Summary
Her presenterer vi en protokoll for å vurdere organiseringen av astrocytic nettverk. Metoden beskrevet minimerer bias å gi beskrivende tiltak av disse nettverkene som celletall, størrelse, område og posisjon i en kjerne. Anisotropy vurderes med en vectorial analyse.
Abstract
Det har blitt stadig klarere at astrocyttene modulerer neuronal funksjonen ikke bare i synaptic og encellede nivåer, men også for nettverket plan flate. Astrocyttene er sterkt knyttet til hverandre gjennom gapet veikryss og koplingen gjennom disse veikryss er dynamisk og sterkt regulert. En nye konseptet er at astrocytic funksjoner er spesialisert og tilpasset til funksjoner av neuronal krets som de er tilknyttet. Derfor er metoder å måle ulike parametere av astrocytic nettverk nødvendig for å bedre beskrive reglene styrer kommunikasjonen og kopling og til videre forstå deres funksjoner.
Her, ved hjelp av image analyseprogramvare (f.eks., ImageJFIJI), vi beskriver en metode for å analysere AC confocal bilder av astrocytic nettverk avslørt av fargestoff-kobling. Disse metodene tillater 1) en automatisert og upartiske deteksjon av merket celler, 2) beregning av størrelsen på nettverket, 3) beregning av fortrinnsrett retningen fargestoff spredt i nettverket, og 4) omplassering av nettverk i området av interesse .
Denne analysen kan brukes til å karakterisere astrocytic nettverk av et bestemt område, sammenligne nettverk av ulike områder knyttet til funksjoner eller sammenligne nettverk innhentet under ulike forhold som har ulike effekter på koblingen. Disse observasjonene kan føre til viktige funksjonelle hensyn. For eksempel analyserer vi astrocytic nettverk av en trigeminal kjernen, der vi tidligere har vist at astrocytic kobling er avgjørende for muligheten av neurons å bytte sine avfyring mønstre fra tonic til rytmisk sprengning1. Ved å måle størrelsen, confinement og fortrinnsrett orientering av astrocytic nettverk i dette, kan vi bygge hypoteser om funksjonelle domener som de circumscribe. Flere studier tyder på at flere andre hjernen områder, inkludert fat cortex, lateral overlegen oliven, olfactory glomeruli og sensoriske kjerner i thalamus og hjernebarken å nevne noen, kan ha nytte av en tilsvarende analyse.
Introduction
Mange studier har beskrevet hvordan Nevron-astrocytter dialog på en sub mobilnettet eller synaptic kan ha implikasjoner i neuronal funksjoner og synaptic overføring. Det er godt etablert at astrocyttene er følsomme for rundt neuronal aktivitet. de har faktisk reseptorer for mange nevrotransmittere inkludert glutamat, GABA, acetylcholine og ATP (se tidligere utgitt av2,3,4). Til gjengjeld behandler astrocytic ensheath synaptic elementer og innflytelse neuronal aktivitet både det og på extrasynaptic steder ved regulere ekstracellulære ioniske homeostase og slippe flere faktorer eller sendere som glutamat, D-serine og ATP 5 , 6 , 7.
Ideen om at astrocyttene kan også modulerer neuronal funksjonen for nettverket plan flate har dukket opp, med bevis at astrocytic reguleres romlig og tilsvarer neuronal segmentering i områder som er preget av en klar anatomiske compartmentalization (som områder med sensoriske representasjoner), indikerer at astrocyttene vil par til andre astrocyttene tjene samme funksjon i stedet for bare de som finnes i nærheten. I laterale overlegen olivenolje, for eksempel er mest astrocytic nettverk orientert ortogonalt til tonotopic akse8, mens i fat cortex eller olfactoty glomeruli, kommunikasjon mellom astrocyttene er mye sterkere i FAT eller glomeruli og svakere mellom tilstøtende de9,10. I begge tilfeller er astrocytic nettverkene orientert mot midten av glomerule eller FAT9,10.
Vi nylig viste at astrocytic aktivitet modulerer neuronal avfyring ved å redusere konsentrasjonen av ekstracellulære Ca2 + ([Ca2 +]e), antagelig gjennom utgivelsen av S100β, en Ca2 +-bindende protein11. Denne effekten, som ble demonstrert i en befolkning på trigeminal rhythmogenic nerveceller i dorsal del av trigeminal sensoriske kjernen (NVsnpr, å spille en viktig rolle i generasjon masticatory bevegelser), skyldes faktum at rytmisk avfyring i disse neurons er avhengig av en vedvarende Na+ gjeldende som er fremmet av nedgang [Ca2 +]e11,12. Rytmisk avfyring i disse neurons kan "fysiologisk" brakt frem av stimulering av deres innganger eller kunstig nedgang av [Ca2 +]e. Vi viste videre at astrocytic koblingen var nødvendig for neuronal rytmisk avfyring1. Dette hevet muligheten for at astrocytic nettverk kan danne omskrevet funksjonelle domener der neuronal aktivitet kan synkroniseres og koordinert. For å vurdere denne hypotesen, nødvendig vi første å utvikle en metode for å grundig dokumentere organiseringen av disse nettverk innen NVsnpr.
Tidligere studier på astrocytic nettverk har hovedsakelig beskrevet omfanget av koblingen i celle nummer og tetthet og området. Forsøk å evaluere form av astrocytic nettverk og retning av fargestoff-kopling ble hovedsakelig utført ved å sammenligne størrelsen på nettverk langs to akser (x og y) i fat cortex9, hippocampus13,14, 15, barreloid felt av thalamus16, lateral overlegen oliven8, olfactory glomeruli10og cortex14. Metodene som er beskrevet her kan upartiske antall merkede celler i et nettverk og en vurdering av området de dekker. Vi har også utviklet verktøy til å definere foretrukket retningen på koblingen innenfor et nettverk og vurdere om foretrukne retningen er mot midten av kjernen eller i en annen retning. I forhold til tidligere brukte metoder gir denne protokollen et middel til å beskrive organisasjon og orientering av astrocytic nettverk i strukturer som dorsal trigeminal viktigste sensoriske kjernen som ikke har en kjent klart anatomiske compartmentalization. I ovenfor studiene, nettverk retningen er beskrevet som et forhold til formen på strukturen i seg selv som er allerede dokumentert (f.eks., barreloid i thalamus, fat i cortex, lag i hippocampus og cortex, glomeruli i den Luktelappen, etc.). I tillegg gir vectorial analyse sammenligninger av orientering avslørte under ulike forhold. Hvis du vil analysere om disse parametrene endres i henhold til plasseringen av nettverk i kjernen, utviklet vi også en metode for å erstatte hvert nettverk referanse til grensene for kjernen. Disse verktøyene kan enkelt tilpasses til andre områder for undersøke nettverk kombinert celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer av kanadiske institutter for helseforskning reglene og ble godkjent av universitetet i Montreal dyr omsorg og bruk komiteen.
1. forberedelse av rotte hjernen skiver
- Forbered 1 L en sukrose-basert løsning (tabell 1) og 1 L standard kunstig cerebrale-spinalvæske (aCSF) (tabell 2).
- Boble sukrose-basert løsning med en blanding av 95% O2 og 5% CO2 (carbogen) i 30 min før du plasserer dem i-80 ° C i ca 30 min til løsningen er kaldt men ikke helt frossen. Bruk denne iskald sukrose som kutte bufferen til kutting av hjernen. Hold det på is når den fjernes fra fryseren.
- Boble aCSF med carbogen gjennom hele eksperimentet. Bruk denne løsningen for skive lagring og perfusing bufferen som patch-clamping og biocytin-utfylling av astrocyttene vil bli utført. Forberede en skive utvinning holder kammer innskudd sektorene hjernen så snart de er kuttet.
Merk: Skive utvinning holder kammeret kan være skreddersydd og består hovedsakelig av en liten godt med en maske på bunnen suspendert i en større brønn som er fylt med aCSF, som en tube er satt inn for å hente carbogen fra bunnen. - Bruk 15 - 21-dag-gamle Sprague-Dawley rotter uten skjevheter sex - eller stamme-spesifikk. Bedøve dyret med isoflurane (1 mL av isoflurane i en bedøvelse induksjon kammer). Sjekk dybden på anestesi ved forsiktig pinching bakben pote eller hale av dyret.
- Halshugge rotta bruker en guillotine, kuttet sin skallen med saks, og raskt fjerne hjernen fra kraniet med en flat slikkepott.
- Dypp hjernen i den iskalde sukrose-basert løsningen for om 30 s og overføre det (med løsningen) til en petri rett. Med et barberblad, fjerne delene som fremre og bakre til området for å være delt, hvis kutte skiver i tverrgående flyet.
- Lim den gjenværende blokken av hjernevevet på rostral siden og fortsetter å kutte hjernen skiver (350 µm tykk) i sukrose-baserte mediet bruker en vibratome. Deretter overføre samlet sektorene i en utvinning holder kammer fylt med carbogenated aCSF ved romtemperatur (RT) før de er klar til å brukes (tillater minst 1 time for gjenoppretting).
Merk: Den siste utviklingen innen tillater lengre inkubasjon opptil 24 h av hjernen skiver i vitro forhold17.
2. Sulforhodamine 101 (SR-101) merking av astrocyttene
- Forvarm et vannbad 34 ° c og plassere to stykke inkubasjon kamre i den. Fylle en av skive inkubasjon kammer med en løsning på aCSF som inneholder 1 μM SR-101, og fyll den andre bare med aCSF.
- Inkuber sektorene i inkubasjon kammeret som inneholder 1 µM SR-101 for 20 min og deretter overføre dem til den andre inkubering kammer for å skylle ut overflødig SR-101 fra vevet. La det ruge i 20 minutter eller mer på 34 ° C, deretter holde inkubasjon kammeret som inneholder skiver på RT til de er nødvendig18.
3. astrocytter Patching og Biocytin fylling
- Merk et stykke, og plasser den i innspillingen kammeret av mikroskopet. Patch astrocyttene, bruker elektroder med en motstand av 4-6MΩ når fylt med en kalium gluconate-basert løsning (se tabell 3).
- Under visuell veiledning og bruker en micromanipulator, direkte opptak elektroden mot en SR-101-merket astrocytter som vist i figur 1. Unngå celler lokalisert på overflaten av sektoren siden de er mer sannsynlig å bli skadet eller har mistet tilkoblinger til nabokommunene cellene.
- For å forhindre lekkasje av biocytin i vevet, minimere positiv presset lagt til oppdateringen pipette og bruke den bare når den er nær astrocytter som vil være lappet (0,1-0,4 mL i 1 mL sprøyter).
- Justere forskyvningen av pipette og dens kapasitans før, oppdatering. Rette for flytende krysset potensialer, så nøyaktig og presise spenning kommandoer er kritiske til eksperimenter19.
- Flytte pipette nært nok astrocytter å observere depresjon forårsaket av positivt trykk. Deretter fjerner det positivt trykket og langsomt bruke noen negative trykket. Klemme astrocytter til-70 mV når segl når 100 MΩ. Vent til segl når 1-3 GΩ. Fortsette å legge negative trykk før bryte inn i cellen. Vær forsiktig mens søknad negative trykket, siden astrocyttene er svært skjøre.
- Vurdere elektrofysiologiske egenskapene til lappet cellen. Spenning-klemme modus, utføre en hel celle strøm-spenning protokoll med en rampe spenning kommando 600 ms varighet alt fra-120 til +110 mV. I gjeldende-klemme modus, utfører du en trinn IV protokoll som injeksjon av 1000 ms gjeldende skritt av 100 pA fra -1 til 1 nA, samplingsfrekvensen av hele celle opptakene er 10 kHz.
Merk: Astrocyttene viser en lineær nåværende-spenning profil uten noen form for retting (som vist i figur 1B) og ingen handling potensial skyte på membran depolarization (figur 1 c). Hvile membran potensialet (rpm) bør være stabile og ikke positivt til - 60mV. I noen hjernen områder er RPM av astrocyttene mer hyperpolarized enn i NVsnpr. - Tillate biocytin å spre i astrocytter i 30 min mens du utfører et trinn IV protokollen hver 5 min.
- Trekke og koble oppdateringen Pipetter forsiktig uten å skade den lappet astrocytter og umiddelbart ta note av forskyvningen av pipette før du tar den ut av opptaket kammeret. Trekk verdien fra membranen potensielle opptakene.
- La hjernen sektoren å hvile i innspillingen kammeret i minst 15 minutter (i tillegg til 30 min for injeksjon) slik at spredning av tracer fra det lappet astrocytter hele nettverket kombinert celler.
Merk: For å avdekke et nettverk av kombinert celler, bare en enkelt celle bør være oppdatert i kjernen av interesse. Hvis flere forsøk er nødvendig for å oppnå en vellykket oppdatering, forkaste saken og prøve å lappe på siden kontralateral eller i en annen hjernen skive. - Lag et merke eller snitt i vevet til å identifisere hvilken side av stykket er vendt oppover, og overføre stykket først til en Petriskål som inneholder vanlige aCSF, deretter i en løsning av 4% paraformaldehyde (PFA). Inkuber sektoren på 4 ° C over natten.
FORSIKTIG: PFA er svært skadelig. Bruk verneutstyr i ventilert hette. Kontroller at alle materialer (pensler, rør, etc.) som har vært i kontakt med PFA ikke kontakter utvinning holder kammer, inkubasjon kammer eller andre materialer som brukes for registrering av ferskt vev.
4. Biocytin åpenbaring
- Åpenbaring med fluorescerende streptavidine
- Vask hjernen skiver 2 x 10 minutter i 0.1 M fosfat buffer saltvann (PBS) i RT. Så, avsløre biocytin av rugende hjernen skiver med streptavidine konjugert til en fluorophore på 1/200 fortynning i PBS med 4% ikke-ioniske vaskemiddel 4 h på RT.
- Vaske hjernen skiver 3 x 10 minutter i 0.1 M PBS på RT og montere delene på glass lysbilder ved hjelp av en vandig montering medium. Plasser sidene som ble injisert oppover, dekkglassvæske lysbilder, og forsegle dem med nail lakk.
- Åpenbaring DAB
Merk: DAB (3,3-diaminobenzidine) åpenbaring kan brukes når fluorescens ikke kan brukes. I dette tilfellet skal eneste åpenbaring metoden bli ansatt for å gjøre sammenligninger.- Vask hjernen skiver 3 x 10 minutter i PBS på RT. ruge sektorene i PBS + H2O2 0,5% i 1 time ved RT.
- Skyll skiver 3 x 10 minutter i PBS på RT. Deretter ruge sektorene i en avidin-biotin kompleks flekker løsning består av PBS og 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel + avidin-biotin komplekse peroxidase standard flekker kit reagenser på 1/100 til 24 timer på RT.
- Skyll skiver 3 x 10 minutter i PBS på RT, ruge dem i en løsning av PBS + DAB 0,05% etter 20 min på RT, og overføre dem i en løsning av PBS + DAB 0,05% + H2O2 0,5%.
FORSIKTIG: DAB er svært skadelig. Bruk verneutstyr i ventilert hette. Farge reaksjonen stoppes når skiver overføres i PBS. - Skyll skiver 5 x 10 min i PBS på RT, montere delene på glass lysbilder (møte sidene som ble injisert oppover) og la dem tørke på et lysbilde tørking benk overnatting på 34 ° C.
- Senk glass lysbilder for 1 min i flere alkohol bad på 70%, 95%, og 100% og slutt med bad av xylen for 1 min.
- Montere glass lysbilder ved hjelp av en toluen-basert syntetisk harpiks montering medium. Plasser coverslips på lysbildene og forsegle dem med nail lakk.
5. nettverk Imaging
- Visualisere astrocytic nettverk bruker skanning AC confocal mikroskop utstyrt med 20 X og 4 X mål (eller et riktig mål å visualisere hele kjernen der nettverket ligger) og en laser til å oppdage fluorophore (i dette tilfellet Alexa-594 er brukes).
- Bruke 20 X forstørrelsen for å gjøre en z-stabel av nettverk av merkede celler. Bruk en oppløsning på 800 x 800 piksler og skanne hastigheten på 12,5 μs/bildepunkt.
Merk: For å bilde hele nettverket, flere stabler er vanligvis nødvendig, og antall stakker må justeres for hvert nettverk. Oppløsning og skanning hastigheten kan endres, men sørg for å bruke de samme innstillingene til alle bildedata. - Bruk 4 X forstørrelse å ta bilder av nettverket og området rundt.
Merk: 4 X imaging brukes til å bestemme nettverk plasseringen i kjernen av interesse. Alltid bildet feltet i lyset. Dette bildet vil være nyttig hvis du ikke tror grensen av kjernen i AC confocal fluorescerende bildet.
6. bildeanalyser
- Data forberedelse
- Bruke programvaren ImageJFIJI (laste den på https://fiji.sc/). Åpne filen og klikk OK i vinduet "Bio-formater Import Options".
- Hvis du vil omdefinere en z-stabel som inneholder bare optisk sektorer trengte for siste z-stakken (figur 2A), klikk på "Stack"-knappen i verktøylinjen (finne, Merk stk | Z prosjekt). Velg "Max intensitet" i Projeksjonstypen innstilling (figur 2A). Lagre filen og gi den navnet "stable fil".
- Hvis filen imaging inneholder flere kanaler, dele den å spare bare kanalen med astrocytic network imaging (bilde | Farge | Delt kanaler).
- Kontroller innstillingene for piksel i bildet [bilde | Egenskaper | Pixel (med "1" for bildepunktdimensjonene)].
- Bruk verktøyet trekk fra bakgrunnen (prosess | Trekke fra bakgrunnen) å fjerne bakgrunnen i biocytin merking. Bruk forhåndsvisning til å angi rullende ballen radius, som er vanligvis satt på 50 piksler (figur 2B).
- Verktøyet Fjern outliers (prosess | Støy | Fjern Outliers) om nødvendig etter trekk fra bakgrunnen trinn. Velg "Bright" i innstillingen "Som uteliggere" (figur 2C). Bruk forhåndsvisning til å angi radius og terskel. Vær forsiktig med dette verktøyet, siden det kan dimme data, som vist i figur 2D.
Merk: Dette verktøyet fjerner av små flekker forårsaket av uspesifikke forekomster av streptavidine (som vist ved de hvite pilene i figur 2B og 2 C før og etter behandling, henholdsvis). - Justere terskelverdien (bilde | Justere | Terskel). Velg "Standard" og "B & W" modus (figur 2E). Klikk på "Bruk".
Merk: Automatisk justering kan brukes, men manuell justering med de to glidebryterne foretrekkes. Målet med dette trinnet er å redusere støy til maksimum uten å miste merket celler. - Konvertere bildet i en binær image med verktøyet binære prosessen (prosess | Binær | Gjøre binær) som vist i figur 2F. Lagre filen som en TIFF-fil og gi den navnet "binær fil".
- Cellen teller
- Kontrollere innstillingen av funksjonen mål (analyser | Angi mål). Velg alternativet "Centroid".
- Bruk verktøyet "Analysere partikler" på "binærfilen" (figur 3A) produsert i forrige trinn (analyser | Analysere partikkel) (Figur 3 c til venstre). Velg "Omriss" i innstillingen "Show" (Figur 3 c). Dette genererer en ny fil som viser resultatet av gjenkjenning (figur 3B).
- Spille med parametere: størrelse (bruk verdier mellom 30 og 6000 for å oppdage bare celler) og sirkularitet (til å angi et intervall mellom 0-1, i som "1" definerer en perfekt sirkel og "0" en tilfeldig figur) å avgrense påvisning (Figur 3 c, venstre). Løpe påvisning av klikker "OK".
Merk: To tabeller vises etter oppdagelsen: 1) en tabell med tittelen "Sammendrag" som gir antall oppdaget celler og 2) en tabell kalt "Resultater" (Figur 3 c, høyre) som inneholder x - og y-koordinatene til hver celle. - Kopierer verdiene og lime dem inn i et regnearkprogram. Lagre denne tabellen under navnet "tabellen". En fil med et plott av oppdaget celler vises også (figur 3B). Lagre filen som en TIFF-fil under navnet "oppdagelse fil".
- Hvis en gruppe av 2 eller flere merkede celler i nettverket registreres som en enkelt celle med verktøyet analyser partikler fordi de er for nær hverandre, bruke verktøyet vannskille (prosess | Binær | Vannskille) på binære bildet før analysere partikler verktøyet, og gjøre analyser partikler trinnene.
Merk: Vannskille verktøyet oppretter en avgrensning 1 bildepunkt bredt mellom ekstremt tett celler. En celle counter plug-in kan brukes når merking utvetydig og kan gjennomføres manuelt.
- Måle astrocytic nettverksområdet
- For å måle areal på nettverk, bruke gjenkjenning filen bruker bildet J.
- Markeringsverktøyet polygon (venstre klikk på knappen i verktøylinjen for å velge den) å spore et polygon som kobler alle cellene ligger i ytre utkanten av nettverket (figur 4A). VENSTREKLIKK for å starte sporing polygonen, og høyreklikk for å lukke den.
Merk: Denne polygon defineres som et område av interesse (ROI) og overflaten vil bli målt for å fastsette areal på nettverket. - Åpne vinduet sett måling (analyser | Angi mål) og velg alternativet "Området". Åpne ROI Manager (analysere | Verktøy | ROI Manager) (figur 4B). Deretter legge spores polygonen i Avkastningen Manager ved å klikke Legg '' til '' (figur 4B) og kjøre målingen ved å klikke '' mål '' i Avkastningen Manager.
Merk: Områdemålenheten vises i en tabell og uttrykkes i piksler. Ikke glem å konvertere denne verdien med omregningsfaktoren for mikroskopet brukes til å hente en verdi i μm2.
- Fastsettelse av hovedretning vektoren
- Fastsettelse av lappet cellen
- Åpne stakkfilen i ImageJFIJI og identifisere lappet cellen i stakkfilen basert på sterkere merking intensitet (figur 4C). Deretter åpne filen som heter "oppdagelsen tabell" i et regnearkprogram og Finn nummeret i lappet cellen og tilsvarende koordinatene.
- Hvis ikke å nøyaktig fastslå lappet cellen, omgir området der innbetalingen av biocytin er tettere i fotografert nettverket av kombinert celler, bruke Polygon-verktøyet i ImageJFIJI, og refererer til denne posisjonen som lappet cellen (Figur 4 d).
- Bruke avkastning (analysere | Verktøy | ROI Manager). Deretter trekke en avkastning på det lappet celleplassering og legge den til Avkastningen Manager (se figur 4B).
- Angi et mål (analyser | Angi mål) og velg alternativet "Centroid".
- I Avkastningen Manager, klikk på "Tiltak" for å få koordinatene for centroid av området spores. Bruk disse koordinatene som referansepunkt for denne bestemte nettverk.
- Referanseintegritet oversettelse
- Beregne koordinatene for hver celle i referanse til den lappet astrocytter ved hjelp av følgende formel:
Med:
som koordinatene for en gitt celle. 
som koordinatene til lappet cellen (eller Referensiell poenget med nettverket); og 
som koordinatene for en gitt celle i den nye referanseintegritet.
Merk: Uttrykke koordinatene for hver celle i referanse til den lappet astrocytter er et viktig skritt i beregning av vektorer fra det lappet astrocytter. Vær forsiktig når du bruker ImageJFIJI som referanseintegritet for ethvert bilde er plassert i øverste venstre hjørne av bildet.
- Beregne koordinatene for hver celle i referanse til den lappet astrocytter ved hjelp av følgende formel:
- Fastsettelse av viktigste vektoren fortrinnsrett orientering
- Beregne koordinatene til viktigste vektoren fortrinnsrett orientering med følgende formel:
Med: (
) som koordinatene til viktigste vektoren for fortrinnsrett retning. og 
som koordinatene for hver celle i nettverket med det lappet celle som referanseintegritet.
Merk: For hver celle i nettverket er en vektor bestemmes i forhold til koordinatene for det lappet astrocytter. Viktigste vektoren for fortrinnsrett retningen på nettverket er summen av alle disse vektorer. - Dividere lengden på de viktigste vektoren (leveres av koordinatene fra bruker formelen over) med antall celler i nettverket minus én (siden koordinatene til lappet cellen ikke er inkludert), normalisere verdiene og aktivere sammenligninger mellom nettverk. En skjematisk visning av denne analysen er presentert i figur 5.
- Beregne koordinatene til viktigste vektoren fortrinnsrett orientering med følgende formel:
- Fastsettelse av lappet cellen
- Plassering av analysert nettverkene i kjernen av interesse
- Justeringen av 20 X og 4 X bilder
- For å bestemme plasseringen av hver nettverk i kjernen av interesse (NVsnpr), kan du bruke 4 X bildet. Åpne 4 X bildet med en vektor image editor.
- Velge 4 X bildet og endre størrelsen ved å multiplisere det med 5. Dimensjon-vinduet ligger i høyre del av den øverste vannrette verktøylinjen. For eksempel for en 4 X-avbildning som har blitt samplet på 800 x 800 piksler, endre prøvetaking oppløsningen til 4000 x 4000 piksler (for å sette enheten arbeider i piksler, gå til "Oppsett" under kategorien fil: filen | Dokumentoppsett). Eksportere filen i TIFF-format og navnet den "størrelsen 4 X".
- Juster øvre venstre hjørne av bildet med det nedre venstre hjørnet av Adobe Illustrator dokumentet.
Merk: Programvaren gir koordinater fra et nederst til venstre referanseintegritet punkt. - Åpne 20 X bildet av nettverket. Bruk '' binærfil '' eller '' oppdagelsen filen '' fordi de er enklere å justere. Deretter spille med dekkevne verktøyet på '' binærfilen '' med 20 X bildet å justere med nytt størrelse 4 X bildet.
Merk: Verktøyet tetthet er i den øverste vannrette verktøylinjen. - Når justeringen er, Velg og holde pipette verktøyet så måleverktøyet vises, og velg det på venstre verktøylinjen.
- Bruk måleverktøyet til å klikke på hjørnet øverst til venstre på 20 X bildet få koordinatene til 20 X referanseintegritet peker til den nye størrelse 4 X bildet.
Merk: Disse koordinater som er referert til som den 20 X referanseintegritet (20XR i figur 5), vil være nyttig for å uttrykke plasseringen av hver nettverk på en skjematisk tegning av kjernen.
- Normalisering av kjernen av interesse
Merk: For å oppsummere dataene, en normalisering av kjernen (NVsnpr) som et rektangel brukes. Fremgangsmåten er beskrevet nedenfor.- Åpne 4 X endrede filen i ImageJFIJI, og bruk polygonverktøyet til surround kjernen (NVsnpr). Bruke bildet med lyset hvis grensene til kjernen ikke kan bli sett; i så fall, husk å endre størrelsen på den første.
- Åpne ROI Manager og legge trukket Avkastningen. "Angi måling", Velg alternativet '' byksende rektangel ''.
Merk: Alternativet "Byksende rektangel" beregner det minste rektanglet rundt trukket kjernen. - Klikk "Tiltak".
Merk: Det vises en tabell med BX og BY, koordinatene til øvre venstre hjørne av rektanglet: '' rektangel posisjon '' samt bredde og høyde. BX og BY er koordinatene til markeringsrammen rektangelet referanseintegritet som kalles
og 
.
- Uttrykk for hver nettverk posisjon i normalisert kjernen
- Express koordinatene til hver celle med 4 X referanseintegritet (svart firkant i figur 5) ved hjelp av følgende formel:
Hvor:
er cellen koordinatene med 4 X referanseintegritet; 
er cellen koordinatene med 20 X referanseintegritet (oransje firkant i figur 5); og 
er koordinatene til 20 X referanseintegritet punkt i 4 X bildet (20XR). - Express celle koordinatene i markeringsrammen rektanglet referanseintegritet (blå i figur 5) ved hjelp av følgende formel:
Hvor:
er cellen koordinater i markeringsrammen rektanglet referanseintegritet; 
er cellen koordinatene i 4 X referanseintegritet; og 
er koordinatene til rammene referanseintegritet i 4 X bildet. - Transformere celle koordinatene i markeringsrammen rektanglet referanseintegritet prosentandelen av bredden og høyden på markeringsrammen rektanglet bruker følgende formel:
Hvor:
er cellen koordinater i prosentandelen av bredden og høyden på markeringsrammen rektanglet; 
er cellen koordinater i markeringsrammen rektanglet referanseintegritet; 
er bredden på markeringsrammen rektangelet målt over i protokollen; og 
er høyden på rammene målt over i protokollen. - For å representere alle nettverk på samme tall, ta hensyn til retningen på sektoren (venstre eller høyre). For å standardisere dataene, er den referanseintegritet brukt på venstre side av stykket. Overføre nettverk koordinatene til høyre til venstre ved å bruke formelen bare x-koordinater:
Hvor:
er x-koordinatet til høyre på sektoren; og 
er nye x-koordinaten uttrykt i den referanseintegritet på venstre side av stykket.
Merk: Alternativt speilet bildet i ImageJFIJI før analysen (bilde | Transformere | Vend horisontalt). - For å uttrykke koordinatene til viktigste vektoren fortrinnsrett orientering, følger du de samme trinnene med cellen koordinater (trinn 6.5.3.1 til 6.5.3.4).
Merk: Uttrykket av koordinatene i prosenter lar en samling av data som et enkelt plott som kjernen (NVsnpr) er utformet som et rektangel.
- Express koordinatene til hver celle med 4 X referanseintegritet (svart firkant i figur 5) ved hjelp av følgende formel:
- Justeringen av 20 X og 4 X bilder
- Studie av kantete forskjellen i den viktigste vektoren fortrinnsrett retning
Merk: Kantete forskjellen på et astrocytic nettverk brukes til å fastslå om fortrinnsrett retningen er mot midten av kjernen av interesse. For å beregne kantete forskjellen (α i figur 5), som er vinkelen mellom viktigste vektoren for fortrinnsrett kjøreretning nettverk (PD, rød linje i figur 5) og linjen går P til C, bruke Al-Kashi teoremet i trekanten PDC (se innsatt figur 5 og Supplerende metoder).- Først Beregn forskjellige lengder bruker programmet av Pythagoras teorem i et kartesisk referanseintegritet ved hjelp av følgende ligning:
Hvor: koordinatene til P og C er
og 
, henholdsvis i markeringsrammen rektanglet referanseintegritet (beregnet ovenfor). - Bestemme kantete differansen i radianer ved hjelp av følgende formel:
- Konvertere kantete forskjellen i grader (f.eks med grader-funksjonen i Excel programvare).
- Samle alle kantede forskjeller ved å plotte dem i vertikal søylediagrammer (figur 7C og 7 D) og avgjøre om det er en fortrinnsrett orientering av astrocytic nettverk.
- Først Beregn forskjellige lengder bruker programmet av Pythagoras teorem i et kartesisk referanseintegritet ved hjelp av følgende ligning:
som koordinatene for en gitt celle. 
som koordinatene til lappet cellen (eller Referensiell poenget med nettverket); og 
som koordinatene for en gitt celle i den nye referanseintegritet.
) som koordinatene til viktigste vektoren for fortrinnsrett retning. og 
som koordinatene for hver celle i nettverket med det lappet celle som referanseintegritet.
og 
.
er cellen koordinatene med 4 X referanseintegritet; 
er cellen koordinatene med 20 X referanseintegritet (oransje firkant i figur 5); og 
er koordinatene til 20 X referanseintegritet punkt i 4 X bildet (20XR).
er cellen koordinater i markeringsrammen rektanglet referanseintegritet; 
er cellen koordinatene i 4 X referanseintegritet; og 
er koordinatene til rammene referanseintegritet i 4 X bildet.
er cellen koordinater i prosentandelen av bredden og høyden på markeringsrammen rektanglet; 
er cellen koordinater i markeringsrammen rektanglet referanseintegritet; 
er bredden på markeringsrammen rektangelet målt over i protokollen; og 
er høyden på rammene målt over i protokollen.
er x-koordinatet til høyre på sektoren; og 
er nye x-koordinaten uttrykt i den referanseintegritet på venstre side av stykket.
og 
, henholdsvis i markeringsrammen rektanglet referanseintegritet (beregnet ovenfor).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kopling mellom cellene i hjernen er ikke statisk, men heller dynamisk regulert av mange faktorer. Metodene beskrevet ble utviklet til å analysere astrocytic nettverk avslørte under ulike forhold og å forstå deres organisasjon i NVsnpr. Disse resultatene er allerede publisert1. Vi utførte biocytin fylling av enkelt astrocyttene i dorsal del av NVsnpr i tre ulike forhold: på resten (i kontroll forhold i fravær av noen stimulering), i Ca2 +-gratis forhold, og følgende elektrisk stimulering av Sensorisk fibre som prosjektet til kjernen. Eksperimentell innstillingene for biocytin fylling av astrocyttene for hver tilstand er illustrert i venstre side av figuren 6AC.
Nettverk av biocytin-merket celler ble observert i kontroll forhold og bekreftet en basal tilstand av cellen kobling mellom NVsnpr astrocyttene på resten. I 11 testet tilfeller viste biocytin spredning nettverk består av 11 ± 3 celler (midten panel i figur 6A, figur 6D) strekker seg over et område på 34737 ± 13254 µm2 (figur 6E). Carbenoxolone (CBX, 20 μM), en ikke-spesifikk blokkering av gapet knutepunktene, ble brukt i en uavhengig sett av eksperimenter for å sikre at observert merking var et resultat av biocytin spredning gjennom gapet veikryss og ikke opptak av cellene i biocytin, som kan lekke i den ekstracellulære plassen fra positiv trykket på oppdateringen pipette før patching. Bad anvendelse av CBX redusert antall merkede celler til 2 ± 0,5 celler (høyre panel i finne 6A, figur 6D; Iman-Conover metoden, P = 0.016; Holm-Sidak test, P = 0.010) og området biocytin til 2297 ± 1726 µm2 (figur 6E; Iman-Conover metoden, P = 0.0009; Holm-Sidak test, P = 0.025).
Effekten av kalsium fjerning fra mediet på NVsnpr astrocytic nettverk ble testet fordi lav ekstracellulære kalsium konsentrasjon er kjent for å åpne connexins og gapet veikryss20,21,22, og det kan brukes som en massiv og ensartet stimulans å åpne opp syncytium og maksimere tracer spredning gjennom gapet veikryss. Astrocytic nettverk som ble åpenbart i Ca2 +-gratis forhold (n = 10) viste et større antall celler enn nettverkene i kontroll forhold, med 37 ± 10 merket celler (midtre panelet i figur 6C, figur 6D; Iman-Conover metoden, P = 0.016; Holm-Sidak test, P < 0,001) dekker et område på 108123 ± 27450 μm2 (midtre panelet i figur 6C, finne 6E; Iman-Conover metoden, P = 0,009; Holm-Sidak test, P = 0,001).
Elektrisk stimulering av afferente innganger til kjernen av interesse i forhold til fullstendig fjerning av kalsium fra mediet, er en mer fysiologiske stimulans som direkte involverer det nevrale kretsløpet rundt. Resultatene fra denne typen manipulasjon kan derfor gi meningsfull informasjon om funksjonelle implikasjonene av astrocytic nettverk observert. For eksempel innspill fra to ulike veier kan føre til ulike effekter på basale delstaten celler kobling i et gitt område, eller det kan framprovosere kopling mellom astrocyttene i forskjellige ruter kjernen. I vår krets elektrisk stimulering av sensoriske fibrene som prosjektet til NVsnpr bruker 2-andre tog på 0,2 ms pulser på 40-60 Hz (n = 11) produsert en økning på koblingen mellom NVsnpr astrocyttene, i forhold til de unstimulated forholdene, med 23 ± 6 celler (midtre panelet i figur 6B, figur 6D; Iman-Conover metoden, P = 0.016; Holm-Sidak test, P = 0.012) spre seg over et område på 814174 ± 15270 μm2 (midtre panelet i finne 6B, finne 6E; Iman-Conover metoden, P = 0,009; Holm-Sidak test, P = 0.004).
Effekten av disse to typer stimulering, fjerning av kalsium fra mediet, og elektrisk stimulering av afferente innganger, er alle forstyrret av CBX. Astrocytic nettverk i denne tilstanden består kun 5 ± 1 celler i Ca2 +-gratis aCSF (høyre panel i figur 6C, figur 6D, n = 4; Iman-Conover metoden, P = 0.016; Holm-Sidak test, P < 0,001) og 9 ± 2 celler sensoriske fiber stimulering (høyre panel i figur 6B, figur 6D, n = 6; Iman-Conover metoden, P = 0.016; Holm-Sidak test, P = 0.023). Nettverk flater ble også redusert 17987 ± 9843 µm2 med Ca2 +-gratis aCSF (figur 6E; n = 4; Iman-Conover metoden, P = 0,009; Holm-Sidak test, P = 0.004) og 39379 ± 11014 µm2 med sensoriske fiber stimulering (figur 6E; n = 6; Iman-Conover metoden, P = 0,009; Holm-Sidak test, P = 0.055).
Anatomiske analyse var utført bare i tilfeller der NVsnpr grenser kan være klart definert på 4 X bildebehandling, som er tilfelle for 9 av 10 nettverk hentet med Ca2 +-gratis aCSF og 8 av 11 nettverk oppnådd med elektrisk stimulering. Plotting av alle analysert astrocytic nettverk på en teoretisk NVnspr viser at de fleste cellene består i nettverk var begrenset forutsetter kjernen (tall 7A og 7B, venstre og den midterste paneler). Med Ca2 +-gratis aCSF, 4 av 9 astrocytic nettverk spredt utenfor NVsnpr i retning av motor kjernen ligger medialt i NVsnpr. I disse 4 tilfeller var majoriteten av merket cellene begrenset til kjernen. Nettverk av merket celler med elektrisk stimulering av sensoriske fibrene var mer begrenset. Bare 2 nettverk utvidet over kjernen grenser, der en spredt over mediodorsal grensen til området lateral supratrigeminal (mørke grønne nettverk i figur 7B, venstre og den midterste paneler). I det andre tilfellet, 2 astrocyttene i rød nettverket (figur 7B, venstre og den midterste paneler) krysset inn i den ventrale delen av NVsnpr.
Vectorial analyse for astrocytic nettverk fortrinnsrett retning (høyre panel i figur 7A og 7B) produsert ulike resultater avhengig av stimulans brukes. For astrocytic nettverk observert med Ca2 +-gratis aCSF, alle unntatt en av vektorer av fortrinnsrett orientering ble orientert mot midten av NVsnpr. Men for astrocytic nettverk observert med elektrisk stimulering, var fortrinnsrett orientering vektorer hovedsakelig orientert mot grensen til kjernen. Dette gjenspeiles ved beregnet kantete forskjellene i fortrinnsrett retning mellom astrocytic nettverk med Ca2 +-gratis aCSF og de med elektrisk stimulering av sensoriske fibrene. Med Ca2 +-gratis aCSF, vertikal søylediagrammer av fordelingen av kantete forskjellen viste at de fleste av nettverk av merket celler har en kantete forskjell mellom 0 og 40 grader, med et gjennomsnitt på kantete forskjellen i 39.5 ± 12,7 grader ( Figur 7C). Med elektrisk stimulering av sensoriske fibre, distribusjon er mer ensartet, og mener kantete forskjellen (99,5 ± 17 grader) er signifikant forskjellig (figur 7 d; student t-test, P = 0.012).
Disse dataene viser at biocytin merking analyse tillater oss å skille effekten av ulike stimuli modulerende astrocytic kobling. Videre gir tilordning av astrocytic nettverk i en normalisert kjerne etterfulgt av vectorial analyse verdifull informasjon om størrelsen og anatomisk organiseringen av disse nettverkene.
Figur 1: hele celle patch-klemmen på astrocytter. (A) astrocyttene merket med en lasting av markør sulforhodamine 101 (SR-101) i NVsnpr. En SR-101-merket astrocytter soma er rettet med oppdateringen Pipetter (hvit stiplet linje). Skala bar = 100 μm. (B) en depolarizing rampen protokollen utføres i spenning-klemme (fra-120 til 110mV) for å vurdere astrocytter passiv egenskaper. (C) vurdering av mangel på handling potensial skyte i astrocytter ved injeksjon av nåværende pulser i gjeldende-klemme modus. Dette tallet er tilpasset fra Condamine et al. (2018) 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: behandling og analyse av astrocytic nettverk med ImageJFIJI programvare. (A) Z-Stack etableringen fra AC confocal avbilding av et astrocytic nettverk. I vinduet øverst til venstre, Z stabel i ImageJFIJI. (B) subtraksjon bakgrunnsprosess. Øverst til venstre, trekke miljøet vindu i ImageJFIJI. Prikket sirkelen fremhever området på bildet hvor effekten av kommandoen trekk fra bakgrunn er tydeligere når sammenlignet med bildet i A. (C) Remove outliers prosessen. Denne prosessen fjerner av små flekker på grunn av uspesifikke forekomster av streptavidine koblet til en Alexa 594. Hvite pilene viser innskudd før (figur 2B) og etter (figur 2C) kommandoen er behandlet. Øverst til venstre, fjerne outliers vindu i ImageJFIJI. (D) eksempel på virkningen som kan produseres av en utilstrekkelig justering av Fjern outliers parametere. Gule piler viser noen uklare celler. (E) justere terskelen prosessen. Øverst til venstre, justere terskelen vindu i ImageJFIJI. Rullefeltene handle på terskelen signal justeringen. (F) gjør binære skritt. Bildet konverteres til en binær fil i ImageJFIJI. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: oppdagelsen av celler i astrocytic nettverk med ImageJFIJI. (A) eksempel på en binær bilde av et astrocytic nettverk innhentet i ImageJFIJI. Skala bar = 100 μm. (B) illustrerer den "oppdagelse fil" innhentet etter bruk analyser partikler prosessen på den binære filen. Figurene tilsvarer alle oppdaget cellene med deres tilknyttede i rødt. (C) venstre delen: analysere partikler vindu i ImageJFIJI. Denne funksjonen merker cellene i nettverket i binær bildet. Størrelsen på funnet cellene og deres sirkularitet kan justeres. Tall brukes bør angis ved prøving og feiling til tilfredsstillende resultat er oppnådd. Høyre del: gjenkjenning tabell generert av analyser partikler prosessen. X- og Y-kolonnene viser koordinatene til hver celle i bildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: området analyse og besluttsomhet lappet cellen i ImageJFIJI. (A) bruke polygon-verktøyet i ImageJFIJI, en avkastning spores rundt klyngen av oppdaget celler (rød linje) som brukes til å bestemme areal på nettverket. (B) Avkastningen legges til Avkastningen Manager. (C) eksempel på en astrocytic nettverk der lappet cellen (hvit pil) er lett identifiserbare på grunn av slående intensiteten av sin biocytin merking. (D) eksempel på en astrocytic nettverk hvor lappet cellen ikke kan identifiseres, men der et område av tettere merking tydelig angir biocytin innskudd. En avkastning er trukket rundt dette området og lagt til Avkastningen manager. Dens centroid er beregnet og betraktet som plasseringen av lappet cellen bruke vectorial analyse. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Diagram over de forskjellige referentials brukes for astrocytic nettverk analyse. Den grå firkanten er 4 X bildet med referanseintegritet punkt 4XR å bli justert etter venstre nederst i Adobe Illustrator dokumentet. Den hvite firkanten i oransje er 20 X bildet med referanseintegritet punkt 20XR. Både bilder er justert med hverandre som beskrevet i protokollen. Markeringsrammen rektangel (blå) definerer NVsnpr (lilla stiplet linje) og skaleres i prosent med referanseintegritet punktet (BR). Teoretisk midten av dorsal del av NVsnpr er schematized av mørk blå dot (C). Astrocytic nettverket er schematized av lappet cellen (svart prikk, P) og viktigste vektoren for fortrinnsrett retning (rød linje). Hver stiplet svart linje er vektoren for hver celle av astrocytic nettverket. Kantete forskjellen astrocytic Network (α) er vinkelen mellom viktigste fortrinnsrett retningen på nettverket (rød linje) og svart linje som kobler det lappet astrocytter teoretisk midten av kjernen. Innfelt er en zoom på 20 X bildet viser trekanten PCD dannet av teoretiske midten av NVsnpr (C) lappet cellen og viktigste vektoren for fortrinnsrett retning (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Astrocytic nettverk merket med biocytin i NVsnpr under ulike forhold viser forskjellige størrelser. (A-C) Til venstre, en skjematisk tegning av eksperimentelle tilstanden. I alle forhold, var en enkelt astrocytter merket av SR-101 mål for hele celle opptak og fylt med biocytin (0,2%). Midterste kolonnen: photomicrographs illustrerer astrocytic nettverk innhentet under kontroll betingelser (A), etter elektrisk stimulering av Vth skrift (2 s tog, 40-60 Hz, 10-300 µA, 0,2 ms pulser) (B); og etter perfusjon med en Ca2 +-gratis aCSF (C). Høyre kolonne: photomicrographs illustrerer astrocytic nettverk innhentet under samme vilkår, men i nærvær av CBX (20 μM) i bad før. Skala bar = 100 μm. (D og E) Loddrette streker diagrammet som representerer antall kombinert celler og areal, henholdsvis biocytin-fylt nettverk av astrocyttene under tre eksperimentelle forhold presentert ovenfor (A, B og C) i tilstedeværelse (klekket) og fravær (solid) CBX (20 ΜM). Dataene er representert som betyr ± SEM. flere sammenligninger (Holm-Sidak test): * = P < 0,05; ** = P < 0,001. Dette tallet er tilpasset fra Condamine et al. (2018) 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Karakterisering av nettverk i NVsnpr under Ca2 +-gratis aCSF og med elektrisk stimulering i Vth tarmkanalen. (A og B) Venstre: Alle celler merket i 9 nettverk fylt under perfusjon med Ca2 +-gratis aCSF (A) eller i 8 nettverk fylt og stimulerer Vth skrift (B) tegnes i henhold til deres posisjon i en teoretisk NVsnpr kjernen (grå firkant). Hvert nettverk (og cellene komponere det) representeres av en annen farge. Middle: grensene for hvert nettverk. Punktum i hvert område representerer lappet cellen. Høyre: representasjon av viktigste vektor av fortrinnsrett retningen for hvert nettverk. Punktet representerer lappet cellen og pilen vektor fortrinnsrett retning. (C og D) Distribusjon av kantete forskjellene mellom viktigste vektoren for fortrinnsrett retningen og en rett linje lappet cellen til midten av det dorsal del av NVsnpr (plassert på 25% på dorsoventral aksen og 50% på mediolateral aksen) under den to betingelser studerte. Den gjennomsnittlige kantete forskjellen var 39.5 ± 12,7 grader i Ca2 +-gratis aCSF, som indikerer en fortrinnsrett orienteringen mot sentrum av kjernen og 99,5 ± 17 grader med elektrisk stimulering, som indikerer en fortrinnsrett orienteringen mot den periferien (student t-test, P = 0.012). Dette tallet er tilpasset fra Condamine et al. (2018) 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| sukrose-aCSF* | mMol |
| Sukrose | 219 |
| KCl | 3 |
| KH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | 4 |
| NaHCO3 | 26 |
| Druesukker | 10 |
| CaCl2 | 0,2 |
Tabell 1: sammensetning av sukrose-baserte løsningen brukes til hjernen kutting. (*) = pH og osmolaritet var justert 7.3-7.4 og 300-320 mosmol/kg, henholdsvis.
| aCSF* | mMol |
| NaCl | 124 |
| KCL | 3 |
| KH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | 1.3 |
| NaHCO3 | 26 |
| Druesukker | 10 |
| CaCl2 | 1.6 |
Tabell 2: sammensetning av aCSF løsningen for skive lagring og hele celle opptak. (*) = pH og osmolaritet var justert 7.3-7.4 og 290-300 mosmol/kg, henholdsvis.
| Intern oppdateringen løsning* | mMol |
| K-gluconate | 140 |
| NaCl | 5 |
| HEPES | 10 |
| EGTA | 0,5 |
| Tris ATP salt | 2 |
| Tris GTP salt | 0,4 |
Tabell 3: sammensetning av interne løsningen for hele celle opptak. (*) = pH og osmolaritet var justert til 7,2-7.3 og 280-300 mosmol/kg, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finnes mange elektrofysiologiske metoder for å vurdere funksjonell kobling mellom astrocyttene23,24. Disse metodene gir imidlertid ikke informasjon om anatomiske ordningen med astrocytic nettverk. En rekke studier har allerede vist at "fargestoff - eller tracer-kopling", som her, oppstår bare i en brøkdel av kombinert celler som oppdages av elektrofysiologiske metoder25,26,27, tyder på at den antall celler oppdaget med denne metoden er undervurdert. Likevel, dette er fortsatt den beste metoden for visualisering av kopling. Større fargestoff-kopling oppnås når du bruker molekyl tracers mindre enn 1-1.2 KDa for å gjennomsyre gapet veikryss20. Live visualisering av kobling kan utføres ved å overvåke spredningen av fluorescerende glukose derivater (2-NBDG) eller en fluorescerende markør (som noen Alexa fargestoffer eller Lucifer gul)13, men på grunn av sin mindre størrelse, biocytin gir bedre resultater og tillater kvantifisering i fast vev. Dermed bør det bemerkes at antall celler oppdaget med denne metoden er i stor grad undervurdert. Noen av cellene kan derimot, merkes ikke på grunn av deres kobling men opptaket av tracer som har lekket til den ekstracellulære plassen. Omfanget av merking som følge av lekkasje kan estimeres kontroll eksperimenter med bad anvendelser av gapet krysset blokkering1. Imidlertid kan det antas at skjevheter på grunn av metoden ville gjelde for alle forhold.
Til slutt, det bør understrekes at ikke alle kombinert celler er astrocyttene. Panglial nettverk der astrocyttene er koplet til oligodendrocytes er beskrevet i flere områder i hjernen, inkludert lateral overlegen oliven8, thalamus16, bark og hippocampus28. Målet var å utvikle en metode for å sammenligne astrocytic nettverk avslørt med fargestoff-koblingen under ulike forhold å vurdere hypotesen at de er godt definert, karakteristiske funksjonelle domener avslørt av ulike stimuli. Siden i NVsnpr, trigeminal hjernestammen kjernen som denne protokollen ble gjennomført, kopling mellom astrocyttene er svært begrenset under hvile forhold, var det viktig å først utvikle en pålitelig og upartisk metode for å oppdage merket celler. Dette ble oppnådd med Automatisert påvisning med ImageJFIJI. Noen ganger er det vanskelig å skille svakt merket celler fra bakgrunnsstøy. Her stabel bildebehandling og en metode i ImageJFIJI brukes til å forbedre signal, men bakgrunnsstøy kan fortsatt være høy og føre til data avvisning. I fremtidige studier, kan avklaring protokoller brukes til å forbedre signal-til-støy-forhold. En lysning protokoll er en interessant avklaring som bevarer vev morfologi (ingen krymping) påvirker ikke lipider og er kompatibel med immunostai-29. En annen begrensning metoden beskrevet er "vannskille" verktøyet brukes til å diskriminere celler som er for nær hverandre. Visuell inspeksjon av oppdaget celler bør gjøres når du bruker dette verktøyet.
Hvis astrocytic nettverk danne funksjonelle domener, så de kan definere grensene for en kjerne eller minst bør være begrenset til grensene for en kjerne. Avdekket nettverk kan alltid være begrenset i en kjerne, mer hvis de er mindre i størrelse, hvis det lappet astrocytter i midten (eller innen) kjernen. For å teste om astrocyttene sitter nær grensen til en kjerne helst par med andre astrocyttene utenfor kjernen eller andre i kjernen, måtte vi bestemme fortrinnsrett retningen som fargestoff spredte seg fra det lappet astrocytter. Flere andre studier har adressert et lignende problem i fat cortex, barreloid felt av thalamus, olfactory glomeruli, hippocampus og lateral overlegen oliven, men de fokusert analyser det meste på avstand av spredning av tracer, elektrofysiologiske karakteristikk av ulike typer astrocyttene i funksjonen av deres lokalisering og spredning av fargestoff langs ortogonale akser med hensyn til disse veldefinerte strukturer8,9,10, 13,14,16. Her brukte vi vectorial analyse for å bestemme dominerende retningen av tracer spredt, som ble gitt av størrelsen og retningen av normalisert viktigste vektoren. Small vektorer angir ingen "dominerende" eller fortrinnsrett orientering. Et kritisk punkt for vectorial analyse er evnen til å nøyaktig identifisere det lappet astrocytter, hvilke er ikke alltid mulig. Et interessant alternativ for å finne det lappet astrocytter er å legge en stor (ikke-gap krysset permeant) og fixable tracer, som dextrans, til innspillingen løsning. Hvis det ikke er mulig å fastslå lappet cellen eller oppdateringen plassering, kan det være bedre å utelate disse eksperimentene fra vektor analyse.
Til slutt for å analysere om egenskapene for nettverk varierte i henhold til deres plassering i kjernen, trengte vi en metode for å uttrykke sin posisjon i en "normalisert" kjerne. Det kritiske trinnet i denne fremgangsmåten er evnen til å se klart grensene til kjernen i lav forstørrelse bilder (4 X). En enkel løsning på dette problemet, er hvis det forekommer ofte å legge en standard histologiske farge til vev behandling før analyse.
Heterogenitet astrocyttene over områder av hjernen er klart etablert, og en voksende mengde bevis støtter konseptet som deres spesialisering er spesielt tilpasset for funksjonen av kretsen som de er innebygd i9, 10,30,31. For at dette skal være sant, bør Inter astrocytic kommunikasjon begrenses til astrocyttene knyttet til samme krets. Observasjoner støtter denne antakelsen dukker opp i ulike hjernen områder, men er mer tydelig i områder med klyngede fremstillinger, som sensoriske kart i fat cortex eller Luktelappen. Men er de fleste rapporter overlapping mellom neuronal og astrocytic kart beskrivende og kvalitative. Metodene rapporterte her kan brukes å objectify disse observasjonene og utvikle verktøy for å bedre analysere astrocytic nettverk i henhold til deres posisjon i en gitt krets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er finansiert av den kanadiske institutter av Health Research, gi/tildele nummer: 14392.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
References
- Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
- Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
- Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control? Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
- Verkhratsky, A., Steinhauser, C. Ion channels in glial cells. Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).
- Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neuroscience. 286, 45-59 (2015).
- Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
- Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
- Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
- Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
- Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
- Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
- Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
- Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
- Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
- Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).
- Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).
- Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
- Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
- Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
- Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
- Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
- Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
- Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
- Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).
