Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Анализируя размер, форму и направленность сетей спаренных астроциты

Published: October 4, 2018 doi: 10.3791/58116
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central, and Département de Neurosciences, Université de Montréal, 2Faculté de Médecine Dentaire, Université de Montréal

Summary

Здесь мы представляем протокол для оценки Организации Астроцитарная сетей. Описан метод минимизирует смещения для предоставления описательного мер этих сетей таких клеток, размер, площадь и позиция в ядра. Анизотропия оценивается с векторного анализа.

Abstract

Она становится все более очевидным, что астроциты модулировать нейрональных функции не только на уровне синаптических и одной ячейки, но и на сетевом уровне. Астроциты тесно связаны друг с другом через разрыв соединения, и соединение через эти соединения является динамичной и жестко регулируемых. Формирующейся концепции, что Астроцитарная функции являются специализированными и адаптированы к функции нейронов цепи, с которой они связаны. Таким образом методы измерения различных параметров Астроцитарная сетей необходимо лучше описать правила, регулирующие их связи и соединения и для более глубокого понимания их функций.

Здесь, используя программное обеспечение для анализа изображения (например., ImageJFIJI), мы описываем метод для анализа конфокальный изображения Астроцитарная сетей, обнаруженных краситель муфта. Эти методы позволяют 1) автоматизированных и беспристрастной выявления помеченных клеток, 2) расчет размера сети, 3) вычисления преференциальных ориентации красителя распространяется в сети и 4) репозиционирования сети в области интересов .

Этот анализ может использоваться для характеризуют Астроцитарная сетей в конкретной области, сравнить сетей разных областей, связанных с различными функциями или сравнить сетей, полученные при различных условиях, которые имеют различные эффекты на муфты. Эти наблюдения могут привести к важным функциональными соображениями. Например мы анализируем Астроцитарная сетей ядра тройничного нерва, где мы ранее показали, что Астроцитарная муфта имеет важное значение для способности нейронов для переключения схем их стрельбы от тоник художественной разрывной1. Путем измерять размер, родов и преференциальных ориентации Астроцитарная сетей в этом ядре, мы можем построить гипотезы о функциональных домены, которые они ограничивают. Некоторые исследования предполагают, что несколько других областях мозга, включая ствол мозга, боковые превосходное оливковое, обонятельные клубочков и сенсорные ядра таламуса и зрительной коры, чтобы назвать несколько, могут извлечь выгоду из аналогичный анализ.

Introduction

Многие исследования были описаны как нейрон экзоцитоз диалог на уровне субклеточном или синаптических может иметь последствия в нейрональных функций и синаптической передачи. Хорошо известно, что астроциты чувствительны к окружающим нейронной активности; в самом деле они имеют рецепторы для многих нейромедиаторов, включая глутамата, ГАМК, ацетилхолин и СПС (см. ранее опубликованных отзывов2,,34). В свою очередь Астроцитарная процессы синаптической элементы ensheath и влияние нейронной активности там и на внесинаптического участках регулирующих внеклеточного ионного гомеостаза и освобождение нескольких факторов или приемник например глутамата, D-серина и СПС 5 , 6 , 7.

Возникла идея, что Астроциты также может модулировать нейрональных функции на уровне сети, с доказательства того, что Астроцитарная муфта пространственно регулируется и соответствует нейрональных сегментации в областях характеризуется ясно анатомические фрагментарность (как районы с сенсорными представлений), указывая, что астроциты будет пару других астроциты, обслуживающих те же функции, а не только те, которые находятся рядом с отелем. В боковых превосходное оливковое например, наиболее Астроцитарная сети ориентированы ортогонально к оси tonotopic8, тогда как в ствол мозга или olfactoty клубочков, связь между астроциты гораздо сильнее в бочках или клубочков и слабее между соседними те9,10. В обоих случаях Астроцитарная сети ориентированы на центр glomerule или ствол9,10.

Недавно мы показали, что Астроцитарная деятельность модулирует нейронов стрельбы путем снижения концентрации внеклеточного Ca2 + ([Ca2 +]e), предположительно путем выпуска S100β, Ca2 +-привязка белка11. Этот эффект, который был продемонстрирован в популяции нейронов тройничного нерва rhythmogenic в спинной части тройничного нерва основные сенсорные ядра (NVsnpr, думал играть важную роль в генерации жевательных движений), приводит к от факта что ритмичный огонь в этих нейронов, зависит от стойких Na+ текущий, способствует уменьшается [Ca2 +]e11,12. Ритмичный огонь в этих нейронов может вызвали «физиологически» путем стимуляции их вклада или искусственное снижение [Ca2 +]e. Мы показали также, что требуется для нейронов ритмичный огонь1Астроцитарная муфты. Это возникает возможность, что Астроцитарная сетей могут образовывать очерченную функциональные домены где нейронной активности могут быть синхронизированы и координации. Для оценки этой гипотезе, мы сначала необходимо разработать метод строго документ Организации этих сетей в пределах NVsnpr.

Предыдущие исследования в Астроцитарная сетях главным образом описал степень сцепления с точки зрения количества клеток и плотности и площадь. Попытки оценить форму Астроцитарная сетей и направление краситель муфта главным образом выполнялись путем сравнения размера сетей по двум осям (x и y) в ствол мозга9, гиппокамп13,14, 15, barreloid области таламуса16, боковые превосходное оливковое8, обонятельные клубочков10и коры14. Описанные здесь методы позволяют беспристрастной количество помеченных клеток в сети и оценки площади, которую они охватывают. Мы также разработали инструменты для определения предпочтительного ориентации сцепного устройства в сети и оценить, является ли предпочтительным ориентации к центру ядра или в другом направлении. По сравнению с ранее используемых методов этот протокол предоставляет средства для описания организации и ориентации Астроцитарная сетей в структурах как спинной тройничного нерва основные сенсорные ядра, которые не имеют известный ясно анатомические фрагментарность. В выше исследований, ориентации сети описан как отношения к форме сама структура, которая уже документально (например., barreloid в таламус, бочки в коре головного мозга, слои в гиппокампе и коры, клубочков в обонятельные луковицы и т.д.). Кроме того Векторный анализ позволяет для сравнения сцепления ориентаций показал в различных условиях. Чтобы проанализировать ли эти параметры изменены согласно позиции сети внутри ядро, мы также разработал метод для замены каждой сети, со ссылкой на границах ядра. Эти инструменты могут быть легко адаптирована в другие районы для расследования сетей спаренных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры обитель правилами Канады институтов здравоохранения исследования и были утверждены Комитетом использования и ухода за животными Монреальского университета.

1. подготовка мозга крысы ломтиками

  1. Подготовка 1 решения на основе сахарозы (Таблица 1) и 1 Л стандартной искусственной мозговой спинномозговой жидкости (ФАГО) (Таблица 2).
  2. Пузырь решение на основе сахарозы с сочетанием 95% O2 и 5% CO2 (Карбоген) за 30 мин перед его размещением в-80 ° C около 30 мин, до тех пор, пока решение является холодная, но не полностью замороженные. Используйте этот ледяной сахарозы как передний буфер для нарезки мозга. Держите его на льду, как только он удаляется из морозильной камеры.
  3. Пузырь фаго с Карбоген через всего эксперимента. Используйте это решение для хранения фрагментов и как perfusing буфера, в котором будет выполняться патч зажима и biocytin заполнение астроциты. Подготовка восстановления срез, держа камеру на хранение срезы мозга, как только они вырезаны.
    Примечание: Ломтик восстановления холдинг камеры может быть на заказ и по существу состоит из одной небольшой хорошо с сеткой внизу приостановлено в крупных хорошо, которая заполняется с фаго, в котором вводится трубка довести Карбоген снизу.
  4. Используйте 15 - 21-дневного Sprague-Dawley крыс без какой-либо предвзятости конкретного пола или деформации. Анестезировать животное с изофлюрановая (1 мл изофлюрановая в камере индукции анестезии). Проверка глубины анестезии, осторожно сжимая задние лапы или хвост животного.
  5. Обезглавить крыс с помощью гильотины, сократить ее череп с ножницами и быстро удалить мозг из черепной коробки с плоской шпателем.
  6. Окуните мозга в ледяной решения на основе сахарозы для о 30 s и передачи его (раствором) Петри блюдо. С лезвием бритвы, удалить части, которые передней и задней в этот район для секционного, если резки ломтиками в поперечной плоскости.
  7. Приклейте оставшийся блок ткани мозга на его стороне Ростральных и приступить к вырезать мозг срезы (толщиной 350 мкм) в среде на основе сахарозы с помощью vibratome. Затем, передачи собранных фрагментов в холдинг камеры заполнены с carbogenated фаго при комнатной температуре (RT), пока они не готовы использовать восстановления (позволяют по крайней мере 1 час для восстановления).
    Примечание: Последние события в области позволяют длительное инкубации до 24 h срезов мозга в vitro условия17.

2. Sulforhodamine 101 (SR-101) маркировки астроциты

  1. Нагреть на водяной бане до 34 ° C и место два фрагмента инкубации камер в нем. Заполните одну из палат инкубации срез с раствором фаго, содержащие 1 мкм SR-101 и заполнить другие только с фаго.
  2. Инкубации срезов в зале инкубации, содержащие 1 мкм SR-101 20 мин и затем передачи их в инкубации второй камеры промыть избыток SR-101 из ткани. Пусть это Проинкубируйте втечение 20 мин или более при температуре 34 ° C, затем держать зале инкубации, содержащие фрагменты в РТ, до тех пор, пока они необходимы18.

3. экзоцитоз исправлений и наполнения Biocytin

  1. Выберите фрагмент и поместить его в записи камеры микроскопа. Патч астроциты, использовать электроды с сопротивлением 4-6MΩ когда заполнены раствором на основе калия глюконат (см. таблицу 3).
  2. Под руководством визуальные и с помощью микроманипулятор прямой записи электрода к SR-101-меченых экзоцитоз, как показано на рисунке 1. Избегайте клетки, расположенные на поверхности среза, так как они более правоподобны для того быть повреждены или потеряли соединения соседних клеток.
  3. Для предотвращения утечки biocytin в ткани, свести к минимуму положительным давлением, добавлен патч пипетки и применять его только тогда, когда это близко к экзоцитоз, которая будет исправлена (0,1-0,4 мл в шприцах по 1 мл).
  4. До исправления, отрегулируйте смещение пипетки и его емкости. Исправление для жидких Джанкшен потенциалов, как и точное напряжение команды имеют решающее значение для экспериментов19.
  5. Переместите пипетку достаточно близко к экзоцитоз наблюдать депрессии, вызванной положительным давлением. Затем удалите положительным давлением и медленно применить некоторые отрицательное давление. Зажим экзоцитоз до -70 mV при печати достигает 100 MΩ. Подождите, пока печать не достигнет 1-3 GΩ. Продолжать применять отрицательное давление до ломать в клетку. Будьте осторожны при применении отрицательное давление, поскольку астроциты являются очень хрупкими.
  6. Оцените электрофизиологических свойств пропатчен ячейки. В режиме напряжение зажим, выполняют с команды рамп напряжения продолжительностью 600 мс до 110 -120 вольт амперных протокол поклеточного МВ. В режиме ток зажим выполните шаг IV протокол, в котором инъекции 1000 мс текущий шаги 100 Па от -1 до 1 nA, частота выборки записей поклеточного – 10 кГц.
    Примечание: Астроциты Показать профиль линейный ток напряжение без какой-либо ректификации (как показано на рисунке 1B) и без действий потенциал стрельбы при деполяризации мембраны (рис. 1 c). Мембранного потенциала покоя (РМП) должно быть стабильным и не положительный, к - 60mV. В некоторых областях мозга РМП астроциты более hyperpolarized, чем в NVsnpr.
  7. Разрешить biocytin для распространения в пределах экзоцитоз 30 мин при выполнении шага IV протокола каждые 5 мин.
  8. Убрать и отсоединить патч пипеткой тщательно не повредив пропатчен экзоцитоз и немедленно принять к сведению смещение пипеткой прежде чем принимать его из записи камеры. Вычитание этого значения из потенциальных записей мембраны.
  9. Оставьте срез мозга отдохнуть в зале записи как минимум 15 мин (в дополнение к 30 мин для инъекций) разрешить распространение трассировщик от пропатчен экзоцитоз для всей сети спаренных клеток.
    Примечание: Выявить сеть спаренных клеток, только одну ячейку следует заплата в ядре интерес. Несколько попыток, если они необходимы для того, чтобы достичь успешного патч отбросить дело и пытаться патч на контралатеральную сторону или в другой срез мозга.
  10. Сделать Марк или разрез в ткани, чтобы определить, какая сторона фрагмента вверх и сначала передать срез чашку Петри, содержащие нормальные фаго, затем в раствор 4% параформальдегида (PFA). Инкубируйте срез на 4 ° C на ночь.
    Предупреждение: PFA чрезвычайно вредно. Используйте защитное снаряжение в вентилированные капюшон. Убедитесь, что все материалы (щетки, трубки и т.д.), которые были в контакте с PFA не контакт восстановления, держа камеру, инкубации камеры или другие материалы, используемые для записи свежие ткани.

4. Biocytin откровения

  1. Откровение с флуоресцентной streptavidine
    1. Мыть мозга кусочки 2 x 10 мин в 0,1 М буфера фосфатный (PBS) на RT. Затем выявить biocytin, инкубации срезов мозга с streptavidine, конъюгированных с Флюорофор на 1/200 разрежения в PBS с 4% неионные моющее средство для 4 h на RT.
    2. Вымойте ломтики мозга 3 x 10 мин в 0,1 М PBS на RT и смонтировать разделы на стеклянных вставках, с использованием средних водный монтажа. Поместите стороны, которые вводили вверх, coverslip слайды и запечатать их лаком для ногтей.
  2. Откровение с DAB
    Примечание: DAB (3,3-Диаминобензидин) Откровение может использоваться когда флуоресценции нельзя использовать. В этом случае только один откровение метод следует использовать для сравнения.
    1. Вымойте, срезы мозга 3 x 10 мин в PBS на RT. инкубации срезов в PBS + H2O2 0,5% за 1 час на RT.
    2. Промыть ломтики 3 x 10 мин в PBS на RT. Затем инкубации срезов в авидин Биотин комплекс окрашивание раствора состоит из PBS и 0.1% неионные моющего средства + авидин Биотин комплекс пероксидазы стандартных окрашивание комплект реагентов в 1/100 за 24 часа на RT.
    3. Промыть ломтики 3 x 10 мин в PBS на RT, инкубировать их в растворе PBS DAB 0,05% на 20 мин в РТ и передавать их в раствор PBS + DAB 0,05% + H2O2 0,5%.
      Предупреждение: DAB очень вредно. Используйте защитное снаряжение в вентилированные капюшон. Цвет реакция останавливается при ломтики передаются в PBS.
    4. Промыть ломтики 5 x 10 мин в PBS на RT, смонтировать разделы на стеклянных вставках (сталкиваются стороны, которые вводили вверх) и дайте им высохнуть на слайде сушки скамейке ночь в 34 ° C.
    5. Опускайте стеклянных скольжениях за 1 мин в нескольких ванн алкоголя в 70%, 95% и 100% и в конце с ванной ксилол за 1 мин.
    6. Смонтируйте стекла слайды с помощью на основе толуола Синтетическая смолаа монтаж среднего. Место coverslips на слайдах и запечатать их лаком для ногтей.

5. сети обработки изображений

  1. Визуализация Астроцитарная сети, используя Сканирующий конфокальный микроскоп оснащен 20 X и 4 X цели (или соответствующие цели для визуализации всего ядра, где находится сеть) и лазер для обнаружения Флюорофор (в данном случае, Alexa-594- используется).
  2. Используйте 20 кратным увеличением для z стека сети помеченных клеток. Использование разрешения 800 x 800 пикселов и проверять скорость 12,5 μs/пиксель.
    Примечание: Для того, чтобы изображение всей сети, обычно требуются несколько стеки, и количество ярусов должна быть скорректирована для каждой сети. Резолюции и сканирования скорость может меняться, но не забудьте использовать одинаковые параметры для всех данных изображения.
  3. Использование 4-кратном принять изображения региона интерес и сети.
    Примечание: 4 X изображений используется для определения сети позиция в ядра интерес. Всегда же поле в переданном свете изображения. Это изображение будет полезным, если вам не удается определить границы ядра в конфокальных флуоресцентного изображения.

6. анализ

  1. Подготовка данных
    1. Использовать программное обеспечение ImageJFIJI (скачать на https://fiji.sc/). Откройте файл и нажмите кнопку ОК в окне «Параметры импорта био-форматов».
    2. Чтобы переопределить z стека, который будет содержать только оптический фрагменты, необходимые для окончательного z стека (рисунок 2A), нажмите на ручку «Стек» в панели инструментов (для поиска, сначала выберите stk | Проект Z). Выберите «Макс интенсивности» в параметр типа проекции (рис. 2A). Сохраните файл и назовите его «стека файлов».
    3. Если изображения файл содержит несколько каналов, разделить его для сохранения только канал с Астроцитарная сети обработки изображений (Image | Цвет | Разделение каналов).
    4. Проверьте параметры пикселя изображения [изображение | Свойства | Пиксел (с «1» для измерения пиксель)].
    5. Используйте инструмент вычитание фона (процесс | Вычитание фона) чтобы удалить фон biocytin маркировки. Используйте функцию предварительного просмотра для задания радиусу качения шарика, который обычно устанавливается в 50 пикселей (рис. 2B).
    6. Используйте средство удаления нетипичные (процесс | Шум | Удаление останцы) если это требуется после шаг вычитание фона. Выберите «Яркий» в параметре «Который нетипичные» (рис. 2 c). Используйте функцию предварительного просмотра, чтобы задать радиус и порог. Будьте осторожны с этим инструментом, так как это может размыть данных, как показано на рисунке 2D.
      Примечание: Этот инструмент удаляет небольшие пятна, вызванные неспецифических месторождения streptavidine (как показано на белые стрелки в Рисунок 2B и 2 C до и после лечения, соответственно).
    7. Отрегулировать порог (изображение | Отрегулируйте | Порог). Выберите режим «По умолчанию» и «B & W» (Рисунок 2E). Нажмите «Применить».
      Примечание: Auto регулировка может использоваться, но ручной регулировки с двух ползунков является предпочтительным. Этот шаг призван снизить уровень шума до максимального без потери каких-либо помечены клетки.
    8. Преобразовать изображение в двоичный образ с помощью средства двоичного процесс (процесс | Двоичные | Сделать двоичные) как показано на рисунке 2F. Сохраните файл как TIFF-файл и назовите его «двоичный файл».
  2. Подсчет клеток
    1. Проверьте настройку функции мера (анализ | Задать измерение). Выберите параметр «Центр тяжести».
    2. Используйте средство «Анализ частиц» на «двоичный файл» (рис. 3A) производится на предыдущем шаге (анализ | Анализ частиц) (рис. 3 c слева). Выберите «Контуры» в параметре «Шоу» (рис. 3 c). Это создает новый файл, показывающий результат обнаружения (рис. 3B).
    3. Играть с параметрами: размер (для обнаружения только клетки, использовать значения между 30 и 6000) и округлость (чтобы определить интервал между 0 до 1, в котором «1» определяет идеальный круг и «0» случайный фигуру) для уточнения обнаружения (рис. 3 c, оставил часть). Запуск обнаружения, нажав «ОК».
      Примечание: Две таблицы будут отображаться после обнаружения: 1) таблицу под названием «Резюме», предоставляющий количество обнаруженных клеток и 2) таблицу под названием «Результаты» (рис. 3 c, правая часть), обеспечивает x - и y координаты каждой ячейки.
    4. Скопируйте значения и вставьте их в приложении электронной таблицы. Сохраните эту таблицу под именем «обнаружение столом». Файл с участком обнаруженных клетки также появятся (рис. 3B). Сохраните этот файл как TIFF-файл под именем «файл обнаружения».
    5. Если группы 2 или более Приклеенные этикетку клеток в сети определяются как одну ячейку с инструментом анализа частиц, потому что они слишком близко друг к другу, используйте средство водораздел (процесс | Двоичные | Водораздел) на двоичное изображение до применения анализ частиц инструмент и повторить шаги анализ частиц.
      Примечание: Средство водораздел создает делимитации 1 пиксель между чрезвычайно тесные клетки. Клетки счетчик плагин может использоваться при маркировке однозначен и может проводиться вручную.
  3. Измерение Астроцитарная сети
    1. Чтобы измерить площадь поверхности сетей, используйте файл обнаружения с помощью изображения Дж.
    2. Используйте средство выбора полигона (щелкните левой кнопкой мыши на кнопку на панели инструментов, чтобы выбрать его) для трассировки, многоугольник, который соединяет все клетки расположен на внешней периферии сети (рис. 4A). Щелкните левой кнопкой мыши, чтобы начать отслеживание полигона и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы закрыть его.
      Примечание: Этот полигон будет определяться как региона интерес (ROI) и его поверхность будет оцениваться для определения площади поверхности сети.
    3. Открыть окно набора измерений (анализ | Задать измерения) и выберите параметр «Область». Откройте диспетчер ROI (анализ | Инструменты | Диспетчер ROI) (рис. 4В). Затем добавьте проследить полигона в менеджере ROI, нажав кнопку '' Добавить '' (рис. 4B) и запустите измерения, нажав кнопку '' мера '' в менеджере ROI.
      Примечание: Измерение площади появятся в таблице и выражается в пикселях. Не забывайте преобразовать это значение с помощью коэффициента конверсии для микроскопа, используется для получения значения в мкм2.
  4. Определение основных направление вектора
    1. Определение пропатчен ячейки
      1. Откройте файл стека в ImageJFIJI и определения исправленной ячейки в файле стек, основанный на его сильнее маркировки интенсивности (рис. 4 c). Затем откройте файл с именем «таблица обнаружения» в приложении электронной таблицы и найти номер исправленной ячейки и ее соответствующих координат.
      2. Если удалось точно определить пропатчен ячейки, окружить в районе, где депозит biocytin плотнее образа сети спаренных клеток, используя инструмент «Многоугольник» в ImageJFIJI, и относятся к этой позиции, что и пропатчен клеток (рис. 4 d).
      3. Используйте менеджер ROI (анализ | Инструменты | Менеджер по ROI). Затем, нарисуйте ROI на пропатчен сотой и добавить его к диспетчеру ROI (см. рис. 4B).
      4. Задать измерения (анализ | Задать измерения) и выберите параметр «Центр тяжести».
      5. В менеджере ROI, нажмите на «Мера» для получения координаты центра тяжести области трассировки. Эти координаты можно используйте в качестве точки отсчета для этой конкретной сети.
    2. Ссылочная перевод
      1. Вычислите координаты каждой ячейки со ссылкой на пропатчен экзоцитоз, используя следующую формулу:
        Equation 1 
        С: Equation 2 как координаты для заданной ячейки; Equation 3 как координаты пропатчен ячейки (или ссылочной точка сети); и Equation 4 как координаты для заданной ячейки в новой ссылочной.
        Примечание: Выражая координаты каждой ячейки со ссылкой на пропатчен экзоцитоз является важным шагом в расчете векторов с исправленными экзоцитоз. Будьте осторожны при использовании ImageJFIJI что ссылочной для любого изображения расположен в верхнем левом углу изображения.
    3. Определение основных вектора преференциальных ориентации
      1. Вычислите координаты вектора главных преференциальных ориентации с использованием следующей формулы:
        Equation 5
        С: (Equation 6) как координаты вектора главных преференциальных ориентации; и Equation 7 как координаты каждой ячейки сети, полученные с исправленной ячейки как ссылочная.
        Примечание: Для каждой ячейки в сети, вектор определяется относительно координат пропатчен экзоцитоз. Главный вектор преференциальных ориентации сети является суммой всех этих векторов.
      2. Разделите длину основных вектора (предоставляемые координаты, полученные от использования указанной выше формулы) на количество клеток в сети минус один (поскольку координаты пропатчен ячейки не включены в стоимость номера), чтобы нормализовать значения и позволяют сравнивать сетей. Схематическое представление этого анализа представлена на рисунке 5.
  5. Размещение анализируемого сетей в ядре интерес
    1. Выравнивание 20 X и 4 X изображений
      1. Чтобы определить положение каждой сети в ядре интерес (NVsnpr), используйте 4 X изображения. Откройте 4 X изображение с векторный редактор изображений.
      2. Выберите 4 X изображение и изменить ее размер, умножив его на 5. Окно измерения расположен в правой части верхней горизонтальной панели инструментов. Например, 4 изображения X, были пробы на 800 x 800 пикселов, изменить разрешение проб до 4000 x 4000 пикселей (чтобы задать рабочую единицу в пикселях, перейдите к «Параметры документа» на вкладке файл: файл | Параметры документа). Экспортируйте файл в формате TIFF и имя его «размер 4 X».
      3. Совместите левый верхний угол изображения с нижнем левом углу документа Adobe Illustrator.
        Примечание: Программное обеспечение предоставляет координаты из ссылочной точки левого нижнего угла.
      4. Откройте 20 X изображение сети. Используйте '' двоичный файл '' или '' обнаружения файла '', потому что они легче согласовать. Затем, играть с помощью непрозрачности инструмента на '' двоичного файла '' 20 X изображение, чтобы привести его в соответствие с повторно размером 4 X изображения.
        Примечание: Непрозрачность инструмент находится в верхней горизонтальной панели инструментов.
      5. Когда выравнивание, выберите и удерживайте инструмент «Пипетка», так появится инструмент «Линейка» и выберите его в левой панели.
      6. Используйте инструмент «Линейка» щелкните в левом верхнем углу 20 X изображения для получения координат 20 X ссылочной указывают на изменения размеров 4 X изображения.
        Примечание: Эти координаты, которые называются 20 X ссылочной (20XR на рис. 5), будет полезным для выражения позиции каждой сети на схема, чертеж ядра.
    2. Нормализация ядро интерес
      Примечание: Для суммирования данных, используется нормализации ядра (NVsnpr) как прямоугольник. Шаги описаны ниже.
      1. Откройте 4 X изменения размера файла в ImageJFIJI и используйте инструмент «Многоугольник» вокруг ядра (NVsnpr). Используйте изображения с пропускаемого света, если границы ядра не способны увидеть; в этом случае не забудьте сначала изменить его размер.
      2. Откройте диспетчер ROI и добавить Рисованные ROI. В «Задать измерение» выберите параметр '' ограничивающего прямоугольника ''.
        Примечание: Параметр «Ограничивающий прямоугольник» вычисляет наименьший прямоугольник вокруг Рисованные ядра.
      3. Нажмите кнопку «Мера».
        Примечание: Таблица появляется с BX и BY, координаты верхнего левого угла прямоугольника: '' прямоугольник позиции '' и предоставляет высоту и ширину. BX и BY являются координаты ограничивающего прямоугольника ссылочной, которые называются Equation 8 и Equation 9 .
    3. Выражение позиции каждой сети в ядре нормализованных
      1. Экспресс координаты каждой ячейки с 4 X ссылочной (черный квадрат на рис. 5) с помощью следующей формулы:
        Equation 10
        Где: Equation 11 являются координаты ячейки с 4 X ссылочной; Equation 12 являются координаты ячейки с 20 X ссылочной (оранжевый квадрат на рис. 5); и Equation 13 координаты 20 X ссылочной точка в изображении 4 X (20XR).
      2. Экспресс координат ячейки в ограничивающий прямоугольник ссылочной (синий на рис. 5) с помощью следующей формулы:
        Equation 14
        Где: Equation 15 являются координаты ячейки в ограничивающий прямоугольник ссылочной; Equation 16 являются координаты ячейки в 4 X ссылочной; и Equation 17 являются координаты ограничивающего прямоугольника ссылочной в 4 X изображения.
      3. Преобразование координат ячейки в ограничивающий прямоугольник ссылочной процент ширина и высота ограничивающего прямоугольника, с использованием следующей формулы:
        Equation 18
        Где: Equation 19 являются клетки координирует в процентах от ширины и высоты прямоугольника, ограничивающего; Equation 20 являются координаты ячейки в ограничивающий прямоугольник ссылочной; Equation 21 ширина ограничивающего прямоугольника, измеряется выше в протоколе; и Equation 22 измеряется высота ограничивающего прямоугольника выше в протоколе.
      4. Для представления всех сетей на ту же цифру, учитывать ориентацию фрагмента (слева или справа). Для стандартизации данных, ссылочной применяется на левой стороне фрагмента. Передачи сетевых координат с правой стороны на левую сторону, применив следующую формулу только к x координаты:
        Equation 23
        Где: Equation 24 — это x координата на правой стороне фрагмента; и Equation 25  это новый x координата выражена в ссылочной на левой стороне фрагмента.
        Примечание: в качестве альтернативы, зеркало изображение в ImageJFIJI до анализа (изображение | Трансформировать | Отразите горизонтально).
      5. Чтобы выразить координаты вектора главных преференциальных ориентации, выполните те же действия с координатами ячейки (шаги 6.5.3.1 для 6.5.3.4).
        Примечание: Выражение координат в процентах позволяет компиляцию данных как один сюжет, в котором ядро (NVsnpr) разработан как прямоугольник.
  6. Исследование угловых разности главный вектор преференциальных направления
    Примечание: Угловой разница Астроцитарная сети используется для определения, является ли преференциальных ориентации к центру ядра интерес. Чтобы вычислить угловое разница (α на рис. 5), который является угол между основным вектором преференциальных направления сети (PD, красная линия на рис. 5) и линия, соединяющая P C, примените теорему ал-Каши в треугольник PDC (см. Вставка Дополнительных методови Рисунок 5 ).
    1. Во-первых Вычислите разной длины, используя применение теоремы Пифагора в декартовой ссылочной, используя следующее уравнение:
      Equation 26
      Где: координаты P и C являются Equation 27 и Equation 28 , соответственно, в ограничивающий прямоугольник ссылочной (рассчитанных выше).
    2. Определите угловое разницу в радианах, с использованием следующей формулы:
      Equation 29
    3. Преобразование угловой разница в градусах (например, с функцией градусов в Excel программного обеспечения).
    4. Скомпилируйте все угловые различия путем построения их в вертикальной гистограммы (рис. 7 c и 7 D) и определить, если есть льготные ориентация Астроцитарная сетей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Связь между клеток в головном мозге не статические, но скорее динамически регулируется многих факторов. Описанные методы были разработаны для анализа Астроцитарная сетей, показали в различных условиях и понять их организации в NVsnpr. Эти результаты были уже опубликованы1. Мы провели biocytin заполнение одного астроциты в спинной части NVsnpr в трех различных условиях: в состоянии покоя (в контролировать условия в отсутствие каких-либо стимуляции), Ca2 +-свободных условиях и после электрическая стимуляция чувствительных волокон, которые проект к ядру. В левой стороны Рисунок 6A- Cприводятся экспериментальные параметры для заполнения biocytin астроциты для каждого условия.

Сети biocytin меченых клеток были замечены в условиях контроля и подтвердил базальной состояние ячейки сцепления между NVsnpr астроциты в состоянии покоя. В 11 случаях, испытания biocytin диффузии показал, что сети состоит из 11 ± 3 клетки (средняя группа в рисунке 6A, рис. 6 d) расширение на площади 34737 ± 13254 мкм2 (Рисунок 6E). Carbenoxolone (CBX, 20 мкм), блокатор неспецифической разрыв соединения, был использован в независимый набор экспериментов для обеспечения того, чтобы наблюдаемые маркировки является результатом biocytin диффузии через разрыв соединения и не поглощение клетками biocytin, который может протекать во внеклеточное пространство от положительное давление патч пипетку до исправления. Ванна применение CBX уменьшено количество помеченных клеток до 2 ± 0.5 клетки (правая панель в Рисунок 6A, Рисунок 6 d; Иман-Коновер метод, P = 0.016; Holm-Sidak тест, P = 0,010) и области biocytin распространились на 2297 ± 1726 мкм2 (Рисунок 6E; Иман-Коновер метод, P = 0,0009; Holm-Sidak тест, P = 0,025).

Эффект удаления кальция с носителя на NVsnpr, Астроцитарная сети был испытан, потому что концентрация низкая внеклеточного кальция, как известно, открыть connexins и разрыв соединения20,21,22и он может быть использован массовых и равномерное стимулом, чтобы открыть синцития и максимизировать трассирующими диффузии через разрыв соединения. Астроцитарная сетей, которые были выявлены в Ca2 +-свободных условий (n = 10) показала большее количество клеток, чем сетей, показали в условиях контроля, с 37 ± 10 помечены клетки (средняя группа в Рисунок 6 c, Рисунок 6 d; Иман-Коновер метод, P = 0.016; Holm-Sidak тест, P < 0,001) площадью 108123 ± 27450 мкм2 (средняя группа в Рисунок 6 c, Рисунок 6E; Иман-Коновер метод, P = 0,009; Holm-Sidak тест, P = 0,001).

По сравнению с полного удаления кальция с носителя, электрической стимуляции афферентных входов к ядру интерес является более физиологическим стимулятором, непосредственно включающей нейронов цепь интерес. Следовательно результаты от такого рода манипуляции может предоставить полезную информацию относительно функциональных последствий Астроцитарная сетей наблюдается. Например ввод из двух различных путей может привести к различные эффекты на состояние базальных клеток, муфты в данной области, или он может выявить связь между астроциты в различных подразделениях ядра. В нашей цепи, электрической стимуляции чувствительных волокон, которые проект в NVsnpr, с помощью 2-х секундное поезда 0,2 мс импульсов на 40-60 Гц (n = 11) производится увеличение сцепления между NVsnpr астроциты, относительно условий, кератоз, с 23 ± 6 клеток (средняя группа в рисунке 6B, Рисунок 6 d; Иман-Коновер метод, P = 0.016; Holm-Sidak тест, P = 0,012) распространяется на площади 814174 ± 15270 мкм2 (средняя группа в Рисунок 6B, Рисунок 6E; Иман-Коновер метод, P = 0,009; Holm-Sidak тест, P = 0,004).

Последствия этих двух видов стимуляции, удаления кальция с носителя и электрическая стимуляция афферентных входов, сорваны CBX. Астроцитарная сетей в этом состоянии составляли лишь 5 ± 1 клетки в Ca2 +-бесплатный Фаго (правая панель в Рисунок 6 c, Рисунок 6 d; n = 4; Иман-Коновер метод, P = 0.016; Holm-Sidak тест, P < 0,001) и 9 ± 2 клетки с чувствительных волокон стимуляции (правая панель в рисунке 6B, Рисунок 6 d; n = 6; Иман-Коновер метод, P = 0.016; Holm-Sidak тест, P = 0,023). Площади поверхности сети были также сокращены до 17987 ± 9843 мкм2 с Ca2 +-бесплатный Фаго (Рисунок 6E; n = 4; Иман-Коновер метод, P = 0,009; Holm-Sidak тест, P = 0,004) и 39379 ± 11014 мкм2 с чувствительных волокон стимуляции (Рисунок 6E; n = 6; Иман-Коновер метод, P = 0,009; Holm-Sidak тест, P = 0,055).

Анатомический анализ проводился только в тех случаях, где NVsnpr границы могут быть четко определены на 4 X изображений, который был получен в случае 9 из 10 сетей с Ca2 +-бесплатный фаго и 8 из 11 сети полученные с электрической стимуляции. Прорисовка всех анализируемых Астроцитарная сетей на теоретических NVnspr показывает, что большинство клеток, состоит в сетях находились в пределах границ ядра (цифры 7A и 7B, левой и средней панели). В Ca2 +-бесплатный фаго, 4 из 9 Астроцитарная сетей распространился за пределы NVsnpr в направлении ядра двигателя, расположенные медиально к NVsnpr. В этих 4 случаях подавляющее большинство клеток помечены ограничивались ядра. Сетей помеченных клеток, полученных с электрической стимуляции чувствительных волокон были более ограничены. Только 2 сетям через границы ядра, в которых один распространения через mediodorsal границу в области боковых supratrigeminal (тёмно зелёная сеть в Рисунок 7B, левой и средней панели). Во втором случае 2 астроциты в красной сети (Рисунок 7B, левой и средней панели), перешли в брюшной части NVsnpr.

Векторный анализ для Астроцитарная сетей преференциальных ориентации (правая панель рис. 7A и 7B) производятся различные результаты в зависимости от используемых стимул. Действительно, для Астроцитарная сетей, наблюдается с Ca2 +-бесплатный фаго, все за исключением одного из векторов преференциальных ориентации были ориентированы в центре NVsnpr. Однако для Астроцитарная сетей, наблюдается с электрической стимуляции, преференциального ориентацию векторов были в основном ориентированы на границах ядра. Это отражено компьютерная угловая различия в преференциальных ориентации между Астроцитарная сетями, полученные с Ca2 +-бесплатно фаго и результатами, полученными с электрической стимуляции чувствительных волокон. В Ca2 +-бесплатные фаго, вертикальной гистограммы распределения угловой разница показал, что большинство сетей помеченных клеток имеют угловой разница между 0 и 40 градусов, при среднем значении углового разница 39,5 ± 12.7 градусов ( На рисунке 7 c). С электрической стимуляции чувствительных волокон, более равномерное распределение, и разность средних угловой (99,5 ± 17 градусов) значительно отличается (рис. 7 d; студент t теста, P = 0,012).

Эти данные показывают, что biocytin маркировки анализ позволяет нам отличить последствия различных раздражителей, модулирует Астроцитарная муфты. Кроме того картирование Астроцитарная сетей в нормализованной ядро следуют векторного анализа обеспечивает ценную информацию о размерах и анатомические организации этих сетей.

Figure 1
Рисунок 1: поклеточного патч зажим экзоцитоз. (A) астроциты, помечены с загрузкой маркер sulforhodamine 101 (SR-101) в NVsnpr. SR-101-меченых экзоцитоз Сома направлена с пипеткой патч (белая пунктирная линия). Шкалы бар = 100 мкм. (B) деполяризующий рамп протокол осуществляется в мембраной (от -120 до 110mV) для оценки характеристик пассивной экзоцитоз. (C) Оценка отсутствие потенциала действий, выпустив в экзоцитоз путем инъекций импульсов тока в режиме ток зажим. Эта цифра приспособлен от Кондамин и др. (2018) 1. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: лечение и анализ Астроцитарная сетей с программным обеспечением ImageJFIJI. (A) Z-стек создание от конфокальная томография Астроцитарная сети. В окне верхнего левого, Z-стека в ImageJFIJI. (B) фоновый процесс вычитание. В левом верхнем углу вычитание фона окна в ImageJFIJI. Пунктирным кругом подчеркивает области на изображении где эффект команду вычитание фона является более очевидным, когда по сравнению с изображения в A. (C) удалить останцы процесса. Этот процесс удаляет мелкие пятна из-за неопределенного месторождения streptavidine, в сочетании с Alexa 594. Белые стрелки показывают депозит до (рис. 2B) и после (рис. 2 c) был обработан команда. В левом верхнем углу удалите нетипичные окна в ImageJFIJI. (D) пример размывания эффекта, которые могут быть произведены неадекватной регулировки параметров останцы удалить. Желтые стрелки показывают некоторые размыты клетки. (E) настройте порог процесса. В левом верхнем углу настройте порог окно в ImageJFIJI. Полосы прокрутки действовать на порог сигнала перестройки. (F) сделайте бинарный шаг. Изображение преобразуется в двоичный файл в ImageJFIJI. Шкалы бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: определение клеток в Астроцитарная сетях с ImageJFIJI. (A) пример бинарного образа Астроцитарная сети, полученные в ImageJFIJI. Шкалы бар = 100 мкм. (B) иллюстрирует «файл обнаружения», полученные после применения процесса анализа частиц на двоичный файл. Формы соответствуют всех обнаруженных клетки с их соответствующее число в красный цвет. (C) оставил часть: анализ частиц окно в ImageJFIJI. Эта функция определяет ячейки сети в двоичное изображение. Можно отрегулировать размер обнаруженного клеток и их округлости. Номера для использования должен быть установлен путем проб и ошибок, пока не получен удовлетворительный результат. Правой части: определение таблицы, генерируемых процессом анализа частиц. X и Y столбцы перечислены координаты каждой клетки обнаружены в изображении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: сети области анализа и определения исправленной ячейки в ImageJFIJI. (A) использование, что инструмент «Многоугольник» в ImageJFIJI, ROI прослеживается вокруг кластера обнаружил клетки (красная линия), которые будут использоваться для определения площади поверхности сети. (B ROI будет добавлен в менеджер ROI. (C) пример Астроцитарная сети, в котором пропатчен клеток (белая стрелка) легко идентифицировать из-за ярких интенсивность его biocytin маркировки. (D) пример Астроцитарная сети где пропатчен ячейки не может быть идентифицирован, но где площадью плотнее маркировка четко указывает biocytin месторождений. ROI обращается вокруг этой области и добавлены к диспетчеру ROI. Его центр тяжести вычисляется и считается позиции пропатчен ячейки для векторного анализа. Шкалы бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: диаграмма различных требований, используемых для Астроцитарная сетей анализа. Серый квадрат является 4 X изображение с ссылочной точки 4XR соответствие с в левом нижнем углу документа Adobe Illustrator. Белый квадрат, окружили в оранжевый является 20 X изображение с ссылочной точки 20XR. Оба изображения выровнены друг с другом, как описано в протоколе. (Синий) прямоугольник определяет NVsnpr (фиолетовая пунктирная линия) и масштабируется в процентах с точкой ссылочной (BR). Theoric центр спинной части NVsnpr схематизируются, темно синяя точка (C). Астроцитарная сеть схематизируются пропатчен ячейки (черная точка, P) и главный вектор преференциальных направления (красная линия). Каждый пунктирная черная линия-вектор каждой ячейки Астроцитарная сети. Угловые разница Астроцитарная сети (α) это угол между основной преференциальных ориентация сети (красная линия) и черные линии, соединяющей пропатчен экзоцитоз теоретический центр ядра. Врезные это зум 20 X изображения показаны треугольник PCD, формируется теоретический центр NVsnpr (C), исправленной ячейки и главный вектор преференциальных направления (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Астроцитарная сети, помечены biocytin в NVsnpr в различных условиях, показаны различные размеры. (A-C) Слева, схема, чертеж экспериментальной состояния. Во всех условиях один экзоцитоз, обозначены SR-101 был предназначен для записи поклеточного и заполнены с biocytin (0,2%). Средняя колонка: микрофотографиями, иллюстрирующие Астроцитарная сети, полученные под контролем состояния (A), после электрической стимуляции Vth тракта (2 поезда s, 40-60 Гц, 10-300 МКА, импульсов 0,2 мс) (B); и после перфузии с Ca2 +-бесплатный Фаго (C). Правая колонка: микрофотографиями, иллюстрирующие Астроцитарная сети полученные на тех же условиях, но в присутствии CBX (20 мкм) в Ванна предварительного. Шкалы бар = 100 мкм. (D и E) Вертикальные полосы диаграммы, представляющие количество сочетании клетки и площадь поверхности, соответственно, biocytin заполнены сетей астроциты в трех экспериментальных условиях, представленные выше (A, B и C) в присутствии (заштрихованы) и отсутствие (твердые) CBX (20 МКМ). Данные представлены как средний ± SEM. несколько сравнений (холм-Sidak тест): * = P < 0,05; ** = P < 0,001. Эта цифра приспособлен от Кондамин и др. (2018) 1. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: Характеристика сетей в NVsnpr под Ca2 +-бесплатный фаго и с электрической стимуляции тракта Vй . (A и B) Слева: Все клетки, помечены в 9 сетях заполнены под перфузии с Ca2 +-бесплатно Фаго (A) или в 8 сетях заполнены, а стимулирование Vth тракта (B) строятся согласно их позиции в теоретическое ядро NVsnpr (серый прямоугольник). Каждой сети (и клеток, составляющих его) представлен другим цветом. Средний: границы каждой сети. Точка в каждой области представляет залатанную ячейку. Право: представление основных вектора преференциальных ориентации каждой сети. Точка представляет пропатчен клеток и стрелки вектора преференциальных направления. (C и D) Распределение угловой различия между основной вектор преференциальных ориентации и прямая линия, соединяющая пропатчен клеток в центре спинной части NVsnpr (расположен на оси dorsoventral 25% и 50% на оси медиолатеральной) под изучены два условия. Средняя угловая разница составила 39,5 ± 12.7 градусов в Ca2 +-бесплатный фаго, указанием преференциального ориентация на центр ядро и 99,5 ± 17 градусов с электрической стимуляции, указывающее преференциального ориентация на Периферия (студент t тест, P = 0,012). Эта цифра приспособлен от Кондамин и др. (2018) 1. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

сахарозы фаго* ммоль
Сахароза 219
KCl 3
KH2PO4 1.25
MgSO4 4
NaHCO3 26
Декстроза 10
CaCl2 0.2

Таблица 1: состав сахарозы-решения на основе используется для нарезки мозга. (*) = рН и осмолярности были приспособлены к 7.3-7.4 и 300-320 mosmol/кг, соответственно.

Фаго* ммоль
NaCl 124
KCL 3
KH2PO4 1.25
MgSO4 1.3
NaHCO3 26
Декстроза 10
CaCl2 1.6

Таблица 2: состав фаго решение, используемое для хранения фрагментов и записи поклеточного. (*) = рН и осмолярности были приспособлены к 7.3-7.4 и 290-300 mosmol/кг, соответственно.

Решение внутренних патч* ммоль
K-глюконат 140
NaCl 5
HEPES 10
EGTA 0.5
Трис СПС соли 2
Трис GTP соли 0.4

Таблица 3: состав внутреннего решения используется для записи поклеточного. (*) = рН и осмолярности были приспособлены к 7.2-7.3 и 280-300 mosmol/кг, соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существует целый ряд электрофизиологических методов для оценки функциональных сцепления между астроциты23,24. Однако эти методы не предоставляют информацию о механизме анатомические Астроцитарная сетей. В ряде исследований уже показали, что «краситель - или трассирующими увязка», как это сделано здесь, возникает только в часть совокупности клеток, которые распознаются электрофизиологические методы25,26,27, предполагая, что недооценивать количество клеток, обнаруженных с помощью этого метода. Тем не менее это по-прежнему лучший метод для визуализации сцепления. Более краска муфта получается при использовании меньше, чем 1-1.2 кДа Трейсеры молекулы проникать разрыв соединения20. Живая визуализация сцепления может осуществляться мониторинг распространения производных флуоресцентных глюкозы (2-NBDG) или флуоресцентные маркер (как некоторые красители Alexa или желтый Люцифера)13, но из-за меньшего размера, biocytin дает лучшие результаты и позволяет для количественной оценки в фиксированных тканей. Таким образом следует отметить, что количество клеток, обнаруженных с помощью этого метода во многом недооценивается. С другой стороны некоторые из клеток могут быть помечены не вследствие их соединения, но из-за поглощения трассирующими, что утечка во внеклеточное пространство. Степени маркировки, в результате утечки может быть оценена в управления эксперименты с приложениями Ванна разрыв соединения окон1. Однако можно предположить, что какой-либо предвзятости за метод будет применяться ко всем условиям.

Наконец следует подчеркнуть, что не все спаренные клетки являются астроциты. Panglial сетей, где астроциты соединены к Олигодендроциты были описаны в нескольких областях мозга, включая боковые превосходное оливковое8, таламуса16, коры и гиппокампа28. Нашей целью было разработать метод сравнения Астроцитарная сетей показал муфтой красителя при различных условиях оценить гипотезу о том, что они образуют четкие, отличительной функциональной доменов, свидетельствуют различные раздражители. Так как в NVsnpr, ядро тройничного нерва ствола мозга, в которой был проведен этот протокол, очень ограничена связью между астроциты под условия отдыха, важно сначала разработать надежные и объективные метода для выявления помеченных клеток. Это было достигнуто с автоматизированного обнаружения с ImageJFIJI. Иногда бывает трудно отличить слегка помечены клетки от фонового шума. Здесь стек изображений и метод в ImageJFIJI используются для улучшения сигнала, но фоновый шум все еще может быть слишком высокой и приведет к отказ данных. В будущих исследованиях разъяснения протоколы могут использоваться для улучшения соотношения сигнал шум. Расчистка протокол-это интересный метод разъяснения, что сохраняет ткани морфологии (отсутствие усадки), не влияет на липиды и совместим с иммуноокрашивания29. Еще одним ограничением метода, описанного является «водораздел» инструмент, используемый для выявления различий клетки, которые находятся слишком близко к друг другу. Визуальный осмотр обнаруженных клеток должно быть сделано при использовании этого инструмента.

Если Астроцитарная сети формируют функциональные домены, затем они могут определить границы ядра или по крайней мере должна сводиться к границам ядра. Выявлено сетей могут всегда быть ограничены внутри ядра, тем более если они меньше по размеру, если залатанное экзоцитоз находится в центре (или в пределах) ядро. Чтобы проверить, если астроциты, сидя на границе ядра предпочтительно пара с другими астроциты вне ядра или с другими в ядре, нам необходимо определить преференциальных направления, к которому краситель распространилась от пропатчен экзоцитоз. Ряд других исследований аналогичный вопрос в ствол мозга, barreloid поля таламуса, обонятельные клубочков, гиппокампа, и боковые превосходное оливковое, но они сосредоточены анализы главным образом на расстоянии диффузии трассировщик, Электрофизиологическая характеристика различных видов астроциты в функции их локализации и распространения краситель вдоль ортогональных осей в отношении этих четко определенной структуры8,9,10, 13,14,16. Здесь мы использовали векторного анализа для определения доминирующего направления трассировщика, распространения, которое было дано по размеру и ориентации вектора нормализованных основной. Малые векторы указывают не ясно «доминирующей» или преференциальных ориентацию. Важным шагом для векторного анализа является способность точно идентифицировать пропатчен экзоцитоз, который не всегда является возможным. Интересной альтернативой помочь найти пропатчен экзоцитоз является добавление большой (не разрыв соединения permeant) и поправимо трассирующими, как декстраны, в записи решение. Если это не возможно определить пропатчен ячейку или расположение патч, он может быть лучше опустить эти эксперименты из векторного анализа.

Наконец чтобы анализировать ли свойства сетей варьируется в зависимости от их расположения в ядре, нам нужно способ выразить свою позицию в «нормализованного» ядро. Только важным этапом этой процедуры является способность ясно видеть границы ядра в малое увеличение изображения (4 X). Простое решение этой проблемы, если это происходит часто, необходимо добавить стандартный гистологические окраска ткани, обработки перед анализом.

Неоднородность астроциты регионах мозга была четко определена, и растущее количество доказательств поддерживает концепцию, что их специализаций особенно приспособлены для функции цепи, что они встроены в9, 10,30,31. Для этого быть правдой, между Астроцитарная связь должна быть ограничена астроциты, связанных с той же цепи. Наблюдения, поддерживая это предположение в областях различных мозга появляются, но более очевидны в районах с кластеризованным представлений, как сенсорные карты в коре ствола или обонятельные луковицы. Однако большинство сообщений о дублировании нейронов и Астроцитарная карты описательный и качественные. Методы, сообщили здесь может использоваться для объективировать эти замечания и разработать инструменты для лучше анализировать Астроцитарная сетей согласно их позиции в данной схеме.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа финансируется Канадским институтов медицинских исследований, номер гранта /: 14392.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Chemicals S671-3
KCl Fisher Chemicals P217-500
KH2PO4 Fisher Chemicals P285-500
MgSO4 Fisher Chemicals M65-500
NaHCO3 Fisher Chemicals S233-500
C6H12O6 Dextrose anhydrous Fisher Chemicals D16-500
CaCl2 dihydrated Sigma C70-500
Sucrose Sigma S9378
D-gluconic acid potassium salt Sigma G45001
MgCl2 anhydrous Sigma M8266
HEPES Sigma H3375
EGTA Sigma E4378
ATPTris Salt Sigma A9062
GTPTris Salt Sigma G9002
Biocytin Sigma B4261
Carbenoxolone disodium salt Sigma C4790
avidin-biotin complex : ABC kit Vestor laboratories PK-4000
Streptavidine-alexa 594 Molecular Probes S11227
Triton Fisher Chemicals BP151-500
Xylene Fisher Chemicals X5-1
Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount Fisher Chemicals SP15-100
Slide Drying Bench Fisherbrand 11-474-470
Vibratome Leica VT 1000S
Microscope cover glass Fisherbrand 12-544A
Microscope slide ColorFrost Fisherbrand 12-550-413
PFA Fisherchemicals 04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope Olympus
40X water-immersion lens Olympus LUMPLFLN40XW
20X water-immersion lens Olympus XLUMPLFL20XW
4X water-immersion lens Olympus XLFLUOR4X/340
Micropipette puller Sutter Instrument P97
Micromanipulator Sutter Instrument MP 225
Camera CCD Sony CX-ST50
Black and white monitor Sony SSM-125
Digidata Molecular devices 1322A
Patch Clamp amplifier Axon instrument Mulitclamp 700A
Electrophysiology acquisition software Molecular devices pClamp 8
Electrophysiology analysis software Molecular devices Clampfit 8
Imaging analysis software ImageJFIJI Open source software. FIJI version including plug in package.
Vector image editor Adobe Illustrator CS4
Spreadsheet application Microsoft Office Excel 2010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
  2. Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
  3. Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control? Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
  4. Verkhratsky, A., Steinhauser, C. Ion channels in glial cells. Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).
  5. Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).
  6. Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neuroscience. 286, 45-59 (2015).
  7. Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
  8. Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
  9. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  10. Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
  11. Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
  12. Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
  13. Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
  14. Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
  15. Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
  16. Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
  17. Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
  18. Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
  19. Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
  20. Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).
  21. Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).
  22. Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
  23. Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
  24. Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
  25. Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
  26. Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
  27. Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
  28. Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
  29. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  30. Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
  31. Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).

Tags

Нейробиология выпуск 140 астроциты муфты сетей Векторный анализ biocytin преференциальные ориентации анатомические Организации
Анализируя размер, форму и направленность сетей спаренных астроциты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Condamine, S., Verdier, D., Kolta,… More

Condamine, S., Verdier, D., Kolta, A. Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes. J. Vis. Exp. (140), e58116, doi:10.3791/58116 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter