם התווית על-ידי SR-101 היה ממוקד עבור כל תא הקלטה, מתמלאת biocytin (0.2%). העמודה האמצעית: photomicrographs הממחישות את הרשתות astrocytic שהושג תחת שליטה תנאי (א), לאחר גירוי חשמלי של מערכת V^th(2 s רכבות, 40-60 הרץ, 10-300 µA, פולסים 0.2 ms) (ב); ואחרי זלוף עם Ca^{2 +}-חנה המבר חינם (C). בעמודה הימנית: photomicrographs הממחישות את הרשתות astrocytic שהושגו תחת באותם התנאים, אך בנוכחות CBX (20 μM) בתוך המנזר אמבט. סרגל קנה מידה = 100 μm. (E ו- D) פסים אנכיים תרשים המייצג את המספר מצמידים תאים, פני השטח, בהתאמה, של הרשתות מלא biocytin של האסטרוציטים בתנאים ניסיוני שלושה שהוצגו לעיל (A, B ו- C) נוכחות (בקעה), היעדר (מוצק) CBX (20 מיקרומטר). הנתונים מוצגים כפי מתכוון ± מרובים ב- SEM. השוואות (מבחן הולם-Sidak): * = P < 0.05; * * = P < 0.001. נתון זה ממאמרו של לה קונדמין. et al. (2018) ¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7: הטזה הרשתות NVsnpr תחת Ca^{2 +}-חנה המבר חינם עם גירוי חשמלי של מערכת V^th - (A ו- B) שמאל: כל התאים הנקרא ברשתות 9 מלא תחת זלוף עם Ca^{2 +}-חינם כלנית חדד (א) או ברשתות 8 מלא תוך שהיא מעוררת את דרכי V^th (B) מותווים על-פי המיקום שלהם בתוך גרעין NVsnpr תיאורטיים (מלבן אפור). כל רשת (ולא התאים להלחין אותו) מיוצג על ידי צבע שונה. האמצעי: הגבולות של כל רשת. הנקודה בכל אזור מייצג את התא תוקנו. מימין: ייצוג הראשי וקטור הכיוון מועדף של כל רשת. הנקודה מייצג את התא תוקנו, החץ וקטור כיוון מועדף. (C ו- D) חלוקת זוויתי ההבדלים העיקריים וקטור כיוון מועדף לבין קו ישר המחבר את התא תוקנו למרכז של החלק הגבי של NVsnpr (הממקומת 25% על הציר dorsoventral ו- 50% על הציר mediolateral) תחת שני תנאים למד. ההבדל זוויתי מרושע היה 39.5 ± מעלות 12.7 ב Ca^{2 +}-כלנית חדד בחינם, המציין את כיוון מועדף לכיוון המרכז של הגרעין, 99.5 ± 17 מעלות עם גירוי חשמלי, המציין את כיוון מועדף לכיוון הפריפריה (תלמיד מבחן t, P = 0.012). נתון זה ממאמרו של לה קונדמין. et al. (2018) ¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

סוכרוז-כלנית חדד^*	mMol
סוכרוז	219
אשלגן כלורי	3
₂פו ח'₄	1.25
MgSO₄	4
NaHCO₃	26
דקסטרוז	10
CaCl₂	0.2

טבלה 1: הרכב של הפתרון מבוסס-סוכרוז משמש עם פרוסות המוח. (*) = pH ו osmolarity היו mosmol מנוכי עונתיות 7.3-7.4 ו 300-320/ק"ג, בהתאמה.

כלנית חדד^*	mMol
NaCl	124
אשלגן כלורי	3
₂פו ח'₄	1.25
MgSO₄	1.3
NaHCO₃	26
דקסטרוז	10
CaCl₂	1.6

בטבלה 2: הרכב של הפתרון חנה המבר המשמש עבור אחסון פרוסה ורישום כל תא. (*) = pH ו osmolarity היו מנוכי עונתיות 7.3-7.4, 290-300 mosmol/kg, בהתאמה.

פתרון תיקון פנימי^*	mMol
K-gluconate	140
NaCl	5
HEPES	10
EGTA	0.5
טריס ATP מלח	2
טריס GTP מלח	0.4

טבלה 3: הרכב של הפתרון פנימי המשמש עבור הקלטת כל תא. (*) = pH ו osmolarity היו מנוכי עונתיות 7.2-7.3, 280-300 mosmol/kg, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

קיימות מספר שיטות אלקטרופיזיולוגיות להערכת תפקודי צימוד בין האסטרוציטים²³^,²⁴. עם זאת, שיטות אלה אינם מספקים מידע אודות הסידור האנטומי של רשתות astrocytic. מספר מחקרים הראו כבר כי "צבע - או מעקב-מצמד", כפי שנעשה כאן, מתרחשת רק בשבריר של מצמידים תאים שזוהו על-ידי שיטות אלקטרופיזיולוגיות²⁵^,²⁶^,²⁷, מציע את זה מספר התאים מזוהה עם שיטה זו היא מערכם עם זאת, זהו עדיין השיטה הטובה ביותר עבור ויזואלזציה של צימוד. יותר צבע-מצמד מתקבל בעת שימוש מולקולה המשדרים קטן מ- 1-1.2 KDa לחלחל הפער צמתי²⁰. הדמיה חיה של צימוד יכול להתבצע על ידי ניטור דיפוזיה של גלוקוז פלורסנט נגזרים (2-NBDG) או על סמן פלורסנט (כמו כמה צבעי אלקסה או צהוב לוציפר)¹³, אך בשל גודלו קטן יותר, biocytin מניב תוצאות טובות יותר, מאפשר כימות ברקמת קבוע. לפיכך, יש לציין כי מספר התאים מזוהה עם שיטה זו היא במידה רבה underestimated. מצד שני, חלק מהתאים יכולה להיקרא לא בגלל צימוד שלהם, אלא בגלל ספיגת של מעקב זה יש דלף לחלל חוץ-תאית. יכול להיות מוערך היקף תיוג כתוצאה דליפה בניסויים שליטה ביישומי אמבט של gap junction חוסם¹. עם זאת, ניתן להניח כי כל הטיה בשל פעולת חלים כל תנאי.

לבסוף, חשוב להדגיש כי לא כל בשילוב תאים הם האסטרוציטים. רשתות Panglial שבו הם מצמידים האסטרוציטים oligodendrocytes להפוך תוארו במספר תחומים המוח, כולל את לרוחב זית מעולה⁸, תלמוס¹⁶, קליפת ההיפוקמפוס²⁸. המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה של השוואת רשתות astrocytic חשף עם צבע-מצמד בתנאים שונים כדי להעריך את ההשערה כי הם יוצרים תחומים פונקציונליים מוגדרים היטב, ייחודי על ידי גירויים שונים. מאז ב NVsnpr, הגרעין טריגמינל גזע המוח שבו נערך פרוטוקול זה, צימוד בין האסטרוציטים מצומצמת מאוד תחת נח תנאים, זה היה חשוב לפתח לראשונה שיטה רציונלית ובלתי אמין כדי לזהות תאים עם תוויות. זה הושג עם זיהוי אוטומטי עם ImageJFIJI. לפעמים קשה להבחין תאים עם תוויות באופן עמום של רעש רקע. כאן, מחסנית הדמיה בפעולת ImageJFIJI משמשים כדי לשפר את האות, אך רעשי רקע עדיין יכול להיות גבוה מדי, להוביל לדחייה נתונים. מחקרים עתידיים, הבהרה פרוטוקולים עשוי לשמש כדי לשפר את יחס אות לרעש. פרוטוקול ניקוי הוא שיטה מעניינת הבהרה שומר על רקמות מורפולוגיה (אין התכווצות), אינה משפיעה על שומנים, ולא תואם immunostaining²⁹. הגבלה נוספת של השיטה המתוארת היא הכלי "קו פרשת המים" נהגה להפלות תאים שנמצאים קרוב אחד לשני. בדיקה ויזואלית של תאים שזוהו צריך להיעשות בעת שימוש בכלי זה.

אם רשתות astrocytic טופס תחומים פונקציונליים, הם עשויים להגדיר את הגבולות של גרעין או לפחות צריך להיות בבידוד לגבולות של גרעין. גילה רשתות יכול תמיד להיות כלוא בתוך גרעין, יותר אם הם קטנים בגודלם, אם אסטרוציט תוקנו במרכז (או בהישג) הגרעין. כדי לבדוק אם האסטרוציטים יושב ליד הגבול עם גרעין רצוי זוג עם אחרים האסטרוציטים מחוץ לגרעין או עם אחרים בתוך הגרעין, היינו צריכים לקבוע את הכיוון מועדף שאליו לצבוע להתפשט מן אסטרוציט תוקנו. מספר מחקרים אחרים עסקו בעיה דומה קליפת חבית, barreloid שדות של תלמוס, חוש הריח glomeruli, ההיפוקמפוס, לרוחב זית מעולה, אבל הם התמקדו ניתוחים בעיקר על המרחק של דיפוזיית רכיב המעקב. אפיון אלקטרופיזיולוגיות של סוגים שונים של האסטרוציטים הפונקציה של לוקליזציה שלהם, התפשטות צבע לאורך צירים אנכיים ביחס אלה מוגדרים היטב מבנים⁸^,⁹^,¹⁰^, ¹³^,¹⁴^,¹⁶. כאן השתמשנו ניתוח וקטורי כדי לקבוע את הכיוון הדומיננטי של מעקב כפולה, אשר ניתנה על ידי גודל וכיוון של וקטור הראשי מנורמל. וקטורים קטן עולה ללא כיוון ברור "דומיננטי" או מועדף. שלב קריטי לצורך ניתוח וקטורי היא היכולת לזהות במדויק את אסטרוציט תוקנו, וזה לא תמיד אפשרי. אלטרנטיבה מעניינת על מנת לאתר את אסטרוציט מתוקנת היא הוספת מחלף כזה גדול (הלא-gap permeant), מעקב ניתן לתיקון, כמו dextrans, לפתרון של הקלטה. אם זה לא ניתן לקבוע את התא תוקנו או תיקון מיקום, ואולי כדאי להשמיט ניסויים אלה מניתוח וקטור.

לבסוף, כדי לנתח אם מאפיינים של רשתות מגוונות לפי המיקום שלהן בגרעין, היינו צריכים שיטה להביע את עמדתם של גרעין "מנורמל". השלב הקריטי רק בהליך זה היא היכולת לראות בבירור את הגבולות של הגרעין של תמונות הגדלה נמוכה (4 X). פתרון פשוט לבעיה זו, אם היא מתרחשת לעתים קרובות, הוא להוסיף הגיוון היסטולוגית סטנדרטי של רקמות עיבוד לפני ניתוח.

הטרוגניות של האסטרוציטים על פני אזורים במוח נוצרת בבירור, ותומך גוף גדל והולך של ראיות הרעיון שלהם מתמחה המותאמים במיוחד עבור הפונקציה של מעגל כי הם מוטבעים ב-⁹^, ¹⁰^,³⁰^,³¹. בשביל זה להיות אמיתי, תקשורת בין-astrocytic צריך להיות מוגבל האסטרוציטים משויך המעגל אותו. תצפיות תמיכה הנחה זו מתגלים באזורי מוח שונים, אבל ניכרות יותר באזורים עם ייצוגים באשכולות, כמו מפות חושית קליפת חבית או הריח הנורה. עם זאת, רוב הדוחות של חפיפה בין מפות עצביים, astrocytic הם תיאורי ומהותי. שיטות דיווח כאן יכול לשמש תידחה תצפיות אלה ולפתח כלים לנתח יותר רשתות astrocytic על פי מיקומם במעגל הנתון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו ממומנת על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר, גרנט/פרס המספר: 14392.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Chemicals	S671-3
KCl	Fisher Chemicals	P217-500
KH₂PO4	Fisher Chemicals	P285-500
MgSO₄	Fisher Chemicals	M65-500
NaHCO₃	Fisher Chemicals	S233-500
C₆H₁₂O₆ Dextrose anhydrous	Fisher Chemicals	D16-500
CaCl₂ dihydrated	Sigma	C70-500
Sucrose	Sigma	S9378
D-gluconic acid potassium salt	Sigma	G45001
MgCl₂anhydrous	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E4378
ATP_{Tris Salt}	Sigma	A9062
GTP_{Tris Salt}	Sigma	G9002
Biocytin	Sigma	B4261
Carbenoxolone disodium salt	Sigma	C4790
avidin-biotin complex : ABC kit	Vestor laboratories	PK-4000
Streptavidine-alexa 594	Molecular Probes	S11227
Triton	Fisher Chemicals	BP151-500
Xylene	Fisher Chemicals	X5-1
Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount	Fisher Chemicals	SP15-100
Slide Drying Bench	Fisherbrand	11-474-470
Vibratome	Leica	VT 1000S
Microscope cover glass	Fisherbrand	12-544A
Microscope slide ColorFrost	Fisherbrand	12-550-413
PFA	Fisherchemicals	04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope	Olympus
40X water-immersion lens	Olympus	LUMPLFLN40XW
20X water-immersion lens	Olympus	XLUMPLFL20XW
4X water-immersion lens	Olympus	XLFLUOR4X/340
Micropipette puller	Sutter Instrument	P97
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP 225
Camera CCD	Sony	CX-ST50
Black and white monitor	Sony	SSM-125
Digidata	Molecular devices	1322A
Patch Clamp amplifier	Axon instrument	Mulitclamp 700A
Electrophysiology acquisition software	Molecular devices	pClamp 8
Electrophysiology analysis software	Molecular devices	Clampfit 8
Imaging analysis software	ImageJFIJI	Open source software. FIJI version including plug in package.
Vector image editor	Adobe	Illustrator CS4
Spreadsheet application	Microsoft Office	Excel 2010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control? Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
Verkhratsky, A., Steinhauser, C. Ion channels in glial cells. Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).
Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).
Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neuroscience. 286, 45-59 (2015).
Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).
Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).
Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).

Neuroscience

ניתוח של גודל, צורה, כיוון של רשתות של האסטרוציטים בשילוב

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.