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Neuroscience

आकार, आकार, और युग्मित Astrocytes के नेटवर्क के दिशात्मकता का विश्लेषण

Published: October 4, 2018 doi: 10.3791/58116
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central, and Département de Neurosciences, Université de Montréal, 2Faculté de Médecine Dentaire, Université de Montréal

Summary

यहां हम astrocytic नेटवर्क के संगठन का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । वर्णित विधि इस तरह के सेल गिनती, आकार, क्षेत्र, और एक नाभिक के भीतर की स्थिति के रूप में इन नेटवर्क के वर्णनात्मक उपाय प्रदान करने के लिए पूर्वाग्रह को कम करता है । Anisotropy एक वैक्टर विश्लेषण के साथ मूल्यांकन किया है ।

Abstract

यह तेजी से स्पष्ट हो गया है कि astrocytes न केवल synaptic और एकल सेल स्तर पर, लेकिन यह भी नेटवर्क के स्तर पर ंयूरॉन समारोह मिलाना । Astrocytes जोरदार अंतर जंक्शनों के माध्यम से एक दूसरे से जुड़े हुए हैं और इन जंक्शनों के माध्यम से युग्मन गतिशील और अत्यधिक विनियमित है. एक उभरती हुई अवधारणा है कि astrocytic कार्यों विशेष और न्यूरॉन सर्किट के साथ वे जुड़े रहे हैं के कार्यों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । इसलिए, तरीके astrocytic नेटवर्क के विभिंन मापदंडों को मापने के लिए बेहतर अपने संचार और युग्मन शासी और आगे उनके कार्यों को समझने के नियमों का वर्णन की जरूरत है ।

यहां, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, ImageJFIJI) का उपयोग कर, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए astrocytic नेटवर्क के फोकल छवियों का विश्लेषण डाई-युग्मन द्वारा पता चला । इन तरीकों 1 के लिए अनुमति देते हैं) लेबल कोशिकाओं के एक स्वचालित और निष्पक्ष पता लगाने, 2) नेटवर्क के आकार की गणना, 3) नेटवर्क के भीतर डाई प्रसार के तरजीही अभिविन्यास की गणना, और 4) ब्याज के क्षेत्र के भीतर नेटवर्क की स्थिति .

इस विश्लेषण के लिए एक विशेष क्षेत्र के astrocytic नेटवर्क की विशेषता इस्तेमाल किया जा सकता है, अलग अलग कार्यों से जुड़े क्षेत्रों के नेटवर्क की तुलना, या विभिंन स्थितियों है कि युग्मन पर अलग प्रभाव है के तहत प्राप्त नेटवर्क की तुलना करें । इन टिप्पणियों महत्वपूर्ण कार्यात्मक विचार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, हम एक astrocytic के नेटवर्क का विश्लेषण, जहां हम पहले से पता चला है कि astrocytic युग्मन ंयूरॉंस की क्षमता के लिए आवश्यक है दिखाने के लिए टॉनिक से अपने फायरिंग पैटर्न के लिए लयबद्ध1फट । इस नाभिक में astrocytic नेटवर्क्स के आकार, परिशोधन, और अधिमानी अभिविन्यास को मापने के द्वारा, हम कार्यात्मक डोमेन के बारे में परिकल्पनाओं का निर्माण कर सकते हैं, जो वे circumscribe हैं । कई अध्ययनों से पता चलता है कि कई अंय मस्तिष्क क्षेत्रों, बैरल प्रांतस्था सहित, सुपीरियर जैतून, घ्राण glomeruli, और संवेदी नाभिक thalamus और दृश्य प्रांतस्था में, कुछ नाम, एक समान विश्लेषण से लाभ हो सकता है ।

Introduction

कई अध्ययनों में बताया गया है कि कैसे एक उप-सेलुलर या synaptic स्तर पर न्यूरॉन-astrocyte संवाद में ंयूरॉन कार्यों और synaptic संचरण में निहितार्थ हो सकते हैं । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि astrocytes आसपास के न्यूरॉन गतिविधि के प्रति संवेदनशील हैं; वास्तव में, वे ग्लूटामेट, गाबा, acetylcholine सहित कई न्यूरोट्रांसमीटर के लिए रिसेप्टर्स है, और एटीपी (पहले से प्रकाशित की समीक्षा2,3,4) देखें. बदले में, astrocytic प्रक्रियाओं ensheath synaptic तत्वों और प्रभाव ंयूरॉन गतिविधि दोनों वहां और extrasynaptic साइटों पर extracellular ईओण homeostasis विनियमन और कई कारकों या ऐसे ग्लूटामेट, डी के रूप में ट्रांसमीटर जारी serine, और एटीपी 5 , 6 , 7.

विचार है कि astrocytes भी नेटवर्क के स्तर पर ंयूरॉंस समारोह मिलाना कर सकते हैं, सबूत के साथ उभरा है कि astrocytic युग्मन विशेष रूप से विनियमित है और एक स्पष्ट संरचनात्मक द्वारा विशेषता क्षेत्रों में ंयूरॉन विभाजन से मेल खाती है compartmentalization (संवेदी अभ्यावेदन के साथ क्षेत्रों की तरह), यह दर्शाता है कि astrocytes अंय astrocytes के लिए कुछ नहीं बल्कि सिर्फ उन है कि द्वारा करीब है एक ही समारोह की सेवा करेंगे । पार्श्व सुपीरियर जैतून में, उदाहरण के लिए, सबसे astrocytic नेटवर्क tonotopic अक्ष8orthogonally उंमुख हैं, जबकि बैरल प्रांतस्था या olfactoty glomeruli में, astrocytes के बीच संचार बहुत बैरल या glomeruli के भीतर मजबूत है और आसंन लोगों के बीच कमजोर9,10। दोनों ही मामलों में, astrocytic नेटवर्क glomerule या बैरल9,10के केंद्र की ओर उन्मुख कर रहे हैं ।

हम हाल ही में दिखाया गया है कि astrocytic गतिविधि extracellular ca की एकाग्रता कम करके न्यूरॉन्स फायरिंग ढा+ ([ca2 +]ई), संभवतः S100β, एक Ca2 +-बाइंडिंग प्रोटीन11की रिहाई के माध्यम से. यह प्रभाव है, जो rhythmogenic के पृष्ठीय भाग में एक की आबादी में का प्रदर्शन किया गया था, जबकि NVsnpr के मुख्य संवेदी नाभिक (, masticatory आंदोलनों की पीढ़ी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सोचा), इस तथ्य से परिणाम है कि इन न्यूरॉन्स में लयबद्ध गोलीबारी एक निर्बाध ना पर निर्भर करता है+ वर्तमान है कि के द्वारा पदोंनत किया जाता है [Ca2 +]e11,12. इन न्यूरॉन्स में लयबद्ध गोलीबारी "शारीरिक रूप से" उनके आदानों या कृत्रिम कमी की उत्तेजना से [Ca2 +]ईको मिलाया जा सकता है । हम आगे पता चला है कि astrocytic युग्मन के लिए आवश्यक था ंयूरॉन लयबद्ध गोलीबारी1। यह संभावना है कि astrocytic नेटवर्क घिरा कार्यात्मक डोमेन फार्म कर सकते है उठाया, जहां ंयूरॉंस गतिविधि सिंक्रनाइज़ और समंवित किया जा सकता है । इस परिकल्पना का आकलन करने के लिए, हम पहले NVsnpr के भीतर इन नेटवर्क के संगठन को कड़ाई से दस्तावेज़ के लिए एक विधि विकसित करने की जरूरत है ।

astrocytic नेटवर्क पर पिछले अध्ययन ज्यादातर सेल संख्या के मामले में युग्मन की हद तक वर्णित है और घनत्व और क्षेत्र को कवर किया । astrocytic नेटवर्क के आकार और डाई-युग्मन की दिशा का मूल्यांकन करने के प्रयास ज्यादातर दो अक्षों के साथ नेटवर्क के आकार की तुलना द्वारा प्रदर्शन किया गया (x और y) बैरल प्रांतस्था9में, हिप्पोकैम्पस13,14, 15, thalamus16, पार्श्व सुपीरियर ओलिव8, घ्राण glomeruli10, और प्रांतस्था14के barreloid क्षेत्रों । यहां वर्णित विधियां किसी नेटवर्क में लेबल किए गए कक्षों की निष्पक्ष गिनती और वे कवर क्षेत्र का अनुमान सक्षम करती हैं । हम भी उपकरण विकसित करने के लिए एक नेटवर्क के भीतर युग्मन के पसंदीदा अभिविन्यास को परिभाषित करने और आकलन है कि पसंदीदा अभिविंयास नाभिक के केंद्र की ओर है या एक अलग दिशा में । पहले इस्तेमाल किया तरीकों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल एक ज्ञात स्पष्ट संरचनात्मक नहीं है कि पृष्ठीय astrocytic के मुख्य संवेदी नाभिक की तरह संरचनाओं में संगठन और अभिविंयास नेटवर्क का वर्णन करने के लिए एक साधन प्रदान करता है compartmentalization । उपरोक्त अध्ययनों में, नेटवर्क अभिविन्यास संरचना के आकार के लिए एक संबंध के रूप में ही वर्णित है जो पहले से ही प्रलेखित है (जैसे, thalamus में barreloid, बैरल में प्रांतस्था, परतों में हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था, glomeruli में घ्राण बल्ब, आदि) । इसके अलावा, वैक्टर विश्लेषण युग्मन विभिंन स्थितियों के तहत पता चला झुकाव की तुलना के लिए अनुमति देता है । विश्लेषण करने के लिए कि क्या इन मापदंडों नाभिक के भीतर नेटवर्क की स्थिति के अनुसार बदल गया है, हम भी एक विधि नाभिक की सीमाओं के संदर्भ में प्रत्येक नेटवर्क को प्रतिस्थापित करने के लिए विकसित की है । इन उपकरणों को आसानी से युग्मित कोशिकाओं के नेटवर्क की जांच के लिए अंय क्षेत्रों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं स्वास्थ्य अनुसंधान नियमों के कनाडाई संस्थानों द्वारा निवास और मॉंट्रियल पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. चूहे ब्रेन स्लाइस की तैयारी

  1. 1 एल एक सुक्रोज-आधारित समाधान (तालिका 1) और मानक कृत्रिम सेरेब्रल-स्पाइनल द्रव (aCSF) (तालिका 2) के 1 एल तैयार करें ।
  2. के बारे में 30 मिनट के लिए-८० ° c में रखने से पहले 30 मिनट के लिए ९५% ओ2 और 5% सह2 (carbogen) के मिश्रण के साथ सुक्रोज-आधारित समाधान बुलबुला, जब तक समाधान ठंडा है, लेकिन पूरी तरह से जमे हुए नहीं है । मस्तिष्क की टुकड़ा करने की क्रिया के लिए काटने बफर के रूप में इस बर्फ ठंड सुक्रोज का प्रयोग करें । इसे फ्रीजर से निकाल कर एक बार बर्फ पर रखें ।
  3. पूरे प्रयोग के माध्यम से carbogen के साथ aCSF बुलबुला । स्लाइस संग्रह के लिए इस समाधान का उपयोग करें और perfusing बफ़र के रूप में जिसमें पैच-clamping और astrocytes के biocytin-भरना किया जाएगा । जैसे ही वे काट रहे हैं के रूप में मस्तिष्क स्लाइसें जमा करने के लिए एक टुकड़ा वसूली होल्डिंग चैंबर तैयार करें ।
    नोट: टुकड़ा वसूली होल्डिंग चैंबर कस्टम किया जा सकता है और एक छोटे से अच्छी तरह से एक बड़े अच्छी तरह से है कि aCSF, जिसमें एक ट्यूब के नीचे से carbogen लाने के लिए डाला जाता है से भरा है में निलंबित तल पर एक जाल के साथ अनिवार्य रूप से होते हैं ।
  4. 15-से 21 दिन पुराने Sprague-Dawley चूहों बिना किसी सेक्स-या तनाव-विशिष्ट पूर्वाग्रह का उपयोग करें । isoflurane के साथ पशु Anesthetize (एक संज्ञाहरण प्रेरण चैंबर में isoflurane के 1 मिलीलीटर) । धीरे हिंद पंजा या जानवर की पूंछ चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें ।
  5. एक गिलोटिन का इस्तेमाल करते हुए चूहे Decapitate, अपनी खोपड़ी को कैंची से काट लें, और जल्दी से ब्रेन को एक समतल रंग के साथ cranium से निकाल दें ।
  6. बर्फ के बारे में 30 एस के लिए ठंडा सुक्रोज-आधारित समाधान में डुबकी और यह (समाधान के साथ) एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण । एक उस्तरा ब्लेड के साथ, भागों है कि पूर्वकाल और क्षेत्र को पीछे कर रहे है अनुभागित, अगर अनुप्रस्थ विमान में स्लाइस काटने हटा दें ।
  7. गोंद अपने rostral पक्ष पर मस्तिष्क ऊतक के शेष ब्लॉक और एक vibratome का उपयोग सुक्रोज आधारित माध्यम में मस्तिष्क स्लाइस (३५० µm मोटी) में कटौती करने के लिए आगे बढ़ना । फिर, एक वसूली होल्डिंग कक्ष तापमान (आरटी) में carbogenated aCSF से भरा चैंबर में एकत्र स्लाइस हस्तांतरण जब तक वे करने के लिए तैयार है (वसूली के लिए कम से कम 1 घंटे की अनुमति) ।
    नोट: क्षेत्र में हाल ही में घटनाओं की अनुमति लंबे समय तक की मशीन में मस्तिष्क स्लाइसें के 24 ज इन विट्रो स्थितियों में 17.

2. Sulforhodamine १०१ (SR-१०१) Astrocytes के लेबल

  1. पूर्व ३४ डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी स्नान गर्मी और उस में दो स्लाइस मशीन कक्षों जगह है । 1 माइक्रोन SR-१०१ युक्त aCSF का एक समाधान के साथ स्लाइस मशीन कक्षों में से एक भरें, और aCSF के साथ ही दूसरे को भरें ।
  2. 20 मिनट के लिए 1 µ एम SR-१०१ युक्त मशीन कक्ष में स्लाइसें और फिर उंहें दूसरी मशीन चैंबर में स्थानांतरण के लिए बाहर अतिरिक्त SR-ऊतक से १०१ कुल्ला । यह ३४ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट या अधिक के लिए गर्मी, तो आरटी पर स्लाइस युक्त जब तक वे18की जरूरत है गर्मी चैंबर रखने के लिए ।

3. Astrocyte पैचिंग और Biocytin भरना

  1. एक स्लाइस का चयन करें और यह माइक्रोस्कोप की रिकॉर्डिंग चैंबर में जगह है । astrocytes पैच करने के लिए, 4-6MΩ का एक प्रतिरोध के साथ इलेक्ट्रोड का उपयोग करें जब पोटेशियम-gluconate-आधारित समाधान के साथ भरा ( तालिका 3देखें).
  2. दृश्य मार्गदर्शन के अंतर्गत और एक micromanipulator का उपयोग करते हुए, चित्र 1में दिखाए गए के रूप में एक SR-१०१-लेबल्ड astrocyte की ओर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड प्रत्यक्ष । स्लाइस की सतह पर स्थित कोशिकाओं से बचें क्योंकि वे अधिक क्षतिग्रस्त होने की संभावना है या पड़ोसी कोशिकाओं के लिए कनेक्शन खो दिया है ।
  3. ऊतक में biocytin के रिसाव को रोकने के लिए, पैच पिपेट करने के लिए जोड़ा सकारात्मक दबाव को कम करने और इसे लागू केवल जब यह astrocyte कि समझौता किया जाएगा (0.1-0.4 मिलीलीटर 1 मिलीलीटर की एक सिरिंज में) के करीब है ।
  4. पैच करने से पहले, पिपेट और उसकी समाई की ऑफसेट समायोजित करें । तरल जंक्शन क्षमता के लिए सही है, के रूप में सटीक और सटीक वोल्टेज आज्ञाओं19प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
  5. सकारात्मक दबाव की वजह से अवसाद का निरीक्षण करने के लिए astrocyte के पास पिपेट को काफी करीब ले जाएं । फिर, सकारात्मक दबाव को दूर करने और धीरे से कुछ नकारात्मक दबाव लागू होते हैं । astrocyte को दबाना-७० एमवी जब सील १०० MΩ तक पहुंचता है । रुको जब तक सील 1-3 GΩ तक पहुंचता है । सेल में तोड़ने तक नकारात्मक दबाव लागू करने के लिए जारी रखें । नकारात्मक दबाव लागू करते समय सावधान रहें, क्योंकि astrocytes बहुत नाजुक हैं ।
  6. patched कक्ष के electrophysiological गुणों का आकलन करें । वोल्टेज दबाना मोड में, एक पूरे सेल वर्तमान-वोल्टेज प्रोटोकॉल ६०० एमएस की अवधि के एक रैंप वोल्टेज कमान के साथ-१२० करने के लिए + ११० एमवी से लेकर प्रदर्शन । वर्तमान क्लैंप मोड में, एक चरण चतुर्थ प्रोटोकॉल जिसमें से १०० pA के १००० ms वर्तमान चरणों का इंजेक्शन 1 करने के लिए 1 ना, पूरे सेल रिकॉर्डिंग की नमूना दर 10 kHz है ।
    नोट: Astrocytes सुधार के किसी भी प्रकार के बिना एक रैखिक वर्तमान वोल्टेज प्रोफ़ाइल दिखाने के लिए (के रूप में चित्र 1bमें दिखाया गया है) और कोई कार्रवाई नहीं झिल्ली ध्रुवीकरण (चित्रा 1C) पर गोलीबारी संभावित । आराम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) स्थिर और सकारात्मक नहीं होना चाहिए-60mV । कुछ ब्रेन एरियाज में astrocytes के आरएमपी की तुलना में ज्यादा hyperpolarized की NVsnpr है ।
  7. biocytin 30 मिनट के लिए astrocyte के भीतर फैलाना है जबकि एक चरण IV प्रोटोकॉल हर 5 मिनट प्रदर्शन की अनुमति दें ।
  8. वापस लेना और पैच astrocyte को नुकसान पहुंचाए बिना पिपेट ध्यान से अलग और तुरंत रिकॉर्डिंग चैंबर से बाहर ले जाने से पहले पिपेट की ऑफसेट का ध्यान रखना । उस मान को झिल्ली संभावित रिकॉर्डिंग से घटाना ।
  9. मस्तिष्क टुकड़ा छोड़ 15 मिनट की एक ंयूनतम के लिए रिकॉर्डिंग चैंबर में आराम करने के लिए (इंजेक्शन के लिए 30 मिनट के अलावा) के लिए समझौता astrocyte से अनुरेखक के प्रसार की अनुमति युग्मित कोशिकाओं के पूरे नेटवर्क के लिए ।
    नोट: युग्मित कोशिकाओं के एक नेटवर्क को उजागर करने के लिए, केवल एक ही सेल ब्याज के नाभिक में समझौता किया जाना चाहिए । एक सफल पैच प्राप्त करने के लिए कई प्रयास की आवश्यकता है, तो मामले को त्यागें और contralateral पक्ष पर या एक और मस्तिष्क टुकड़ा में पैच करने के लिए प्रयास करें ।
  10. एक निशान या ऊतक में चीरा की पहचान करने के लिए जो टुकड़ा के ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है, और एक पेट्री सामांय aCSF युक्त पकवान के लिए पहले टुकड़ा हस्तांतरण, तो 4% paraformaldehyde (पीएफए) के समाधान में । 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में टुकड़ा मशीन ।
    सावधानी: पीएफए बेहद नुकसानदेह है । एक हवादार हुड में सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग करें । सुनिश्चित करें कि सभी सामग्री (ब्रश, ट्यूबों, आदि) है कि पीएफए के साथ संपर्क में रहे है वसूली होल्डिंग चैंबर, मशीन कक्ष, या अंय ताजा ऊतक रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल सामग्री से संपर्क नहीं करते ।

4. Biocytin रहस्योद्घाटन

  1. फ्लोरोसेंट streptavidine के साथ रहस्योद्घाटन
    1. RT पर ०.१ मीटर फास्फेट बफर खारा (पंजाब) में मस्तिष्क स्लाइसें 2 x 10 मिनट धो लें । फिर, streptavidine संयुग्मित के साथ एक fluorophore के लिए 4% गैर-ईओण डिटर्जेंट 4 के लिए आर टी पर में 1/200 कमजोर पड़ने के साथ मस्तिष्क स्लाइसें biocytin से पता चलता है ।
    2. धो मस्तिष्क ०.१ एम पंजाब में 3 x 10 मिनट में आरटी और कांच स्लाइड पर वर्गों माउंट एक जलीय बढ़ते मध्यम का उपयोग कर । ऊपर की ओर इंजेक्ट किए गए पक्षों को रखें, स्लाइड्स coverslip, और नेल-वार्निश के साथ उंहें सील करें ।
  2. ढाब के साथ रहस्योद्घाटन
    नोट: ढाब (3, 3-diaminobenzidine) रहस्योद्घाटन इस्तेमाल किया जा सकता है जब प्रतिदीप्ति इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । इस मामले में, केवल एक रहस्योद्घाटन विधि तुलना बनाने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए ।
    1. आर टी पर पंजाब में मस्तिष्क स्लाइसें 3 x 10 मिनट धो लो. पंजाब में स्लाइसें + एच2ओ 2 ०.५% आरटी में 1 घंटे के लिए मशीन ।
    2. आरटी में पंजाब में स्लाइस 3 x 10 मिनट कुल्ला फिर, एक avidin में स्लाइसें-बायोटिन जटिल दाग पंजाबियों से बना समाधान और ०.१% गैर ईओण डिटर्जेंट + avidin-बायोटिन जटिल peroxidase मानक धुंधला किट आरटी में 24 घंटे के लिए 1/100
    3. आरटी में पंजाब में स्लाइस 3 x 10 मिनट कुल्ला, उंहें पंजाबियों के समाधान में मशीन + ढाब 20 मिनट के लिए आरटी में ०.०५%, और उंहें पंजाब के समाधान में स्थानांतरण + ढाब ०.०५% + एच2ओ2 ०.५% ।
      सावधानी: ढाब बेहद नुकसानदेह है । एक हवादार हुड में सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग करें । जब स्लाइसेस को पंजाब में स्थानांतरित किया जाता है तो रंग की प्रतिक्रिया रोकी जाती है ।
    4. RT पर पंजाब में स्लाइस 5 x 10 मिनट कुल्ला, ग्लास स्लाइड पर वर्गों माउंट (पक्ष है कि ऊपर की ओर इंजेक्ट किया गया चेहरा) और उंहें एक स्लाइड सुखाने पर सूखी ३४ ° c पर रात भर देते हैं ।
    5. ७०%, ९५%, और १००% पर कई शराब स्नान में 1 मिनट के लिए ग्लास स्लाइड जलमग्न, और 1 मिनट के लिए xylene के एक स्नान के साथ अंत ।
    6. एक टोल्यूनि आधारित सिंथेटिक राल बढ़ते माध्यम का उपयोग कर कांच स्लाइड माउंट । स्लाइड पर coverslips प्लेस और नाखून वार्निश के साथ उंहें सील ।

5. नेटवर्क इमेजिंग

  1. astrocytic एक स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप 20X और 4x उद्देश्यों के साथ सुसज्जित का उपयोग कर (या एक उपयुक्त उद्देश्य पूरे नाभिक कल्पना जहां नेटवर्क स्थित है) और एक लेजर fluorophore का पता लगाने के लिए (इस मामले में, Alexa-५९४ है कल्पना प्रयुक्त) ।
  2. लेबल किए गए कक्षों के नेटवर्क का z-स्टैक बनाने के लिए 20X आवर्धन का उपयोग करें । ८०० x ८०० पिक्सेल और १२.५ μs/पिक्सेल की स्कैन गति का एक समाधान का उपयोग करें ।
    नोट: आदेश में पूरे नेटवर्क छवि के लिए, कई ढेर आम तौर पर आवश्यक हैं, और ढेर की संख्या प्रत्येक नेटवर्क के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है । संकल्प और स्कैन गति बदला जा सकता है, लेकिन सभी डेटा छवि के लिए एक ही सेटिंग का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें.
  3. नेटवर्क और रुचि के क्षेत्र की छवियां लेने के लिए 4x आवर्धन का उपयोग करें ।
    नोट: 4x इमेजिंग के लिए ब्याज के नाभिक के भीतर नेटवर्क स्थिति निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हमेशा एक ही क्षेत्र में संचारित प्रकाश छवि । इस छवि यदि आप फोकल फ्लोरोसेंट छवि में नाभिक की सीमा निर्धारित नहीं कर सकते उपयोगी हो जाएगा ।

6. छवि विश्लेषण

  1. डेटा तैयारी
    1. सॉफ्टवेयर ImageJFIJI (https://fiji.sc/पर इसे डाउनलोड) का प्रयोग करें । फ़ाइल खोलें और "जैव-स्वरूप आयात विकल्प" विंडो में ठीक क्लिक करें ।
    2. एक z-स्टैक है कि केवल ऑप्टिकल अंतिम z-स्टैक (चित्रा 2a) के लिए आवश्यक स्लाइस शामिल होंगे फिर से परिभाषित करने के लिए, टूलबार में "स्टैक" घुंडी पर क्लिक करें (खोजने के लिए, पहले stk का चयन करें । जेड परियोजना) । प्रोजेक्शन प्रकार सेटिंग (चित्र 2a) में "अधिकतम तीव्रता" का चयन करें । फ़ाइल सहेजें और इसे "स्टैक फ़ाइल" नाम है ।
    3. यदि इमेजिंग फ़ाइल में कई चैनल हैं, यह astrocytic नेटवर्क इमेजिंग के साथ केवल चैनल संरक्षण के लिए विभाजित (छवि । रंग | चैनल विभाजित करें) ।
    4. छवि की पिक्सेल सेटिंग्स की जांच करें [छवि । गुण | पिक्सेल (पिक्सेल आयाम के लिए "1" के साथ)].
    5. का प्रयोग करें पृष्ठभूमि उपकरण घटाना (प्रक्रिया । पृष्ठभूमि घटाना) biocytin ्र की पृष्ठभूमि को दूर करने के लिए । रोलिंग गेंद त्रिज्या, जो आम तौर पर ५० पिक्सल (चित्रा बी) पर सेट है सेट करने के लिए पूर्वावलोकन समारोह का प्रयोग करें ।
    6. outliers निकालें उपकरण का उपयोग करें (प्रक्रिया | रव | Outliers निकालें) यदि यह घटाना पृष्ठभूमि चरण के बाद आवश्यक है । "जो Outliers" सेटिंग (चित्र 2c) में "उज्ज्वल" का चयन करें । त्रिज्या और थ्रेशोल्ड सेट करने के लिए पूर्वावलोकन फ़ंक्शन का उपयोग करें. इस उपकरण से सावधान रहें, क्योंकि यह आंकड़ा 2dमें दिखाए गए डेटा को धुंधला कर सकता है ।
      नोट: यह उपकरण streptavidine के विशिष्ट जमाव की वजह से छोटे धब्बे को हटा देता है (जैसा कि चित्र 2 बी और 2c में पहले और बाद में उपचार, क्रमशः सफेद तीरों द्वारा दिखाया गया है) ।
    7. सीमा समायोजित करें (छवि । समायोजित करें । थ्रेशोल्ड) । "डिफ़ॉल्ट" और "B & W" मोड (आरेख 2E) का चयन करें । "Apply" पर क्लिक करें ।
      नोट: ऑटो एडजस्ट किया जा सकता है, लेकिन दो स्लाइडर सलाखों के साथ मैनुअल समायोजन पसंद है. इस कदम का उद्देश्य किसी भी लेबल कोशिकाओं को खोने के बिना अधिकतम करने के लिए शोर को कम करने के लिए है ।
    8. बाइनरी प्रक्रिया उपकरण के साथ एक द्विआधारी छवि में छवि कंवर्ट (प्रक्रिया । बाइनरी | बाइनरी बनाएं) जैसा चित्र 2Fमें दिखाया गया है । फ़ाइल एक TIFF फ़ाइल के रूप में सहेजें और इसे "बायनेरी फ़ाइल" नाम है ।
  2. सेल मतगणना
    1. माप की सेटिंग की जांच करें समारोह (विश्लेषण । माप सेट करें) । "केन्द्रक" विकल्प का चयन करें ।
    2. का प्रयोग करें "विश्लेषण कण" उपकरण पर "बाइनरी फ़ाइल" (आंकड़ा 3ए) पिछले चरण में उत्पादित (विश्लेषण | कण का विश्लेषण) (बाईं ओरचित्रा 3 सी) । "शो" सेटिंग (चित्र 3सी) में "रूपरेखाएं" चुनें । यह एक नई फ़ाइल उत्पंन करता है जो पता लगाने (चित्र बी) का परिणाम दिखाती है ।
    3. मापदंडों के साथ खेलो: आकार (केवल कक्षों का पता लगाने के लिए, 30 और ६००० के बीच मानों का उपयोग करें) और प्रचलन (0 से 1 के बीच के अंतराल को निर्धारित करने के लिए, जिसमें "1" एक पूर्ण वृत्त को परिभाषित करता है और "0" एक यादृच्छिक आकृति) पता लगाना (आरेख 3सी, बाएं भाग) को परिष्कृत करना "ठीक" पर क्लिक करके पता लगाने चलाएं ।
      नोट: दो तालिकाओं का पता लगाने के बाद दिखाई देगा: 1) एक तालिका जिसका शीर्षक "सारांश" है जो पता लगाए गए कक्षों की संख्या, और 2) एक तालिका जिसका शीर्षक "परिणाम" (चित्रा 3सी, दायां भाग) है जो प्रत्येक कक्ष के x-और y-निर्देशांक प्रदान करता है ।
    4. मानों की प्रतिलिपि बनाएं और उंहें किसी स्प्रेडशीट अनुप्रयोग में चिपकाएं । "खोज तालिका" नाम के अंतर्गत इस तालिका सहेजें । पता लगाए गए कक्षों की एक साजिश के साथ एक फ़ाइल भी दिखाई देगा (चित्र बी) । "खोज फ़ाइल" नाम के अंतर्गत एक TIFF फ़ाइल के रूप में इस फ़ाइल को सहेजें ।
    5. यदि नेटवर्क में 2 या अधिक लेबल वाले कक्षों का समूह विश्लेषण कणों उपकरण के साथ एक एकल कक्ष के रूप में पाया जाता है क्योंकि वे भी एक दूसरे के करीब हैं, वाटरशेड उपकरण का उपयोग करें (प्रक्रिया | बाइनरी | वाटरशेड) विश्लेषण कणों उपकरण लागू करने से पहले बाइनरी छवि पर , और विश्लेषण कणों कदम फिर से करें ।
      नोट: वाटरशेड उपकरण बेहद करीबी कोशिकाओं के बीच 1 पिक्सेल चौड़ा का सीमांकन बनाता है । लेबलिंग स्पष्ट है और मैन्युअल रूप से आयोजित किया जा सकता है जब एक सेल काउंटर प्लग में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. मापने astrocytic नेटवर्क क्षेत्र
    1. नेटवर्क की सतह क्षेत्र को मापने के लिए, छवि J का उपयोग करके खोज फ़ाइल का उपयोग करें ।
    2. बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करें (यह चयन करने के लिए उपकरण पट्टी में बटन पर छोड़ दिया क्लिक करें) एक बहुभुज है कि नेटवर्क की बाहरी परिधि में स्थित सभी कोशिकाओं को जोड़ता है ट्रेस करने के लिए (चित्र 4a) । बाएं क्लिक करें बहुभुज अनुरेखण शुरू करने के लिए, और सही इसे बंद करने के लिए क्लिक करें ।
      नोट: इस बहुभुज को ब्याज के क्षेत्र (ROI) के रूप में परिभाषित किया जाएगा और इसकी सतह को नेटवर्क की सतह क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए मापा जाएगा.
    3. माप सेट विंडो खोलें (विश्लेषण | माप सेट) और "क्षेत्र" विकल्प का चयन करें । रॉय प्रबंधक खोलो (विश्लेषण । उपकरण । रॉय प्रबंधक) (चित्रा 4B) । फिर, ' ' add ' ' (आरेख 4B) क्लिक करके roi प्रबंधक में traced बहुभुज जोड़ें और roi प्रबंधक में ' ' माप ' ' पर क्लिक करके माप चलाएँ.
      नोट: क्षेत्र का मापन किसी तालिका में दिखाई देगा और पिक्सेल में व्यक्त किया जाएगा. माइक्रोन2में एक मूल्य प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के लिए रूपांतरण कारक के साथ इस मूल्य को बदलने के लिए मत भूलना ।
  4. मुख्य दिशा सदिश का निर्धारण
    1. समझौता कक्ष का निर्धारण
      1. स्टैक फ़ाइल को ImageJFIJI में खोलें और अपनी सशक्त लेबलिंग तीव्रता (चित्र 4c) के आधार पर स्टैक फ़ाइल में patched कक्ष की पहचान करें । फिर, किसी स्प्रेडशीट अनुप्रयोग में "डिटेक्शन टेबल" नामक फ़ाइल खोलें और patched कक्ष और उसके संगत निर्देशांकों से संबद्ध संख्या ढूँढें.
      2. सही ढंग से समझौता सेल निर्धारित करने में असमर्थ है, जहां biocytin के जमा ImageJFIJI में बहुभुज उपकरण का उपयोग कर, युग्मित कोशिकाओं के imaged नेटवर्क में सघन है क्षेत्र के चारों ओर, और समझौता सेल (चित्रा 4d) के रूप में इस स्थिति को देखें ।
      3. रॉय प्रबंधक का प्रयोग करें (विश्लेषण । उपकरण । रॉय प्रबंधक) । फिर, समझौता सेल स्थान पर एक रॉय आकर्षित और यह रॉय प्रबंधक को जोड़ने के लिए ( चित्रा 4Bदेखें) ।
      4. एक माप सेट करें (विश्लेषण | माप सेट) और "केन्द्रक" विकल्प का चयन करें ।
      5. रॉय प्रबंधक में, traced क्षेत्र के केन्द्रक के निर्देशांक प्राप्त करने के लिए "माप" पर क्लिक करें । इन निर्देशांकों का उपयोग इस विशिष्ट नेटवर्क के लिए संदर्भ बिंदु के रूप में करें.
    2. अधिमानी अनुवाद
      1. निंन सूत्र का उपयोग करके patched astrocyte के संदर्भ में प्रत्येक कक्ष के निर्देशांक परिकलित करें:
        Equation 1 
        के साथ Equation 2 : किसी दिए गए कक्ष के लिए निर्देशांक के रूप में; Equation 3 के रूप में समझौता प्रकोष्ठ के निर्देशांक (या नेटवर्क के संदर्भ बिंदु); और Equation 4 नए संदर्भ में किसी दिए गए कक्ष के लिए निर्देशांक के रूप में ।
        नोट: समझौता astrocyte के संदर्भ में प्रत्येक कोशिका के निर्देशांक व्यक्त करने के लिए समझौता astrocyte से वैक्टर की गणना में एक महत्वपूर्ण कदम है. ImageJFIJI का उपयोग करते समय सावधान रहें कि किसी भी छवि के लिए संदर्भित छवि के शीर्ष बाएँ कोने में स्थित है ।
    3. अधिमानी अभिविंयास के मुख्य सदिश का निर्धारण
      1. निम्न सूत्र के साथ अधिमानी अभिविन्यास के मुख्य वेक्टर के निर्देशांक की गणना:
        Equation 5
        के साथ:Equation 6() अधिमानता अभिविंयास के मुख्य सदिश के निर्देशांक के रूप में; और Equation 7 के रूप में संदर्भ के रूप में समझौता सेल के साथ प्राप्त नेटवर्क के प्रत्येक कोशिका के निर्देशांक ।
        नोट: नेटवर्क में प्रत्येक कक्ष के लिए, एक वेक्टर patched astrocyte के निर्देशांक के सापेक्ष निर्धारित होता है । नेटवर्क के अधिमानी अभिविंयास के मुख्य सदिश इन सभी वैक्टर का योग है ।
      2. मुख्य सदिश की लंबाई विभाजित (ऊपर के फार्मूले का उपयोग करने से प्राप्त निर्देशांक द्वारा प्रदान की) नेटवर्क में एक शूंय से कोशिकाओं की संख्या से (के बाद से समझौता कक्ष के निर्देशांक शामिल नहीं हैं), मूल्यों को सामान्य करने के लिए और के बीच तुलना सक्षम नेटवर्क. इस विश्लेषण का एक योजनाबद्ध दृश्य चित्रा 5में प्रस्तुत किया गया है ।
  5. ब्याज के नाभिक में विश्लेषित नेटवर्क की नियुक्ति
    1. 20X और 4x छवियों का संरेखण
      1. ब्याज (NVsnpr) के नाभिक में प्रत्येक नेटवर्क की स्थिति का निर्धारण करने के लिए, 4x छवि का उपयोग करें । एक वेक्टर छवि संपादक के साथ 4x छवि खोलें ।
      2. 4x छवि का चयन करें और 5 से गुणा करके इसके आकार को संशोधित । आयाम विंडो शीर्ष क्षैतिज उपकरण पट्टी के दाएँ भाग में स्थित है । उदाहरण के लिए, ८०० x ८०० पिक्सेल पर नमूना लिया गया है एक 4x छवि के लिए, नमूना रिज़ॉल्यूशन ४००० x ४००० पिक्सेल करने के लिए परिवर्तित करें (कार्य इकाई में पिक्सेल सेट करने के लिए, पर जाएँ "दस्तावेज़ सेटअप" के अंतर्गत फ़ाइल टैब: फ़ाइल | दस्तावेज़ सेटअप) । फ़ाइल को TIFF स्वरूप में निर्यात करें और इसे "मट 4x" नाम दें ।
      3. Adobe illustrator दस्तावेज़ के निचले-बाएँ कोने के साथ छवि के ऊपरी-बाएँ कोने में संरेखित करें ।
        नोट: सॉफ्टवेयर एक नीचे बाएं कोने संदर्भित बिंदु से निर्देशांक प्रदान करता है.
      4. नेटवर्क की 20X छवि खोलें । ' ' बायनेरी फ़ाइल ' ' या ' ' खोज फ़ाइल ' ' का उपयोग करें क्योंकि वे संरेखित करने के लिए आसान हैं । फिर, 20X छवि के ' ' द्विआधारी फ़ाइल ' ' पर अस्पष्टता उपकरण के साथ खेलने के लिए यह फिर से आकार 4x छवि के साथ संरेखित करें ।
        नोट: अस्पष्टता उपकरण शीर्ष क्षैतिज उपकरण पट्टी में है ।
      5. जब संरेखण किया जाता है, का चयन करें और पिपेट उपकरण को दबाए रखें ताकि माप उपकरण प्रकट होता है, और इसे बाएँ उपकरण पट्टी में का चयन करें ।
      6. 20X छवि के ऊपर-बाएं कोने पर क्लिक करने के लिए माप उपकरण का प्रयोग करें 20X संदर्भ बिंदु के निर्देशांक प्राप्त करने के लिए आकार दिया 4x छवि पर.
        नोट: ये निर्देशांक, जो 20X संदर्भित ( चित्रा 5में 20XR) के रूप में संदर्भित कर रहे हैं, नाभिक के एक योजनाबद्ध ड्राइंग पर प्रत्येक नेटवर्क की स्थिति को व्यक्त करने के लिए उपयोगी हो जाएगा.
    2. ब्याज के नाभिक का सामान्यीकरण
      नोट: डेटा योग करने के लिए, नाभिक (NVsnpr) के एक आयत के रूप में एक सामान्य उपयोग किया जाता है । चरण नीचे बताए गए हैं ।
      1. ImageJFIJI में 4x आकार का फ़ाइल खोलें, और नाभिक (NVsnpr) को घेर करने के लिए बहुभुज उपकरण का उपयोग करें । नाभिक की सीमाओं को देखा जा करने में सक्षम नहीं हैं, तो संचारित प्रकाश के साथ छवि का उपयोग करें; जो मामले में, यह पहले आकार बदलने के लिए याद है ।
      2. रॉय प्रबंधक खोलें और खींचा रॉय जोड़ें । "माप सेट" में, ' ' बाउंड आयत ' ' विकल्प का चयन करें ।
        नोट: "बाउंड आयत" विकल्प आरेखित नाभिक के आस-पास के छोटे आयत का परिकलन करता है ।
      3. "माप" पर क्लिक करें ।
        नोट: एक तालिका BX और उसके द्वारा, आयत के ऊपरी बाएं कोने के निर्देशांक: ' ' आयत स्थिति ' ' के साथ प्रकट होती है और चौड़ाई और ऊंचाई प्रदान करती है । BX और द्वारा समयबद्ध आयत संदर्भित है जो और Equation 8 Equation 9 के रूप में संदर्भित कर रहे है के निर्देशांक हैं ।
    3. सामान्यीकृत नाभिक में प्रत्येक नेटवर्क स्थिति की अभिव्यक्ति
      1. निंन सूत्र का उपयोग करके प्रत्येक कक्ष के निर्देशांकों को 4x वरीयता ( चित्रा 5में काला वर्ग) के साथ व्यक्त करें:
        Equation 10
        कहां: Equation 11 4x संदर्भित के साथ सेल निर्देशांक हैं; Equation 12 20X संदर्भित ( चित्र 5में नारंगी वर्ग) के साथ कक्ष निर्देशांक हैं; और Equation 13 4x छवि (20XR) में 20X संदर्भ बिंदु के निर्देशांक हैं ।
      2. निंन सूत्र का उपयोग करते हुए कक्ष निर्देशांकों को बाउंड आयत संदर्भित ( चित्र 5में नीला) में व्यक्त करें:
        Equation 14
        कहां: Equation 15 बाउंडिंग आयत संदर्भित में कक्ष निर्देशांक हैं; Equation 16 4x संदर्भ में सेल निर्देशांक हैं; और Equation 17 4x छवि में समयबद्ध आयत संदर्भित के निर्देशांक हैं ।
      3. कक्ष निर्देशांकों को बाउंडिंग आयत में रूपांतरित करें, निम्न सूत्र का उपयोग करके बाउंड आयत की चौड़ाई और ऊँचाई के प्रतिशत को संदर्भित करता है:
        Equation 18
        कहां: Equation 19 चौड़ाई और बाउंड आयत की ऊंचाई के प्रतिशत में कक्ष निर्देशांक हैं; Equation 20 बाउंड आयत संदर्भ में कक्ष निर्देशांक हैं; Equation 21 प्रोटोकॉल में ऊपर मापा बाउंड आयत की चौड़ाई है; और Equation 22 सीमा प्रोटोकॉल में ऊपर मापा आयत की ऊंचाई है ।
      4. एक ही आंकड़ा पर सभी नेटवर्क का प्रतिनिधित्व करने के लिए, खाते में टुकड़ा के उंमुखीकरण ले (बाएं या दाएं पक्ष) । डेटा का मानकीकरण करने के लिए, संदर्भित स्लाइस के बाईं ओर पर लागू किया जाता है । केवल x-निर्देशांकों के लिए निम्न सूत्र को लागू करने से बाईं ओर दाईं ओर के नेटवर्क निर्देशांक स्थानांतरित करें:
        Equation 23
        कहां: Equation 24 टुकड़ा के दाईं ओर x-समंवय है; और Equation 25  नए एक्स-टुकड़ा के बाईं ओर संदर्भ में व्यक्त समंवय है ।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, विश्लेषण से पहले ImageJFIJI में चित्र दर्पण (छवि । परिणत | क्षैतिज फ्लिप) ।
      5. अधिमानी अभिविंयास के मुख्य सदिश के निर्देशांक व्यक्त करने के लिए, सेल निर्देशांक (steps 6.5.3.1 to 6.5.3.4) के साथ समान चरणों का पालन करें ।
        नोट: निर्देशांकों की अभिव्यक्ति प्रतिशत में एक एकल प्लॉट जिसमें नाभिक (NVsnpr) एक आयत के रूप में डिज़ाइन किया गया है के रूप में डेटा का एक संकलन की अनुमति देता है ।
  6. अधिमानी दिशा के मुख्य वेक्टर के कोणीय अंतर का अध्ययन
    नोट: एक astrocytic नेटवर्क के कोणीय अंतर यह निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि क्या इसके तरजीही अभिविंयास ब्याज के नाभिक के केंद्र की ओर है । कोणीय अंतर ( चित्रा 5में α) की गणना करने के लिए, जो नेटवर्क के अधिमान दिशा के मुख्य सदिश के बीच कोण है (पीडी, चित्रा 5में लाल रेखा) और सी के लिए पी जोड़ने लाइन, त्रिकोण में अल-काशी प्रमेय लागू करें PDC (देखें चित्रा 5 और अनुपूरक तरीकोंका इनसेट) ।
    1. सबसे पहले, विभिंन लंबाई एक काटीज़ियनवादी संदर्भ में निंनलिखित समीकरण का उपयोग कर Pythagorean प्रमेय के आवेदन का उपयोग कर की गणना:
      Equation 26
      कहां: P और C के निर्देशांक हैं Equation 27 और Equation 28 , क्रमशः, बाउंड आयत संदर्भ में (ऊपर परिकलित).
    2. रेडियंस में कोणीय अंतर निम्न सूत्र का उपयोग कर निर्धारित करें:
      Equation 29
    3. डिग्री में कोणीय अंतर परिवर्तित (उदाहरण के लिए, एक्सेल सॉफ्टवेयर में डिग्री समारोह के साथ) ।
    4. ऊर्ध्वाधर बार चार्ट में उंहें प्लॉटिंग द्वारा सभी कोणीय मतभेदों को संकलित (आंकड़ा 7C और 7d) और निर्धारित अगर वहां astrocytic नेटवर्क के एक तरजीही उंमुखीकरण है ।

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Representative Results

मस्तिष्क में कोशिकाओं के बीच युग्मन स्थिर नहीं बल्कि गतिशील कई कारकों द्वारा विनियमित है । वर्णित तरीकों को astrocytic नेटवर्क का विश्लेषण विभिंन परिस्थितियों में पता चला और NVsnpr में उनके संगठन को समझने के लिए विकसित किया गया । ये परिणाम पहले से ही1प्रकाशित किया गया है । हम तीन विभिंन स्थितियों में NVsnpr के पृष्ठीय भाग में एकल astrocytes के भरने biocytin प्रदर्शन: आराम में (किसी भी उत्तेजना के अभाव में नियंत्रण की स्थिति में), Ca2 +-मुक्त शर्तों में, और विद्युत उत्तेजना के बाद संवेदी फाइबर कि नाभिक के लिए परियोजना । प्रत्येक शर्त के लिए astrocytes के biocytin भरने के लिए प्रयोगात्मक सेटिंग्स चित्रा 6A-सीके बाईं ओर में सचित्र हैं ।

biocytin के नेटवर्क-लेबल कोशिकाओं नियंत्रण की स्थिति में मनाया और आराम में NVsnpr astrocytes के बीच सेल युग्मन के एक बेसल राज्य की पुष्टि की गई । 11 मामलों का परीक्षण किया, biocytin प्रसार में 11 ± 3 कोशिकाओं से बना नेटवर्क दिखाया ( चित्रा 6Aमें मध्य पैनल, चित्रा 6D) ३४७३७ ± १३२५४ µm2 (चित्रा 6E) के एक क्षेत्र पर विस्तार । Carbenoxolone (CBX, 20 माइक्रोन), गैप जंक्शनों के एक गैर विशिष्ट अवरोधक, प्रयोगों के एक स्वतंत्र सेट में प्रयोग किया जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए कि मनाया लेबल गैप जंक्शनों के माध्यम से biocytin प्रसार का एक परिणाम था और नहीं biocytin की कोशिकाओं द्वारा, जो रिसाव सकता पैच करने से पहले पिपेट पैच करने के लिए लागू किया गया सकारात्मक दबाव से extracellular अंतरिक्ष में । CBX के स्नान आवेदन 2 ± ०.५ कोशिकाओं को लेबल कोशिकाओं की संख्या कम ( चित्रा 6A, चित्रा 6Dमें दाहिने पैनल; ईमान-विधि, पी = ०.०१६; होल्म-Sidak परीक्षण, पी = ०.०१०) और biocytin के क्षेत्र में फैले २२९७ ± १७२६ µm2 (चित्रा 6E; ईमान-विधि, पी = ०.०००९; होल्म-Sidak test, P = ०.०२५).

NVsnpr astrocytic नेटवर्क पर मध्यम से कैल्शियम हटाने के प्रभाव का परीक्षण किया गया था क्योंकि कम extracellular कैल्शियम एकाग्रता connexins और गैप जंक्शनों20,21,22खोलने के लिए जाना जाता है, और यह इस्तेमाल किया जा सकता एक बड़े पैमाने पर और वर्दी उत्तेजना के रूप में syncytium खोलने के लिए और गैप जंक्शनों के माध्यम से अनुरेखक प्रसार को अधिकतम । astrocytic नेटवर्क है कि Ca 2 में पता चला रहे थे+-मुक्त शर्तों (n = 10) कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या से पता चला नेटवर्क नियंत्रण की स्थिति में पता चला, ३७ ± 10 लेबल कोशिकाओं ( चित्रा 6C, चित्रा 6Dमें मध्य पैनल के साथ; ईमान-विधि, पी = ०.०१६; होल्म-Sidak परीक्षण, P < ०.००१) १०८१२३ ± २७४५० माइक्रोन2 ( चित्रा 6C, चित्रा 6Eमें मध्य पैनल के एक क्षेत्र को कवर; ईमान-विधि, पी = ०.००९; होल्म-Sidak test, P = ०.००१).

मध्यम से कैल्शियम की पूरी हटाने की तुलना में, ब्याज के नाभिक के लिए afferent आदानों की विद्युत उत्तेजना एक अधिक शारीरिक उत्तेजना है कि सीधे ब्याज की न्यूरॉन सर्किट शामिल है । नतीजतन, हेरफेर के इस प्रकार से परिणाम सार्थक astrocytic नेटवर्क के कार्यात्मक निहितार्थ के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते है मनाया । उदाहरण के लिए, दो अलग रास्ते से इनपुट एक दिए गए क्षेत्र में युग्मन कोशिकाओं के बेसल राज्य पर अलग प्रभाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, या यह नाभिक के अलग उपभागों में astrocytes के बीच युग्मन बटोरना हो सकता है । हमारे सर्किट में संवेदी तंतुओं की विद्युत उत्तेजना है कि परियोजना NVsnpr के लिए 2-०.२ ms दालों की दूसरी गाड़ियों का उपयोग 40-60 हर्ट्ज (n = 11) में NVsnpr astrocytes के बीच युग्मन की वृद्धि का उत्पादन, उत्तेजित शर्तों के सापेक्ष, 23 ± 6 कोशिकाओं के साथ (मिडिल पैनल में चित्रा घमण्ड, फिगर 6D; ईमान-विधि, पी = ०.०१६; होल्म-Sidak परीक्षण, पी = ०.०१२) ८१४१७४ ± १५२७० माइक्रोन2 के एक क्षेत्र पर बाहर फैल ( चित्रा घमण्ड, चित्रा 6Eमें मध्य पैनल; ईमान-विधि, पी = ०.००९; होल्म-Sidak test, P = ०.००४).

उत्तेजना के इन दो प्रकार के प्रभाव, मध्यम से कैल्शियम को हटाने, और afferent आदानों की विद्युत उत्तेजना, सभी CBX द्वारा बाधित कर रहे हैं । इस हालत में astrocytic नेटवर्क सीए 2 में केवल 5 ± 1 कोशिकाओं को शामिल+-मुक्त aCSF ( चित्रा 6Cमें दाहिने पैनल, चित्रा 6D; n = 4; ईमान-विधि, पी = ०.०१६; होल्म-Sidak परीक्षण, पी < ०.००१) और संवेदी तंतु उत्तेजना के साथ 9 ± 2 कोशिकाओं ( चित्रा घमण्डमें दाहिने पैनल, चित्रा 6D; n = 6; ईमान-विधि, पी = ०.०१६; होल्म-Sidak test, P = ०.०२३). नेटवर्क सतह क्षेत्रों को भी कम किया गया १७९८७ ± ९८४३ µm2 Ca के साथ2 +-मुक्त aCSF (चित्रा 6E; n = 4; ईमान-विधि, पी = ०.००९; होल्म-Sidak परीक्षण, पी = ०.००४) और ३९३७९ ± ११०१४ µm2 संवेदी तंतुओं उत्तेजना के साथ (चित्रा 6E; n = 6; ईमान-विधि, पी = ०.००९; होल्म-Sidak test, P = ०.०५५).

संरचनात्मक विश्लेषण केवल मामलों में किया गया था जहां NVsnpr सीमाओं स्पष्ट रूप से 4x इमेजिंग पर परिभाषित किया जा सकता है, जो 9 Ca के साथ प्राप्त 10 नेटवर्क से बाहर के लिए मामला था+-मुक्त aCSF और 8 से बाहर 11 विद्युत उत्तेजना के साथ प्राप्त नेटवर्क । सब एक सैद्धांतिक NVnspr पर विश्लेषण astrocytic नेटवर्क के प्लॉटिंग से पता चलता है कि अधिकांश नेटवर्क में शामिल कोशिकाओं नाभिक सीमाओं के भीतर सीमित थे (आंकड़े 7A और 7B, बाएं और मध्य पैनलों) । Ca के तहत2 +-मुक्त aCSF, 4 से बाहर 9 astrocytic नेटवर्क NVsnpr के बाहर फैले मोटर की दिशा में NVsnpr के लिए औसत दर्जे का स्थित । इन 4 मामलों में, लेबल कोशिकाओं के विशाल बहुमत नाभिक तक ही सीमित थे । संवेदी तंतुओं की विद्युत उत्तेजना के साथ प्राप्त लेबल कोशिकाओं के नेटवर्क अधिक प्रतिबंधित थे. केवल 2 नाभिक सीमाओं, जिसमें पार्श्व supratrigeminal क्षेत्र में mediodorsal सीमा पर फैले एक ( चित्रा 7B, बाएँ और मध्य पैनलों में डार्क ग्रीन नेटवर्क) पर विस्तारित नेटवर्क । दूसरे मामले में, लाल नेटवर्क में 2 astrocytes (चित्रा 7B, बाएँ और मध्य पैनलों) NVsnpr के ventral हिस्से में पार कर दिया.

astrocytic नेटवर्क तरजीही अभिविंयास के लिए वैक्टर विश्लेषण ( चित्रा 7A और 7Bमें सही पैनल) इस्तेमाल उत्तेजना पर निर्भर करता है अलग परिणाम का उत्पादन किया । वास्तव में, astrocytic नेटवर्क के लिए 2 सीए के साथ मनाया+मुक्त aCSF, तरजीही अभिविंयास के वैक्टर में से एक को छोड़कर सभी NVsnpr के केंद्र की ओर उन्मुख थे. हालांकि, astrocytic नेटवर्क के लिए विद्युत उत्तेजना के साथ मनाया, अधिमानी अभिविंयास वैक्टर ज्यादातर नाभिक की सीमाओं की ओर उंमुख थे । इस astrocytic नेटवर्क Ca2 +-मुक्त aCSF और संवेदी तंतुओं की विद्युत उत्तेजना के साथ प्राप्त उन के साथ प्राप्त के बीच तरजीही अभिविन्यास में गणना कोणीय मतभेदों से परिलक्षित होता है. Ca2 +-मुक्त aCSF के तहत, कोणीय अंतर के वितरण के ऊर्ध्वाधर बार चार्ट से पता चला है कि लेबल कोशिकाओं के नेटवर्क के अधिकांश 0 और ४० डिग्री के बीच एक कोणीय अंतर है, ३९.५ ± १२.७ डिग्री के कोणीय अंतर का मतलब के साथ ( चित्रा 7C). संवेदी फाइबर की बिजली की उत्तेजना के साथ, वितरण और अधिक समान है, और मतलब कोणीय अंतर (९९.५ ± 17 डिग्री) काफी अलग है (आंकड़ा 7d; छात्र टी परीक्षण, पी = ०.०१२) ।

इन आंकड़ों से पता चलता है कि biocytin लेबलिंग विश्लेषण हमें astrocytic युग्मन नियमन विभिंन उत्तेजनाओं के प्रभाव को अलग करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, एक सामान्यीकृत नाभिक में वैक्टर विश्लेषण के बाद astrocytic नेटवर्क का मानचित्रण आकार और इन नेटवर्क के संरचनात्मक संगठन पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: astrocyte के पूरे सेल पैच-क्लैंप । (a) NVsnpr में मार्कर sulforhodamine १०१ (SR-१०१) की लोडिंग के साथ लेबल Astrocytes । एक SR-१०१-लेबल astrocyte सोमा पैच पिपेट (सफेद डैश्ड लाइन) के साथ लक्षित है । स्केल बार = १०० माइक्रोन । (ख) एक ध्रुवीकरण रैंप प्रोटोकॉल वोल्टेज में किया जाता है-दबाना (से-१२० 110mV करने के लिए) astrocyte निष्क्रिय विशेषताओं का आकलन करने के लिए । (ग) वर्तमान-क्लैंप मोड में वर्तमान दालों के इंजेक्शन द्वारा astrocyte में कार्रवाई संभावित गोलीबारी की कमी का आकलन. यह आंकड़ा Condamine एट अल से अनुकूलित है । (२०१८) 1. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: उपचार और ImageJFIJI सॉफ्टवेयर के साथ astrocytic नेटवर्क का विश्लेषण । (A) Z-स्टैक निर्माण किसी astrocytic नेटवर्क के फोकल इमेजिंग से । ऊपर-बाएं, ImageJFIJI में Z-स्टैक विंडो । (ख) पृष्ठभूमि घटाव प्रक्रिया । ऊपर-बाईं ओर, ImageJFIJI में पृष्ठभूमि विंडो घटाना. डॉटेड वृत्त छवि पर उस क्षेत्र पर बल देता है जहां पृष्ठभूमि को घटाना आदेश के प्रभाव में छवि की तुलना में अधिक स्पष्ट है (C) outliers प्रक्रिया को निकालें । इस प्रक्रिया में एक Alexa ५९४ करने के लिए युग्मित streptavidine के विशिष्ट जमा के कारण छोटे धब्बे निकालता है । सफेद तीर जमा दिखाने से पहले (चित्रा 2बी) और बाद (चित्रा 2c) आदेश पर कार्रवाई की गई है । ऊपर-बाएं, ImageJFIJI में outliers विंडो निकालें । (घ) धुंधला प्रभाव है कि एक अपर्याप्त समायोजन के द्वारा उत्पादित किया जा सकता है का उदाहरण outliers निकालें पैरामीटर । पीले तीर कुछ धुंधला कोशिकाओं को दिखाते हैं । (ङ) थ्रेशोल्ड प्रक्रिया समायोजित करें । ऊपर-बाईं ओर, ImageJFIJI में थ्रेशोल्ड विंडो समायोजित करें । स् क्रॉल पट्टियां थ्रेशोल्ड संकेत समायोजन पर कार्य करते हैं । (च) बाइनरी स्टेप बनाओ. छवि ImageJFIJI में एक बाइनरी फ़ाइल में कनवर्ट किया जाता है । स्केल बार = १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ImageJFIJI के साथ astrocytic नेटवर्क में कोशिकाओं का पता लगाने. (a) ImageJFIJI में प्राप्त किसी astrocytic नेटवर्क की बाइनरी छवि का उदाहरण । स्केल बार = १०० माइक्रोन । (B) बायनेरी फ़ाइल पर विश्लेषण कणों की प्रक्रिया लागू करने के बाद प्राप्त "डिटेक्शन फ़ाइल" दिखाता है । आकृतियां लाल रंग में उनकी संबद्ध संख्या वाले सभी खोजे गए कक्षों के संगत होती हैं । (ग) वाम भाग: विश्लेषण ImageJFIJI में कणों खिड़की । यह फ़ंक्शन बायनेरी छवि में नेटवर्क के कक्षों का पता लगाता है । खोजे गए कक्षों का आकार और उनके प्रचलन को समायोजित किया जा सकता है । किसी संतोषजनक परिणाम प्राप्त होने तक संख्याओं का उपयोग परीक्षण-और-त्रुटि द्वारा सेट किया जाना चाहिए । दायां भाग: विश्लेषण कणों की प्रक्रिया द्वारा उत्पंन डिटेक्शन टेबल । X और Y स्तंभ छवि में पाए गए प्रत्येक कक्ष के निर्देशांक सूचीबद्ध करते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: नेटवर्क क्षेत्र विश्लेषण और ImageJFIJI में समझौता सेल का निर्धारण । (A) ImageJFIJI में बहुभुज उपकरण का उपयोग करके, किसी ROI का पता लगाया गया क्लस्टर के चारों ओर traced है (लाल रेखा) जो नेटवर्क की सतह क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाएगा । (B) रॉय को roi प्रबंधक में जोड़ा जाता है. (ग) एक astrocytic नेटवर्क है जिसमें समझौता कोशिका (सफेद तीर) आसानी से अपनी biocytin लेबलिंग के हड़ताली तीव्रता की वजह से पहचान योग्य है का उदाहरण । (D) एक astrocytic नेटवर्क का उदाहरण जहां समझौता कक्ष पहचाना नहीं जा सका, लेकिन जहां सघन लेबलिंग का एक क्षेत्र biocytin जमाराशियों को स्पष्ट रूप से इंगित करता है । एक रॉय इस क्षेत्र के आसपास तैयार है और रॉय प्रबंधक को जोड़ा है । इसका केन्द्रक अभिकलन है और वैक्टर विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए समझौता सेल की स्थिति के रूप में माना जाता है । स्केल बार = १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: astrocytic नेटवर्क विश्लेषण के लिए इस्तेमाल अलग संदर्भ के आरेख. धूसर वर्ग को संदर्भित बिंदु 4XR के साथ 4x छवि है Adobe illustrator दस्तावेज़ के बाएँ नीचे कोने के साथ संरेखित करने के लिए । नारंगी रंग में घिरा सफेद वर्ग 20X छवि के साथ संदर्भित बिंदु 20XR है । दोनों छवियां एक दूसरे के साथ संरेखित है जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है । बाउंड आयत (नीला) NVsnpr (जामुनी डैश्ड रेखा) को परिभाषित करता है और उसे संदर्भित बिंदु (BR) के साथ प्रतिशत में स्केल किया जाता है । NVsnpr के पृष्ठीय भाग का theoric केंद्र डार्क ब्लू डॉट (सी) द्वारा schematized है. astrocytic नेटवर्क समझौता प्रकोष्ठ (ब्लैक डॉट, पी) द्वारा schematized है और अधिमानी दिशा (लाल रेखा) का मुख्य सदिश है । प्रत्येक डैश्ड काली रेखा astrocytic नेटवर्क के प्रत्येक कक्ष का वेक्टर है । astrocytic नेटवर्क के कोणीय अंतर (α) नेटवर्क (लाल रेखा) और काली रेखा है कि नाभिक के सैद्धांतिक केंद्र के लिए समझौता astrocyte जोड़ता है की मुख्य अधिमानी उंमुखीकरण के बीच कोण है । इनसेट 20X छवि के एक ज़ूम त्रिकोण PCD NVsnpr (सी), समझौता सेल के सैद्धांतिक केंद्र द्वारा गठित दिखा रहा है, और तरजीही दिशा (डी) के मुख्य सदिश । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: Astrocytic विभिन्न आकारों में दिखा विभिन्न स्थितियों के तहत NVsnpr में biocytin के साथ लेबल नेटवर्क. (A-C) बाईं ओर, प्रयोगात्मक हालत के एक योजनाबद्ध ड्राइंग । सभी स्थितियों में, एक एकल astrocyte SR-१०१ द्वारा लेबल पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित और biocytin (०.२%) के साथ भरा था । मध्य स्तंभ: photomicrographs astrocytic नियंत्रण शर्तों के तहत प्राप्त नेटवर्क illustrating (A), Vगु पथ की विद्युत उत्तेजना के बाद (2 एस गाड़ियों, 40-60 हर्ट्ज, 10-300 µA, ०.२ एमएस पल्स) (ख); और एक Ca2 +-मुक्त aCSF (सी) के साथ छिड़काव के बाद । दायां स्तंभ: photomicrographs एक ही स्थिति के तहत प्राप्त astrocytic नेटवर्क illustrating लेकिन स्नान में CBX (20 माइक्रोन) की उपस्थिति से पहले । स्केल बार = १०० माइक्रोन । (डी और ई) ऊर्ध्वाधर सलाखों के युग्मित कोशिकाओं की संख्या का प्रतिनिधित्व चार्ट और सतह क्षेत्र, क्रमशः तीन प्रयोगात्मक ऊपर प्रस्तुत (ए, बी, और सी) की उपस्थिति में (रची) और अनुपस्थिति (ठोस) के तहत astrocytes के biocytin-भरा नेटवर्क के CBX (२० µ मी). डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । एकाधिक तुलना (होल्म-Sidak test): * = P < ०.०५; * * = P < ०.००१ । यह आंकड़ा Condamine एट अल से अनुकूलित है । (२०१८) 1. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: Ca2के तहत NVsnpr में नेटवर्क का वर्णन +-मुक्त aCSF और Vगु पथ के विद्युत उत्तेजना के साथ । (A और B) बाएं: सभी 9 Ca के साथ छिड़काव के तहत भरा नेटवर्क+-मुक्त aCSF (A) या 8 में लेबल जबकि Vगु पथ उत्तेजक (ख) एक सैद्धांतिक NVsnpr नाभिक (ग्रे आयत) में अपनी स्थिति के अनुसार रची जाती है । प्रत्येक नेटवर्क (और यह रचना कक्ष) एक अलग रंग द्वारा प्रतिनिधित्व किया है । मध्य: प्रत्येक नेटवर्क की सीमाएं । प्रत्येक क्षेत्र में डॉट समझौता कक्ष का प्रतिनिधित्व करता है । सही: प्रत्येक नेटवर्क के अधिमानी अभिविंयास के मुख्य सदिश का प्रतिनिधित्व । डॉट समझौता कक्ष और तीर तरजीही दिशा के सदिश का प्रतिनिधित्व करता है । (सी और डी) तरजीही अभिविंयास के मुख्य सदिश के बीच कोणीय मतभेदों का वितरण और एक सीधी रेखा NVsnpr के पृष्ठीय भाग के केंद्र के लिए समझौता सेल को जोड़ने (dorsoventral अक्ष पर 25% पर स्थित है और mediolateral अक्ष पर ५०%) के तहत दो शर्तों का अध्ययन किया । मतलब कोणीय अंतर सीए 2 में ३९.५ ± १२.७ डिग्री था+-मुक्त aCSF, नाभिक के केंद्र की ओर एक तरजीही अभिविन्यास का संकेत है और विद्युत उत्तेजना के साथ ९९.५ ± 17 डिग्री, के प्रति एक तरजीही अभिविन्यास का संकेत परिधि (छात्र टी परीक्षण, पी = ०.०१२) । यह आंकड़ा Condamine एट अल से अनुकूलित है । (२०१८) 1. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सुक्रोज-aCSF* mMol
Sucrose २१९
KCl 3
KH2पो4 १.२५
MgSO4 4
NaHCO३ 26
डेक्सट्रोज 10
CaCl२ ०.२

तालिका 1: मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया के लिए इस्तेमाल किया सुक्रोज आधारित समाधान की संरचना। (*) = pH और osmolarity को क्रमशः 7.3-7.4 और 300-320 mosmol/

aCSF* mMol
Nacl १२४
KCL 3
KH2पो4 १.२५
MgSO4 १.३
NaHCO३ 26
डेक्सट्रोज 10
CaCl२ १.६

तालिका 2: स्लाइस भंडारण और पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल aCSF समाधान की संरचना । (*) = pH और osmolarity को क्रमशः 7.3-7.4 और 290-300 mosmol/

आंतरिक पैच समाधान* mMol
K-gluconate १४०
Nacl 5
HEPES 10
EGTA ०.५
Tris एटीपी सॉल्ट 2
Tris GTP नमक ०.४

तालिका 3: आंतरिक समाधान की संरचना पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया । (*) = pH और osmolarity को क्रमशः 7.2-7.3 और 280-300 mosmol/

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Discussion

electrophysiological तरीकों की एक संख्या23astrocytes,24के बीच कार्यात्मक युग्मन का आकलन करने के लिए मौजूद हैं । हालांकि, इन पद्धतियों astrocytic नेटवर्क की संरचनात्मक व्यवस्था के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते । अध्ययन के एक नंबर पहले से ही दिखाया गया है कि "डाई-या अनुरेखक-युग्मन", के रूप में यहाँ किया, electrophysiological तरीकों25,26,27द्वारा पता लगाया जाता है कि युग्मित कोशिकाओं के एक अंश में ही होता है, सुझाव है कि इस पद्धति के साथ खोजे गए कक्षों की संख्या को आंका गया है । इसके बावजूद, यह अभी भी युग्मन की कल्पना के लिए सबसे अच्छा तरीका है । अधिक से अधिक डाई-युग्मन जब अणु अनुरेखकों का उपयोग कर प्राप्त की है 1 से छोटे-1.2 केडीए रिस गैप जंक्शनों20. युग्मन के लाइव दृश्य फ्लोरोसेंट ग्लूकोज डेरिवेटिव (2-NBDG) या एक फ्लोरोसेंट मार्कर की निगरानी प्रसार द्वारा किया जा सकता है (कुछ Alexa रंजक या लूसिफ़ेर पीले रंग की तरह)13, लेकिन इसके छोटे आकार के कारण, biocytin पैदावार बेहतर परिणाम और निश्चित ऊतक में ठहराव के लिए अनुमति देता है । इस प्रकार, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस विधि के साथ पाया कोशिकाओं की संख्या काफी हद तक कम करके आंका है । दूसरी ओर, कोशिकाओं के कुछ क्योंकि उनके युग्मन के लेबल नहीं किया जा सकता है, लेकिन क्योंकि अनुरेखक कि extracellular अंतरिक्ष में लीक हो गया है की अधिकता. रिसाव से उत्पंन लेबल की हद तक एक अंतर जंक्शन ब्लॉकर1के स्नान अनुप्रयोगों के साथ नियंत्रण प्रयोगों में अनुमान लगाया जा सकता है । हालांकि, यह माना जा सकता है कि किसी भी विधि के कारण पूर्वाग्रह सभी शर्तों पर लागू होते हैं ।

अंत में, यह जोर दिया जाना चाहिए कि सभी युग्मित कोशिकाओं astrocytes नहीं कर रहे हैं । Panglial नेटवर्क जहां astrocytes oligodendrocytes करने के लिए युग्मित कर रहे है कई मस्तिष्क क्षेत्रों में वर्णित किया गया है, पार्श्व सुपीरियर ओलिव8, thalamus16, प्रांतस्था, और28हिप्पोकैम्पस सहित । हमारा उद्देश्य astrocytic नेटवर्क की तुलना की एक विधि विकसित करने के लिए विभिंन परिस्थितियों में डाई-युग्मन के साथ पता चला था परिकल्पना है कि वे अच्छी तरह से परिभाषित फार्म का आकलन, विशिष्ट कार्यात्मक डोमेन विभिंन उत्तेजनाओं द्वारा पता चला । NVsnpr में के बाद से, जो इस प्रोटोकॉल का आयोजन किया गया था, astrocytes के बीच युग्मन, brainstem नाभिक में बहुत आराम की स्थिति के तहत सीमित है, यह पहली बार एक विश्वसनीय और निष्पक्ष विधि लेबल कोशिकाओं का पता लगाने के लिए विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण था । यह ImageJFIJI के साथ स्वचालित पता लगाने के साथ हासिल की थी । पृष्ठभूमि शोर से बेहोशी से लेबल किए गए कक्षों को कभी-कभार अलग करना कठिन होता है. यहां, स्टैक इमेजिंग और ImageJFIJI में एक विधि के लिए संकेत में सुधार किया जाता है, लेकिन पृष्ठभूमि शोर अभी भी बहुत अधिक हो सकता है और डेटा अस्वीकृति के लिए सीसा । भविष्य के अध्ययन में, स्पष्टीकरण प्रोटोकॉल के लिए संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार किया जा सकता है । एक समाशोधन प्रोटोकॉल स्पष्टीकरण का एक दिलचस्प तरीका है कि ऊतक आकृति विज्ञान (कोई सिकुड़ना) को बरकरार रखता है, लिपिड को प्रभावित नहीं करता है, और immunostaining29के साथ संगत है । वर्णित विधि की एक और सीमा "वाटरशेड" भेदभाव कोशिकाओं है कि एक दूसरे के भी करीब है करने के लिए इस्तेमाल उपकरण है । इस उपकरण का उपयोग करते समय पता लगाए गए कक्षों का दृश्य निरीक्षण किया जाना चाहिए ।

यदि astrocytic नेटवर्क कार्यात्मक डोमेन फार्म, तो वे एक नाभिक की सीमाओं को परिभाषित कर सकते है या एक नाभिक की सीमाओं तक ही सीमित होना चाहिए । पता चला नेटवर्क हमेशा एक नाभिक के भीतर सीमित हो सकता है, और इसलिए अगर वे आकार में छोटे हैं, अगर समझौता astrocyte केंद्र में है (या भीतर) नाभिक । परीक्षण करने के लिए यदि astrocytes एक नाभिक की सीमा के पास बैठे अधिमानतः नाभिक के बाहर अंय astrocytes के साथ या नाभिक के भीतर अंय लोगों के साथ, हम तरजीही दिशा निर्धारित करने की जरूरत है जो रंग समझौता astrocyte से फैल गया । कई अंय अध्ययनों बैरल प्रांतस्था, thalamus, घ्राण glomeruli, हिप्पोकैम्पस, और पार्श्व बेहतर जैतून के barreloid क्षेत्रों में एक समान मुद्दा को संबोधित किया है, लेकिन वे ज्यादातर अनुरेखक के प्रसार की दूरी पर ध्यान केंद्रित विश्लेषण, electrophysiological अपने स्थानीयकरण के समारोह में astrocytes के विभिंन प्रकार के लक्षण वर्णन, और इन अच्छी तरह से परिभाषित संरचनाओं के संबंध में ओर्थोगोनल कुल्हाड़ियों के साथ डाई के प्रसार8,9,10, 13,14,16. यहां, हम वैक्टर विश्लेषण का इस्तेमाल किया अनुरेखक प्रसार के प्रमुख दिशा निर्धारित करते हैं, जो सामांय मुख्य सदिश के आकार और अभिविंयास द्वारा दिया गया था । छोटे वैक्टर संकेत नहीं स्पष्ट "प्रमुख" या तरजीही अभिविंयास । वेक्टर विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के लिए सही समझौता astrocyte है, जो हमेशा संभव नहीं है की पहचान करने की क्षमता है । एक दिलचस्प वैकल्पिक समझौता astrocyte को खोजने में मदद करने के लिए एक बड़े (गैर अंतर जंक्शन permeant) और fixable अनुरेखक, dextrans की तरह, रिकॉर्डिंग समाधान के लिए जोड़ने के लिए है । यदि यह पैच किए गए कक्ष या पैच स्थान निर्धारित करने के लिए संभव नहीं है, यह वेक्टर विश्लेषण से इन प्रयोगों को छोड़ करने के लिए बेहतर हो सकता है ।

अंत में, विश्लेषण करने के लिए कि क्या नेटवर्क के गुण नाभिक में अपने स्थान के अनुसार विविध, हम एक विधि की जरूरत है एक "सामान्यीकृत" नाभिक में अपनी स्थिति को व्यक्त करते हैं । इस प्रक्रिया में केवल महत्वपूर्ण कदम को स्पष्ट रूप से कम आवर्धन छवियों (4x) में नाभिक की सीमाओं को देखने की क्षमता है । इस समस्या का एक सरल समाधान, अगर यह अक्सर होता है, विश्लेषण से पहले ऊतक प्रसंस्करण के लिए एक मानक ऊतकवैज्ञानिक रंगाई जोड़ने के लिए है.

मस्तिष्क क्षेत्रों में astrocytes के विविधता स्पष्ट रूप से स्थापित है, और सबूत की बढ़ती शरीर की अवधारणा का समर्थन करता है कि उनकी विशेषज्ञता विशेष रूप से सर्किट है कि वे9में एंबेडेड है के समारोह के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, 10,30,31. इस के लिए सच है, अंतर astrocytic संचार एक ही सर्किट से जुड़े astrocytes तक ही सीमित होना चाहिए । इस धारणा का समर्थन टिप्पणियों अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में उभर रहे हैं, लेकिन संकुल अभ्यावेदन के साथ क्षेत्रों में और अधिक स्पष्ट कर रहे हैं, प्रति बैरल प्रांतस्था या घ्राण बल्ब में संवेदी नक्शे की तरह । हालांकि, न्यूरॉन और astrocytic मैप्स के बीच ओवरलैप की सबसे रिपोर्ट वर्णनात्मक और गुणात्मक हैं । यहां बताया तरीकों को इन टिप्पणियों objectify और उपकरण विकसित करने के लिए बेहतर एक दिया सर्किट में अपनी स्थिति के अनुसार astrocytic नेटवर्क का विश्लेषण किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थानों द्वारा वित्त पोषित है, अनुदान/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Chemicals S671-3
KCl Fisher Chemicals P217-500
KH2PO4 Fisher Chemicals P285-500
MgSO4 Fisher Chemicals M65-500
NaHCO3 Fisher Chemicals S233-500
C6H12O6 Dextrose anhydrous Fisher Chemicals D16-500
CaCl2 dihydrated Sigma C70-500
Sucrose Sigma S9378
D-gluconic acid potassium salt Sigma G45001
MgCl2 anhydrous Sigma M8266
HEPES Sigma H3375
EGTA Sigma E4378
ATPTris Salt Sigma A9062
GTPTris Salt Sigma G9002
Biocytin Sigma B4261
Carbenoxolone disodium salt Sigma C4790
avidin-biotin complex : ABC kit Vestor laboratories PK-4000
Streptavidine-alexa 594 Molecular Probes S11227
Triton Fisher Chemicals BP151-500
Xylene Fisher Chemicals X5-1
Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount Fisher Chemicals SP15-100
Slide Drying Bench Fisherbrand 11-474-470
Vibratome Leica VT 1000S
Microscope cover glass Fisherbrand 12-544A
Microscope slide ColorFrost Fisherbrand 12-550-413
PFA Fisherchemicals 04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope Olympus
40X water-immersion lens Olympus LUMPLFLN40XW
20X water-immersion lens Olympus XLUMPLFL20XW
4X water-immersion lens Olympus XLFLUOR4X/340
Micropipette puller Sutter Instrument P97
Micromanipulator Sutter Instrument MP 225
Camera CCD Sony CX-ST50
Black and white monitor Sony SSM-125
Digidata Molecular devices 1322A
Patch Clamp amplifier Axon instrument Mulitclamp 700A
Electrophysiology acquisition software Molecular devices pClamp 8
Electrophysiology analysis software Molecular devices Clampfit 8
Imaging analysis software ImageJFIJI Open source software. FIJI version including plug in package.
Vector image editor Adobe Illustrator CS4
Spreadsheet application Microsoft Office Excel 2010

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४० Astrocytes युग्मन नेटवर्क वैक्टर विश्लेषण biocytin तरजीही अभिविन्यास संरचनात्मक संगठन
आकार, आकार, और युग्मित Astrocytes के नेटवर्क के दिशात्मकता का विश्लेषण
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Condamine, S., Verdier, D., Kolta, A. Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes. J. Vis. Exp. (140), e58116, doi:10.3791/58116 (2018).

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