Summary
여기 astrocytic 네트워크의 조직 평가 프로토콜 선물이. 설명된 방법 셀 수, 크기, 지역, 및 핵 내의 위치 등이 네트워크의 기술적인 조치를 제공 하는 바이어스를 최소화 합니다. 이방성 vectorial 분석 평가 이다.
Abstract
그것은 이다 네트워크 수준에서 뿐만 아니라 시 냅 스 및 단일 세포 수준에서 뿐만 아니라 신경 기능 조절 점점 더 분명 되었다. 이다는 강력 하 게 서로 연결 간격 접속 점을 통해 이며 커플링이이 접합을 통해 역동적이 고 높은 규제. 새로운 개념은 astrocytic 함수는 전문화 하 고 그들은 연결 하는 신경 회로의 기능에 맞게. 따라서, 더 나은 그들의 통신을 제어 하 고 커플링 규칙을 설명 하 고 그들의 기능을 더욱 이해 하 astrocytic 네트워크의 다양 한 매개 변수를 측정 하는 방법이 필요 합니다.
여기, 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 (예., ImageJFIJI), 염료 커플링 공개 astrocytic 네트워크의 공초점 이미지를 분석 하는 방법을 설명. 이러한 방법은 허용 1)는 자동화 되 고 편견 검색 레이블이 지정 된 셀의 2) 3) 염료는 네트워크 내에서 확산과 4) 관심의 영역 내에서 네트워크의 위치에의 우선 방향 계산 네트워크의 크기의 계산 .
이 분석은 특정 영역의 astrocytic 네트워크 특성, 비교 다른 기능에 관련 된 다른 분야의 네트워크 또는 네트워크 연결에 서로 다른 영향을 서로 다른 조건 하에서 얻은 비교를 사용할 수 있습니다. 이러한 관측 기능 중요 한 고려 사항이 될 수 있습니다. 예를 들어, 우리가 어디 우리가 이전 나타났습니다 astrocytic 커플링 리듬 붕괴1토 닉에서 그들의 발사 패턴을 전환 하는 뉴런의 기능을 위해 필수적 이다 trigeminal 핵의 astrocytic 네트워크 분석. 크기, 감 금, 그리고이 핵에서 astrocytic 네트워크의 우선 방향을 측정, 우리 그들은 등 기능 도메인에 대 한 가설을 구축할 수 있습니다. 여러 연구 결과 시상 및 몇 가지 이름으로, 시각 피 질에 신 피 질, 측면 우수한 올리브, 후 각 glomeruli, 및 감각 핵을 포함 하 여 다른 몇몇 두뇌 지역 유사한 분석 으로부터 혜택을 받을 수는 것이 좋습니다.
Introduction
많은 연구는 어떻게 하위 셀룰러 또는 시 냅 스 수준에서 신경-사이토 대화 신경 기능 및 시 냅 스 전송에 영향을 가질 수 있습니다 설명 했습니다. 그것은 잘 이다 주변 신경 활동에 민감합니다 설립 사실, 그들은 많은 신경 전달 물질 등 조미료, GABA, 아 세 틸 콜린, ATP (이전에 게시 리뷰2,,34참조)에 대 한 수용 체가 있다. 반환에서는, astrocytic 처리 ensheath 시 냅 스 요소와 영향 신경 활동 거기와 extrasynaptic 사이트에 extracellular 이온 항상성 조절 하 고 여러 요인 또는 송신기 조미료, D-떠들고, ATP 등을 발표 하 여 5 , 6 , 7.
Astrocytic 커플링은 공간적으로 통제 되 고 취소 해 부 특징 영역에서 신경 세그먼트에 해당 하는 증거 이다 네트워크 수준에서 신경 기능 조절 또한 수 아이디어가 나왔다 (같은 감각 표현 영역), 구획 이다 보다는 그냥 그 근처는 같은 기능을 제공 하는 다른 이다에 커플 것입니다 나타냅니다. 측면 우수한 올리브에서 예를 들어, 가장 astrocytic 네트워크는8tonotopic 축 직교 방향 신 피 질 또는 olfactoty glomeruli 이다 간의 통신 배럴 또는 glomeruli 훨씬 더 강한 반면 그리고 인접 한 것 들9,10사이 약한. 두 경우 모두, astrocytic 네트워크는 glomerule 또는 배럴9,10의 중심을 향해 지향.
우리는 최근 astrocytic 활동의 extracellular 캘리포니아2 + 농도 감소 시켜 신경 발포 변조 보였다 ([캘리포니아2 +]e), S100β, 캘리포니아2 +의 출시를 통해 아마도-바인딩 단백질11. 감각 trigeminal 메인의 등 쪽 부분에 trigeminal rhythmogenic 뉴런의 인구에서 시연 되었다는 사실에서 유래한 다 핵 (NVsnpr, masticatory의 생성에 중요 한 역할을 생각),이 효과 이러한 뉴런에 리듬 발사는 영구 나+ 현재 [캘리포니아2 +]e11,12의 감소에 의해 추진에 따라 달라 집니다. 이러한 뉴런에 리듬 발사 그들의 입력의 자극 또는 인공 감소 [캘리포니아2 +]e의 "순수" elicited 수 있습니다. 우리는 더 astrocytic 커플링 신경 리듬 발사1필요 이었다는 것을 보여주었다. 이 astrocytic 네트워크 신경 활동을 동기화 할 수 및 조정 circumscribed 기능 도메인을 형성 수 있습니다 가능성 제기. 이 가설을 평가 하기 위해 우리가 먼저를 엄격 하 게 NVsnpr 내에서 이러한 네트워크의 조직 방법을 개발 필요 합니다.
Astrocytic 네트워크에 대 한 이전 연구 대부분 휴대폰 번호와 밀도 및 영역 결합의 정도 설명 했습니다. Astrocytic 네트워크의 형태와 염료-커플링의 방향 평가 하려고 했다 주로 배럴 피9, 마13,14, 두 개의 축 (x와 y)에 따라 네트워크의 크기를 비교 하 여 수행 15, barreloid 분야 시상16, 측면 우수한 올리브8, 후 각 glomeruli10, 피 질14의. 여기에 설명 된 메서드는 네트워크에 있는 레이블된 셀의 편견된 수와 그들이 커버 영역의 추정 가능 우리는 또한 네트워크 내에서 연결의 기본 설정된 방향을 정의 하 고 핵의 또는 다른 방향에서 중심으로 원하는 방향 인지 평가 도구를 개발 했다. 이전에 사용한 방법에 비해이 프로토콜 조직 및 알려진 취소 해 부가 없는 지 trigeminal 주 감각 핵 같은 구조에 astrocytic 네트워크의 방향을 설명 하는 수단 제공 서입니다. 위의 연구에서 네트워크 방향으로 이미 문서화 구조 자체의 모양에 관계 설명 (예., 시상, 피 질, 배럴에에서 barreloid 해 마와 피 질,에서 glomeruli 레이어 후 각 전구, 등입니다.)입니다. 또한, vectorial 분석 방향 밝혀 다른 조건 하에서 커플링의 비교에 대 한 수 있습니다. 이러한 매개 변수는 핵 내에서 네트워크의 위치에 따라 변경 여부 분석, 우리는 또한 핵의 경계에 관하여 각 네트워크를 대체 하는 방법을 개발. 이러한 도구는 연결 된 셀의 조사 네트워크에 대 한 다른 지역에 쉽게 적응 될 수 있다.
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Protocol
모든 절차는 건강 연구의 캐나다 학회 규칙에 의해 거주 하 고 몬트리올의 대학 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1입니다. 쥐 뇌 조각의 준비
- 자당 기반 솔루션 (표 1)의 1 리터와 표준 인공 뇌 척추 액체 (실제) (표 2) 1 리터를 준비 합니다.
- 95% O2 , 5% CO2 (carbogen) 30 분의 혼합으로 자당 기반 솔루션 솔루션 감기 하지만 하지 완전히 고정 될 때까지 약 30 분,-80 ° C에 그것을 배치 하기 전에 거품. 두뇌의 조각화에 대 한이 얼음 처럼 차가운 자당 절단 버퍼 사용 합니다. 냉동 고에서 제거 되 면 얼음에 그것을 유지.
- 전체 실험을 통해 carbogen와 실제 거품. 이 솔루션을 사용 하 여 슬라이스 저장용 perfusing 버퍼는 패치 클램핑 및 이다의 biocytin 채우기 수행 됩니다. 최대한 빨리 그들은 잘라 두뇌 분할 입금 챔버를 들고 조각을 복구를 준비 합니다.
참고: 슬라이스 복구 지주 챔버 주문 품 일 수 있고 실제, 튜브 아래쪽에서 carbogen 려 삽입으로 가득 큰 우물에 하단에 메쉬를 하나의 작은의 본질적으로 구성 되어. - 어떤 섹스 또는 스트레인 특정 편견 없이 15에 21-하루-오래 된 Sprague-Dawley 쥐를 사용 합니다. Isoflurane (1 mL의 마 취 유도 실에서 isoflurane)와 동물 anesthetize 부드럽게 뒷 발 또는 동물의 꼬리를 곤란 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다.
- 목을 벨 쥐를 단두대를 사용 하 여가 위, 그것의 두개골을 잘라 고 신속 하 게 편평한 주걱으로는 두개골에서 뇌를 제거.
- 30 s 및 전송에 대 한 그것 (솔루션)에 페 트리 접시에 얼음 처럼 차가운 자당 기반 솔루션에서 뇌를 찍어. 면도기 칼 날 앞쪽 및 후부 영역으로 구분 되는 부분을 제거 절단 조각 가로 평면에서 경우.
- 접착제의 rostral 측면에 뇌 조직의 나머지 블록 고 자당 기반 매체는 vibratome를 사용 하 여 뇌 조각 (350 µ m 두께)을 잘라 계속 합니다. 그런 다음 전송 챔버를 사용할 수 있을 때까지 실 온 (RT)에서 carbogenated 실제 가득 들고 복구에서 수집 된 조각 (복구에 최소 1 시간을 허용).
참고: 필드에 최근 개발 허용 연장된 보육까지 체 외에서 뇌 조각의 24 h 조건17.
2. Sulforhodamine 101 (SR-101) 이다의 라벨
- 34 ° C에 물 목욕 전 열 및 그것 두 슬라이스 보육 실 장소. 분할 영역 보육 실 1 μ M를 포함 하는 실제의 솔루션 작성 SR-101, 채울 다른만 실제.
- 1 µ M를 포함 하는 인큐베이션 챔버에 슬라이스를 품 어 20 분 및 다음 전송 두 번째 외피에 그들 조직에서 초과 SR 101 개 린스 챔버 SR-101. 그것은 20 분 동안 품 어 또는 34 ° C에서 더 많은 다음 유지 때까지 RT에서 분할 영역을 포함 하는 인큐베이션 챔버 필요한18.
3. 사이토 패치 및 Biocytin 작성
- 슬라이스를 선택 하 고 현미경의 녹음 실에서 그것을 배치. 패치 이다, 4-6MΩ 칼륨 구 루 콘-기반 솔루션으로 채워질 때의 저항 전극 사용 ( 표 3참조).
- 시각적 지침과는 micromanipulator를 사용 하 여, 아래 그림 1에서 보듯이 한 SR 101 표시 된 사이토를 향해 기록 전극 직접. 이후 그들은 더 많은 가능성이 손상 되거나 인접 셀에 연결을 잃 었 조각의 표면에 있는 세포를 하지 마십시오.
- Biocytin 조직에서의 누설을 방지 하기 위해 패치 피 펫에 추가 긍정적인 압력을 최소화 하 고 고칠 것 이다 사이토 가까이 하는 경우에 적용 (0.1-0.4 mL 1 mL 주사기에).
- 패치 전에 피 펫의 커패시턴스의 간격 조정. 정확 하 고 정밀한 전압 명령을 중요 한 실험19액체 접합 잠재력에 대 한 수정.
- 피펫으로 긍정적인 압력에 의해 발생 하는 우울증을 관찰 하는 사이토를 충분히 가까이 이동 합니다. 그런 다음, 긍정적인 압력을 제거 하 고 천천히 일부 부정적인 압력을 적용. 클램프-70에 사이토 mV 인감 100 m ω에 도달 하면. 인감에 1-3 GΩ를 도달할 때까지 기다립니다. 계속 셀에 침입까지 부정적인 압력을 적용. 때문에 이다 매우 연약한 부정적인 압력을 적용 하는 동안 주의 해야 합니다.
- 기 워 진된 셀의 electrophysiological 속성을 평가 합니다. 전압 클램프 모드에서-120에서 110에 이르기까지 600 ms의 램프 전압 명령으로 전체 셀 전류-전압 프로토콜 수행 mV. 전류 클램프 모드에 있는 1000 밀리초 현재 단계 100 pA의-1에서 1 nA, 전체 셀 녹음의 샘플링 레이트의 주입은 10 kHz 단계 IV 프로토콜을 수행 합니다.
참고: 이다 정류 ( 그림 1B에서 같이)의 어떤 종류 없이 막 도발은 (그림 1C)에 따라 발사 작업 잠재력 선형 전류-전압 프로필 표시. 휴식 막 잠재력 (RMP) 안정적이 고을-60mV 긍정 하지 해야 합니다. 어떤 뇌 영역에 이다의 RMP는 NVsnpr에서 보다 더 hyperpolarized입니다. - 단계 IV 프로토콜 마다 5 분을 수행 하는 동안 30 분 동안 사이토 내 확산 biocytin 허용.
- 철회 및 패치 사이토를 손상 없이 패치 피 펫을 신중 하 게 분리 하 고 즉시 주의 피 펫의 오프셋의 녹음 실에서 그것을 복용 하기 전에. 막 잠재력 기록에서 해당 값을 뺍니다.
- 뇌 조각을 결합 된 셀의 전체 네트워크에 패치 사이토에서 추적 프로그램의 확산을 허용 (이외에 주입을 위한 30 분) 15 분의 최소 녹음 실에서 나머지를 남겨 주세요.
참고: 결합 된 세포의 네트워크를 공개, 단일 셀만 해야 패치 관심의 핵에서. 여러 시도가 성공적인 패치를 달성 하기 위해 필요한 경우, 경우 삭제 하 고 패치 contralateral 쪽 이나 다른 뇌 조각에 하려고 합니다. - 슬라이스 면을 위쪽으로 직면 하 고 식별 하는 조직에 마크 또는 절 개를 확인 하 고 4 %paraformaldehyde (PFA)의 솔루션으로 정상적인 실제를 포함 하는 배양 접시에 슬라이스를 먼저 전송. 4 ° C에서 슬라이스를 밤새 품 어.
주의: PFA 매우 유해한입니다. 보호 장비를 사용 하 여 통풍 후드. PFA 접촉 된 모든 자료 (브러쉬, 튜브, 등) 복구 챔버, 보육 실, 또는 신선한 조직의 기록에 사용 하는 기타 자료를 들고 게 연락 하지 마십시오 확인 하십시오.
4. Biocytin 계시
- 형광 streptavidine와 계시
- 워시 뇌 조각 2 x 10 분 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 실시간에 그런 다음 실시간에 4 h 4% 비 이온 세제로 PBS에서 1/200 희석에 fluorophore를 활용 하는 streptavidine와 함께 뇌 조각 잠복기는 biocytin 공개
- RT에서 0.1 M PBS에 뇌 조각 3 x 10 분을 세척 하 고 수성 설치 매체를 사용 하 여 유리 슬라이드에 섹션을 탑재. 위쪽으로 coverslip 주입 했다 측면 슬라이드에 놓고 손톱 광택 그들을 봉인.
- DAB와 계시
참고: 소량 (3, 3-diaminobenzidine) 계시는 형광을 사용할 수 없는 경우 사용할 수 있습니다. 이 경우에, 하나의 계시 방법 비교에 대 한 고용 해야 합니다.- 뇌 조각 실시간에 PBS에 3 x 10 분 알을 품고 조각 PBS + H2O2 0.5% 실시간에서 1 시간 동안 세척
- 실시간에 PBS에 조각 3 x 10 분을 씻어 그런 다음, 실시간 24 시간 PBS와 0.1% 비 이온 세제 + avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 과산화 효소 표준 얼룩 키트 시 약 1/100의 구성 avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 얼룩 솔루션에서 분할 영역을 품 어
- RT에 PBS에 3 x 10 분 슬라이스를 헹 구 십시오, PBS의 솔루션에 그들을 품 어 + RT에서 20 분에 대 한 0.05%를 소량 PBS의 솔루션으로 그들을 전송 + DAB 0.05% + H2O2 0.5%.
주의: 소량은 매우 해로운. 보호 장비를 사용 하 여 통풍 후드. 슬라이스는 PBS에 전송 될 때 색상 반응 중지 됩니다. - RT에 PBS에 조각 5 x 10 분을 씻어, 유리 슬라이드 (얼굴 위쪽으로 주입 했다 측면)에 섹션을 마운트 슬라이드 벤치 34 ° c.에 하룻밤 건조에 말리 고
- 1 분 동안 크 실 렌의 목욕, 70%, 100%, 95%, 및 끝에 몇 가지 알코올 목욕에 1 분 동안 유리 슬라이드 잠수함
- 유리 슬라이드는 톨루엔 기반 합성 수 지 매체를 설치를 사용 하 여 탑재 합니다. Coverslips를 슬라이드에 놓고 손톱 광택 그들을 봉인.
5. 네트워크 영상
- 스캐닝 confocal 현미경 20 X 4 X 목표 (또는 네트워크는 전체 핵을 시각화 하는 적절 한 목표)를 사용 하 여 astrocytic 네트워크 시각화는 fluorophore를 감지 하는 레이저 (이 경우에, 알 렉 사-594는 사용).
- 20 배 확대를 사용 하 여 레이블이 지정 된 셀의 네트워크의 z 스택 수 있도록. 800 x 800 픽셀의 해상도 사용 하 고 스캔 속도 12.5 μ/픽셀의.
참고: 전체 네트워크 이미지를 위해 여러 기반은 일반적으로 필요 하 고, 그리고 스택 수 각 네트워크에 대 한 조정 될 필요가 있다. 모든 데이터의 이미지를 동일한 설정을 사용 해야 하지만 볼 수 있듯이 해상도 및 스캔 속도 변경할 수 있습니다. - 4 배 확대를 사용 하 여 네트워크 및 관심 영역에의 이미지를 데리고.
참고: 이미징 X 4는 관심의 핵 내 네트워크 위치를 결정 하는 데 사용 됩니다. 항상 이미지 전송된 빛에 동일한 필드. 공초점 형광 이미지에서 핵의 테두리를 확인할 수 없는 경우이 이미지는 유용할 것 이다.
6. 이미지 분석
- 데이터 준비
- ImageJFIJI 소프트웨어를 사용 하 여 (https://fiji.sc/에서 다운로드). 파일을 "바이오 형식 가져오기 옵션" 창에서 확인을 클릭 합니다.
- Z-스택만 최종 z-스택 (그림 2A)에 필요한 광학 분할 영역을 포함 하는 재정의 하려면 도구 모음에서 "스택" 손잡이에 (찾을, 먼저 stk 선택 | Z 프로젝트)입니다. 프로젝션 유형 설정 (그림 2A)에서 "최대 강도"를 선택 합니다. 파일을 저장 하 고 이름을 "스택 파일".
- 이미지 파일에 여러 채널 있으면 astrocytic 네트워크 영상으로 채널만을 보존 하기 위해 그것을 분할 (이미지 | 컬러 | 채널 분할).
- 이미지의 픽셀 설정을 확인 [이미지 | 속성 | 픽셀 (픽셀 차원에 대 한 "1")와 함께].
- Subtract 배경 도구를 사용 하 여 (프로세스 | 배경 빼기) biocytin 라벨의 배경을 제거 하. 미리 보기 기능을 사용 하 여 일반적으로 50 픽셀 (그림 2B)에 설정 된 롤링 볼 반지름 설정.
- 제거 outliers 도구를 사용 하 여 (프로세스 | 소음 | Outliers를 제거) 빼기 배경 단계에 따라 필요한 경우. "어떤 Outliers" 설정 (그림 2C)에 "밝은"를 선택 합니다. 미리 보기 기능을 사용 하 여 반경 및 임계값 설정. 이후 그림 2D와 같이 그것은 데이터를 흐리게 수 있습니다이 도구와 함께 주의 해야 합니다.
참고:이 도구는 (같이 그림 2B와 2c 에 흰색 화살표로 처리, 전후 각각) streptavidine의 불특정 예금으로 인 한 작은 반점 제거 됩니다. - 임계값을 조정 (이미지 | 조정 | 임계값)입니다. "기본" 및 "B & W" 모드 (그림 2E)을 선택 합니다. "적용" 클릭 합니다.
참고: 자동 조정 사용할 수 있습니다, 하지만 두 개의 슬라이더 막대를 사용 하 여 수동 조정 하는 것이 좋습니다. 이 단계의 목표는 소음을 줄이기 위해 최대 레이블이 지정 된 셀에 그대로입니다. - 이진 프로세스 도구 바이너리 이미지 이미지 변환 (프로세스 | 이진 | 이진 하 게) 그림 2 층에 같이. TIFF 파일로 파일을 저장 하 고 이름을 "이진 파일".
- 셀 계산
- 측정 기능 설정을 확인 (분석 | 설정 측정). "중심" 옵션을 선택 합니다.
- "이진 파일"에서 "입자 분석" 도구를 사용 하 여 이전 단계에서 (그림 3A) 생산 (분석 | 입자 분석) (왼쪽그림 3C ). "표시" 설정 (그림 3C)에서 "설명"을 선택 합니다. 이 탐지 (그림 3B)의 결과 표시 하는 새 파일을 생성 합니다.
- 매개 변수와 함께 재생: (만 셀을 검출 하려면 30과 6000 사이의 값을 사용 하 여) 크기와 순환 (사이의 간격을 결정 하 0 ~ 1는 "1"에서 완벽 한 원형 및 정의 "0" 임의의 모양) 탐지 (그림 3C, 왼쪽 부분)을 수정. "확인"을 클릭 하 여 검색을 실행 합니다.
참고: 두 테이블 검색 다음 표시 됩니다: 각 셀 x 및 y 좌표를 제공 하는 1) 테이블 "요약" 제목 검색 된 셀의 수를 제공 하 고 2) "결과" (그림 3C, 오른쪽 부분) 라는 테이블. - 값을 복사 하는 스프레드시트 응용 프로그램에 붙여넣을 합니다. 이름 "감지 테이블"에서이 테이블을 저장 합니다. 검색 된 셀의 음모와 파일 (그림 3B) 나타납니다. 이름 "검색 파일" TIFF 파일로이 파일을 저장 합니다.
- 분수령 도구를 사용 하 여 네트워크에서 2 또는 더 레이블 셀 그룹 분석 입자 도구 단일 셀 때문에 너무 가깝게 서로 게 감지 되 면 (프로세스 | 이진 | 분수령) 바이너리 이미지 분석 입자를 적용 하기 전에 도구를, 그리고 분석 입자 단계를 다시 실행.
참고: 분수령 도구는 매우 가까운 셀 사이의 폭 1 픽셀의 한계를 만듭니다. 셀 카운터 플러그인 수 있는 라벨은 모호 하 고 수동으로 수행할 수 있습니다 때 사용.
- Astrocytic 네트워크 영역 측정
- 네트워크의 표면적을 측정 하려면 제이 이미지를 사용 하 여 검색 파일
- 다각형 선택 도구를 선택 하려면 도구 모음에서 단추 (왼쪽된 클릭)를 사용 하 여 (그림 4A) 네트워크의 외부 주변에 있는 모든 셀을 연결 하는 다각형을. 왼쪽 다각형, 추적을 시작 하 고 그것을 마우스 오른쪽 단추로.
참고:이 다각형 (ROI)의 지역으로 정의 됩니다 하 고 그것의 표면 네트워크의 표면 영역을 결정 하기 위해 측정 됩니다. - 설정된 측정 창을 엽니다 (분석 | 측정 설정) 및 "영역" 옵션을 선택. 투자 수익 관리자 (분석 | 도구 | 투자 수익 관리자) (그림 4B). 다음, '추가 ' (그림 4B)를 클릭 하 여 추적된 다각형 투자 수익 관리자에서 추가 하 고 ROI 관리자에서 '측정'을 클릭 하 여 측정을 실행.
참고: 영역 측정 테이블에 표시 됩니다 및 픽셀 단위로 표시 됩니다. Μ m2에서 값을 가져오는 데 사용 하는 현미경에 대 한 변환 인수를이 값으로 변환 하는 것을 잊지 마십시오.
- 주요 방향 벡터의 결정
- 기 워 진된 셀의 결정
- ImageJFIJI에서 스택 파일을 열고 그것의 강한 라벨 강도 (그림 4C)에 따라 스택 파일에 패치 셀을 식별 합니다. 그런 다음 스프레드시트 응용 프로그램에서 "검색 표" 라는 파일 열고 패치 된 셀 및 해당 좌표에 관련 된 수 있습니다.
- 정확 하 게 패치 된 셀을 확인할 수 없습니다, 경우에 biocytin 예금 ImageJFIJI에서 다각형 도구를 사용 하 여 결합 된 셀의 이미지 네트워크에서 밀도가 지역 포위 하 고 패치 셀 (그림 4D)의이 위치 합니다.
- 투자 수익 관리자를 사용 하 여 (분석 | 도구 | 투자 수익 관리자)입니다. 그런 다음 패치 셀 위치에는 투자 수익을 그릴 하 고 ROI 관리자에 추가 ( 그림 4B참조).
- 설정 측정 (분석 | 설정 측정) 하 고 "중심" 옵션을 선택 합니다.
- 투자 수익 관리자에서 "측정" 추적된 지역의 중심의 좌표를 클릭. 이 좌표를 사용 하 여이 특정 네트워크에 대 한 참조 지점으로.
- 참조 번역
- 다음 수식을 사용 하 여 패치 사이토에 관하여 각 셀의 좌표를 계산.
함께:
좌표로 주어진 셀; 
패치 셀 (또는 네트워크의 참조 포인트);의 좌표로 그리고 
으로 지정 된 셀에 새 참조에 대 한 좌표.
참고: 패치 사이토에서 벡터 계산에 중요 한 단계는 패치 사이토에 관하여 각 셀의 좌표를 표현. 조심 하면 ImageJFIJI를 사용 하 여 모든 이미지에 대 한 참조는 이미지의 왼쪽 위 모서리에 있는.
- 다음 수식을 사용 하 여 패치 사이토에 관하여 각 셀의 좌표를 계산.
- 우선 방향의 주요 벡터의 결정
- 다음 수식 사용 하 여 우선 방향의 기본 벡터의 좌표를 계산.
함께: (
)으로 우선 방향;의 기본 벡터의 좌표 그리고 
는 패치 취득 네트워크의 각 셀의 좌표로 셀로 참조.
참고: 네트워크에 있는 각 셀에 대 한 벡터 패치 사이토의 좌표를 기준으로 결정 됩니다. 우선 방향 네트워크의 주요 벡터는이 벡터의 합. - 하나 (이후 패치 셀의 좌표 포함 되지 않습니다), 마이너스 네트워크에서 셀의 수에 나누어 (위의 수식을 사용 하 여에서 얻은 좌표에서 제공) 주요 벡터의 길이 값을 정규화 하 고 사이 비교를 사용 하 네트워크입니다. 이 분석의 회로도 보기는 그림 5에 표시 됩니다.
- 다음 수식 사용 하 여 우선 방향의 기본 벡터의 좌표를 계산.
- 기 워 진된 셀의 결정
- 관심의 핵에서 분석 된 네트워크의 배치
- 20 X 4 X 이미지의 맞춤
- (NVsnpr)의 핵에 있는 각 네트워크의 위치를 확인 하려면 4 X 이미지를 사용 합니다. 벡터 이미지 편집기로 4 X 이미지를 엽니다.
- 4 X 이미지를 선택 하 고 5로 그것을 곱하여 그 크기를 수정 합니다. 차원 창의 위쪽 가로 도구 모음의 오른쪽 부분에 위치 해 있습니다. 예를 들어, 800 x 800 픽셀 샘플링 되는 4 X 이미지, 4000 x 4000 픽셀 샘플링 해상도 변경 (픽셀 단위로 작업 단위를 설정로 이동 "문서 설정" 파일 탭: 파일 | 문서 설정)입니다. TIFF 형식 및 이름 그것 "크기 4 X" 파일을 내보냅니다.
- 어도비 일러스트 레이 터 문서의 왼쪽 아래 모서리와 이미지의 왼쪽 위 모서리를 맞춥니다.
참고: 소프트웨어 왼쪽 하단 참조 지점에서 좌표를 제공합니다. - 네트워크의 20 X 이미지를 엽니다. '바이너리 파일 ' 또는 '검색 파일 '을 사용 하 여 그들은 정렬 하기 쉽기 때문에. 다음, 다시 크기 4 X 정렬 20 X 이미지의 '이진 파일'에 불투명도 도구 함께 플레이 이미지.
참고: 투명도 도구 최고 가로 도구 모음에는. - 때 정렬이 완료 및 측정 도구가 나타납니다, 그래서 피 펫 도구를 잡고 선택한 왼쪽된 도구 모음에서 선택.
- 20 X의 좌표를 참조 20 X 이미지의 왼쪽 위 모서리에 클릭 하 여 측정 도구 크기 4 X에 포인트를 사용 하 여 이미지.
참고: 라고 하는 20 X 참조 (20XR 그림5에서),이 좌표는 핵의 그리기 회로도에 각 네트워크의 위치를 표현 하는 데 유용 있을 것입니다.
- 관심의 핵의 정규화
참고: 데이터를 요약, 사각형으로 핵 (NVsnpr)의 정규화가 사용 됩니다. 아래 단계를 설명 합니다.- 오픈 4 X ImageJFIJI에서 파일 크기를 조정 하 고 다각형 도구를 사용 하 여 핵 (NVsnpr)를 둘러싸고. 사용 하 여 이미지 전송된 빛으로 핵의 테두리; 볼 수 수 없는 경우 어떤 경우에, 먼저 그것을 조정 기억 해요.
- 투자 수익 관리자 열고 그려진된 ROI를 추가 합니다. "설정 측정"에서 ' 경계 사각형 ' 옵션을 선택 합니다.
참고: "경계 사각형" 옵션 그려진된 핵 주위에 작은 사각형을 계산합니다. - "측정"을 클릭 합니다.
참고: BX와 BY, 사각형의 왼쪽된 위 모퉁이의 좌표는 테이블이 나타납니다: ' 사각형 위치 ' 하 고 너비와 높이 제공 합니다. BX, BY 이라고 참조 하는 경계 사각형의 좌표는
및 
.
- 정규화 된 핵에서 각 네트워크 위치 표현
- 각 셀 참조 X 4 (검은 사각형 그림5에서)의 좌표 표현 다음 수식을 사용 하 여:
장소:
는 4 X 셀 좌표 참조; 
는 20 X 참조 셀 좌표 (오렌지 광장 그림 5에서); 그리고 
X 4 X 이미지 (20XR)에서 참조 포인트 20의 좌표. - ( 그림 5의 파란색) 참조 하는 경계 사각형에 셀 좌표 표현 다음 수식을 사용 하 여:
장소:
셀 참조; 하는 경계 사각형의 좌표는 
는 X 4에서 셀 좌표 참조; 그리고 
는 경계 사각형의 좌표 4 X 이미지에서 참조. - 다음 수식을 사용 하 여 경계 사각형의 높이 폭의 비율을 참조 하는 경계 사각형의 셀 좌표 변환:
장소:
셀 폭의 비율 및 높이 경계 사각형;의 좌표는 
셀 참조; 하는 경계 사각형의 좌표는 
프로토콜; 위에서 측정 하는 경계 사각형의 너비입니다 그리고 
는 경계 사각형의 높이 측정 위의 프로토콜에. - 같은 그림에 모든 네트워크를 표현 하기 위해 계정에 걸릴 슬라이스 (왼쪽 또는 오른쪽)의 방향. 데이터를 표준화 하는 참조에 적용 됩니다 슬라이스의 왼쪽. X 좌표에만 다음 수식을 적용 하 여 왼쪽 오른쪽의 네트워크 좌표를 전송:
장소:
은 슬라이스; 오른쪽에 x 좌표 그리고 
은 새로운 x 좌표 슬라이스의 왼쪽에는 참조에 표현.
참고: 또는, 거울 분석 하기 전에 ImageJFIJI에 그림 (이미지 | 변환 | 뒤집기 수평으로). - 우선 방향의 기본 벡터의 좌표 표현 하 셀 좌표 (단계 6.5.3.1 6.5.3.4)와 같은 단계를 수행 합니다.
참고: 백분율로 좌표 식 있는 핵 (NVsnpr)은 사각형으로 설계 된 단일 플롯으로 데이터의 편집을 허용 한다.
- 각 셀 참조 X 4 (검은 사각형 그림5에서)의 좌표 표현 다음 수식을 사용 하 여:
- 20 X 4 X 이미지의 맞춤
- 우선 방향 주요 벡터의 각도 차이의 연구
참고: astrocytic 네트워크의 각도 차이 관심의 핵의 중심을 향해 우선 방향을 인지 확인 하는 데 사용 됩니다. ( 그림 5의 PD, 빨간 라인) 네트워크의 우선 방향의 주요 벡터와 c P를 연결 하는 선 사이의 각도 각도 차이 ( 그림 5의 α)를 계산 하려면 삼각형 PDC (참조로 알-카스 정리 적용 삽입 된 그림 5 의 보충 방법).- 첫째, 직교 참조 사용 하 여 다음과 같은 방정식으로 피타고라스의 정리의 응용 프로그램을 사용 하 여 서로 다른 길이 계산:
장소: P와 C의 좌표는
, 
, 각각, (위의 계산) 경계 사각형 참조에서. - 다음 수식을 사용 하 여 라디안에서 각도 차이 확인 합니다.
- 도 (예를 들어, Excel 소프트웨어에서도 함수) 각도 차이 변환 합니다.
- 세로 막대형 차트 (그림 ℃ 및 7 D)에 그들을 그려서 모든 각도 차이 컴파일하고 astrocytic 네트워크의 우선 방향을 인지 확인 합니다.
- 첫째, 직교 참조 사용 하 여 다음과 같은 방정식으로 피타고라스의 정리의 응용 프로그램을 사용 하 여 서로 다른 길이 계산:
좌표로 주어진 셀; 
패치 셀 (또는 네트워크의 참조 포인트);의 좌표로 그리고 
으로 지정 된 셀에 새 참조에 대 한 좌표.
)으로 우선 방향;의 기본 벡터의 좌표 그리고 
는 패치 취득 네트워크의 각 셀의 좌표로 셀로 참조.
및 
.
는 4 X 셀 좌표 참조; 
는 20 X 참조 셀 좌표 (오렌지 광장 그림 5에서); 그리고 
X 4 X 이미지 (20XR)에서 참조 포인트 20의 좌표.
셀 참조; 하는 경계 사각형의 좌표는 
는 X 4에서 셀 좌표 참조; 그리고 
는 경계 사각형의 좌표 4 X 이미지에서 참조.
셀 폭의 비율 및 높이 경계 사각형;의 좌표는 
셀 참조; 하는 경계 사각형의 좌표는 
프로토콜; 위에서 측정 하는 경계 사각형의 너비입니다 그리고 
는 경계 사각형의 높이 측정 위의 프로토콜에.
은 슬라이스; 오른쪽에 x 좌표 그리고 
은 새로운 x 좌표 슬라이스의 왼쪽에는 참조에 표현.
, 
, 각각, (위의 계산) 경계 사각형 참조에서.
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Representative Results
뇌에서 세포 간의 결합 정적 하지만 오히려 동적으로 많은 요인에 의해 규제 되지 않습니다. 다른 조건 하에서 공개 astrocytic 네트워크를 분석 하 고 NVsnpr에 그들의 조직을 이해 하기 설명 하는 방법 개발 되었다. 이러한 결과 출판된1에 이미 있다. 우리는 세 가지 다른 조건에서 NVsnpr의 등 쪽 부분에 단일 이다 biocytin 작성 수행: 캘리포니아2 +(제어 조건에 없을 경우에 어떤 자극), 휴식-무료 조건, 및의 전기 자극에 따라 감각 섬유는 핵에 프로젝트입니다. 각 조건에 대 한 이다 biocytin 작성에 대 한 실험 설정은 그림 6A-C의 왼쪽된 측면에 설명 됩니다.
Biocytin 표시 된 셀의 네트워크 제어 조건에서 관찰 됐다 고 나머지에서 NVsnpr 이다 사이 결합 하는 세포의 기저 상태 확인. 11 테스트 경우, biocytin 확산 네트워크 11 ± 3 셀 ( 그림 6A, 그림 6D에 중간 패널) 확장 34737 ± 13254 µ m2 (그림 6E)의 영역으로 구성 했다. Carbenoxolone (CBX, 20 μ M), 간격 접속점의 일반적인 차단기 관찰된 레이블 간격 접속점 및 누설 수 biocytin의 세포에 의해 이해 하지 통해 biocytin 확산의 결과 보장 하기 위해 독립적인 실험에서 사용 되었다 로 패치 전에 패치 피 펫에 적용 하는 긍정적인 압력에서 세포 외 공간. 2 ± 0.5 셀 ( 그림 6A, 그림 6D;에서 오른쪽 패널에 레이블이 지정 된 셀의 수를 감소 하는 CBX의 목욕 응용 프로그램 Iman 코노 버는 방법, P = 0.016; Holm-Sidak 테스트, P = 0.010) biocytin 영역 확산 2297 ± 1726 µ m2 (6E 그림; Iman 코노 버는 방법, P = 0.0009; Holm-Sidak 테스트, P = 0.025).
NVsnpr astrocytic 네트워크 낮은 세포 외 칼슘 농도 열고 connexins 및 간격 접속점20,,2122, 그것으로 알려져 있기 때문에 테스트에 매체에서 칼슘 제거의 효과 사용할 수 있습니다. 크고 균일 한 자극에서 syncytium 열고 간격 접속점 통해 추적 프로그램 보급을 극대화으로. 캘리포니아2 +에서 계시 되었다 astrocytic 네트워크-무료 조건 (n = 10) 37 ± 10 표시 세포 (중간 패널 그림 6 c, 그림 6D; 제어 조건에서 네트워크 보다 더 많은 셀을 보였다 Iman 코노 버는 방법, P = 0.016; Holm-Sidak 테스트, P < 0.001) 108123 ± 27450 μ m2 ( 그림 6 c, 6E 그림; 중간 패널의 영역을 다루는 Iman 코노 버는 방법, P = 0.009; Holm-Sidak 테스트, P = 0.001).
매체에서 칼슘의 완전 한 제거에 비교해, 관심의 핵을 구심 성 입력의 전기 자극 직접 관심의 신경 회로 포함 하는 더 많은 생리 적 자극 이다. 따라서, 조작의이 유형의 결과 관찰 astrocytic 네트워크의 기능적인 의미에 대 한 의미 있는 정보를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 두 개의 서로 다른 경로에서 입력 커플링 주어진된 지역에 있는 세포의 기저 상태에 다양 한 효과로 이어질 수 있습니다 또는 그것은 핵의 다른 구획에서 이다 간의 결합을 유도 수 있습니다. 우리의 회로에서 40-60 Hz에 0.2 ms의 2 번째 열차를 사용 하 여 NVsnpr를 프로젝트 감각 섬유의 전기 자극 펄스 (n = 11) 23 ± 6 셀 unstimulated 조건 기준으로 NVsnpr 이다 사이의 커플링의 증가 생산 (중간 패널 그림 6B, 그림 6D; Iman 코노 버는 방법, P = 0.016; Holm-Sidak 테스트, P = 0.012) 814174 ± 15270 μ m2 ( 그림 6B, 6E 그림;에 중간 패널의 영역 밖으로 확산 Iman 코노 버는 방법, P = 0.009; Holm-Sidak 테스트, P = 0.004).
이러한 두 종류의 자극, 매체에서 칼슘의 제거와의 구심 성 입력을 전기 자극의 효과 모두 CBX에 의해 중단 됩니다. 이 상태에서 astrocytic 네트워크 구성에서 Ca2 +5 ± 1 셀-무료 실제 ( 그림 6 c, 그림 6D에 오른쪽 패널; n = 4; Iman 코노 버는 방법, P = 0.016; Holm-Sidak 테스트, P < 0.001) 및 감각 섬유 자극 9 ± 2 셀 ( 그림 6B, 그림 6D에 오른쪽 패널; n = 6; Iman 코노 버는 방법, P = 0.016; Holm-Sidak 테스트, P = 0.023). 네트워크 표면 영역 또한 캘리포니아2 +17987 ± 9843 µ m2 로 감소 되었다-무료 실제 (그림 6E; n = 4; Iman 코노 버는 방법, P = 0.009; Holm-Sidak 테스트, P = 0.004)와 감각 섬유 자극 39379 ± 11014 µ m2 (그림 6E; n = 6; Iman 코노 버는 방법, P = 0.009; Holm-Sidak 테스트, P = 0.055).
해 부 분석 이미징, X 4에 NVsnpr 경계 수 명확 하 게 정의 된 하는 있는 경우에만 수행 했다는 10 중에서 9 네트워크에 대 한 경우 Ca2 +얻은-무료 실제와 8의 11 네트워크 전기 자극으로 얻은. 이론적인 NVnspr에 모든 분석된 astrocytic 네트워크의 표시는 네트워크에 구성 된 대부분의 세포 (그림 7A와 7B, 왼쪽과 가운데 패널) 핵 경계 내에서 국한 되었다 보여줍니다. 캘리포니아2 +-무료 실제, 9 개의 4 astrocytic 네트워크 medially는 NVsnpr에 있는 모터 핵의 방향에 NVsnpr의 외부 확산. 4이 경우에서 레이블이 지정 된 셀의 대부분 핵에 국한 되었다. 감각 섬유의 전기 자극으로 얻은 레이블이 지정 된 셀의 네트워크 더 제한 했다. 2 네트워크를 하나 걸쳐 mediodorsal 국경 측면 supratrigeminal 영역 ( 그림 7B에 어두운 녹색 네트워크, 왼쪽과 가운데 패널)으로 핵 국경 확장. 두 번째 경우에서 (그림 7B, 왼쪽과 가운데 패널) 빨간 네트워크에 2 이다는 NVsnpr의 복 부 부분에 교차.
Astrocytic 네트워크 우선 방향 ( 그림 7A 와 7B의 오른쪽 패널)에 대 한 vectorial 분석 사용 자극에 따라 다른 결과 생산. 사실, 캘리포니아2 +관찰 astrocytic 네트워크에 대 한-무료 실제 우선 오리 엔 테이 션 벡터 중 하나를 제외 하 고 모두는 NVsnpr의 중심 쪽으로 지향 했다. 그러나,이 전기 자극으로 관찰 하는 astrocytic 네트워크 우선 방향 벡터 지향 핵의 테두리 쪽으로 주로 했다. 이것은 캘리포니아2 +얻은 astrocytic 네트워크 사이 특혜 방향 계산된 각도 차이 의해 반영-실제와 감각 섬유의 전기 자극으로 얻을 그 무료. 캘리포니아2 +-무료 실제 각도 차이의 분포의 세로 막대형 차트는 레이블이 지정 된 셀의 네트워크의 대부분이 0 39.5 ±의 각도 차이의 의미와 40도 사이의 각도 차이 12.7도 ( 보여주었다 그림 ℃). 감각 섬유의 전기 자극, 분포 보다 균일 이며 평균 각도 차이 (99.5 ± 17도) 상당히 다르다 (그림 7D; 학생 t-검정, P = 0.012).
이러한 데이터는 biocytin 분석 라벨 astrocytic 커플링을 변조 하는 다른 자극의 효과 구별 수 있습니다 보여줍니다. 또한, 표준화 된 핵 vectorial 분석 뒤에 astrocytic 네트워크의 크기와 이러한 네트워크의 해 부 조직에 귀중 한 정보를 제공 합니다.
그림 1: 사이토의 전체 셀 패치 클램프. (A) NVsnpr에서 마커 sulforhodamine 101 (SR-101)의 로딩 표시 이다. SR 101 표시 된 사이토 소마 패치 피 펫 (흰색 점선)와 대상 이다. 눈금 막대 100 μ m =. (B) depolarizing 램프 프로토콜 (110mV 하-120)에서 전압 클램프 사이토 수동 특성을 평가 하기 위해 수행 됩니다. (C) 활동 전위 전류 클램프 모드에서 전류 펄스의 주입은 사이토에 발사의 부족의 평가. 이 수치는 콘 외. 에서 적응 (2018) 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 치료 및 ImageJFIJI 소프트웨어와 함께 astrocytic 네트워크의 분석. (A) Z-스택 astrocytic 네트워크의 confocal 영상에서 창조. 왼쪽 상단 Z-스택 창 ImageJFIJI. (B) 배경 빼기 과정입니다. 왼쪽 상단에 ImageJFIJI에 배경 창을 뺍니다. 어디 빼기 배경 명령의 효과 더 명백한 때 이미지 영역을 강조 하는 점선된 원 A. (C) 제거 outliers 과정에서 이미지에 비해. 이 프로세스는 알 렉 사 594에 결합 하는 streptavidine의 불특정 예금 때문 작은 반점 제거 합니다. 흰색 화살표 표시 (그림 2B) 전에 입금 하 고 (그림 2C) 후 명령이 처리 되었습니다. 왼쪽 상단에에서 ImageJFIJI에 outliers 창을 제거 합니다. (D) 제거 outliers 매개 변수의 부적당 한 조정에 의해 생성 될 수 있습니다 흐림 효과의 예. 노란색 화살표 표시 일부 흐리게 셀. (E) 임계값 프로세스를 조정 합니다. 왼쪽 상단에 ImageJFIJI에서 임계값 창을 조정 합니다. 스크롤 막대 임계값 신호 조정에서 작동합니다. (F) 이진 단계를 확인 합니다. 이미지는 ImageJFIJI에 이진 파일로 변환 됩니다. 눈금 막대 100 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: ImageJFIJI와 astrocytic 네트워크에서 셀의 검출. (A)의 ImageJFIJI에서 astrocytic 네트워크의 이진 이미지를 예. 눈금 막대 100 μ m =. (B) 이진 파일에 분석 입자 프로세스를 적용 한 후 얻은 "검색 파일을"을 보여 줍니다. 셰이프는 빨강에 그들의 연결 번호로 검색 된 모든 셀에 해당합니다. (C) 부분을 왼쪽: 입자 창 ImageJFIJI에서 분석. 이 함수는 바이너리 이미지에 네트워크의 셀을 검색합니다. 검색 된 세포와 그들의 순환의 크기를 조정할 수 있습니다. 만족 스러운 결과 얻을 때까지 평가판 및 오류에 의해 사용 되는 숫자를 설정 해야 합니다. 오른쪽 부분: 검색 테이블 분석 입자 프로세스에 의해 생성 된. X 및 Y 열 이미지에서 검색 된 각 셀의 좌표를 나열 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 네트워크 지역 분석 및 ImageJFIJI에서 패치 셀의. (A) 사용 하 여 클러스터의 주위 ImageJFIJI, ROI에에서 다각형 도구 추적 감지 세포 (레드 라인) 네트워크의 표면 영역을 결정 하는 데 사용 됩니다. (B) 투자 수익 ROI 관리자에 추가 됩니다. (C)는 패치 셀 (흰색 화살표)의 biocytin 라벨의 눈에 띄는 강도 때문에 쉽게 식별이 astrocytic 네트워크의 예입니다. (D) astrocytic 네트워크의 예 고친된 세포를 식별할 수 없는, 하지만 어디의 밀도가 지역 biocytin 예금 나타냅니다 명확 하 게 라벨. ROI는 주변이 그려지고 ROI 관리자에 추가 됩니다. 그것의 중심 계산 이며 vectorial 분석에 사용할 패치 셀의 위치를 간주 합니다. 눈금 막대 100 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: astrocytic 네트워크 분석을 위해 사용 하는 다른 referentials의 다이어그램. 회색 사각형은 어도비 일러스트 레이 터 문서의 왼쪽된 하단 모서리에 맞춰 정렬 되려면 참조 포인트 4XR와 4 X 이미지입니다. 오렌지에 둘러싸인 흰색 사각형 참조 포인트 20XR와 20 X 이미지입니다. 두 이미지는 서로와 프로토콜에 설명 된 대로 정렬 됩니다. 경계 사각형 (블루) NVsnpr (보라색 점선)를 정의 하 고 참조 포인트 (BR) 비율에서 조정 됩니다. NVsnpr의 등 쪽 부분의 theoric 센터 진한 파란색 점 (C)에 의해 도식화 이다. Astrocytic 네트워크 패치 셀 (검은 점, P)에 의해 도식화 및 우선 방향 (레드 라인)의 주요 벡터. 각 파선 블랙 astrocytic 네트워크의 각 셀의 벡터 이다. Astrocytic 네트워크 (α)의 각도 차이 네트워크 (레드 라인)의 주요 우선 방향 및 핵의 이론적인 센터에 연결 하는 패치 사이토 검은 선 사이의 각도입니다. 삽입은 PCD는 NVsnpr (C), 기 워 진된 셀 및 우선 방향 (D)의 주요 벡터의 이론적인 센터에 의해 형성 된 삼각형을 보여주는 20 X 이미지의 확대/축소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 다양 한 크기를 표시 하는 다른 조건 하에서 NVsnpr에 biocytin 표시 Astrocytic 네트워크. (A-C) 에 왼쪽, 실험 조건의 그리기 회로도. 모든 조건에서 단일 사이토 SR-101에 의해 표시 된 전체 세포 기록에 대 한 대상 이었고 biocytin (0.2%)으로 가득. 중간 열: V목 관 (2 s 기차, 40-60 Hz, 10-300 µ A, 0.2 ms 펄스)의 전기 자극 후 photomicrographs astrocytic 네트워크 제어에서 얻은 보여주는 조건 (A), (B); 관류는 캘리포니아2 +후-무료 실제 (C). 오른쪽 열: photomicrographs astrocytic 네트워크를 보여주는 얻은 동일한 조건 하에서 하지만 CBX의 존재 (20 μ M) 목욕 사전에서. 눈금 막대 100 μ m =. (D 및 E) 세로 막대 차트의 수를 나타내는 결합 된 셀과 영역, 각각, 이다 위의 세 가지 실험 조건에서의 biocytin 가득 네트워크의 (A, B 및 C) (부 화) 하는 존재와 부재 (솔리드) CBX (20 Μ M). 데이터 의미 ± SEM. 다중 비교 (Holm Sidak 테스트)로 표시 됩니다: * P = < 0.05; * * P = 0.001 <. 이 수치는 콘 외. 에서 적응 (2018) 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 캘리포니아2 +에서 NVsnpr에 네트워크의 특성-무료 실제와 V일 관의 전기 자극. (A와 B) 왼쪽: 캘리포니아2 +관류에서 9 네트워크에 표시 된 모든 셀 가득-실제 무료 (A) 또는 V목 관 (B)를 자극 하면서 가득 8 네트워크에서 이론적인 NVsnpr 핵 (회색 사각형)에 있는 그들의 위치에 따라 그려집니다. 각 네트워크 (와 그것을 구성 하는 세포) 다른 색으로 표시 됩니다. 가운데: 각 네트워크의 경계. 각 지역에서 도트 패치 셀을 나타냅니다. 오른쪽: 각 네트워크의 우선 방향의 주요 벡터의 표현. 점을 패치 셀과 화살표 우선 방향 벡터를 나타냅니다. (C, D) 우선 방향의 주요 벡터와 아래 패치 셀 NVsnpr (dorsoventral 축에서 25% 및 입장 축에 50%에 위치)의 등 쪽 부분의 중심을 연결 하는 직선의 각도 차이의 분포는 두 가지 조건을 공부. 평균 각도 차이 39.5 ± 12.7도 캘리포니아2 +-무료 실제를 나타내는 핵의 99.5 ± 센터 쪽으로 우선 방향 쪽으로 우선 방향을 나타내는 전기 자극으로 17도 주변 (학생 t-검정, P = 0.012). 이 수치는 콘 외. 에서 적응 (2018) 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 자당-실제* | mMol |
| 자당 | 219 |
| KCl | 3 |
| KH2포4 | 1.25 |
| MgSO4 | 4 |
| NaHCO3 | 26 |
| 우선 당 | 10 |
| CaCl2 | 0.2 |
표 1: 뇌 조각화 사용 자당 기반 솔루션의. (*) = pH 및 osmolarity는 7.3-7.4 및 300-320 조정된 mosmol/kg, 각각.
| 실제* | mMol |
| NaCl | 124 |
| KCL | 3 |
| KH2포4 | 1.25 |
| MgSO4 | 1.3 |
| NaHCO3 | 26 |
| 우선 당 | 10 |
| CaCl2 | 1.6 |
표 2: 분할 저장 및 전체 셀 녹음에 사용 되는 실제 솔루션의 구성. (*) = pH 및 osmolarity는 7.3-7.4 및 290-300 조정된 mosmol/kg, 각각.
| 내부 패치 솔루션* | mMol |
| K-글 루 콘 산 | 140 |
| NaCl | 5 |
| HEPES | 10 |
| EGTA | 0.5 |
| 트리 스 ATP 소금 | 2 |
| 트리 스 GTP 소금 | 0.4 |
표 3: 전체 셀 녹음에 사용 되는 내부 솔루션의 구성. (*) = pH 및 osmolarity는 7.2-7.3 및 280-300 조정된 mosmol/kg, 각각.
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Discussion
Electrophysiological 방법의 수 이다23,24사이 결합 기능을 평가 하기 위해 존재 한다. 그러나,이 메서드는 astrocytic 네트워크의 해부학 적 배열에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. 많은 연구를 이미 그 "염료 또는 추적 프로그램-커플링", 다 여기, 발생의 일부분에만 electrophysiological 방법25,26,27, 그 제안에 의해 검색 된 셀을 결합 하 여 나타났습니다는 이 방법으로 검색 하는 셀의 수를 과소평가 된다. 그럼에도 불구 하 고, 여전히 커플링의 시각화에 대 한 가장 좋은 방법입니다. 더 큰 염료 커플링 간격 접속점20침투 1-1.2 KDa 보다 작은 분자 추적기를 사용할 때 얻을 수 있다. 커플링의 라이브 시각화 형광 포도 당 유도체 (2-NBDG) 또는 (예: 일부 알 렉 사 염료 또는 루시퍼 노란색) 형광 마커13의 확산을 모니터링 하 여 수행할 수 있습니다 하지만 작은 크기로 인해 biocytin 더 나은 결과 산출 하 고 고정 된 조직에서 정량화 할 수 있습니다. 따라서,이 방법으로 감지 하는 세포의 수는 크게 과소 평가 주목 한다. 그들의 연결 때문에 아닙니다 그러나 세포 외 공간으로 샜 추적기의 통풍 관 때문에 다른 한편으로, 일부 셀 표시 될 수 있습니다. 누설에서 유래 라벨의 범위는 갭 정션 차단기1의 목욕 응용 제어 실험에서 추정 수 있습니다. 그러나, 그것은 어떤 바이어스도는 방법으로 모든 조건에 적용 것 이라고 생각 수 있습니다.
마지막으로, 모든 결합된 세포는 이다 강조 한다. Panglial 네트워크 이다 oligodendrocytes를 결합 하는 측면 우수한 올리브8, 시상16, 피 질, 해 마28등 여러 뇌 분야에서 설명 했습니다. 우리의 목표는 그들은 잘 정의 된, 독특한 기능 도메인 다른 자극에 의해 형성 하는 가설을 평가 하기 위해 다른 조건 하에서 염색 커플링 공개 astrocytic 네트워크를 비교 하는 방법을 개발 했다. NVsnpr, 실시 하는이 프로토콜은, trigeminal brainstem 핵 이다 간의 결합은 매우 제한 된 이후 휴식 조건, 아래 먼저 레이블된 셀을 검출 안정적이 고 공평한 방법을 개발 하는 것이 중요 했다. 이 ImageJFIJI와 자동된 감지로 달성 되었다. 때로는 배경 잡음에서 희미하게 레이블된 셀을 구별 하는 것이 어렵습니다. 여기, 스택 이미징 및 ImageJFIJI 메서드는 신호를 개선 하는 데 사용 됩니다 하지만 배경 잡음 수 여전히 너무 높고 데이터 거부를 리드. 미래 연구에서 명확한 프로토콜 신호 대 잡음 비율을 개선 하기 위해 사용할 수 있습니다. 개간 프로토콜 설명 조직 형태 (수축)을 유지, 지질에는 영향을 미치지 않습니다 이며 immunostaining29와 호환의 재미 있는 방법입니다. 설명 하는 방법의 또 다른 한계는 너무 가까이 셀을 차별 하는 데 사용 하는 "분수령" 도구 서로. 검색 된 셀의 시각적 검사 때이 도구를 사용 하 여 수행 되어야 합니다.
Astrocytic 네트워크 형성 기능 도메인, 다음 그들은 핵의 경계를 정의할 수 있습니다 또는 적어도 핵의 경계에 국한 한다. 네트워크 수 있습니다 항상 국한는 핵 내에서 더 많은 그래서 패치 사이토 중심에 (또는 이내) 인 경우 크기가 작은 경우 공개 핵. 선호는 핵의 국경 근처에 앉아 이다 부부 핵 밖에 다른 이다 또는 다른 사람 핵 내에서 하는 경우를 테스트 하려면 우리는 염료 확산 패치 사이토에서 우선 방향을 결정 필요 합니다. 다른 여러 연구 총 신 피 질, 시상, 후 각 glomeruli, 해 마, 그리고 측면 우수한 올리브의 barreloid 필드에 비슷한 문제를 해결 해야 하지만 그들은 분석 추적 프로그램의 거리에 주로 초점을 맞춘 이다 그들의 지 방화의 기능 그리고이 잘 정의 된 구조8,,910에 관하여 직교 축 따라 염료의 확산에의 다양 한 종류의 electrophysiological 특성화 13,,1416. 여기, 우리가 추적 프로그램 확산, 어떤 크기의 정규화 된 주요 벡터의 방향에 의해 주어졌다의 지배적인 방향을 결정 vectorial 분석 사용. 작은 벡터 아무 명확한 "지배" 또는 우선 방향을 나타냅니다. Vectorial 분석에 대 한 중요 한 단계는 정확 하 게는 항상 가능한 패치 사이토를 식별 하는 기능입니다. 대형 (비 간격 교차점 permeant)를 추가 하는 패치 사이토를 찾는 데 도움이 흥미로운 대신와 dextrans 녹음 솔루션 처럼 고칠 수 추적. 패치 셀 또는 패치 위치를 확인할 수는 없습니다, 그것은 벡터 분석에서 이러한 실험을 생략 좋을 수 있습니다.
마지막으로, 핵에 있는 그들의 위치에 따라 네트워크의 속성 변화 여부를 분석, 우리는 "정규화" 핵에서 그들의 위치를 표현 하는 방법이 필요 합니다. 이 절차에만 중요 한 단계는 명확 하 게 낮은 확대 이미지 (4 배)에 핵의 테두리를 볼 수 있는 능력입니다. 이 문제에 간단한 해결책, 자주 발생 하는 경우 분석 하기 전에 처리 하는 조직에 표준 조직학 채색을 추가 하는.
이 두뇌 지역에 걸쳐 이다의 명확 하 게 설립, 그리고 증거의 성장 몸은 그들의 전문화는 특히9, 에 포함 하는 회로의 기능에 맞게 개념 지원 10,,3031. 이 사실, 간 astrocytic 통신 이다 동일한 회로에 관련 된 제한 해야 합니다. 관찰이이 가정을 지 원하는 서로 다른 뇌 영역에서 신흥 하지만 총 신 피 질 또는 후 각 전구에 감각 지도 같은 클러스터 된 표현으로 지역에서 더 분명. 그러나, 신경 및 astrocytic 지도 사이 오버랩의 대부분의 리포트는 설명 하 고 질적. 여기에서 보고 된 방법 이러한 관찰 객관성 개발 하 고 더 나은 주어진된 회로에서 그들의 위치에 따라 astrocytic 네트워크를 분석 하는 도구 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회, 부여/보너스 번호에 의해 투자: 14392.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
References
- Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
- Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
- Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control? Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
- Verkhratsky, A., Steinhauser, C. Ion channels in glial cells. Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).
- Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neuroscience. 286, 45-59 (2015).
- Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
- Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
- Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
- Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
- Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
- Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
- Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
- Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
- Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
- Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).
- Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).
- Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
- Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
- Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
- Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
- Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
- Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
- Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
- Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).
