Neuroscience

Analysera den storlek, form och riktningen av nätverk av kopplade astrocyter

Published: October 4, 2018 doi: 10.3791/58116

Steven Condamine¹, Dorly Verdier¹, Arlette Kolta^1,2

¹Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central, and Département de Neurosciences, Université de Montréal, ²Faculté de Médecine Dentaire, Université de Montréal

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma organisationen av astrocytic nätverk. Den beskrivna metoden minimerar bias för att ge beskrivande åtgärder av dessa nätverk såsom celltal, storlek, område och position inom en kärna. Anisotropi bedöms med ett vectorial analys.

Abstract

Det har blivit allt tydligare att astrocyterna modulera nervcellernas funktion inte bara på synaptic och encelliga nivåer, men också på nätnivå. Astrocyter är starkt kopplade till varandra genom gap-junctions och koppling genom dessa korsningar är dynamisk och starkt reglerade. En framväxande koncept är att astrocytic funktioner är specialiserade och anpassade till funktionerna av neuronala kretsen som de är associerade. Därför behövs metoder att mäta olika parametrar för astrocytic nätverk att bättre beskriva bestämmelser om sin kommunikation och koppling och att ytterligare förstå deras funktioner.

Här, använda programvaran bild analys (t.ex., ImageJFIJI), beskriver vi en metod för att analysera confocal bilder av astrocytic nätverk avslöjades av färgämne-koppling. Dessa metoder använder för (1) en automatiserad och opartisk påvisande av märkta celler, 2) beräkning av storleken på nätverket, 3) uträkningen av förmånliga orientering av färgämne sprids inom nätverket, och 4) ompositionering av nätverket inom området av intresse .

Denna analys kan användas för att karaktärisera astrocytic nät i ett visst område, jämför nätverk av olika områden som är associerade till olika funktioner eller jämföra nätverk som erhållits under olika förhållanden som har olika effekter på kopplingen. Dessa observationer kan leda till viktiga funktionella överväganden. Exempelvis analyserar vi en trigeminala kärnan, där vi har tidigare visat att astrocytic koppling är avgörande för möjligheten för nervceller att växla sina bränning mönster från tonic till rytmiska sprängtryck¹astrocytic nät. Genom att mäta storleken, instängdhet och förmånliga orientering av astrocytic nät i detta nucleus, kan vi bygga hypoteser om funktionella domäner som de begränsa. Flera studier tyder på att flera andra områden i hjärnan, inklusive fat cortex, laterala överlägsen oliv, lukt glomeruli och sensoriska kärnor i thalamus och syncentrum, för att nämna några, kan dra nytta av en liknande analys.

Introduction

Många studier har beskrivit hur neuron-Astrocyten dialogen på sub cellulära eller synaptic nivå kan ha följder i neuronala funktioner och synaptisk transmission. Det är väletablerat att astrocyterna är känsliga för omgivande neuronal aktivitet; i själva verket har de receptorer för många neurotransmittorer som glutamat, GABA, acetylkolin och ATP (se tidigare publicerade recensioner²^,³^,⁴). I gengäld bearbetar astrocytic ensheath synaptic element och inflytande neuronal aktivitet både där och på extrasynaptic platser genom att reglera extracellulära Joniska homeostas och släppa flera faktorer eller sändare som glutamat, D-serine och ATP ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷.

Idén att astrocyterna också kan modulera nervcellernas funktion på nätnivå har uppstått, med bevis att astrocytic koppling regleras rumsligt och motsvarar neuronala segmentering i områden som kännetecknas av en tydlig anatomiska uppdelning (liksom områden med sensoriska representationer), vilket tyder på att astrocyterna kommer par till andra astrocyter som serverar samma funktion i stället för bara de som finns i närheten. I laterala överlägsen oliv, exempelvis är mest astrocytic nätverk orienterade vinkelrätt till tonotopic axel⁸, medan i de fat cortex eller olfactoty glomeruli, kommunikationen mellan astrocyter är mycket starkare inom fat eller glomeruli och svagare mellan angränsande sådana⁹^,¹⁰. I båda fallen är astrocytic nätverken orienterade mot mitten av den glomerule eller fat⁹^,¹⁰.

Vi visade nyligen att astrocytic aktivitet modulerar neuronala bränning genom att minska koncentrationen av extracellulära Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_e, förmodligen genom frisättning av S100β, en Ca^{2 +}-bindande protein¹¹. Denna effekt, vilket visades i en population av trigeminala rhythmogenic nervceller i den dorsala delen av trigeminala sensoriska kärna (NVsnpr, tros spela en viktig roll i generationen av käkmuskulatur rörelser), resulterar från faktumet som rytmiska bränning i dessa nervceller är beroende av en ihållande Na⁺ nuvarande som främjas av minskningar av [Ca^{2 +}]_e¹¹^,¹². Rytmiska bränning i dessa nervceller kan vara framkallas ”fysiologiskt” av stimulering av deras ingångar eller konstgjorda minskningen av [Ca^{2 +}]_e. Vi visade att det krävdes astrocytic koppling för neuronal rytmiska bränning¹. Detta tog upp möjligheten att astrocytic nätverk kan bildas avgränsade funktionella domäner där neuronal aktivitet kan synkroniseras och samordnas. För att bedöma denna hypotes, behövde vi först utveckla en metod för att noggrant dokumentera organisationen av dessa nätverk inom NVsnpr.

Tidigare studier på astrocytic nätverk har mestadels beskrivs omfattningen av koppling när det gäller antalet celler och densitet och omfattas. Försök att utvärdera formen på astrocytic nätverk och riktningen av färgämne-koppling utfördes mestadels genom att jämföra storleken på nätverk längs två axlar (x och y) i fat cortex⁹, hippocampus¹³^,¹⁴^, ¹⁵, barreloid fält i thalamus¹⁶, laterala överlägsen oliv⁸, lukt glomeruli¹⁰, och cortex¹⁴. Metoderna som beskrivs här aktivera opartisk räkningarna av märkta celler i ett nätverk och en uppskattning av det område de täcker. Vi har också utvecklat verktyg för att definiera önskad orientering i koppling inom ett nätverk och att bedöma om den önskade inriktningen är mot mitten av kärnan eller i en annan riktning. Jämfört med tidigare använda metoder tillhandahåller detta protokoll ett sätt att beskriva organisationen och läggning av astrocytic nät i strukturer som den dorsala trigeminala viktigaste sensoriska kärnan som inte har en känd tydliga anatomiska olika fack. I ovanstående studier nätverk orientering beskrivs som en relation till formen på själva konstruktionen som är redan dokumenterat (t.ex., barreloid i thalamus, fat i cortex, lager i hippocampus och hjärnbarken, glomeruli i i luktbulben, etc.). Dessutom möjliggör vectorial analys jämförelser av koppling riktlinjer avslöjade under olika förhållanden. För att analysera om dessa parametrar ändras enligt positionen för nätverket inom kärnan, har vi också utvecklat en metod för att ersätta varje nätverk med hänvisning till gränserna för kärnan. Dessa verktyg kan enkelt anpassas till andra områden för utredande nät av kopplade celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden abode av kanadensiska institut för hälsa forskning regler och godkändes av universitetet i Montreal djurens vård och användning kommittén.

1. beredning av råtthjärna skivor

Förbereda 1 L av en sackaros-baserad lösning (tabell 1) och 1 L standard konstgjorda cerebral-spinal vätska (aCSF) (tabell 2).
Bubbla sackaros-baserade lösningen med en blandning av 95% O₂ och 5% CO₂ (carbogen) för 30 min innan du placerar den i-80 ° C i ca 30 min, tills lösningen är kall men inte helt fryst. Använda denna iskalla sackaros som skärande bufferten för skivning av hjärnan. Hålla den på isen när det är bort från frysen.
Bubbla aCSF med carbogen genom hela experimentet. Använda denna lösning för skiva lagring och som perfusing bufferten som den patch-fastspänning och biocytin-fyllning av astrocyter kommer att utföras. Förbereda en slice återhämtning håller kammaren att deponera hjärnan skivor så snart de skärs.
Obs: Skiva återhämtning innehav kammaren kunde vara skräddarsydda och består huvudsakligen av en liten brunn med en maskstorlek på botten upphängd i en större brunn som är fylld med aCSF, där en slang förs för att få carbogen från botten.
Använd 15 - 21 dag-gamla Sprague-Dawley-råttor utan någon sex - eller stamspecifika bias. Söva djuret med isofluran (1 mL av isofluran i en kammare för induktion av anestesi). Kontrollera djup anestesi genom att försiktigt klämma den hind tass eller svans av djuret.
Halshugga råtta med en giljotin, skära sin skalle med sax och snabbt ta bort hjärnan från kraniet med en platt spatel.
Doppa hjärnan i den iskalla sackaros-baserad lösningen för om 30 s och överföra det (med lösningen) till en petri maträtt. Med ett rakblad, ta bort de delar som är främre och bakre till området för att vara sektioneras, om skära skivor i tvärplanet.
Limma den återstående blocket av hjärnvävnad på dess rostralt sida och fortsätt att skär hjärnan skivor (350 µm tjock) sackaros-baserade medium med en vibratome. Överför sedan de insamlade skivorna i en återhämtning håller kammare fylld med carbogenated aCSF vid rumstemperatur (RT) tills de är redo att användas (tillåta minst 1 timme för återvinning).
Obs: Senaste utvecklingen på området tillåta långvarig inkubering upp till 24 h av hjärnan skivor i in vitro- villkorar¹⁷.

2. Sulforhodamine 101 (SR-101) märkning av astrocyter

Pre-Värm ett vattenbad till 34 ° C och placera två slice inkubation kammare i den. Fyll en av slice inkubation avdelningarna med en lösning av aCSF innehållande 1 μM SR-101, och fyll den andra bara med aCSF.
Inkubera skivor i inkubation kammaren som innehåller den 1 µM SR-101 för 20 min och sedan överföra dem till andra ruvning kammare för att skölja ur överflödig SR-101 från vävnaden. Låt det Inkubera i 20 min eller mer på 34 ° C, behövs sedan hålla inkubation kammaren som innehåller skivor på RT tills de är¹⁸.

3. Astrocyten lapp och Biocytin fyllning

Markera ett segment och placera den i mikroskopet inspelning kammare. Att patch astrocyter, använda elektroder med ett motstånd på 4-6MΩ när fylld med en kalium-glukonat-baserad lösning (se tabell 3).
Under visuell vägledning och använder en micromanipulator, direkt inspelning elektroden mot en SR-101-märkt Astrocyten som visas i figur 1. Undvika celler ligger på ytan av segmentet eftersom de är mer sannolikt att vara skadad eller har förlorat anslutningar till angränsande celler.
För att förhindra läckage av biocytin i vävnaden, minimera realiteten pressar till patch pipetten och gäller det bara när det är nära den Astrocyten som kommer lagas (0.1-0.4 mL i en spruta med 1 mL).
Före korrigering, justera förskjutningen av pipetten och dess kapacitans. Korrigera för flytande junction potentialer, som korrekt och exakt spänning kommandon är kritiska till experiment¹⁹.
Flytta pipetten nära nog till Astrocyten att iaktta depression orsakas av realiteten pressar. Ta sedan bort det positiva trycket och långsamt tillämpa vissa undertryck. Klämma i Astrocyten till -70 mV när tätningen når 100 MΩ. Vänta tills tätningen når 1-3 GΩ. Fortsätta att gälla undertryck till att bryta in i cellen. Vara försiktig när du applicerar undertryck, då astrocyter är mycket bräcklig.
Bedöma den lappat cellen elektrofysiologiska egenskaper. I spänning-clamp läge, utföra ett hela-cell ström-spänning protokoll med en ramp spänning befälet över 600 ms behandlingsduration från -120 till + 110 mV. I nuvarande-clamp-läge, utför ett steg IV protokoll där injektion av 1000 ms aktuella stegen för 100 pA från -1 till 1 nA, samplingsfrekvens för hela-cell inspelningar är 10 kHz.
Obs: Astrocyterna visar en linjär ström-spänning-profil utan någon form av rättelse (som visas i figur 1B) och ingen aktionspotential som skjuter på membran depolarisation (figur 1 c). Vilande membranpotentialen (RMP) bör vara stabil och inte positiv till - 60mV. I vissa områden i hjärnan är RMP av astrocyter mer hyperpolarized än i NVsnpr.
Låt biocytin att sprida inom Astrocyten för 30 min när de utför ett steg IV protokollet var 5 minut.
Lossa patch pipetten försiktigt utan att skada den lappat Astrocyten in teleskopcylindern och omedelbart ta del av förskjutningen av pipetten innan du tar den ur inspelningen kammaren. Subtrahera värdet av membranet potential inspelningar.
Lämna hjärnan segmentet att vila i inspelning kammaren i minst 15 min (utöver de 30 min injektionsvätska) för att tillåta spridning av spårämnet från den lappat Astrocyten till hela nätverk av kopplade celler.
Obs: För att avslöja ett nätverk av kopplade celler, bara en enda cell bör lagas i kärnan av intresse. Om flera försök krävs för att uppnå en framgångsrik lapp, kasta fallet och försök till lapp på den kontralaterala sidan eller i en annan hjärna skiva.
Gör ett märke eller incision i vävnaden att identifiera vilken sida av segmentet är vänt uppåt och överföra skiva först till en petriskål som innehåller normala aCSF, sedan till en lösning av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA). Inkubera segmentet vid 4 ° C över natten.
Varning: PFA är skadligt. Använd skyddsutrustning i en ventilerad huv. Se till att inte kontakta alla material (borstar, rör, etc.) som har varit i kontakt med PFA återhämtningen håller kammaren, inkubation kammare eller andra material som används för inspelning av frisk vävnad.

4. Biocytin uppenbarelse

Uppenbarelse med fluorescerande streptavidine
1. Tvätta hjärnan skivor 2 x 10 min i 0,1 M fosfat buffert saltlösning (PBS) på RT. Sedan, avslöja biocytin genom ruvning hjärnan skivor med streptavidine konjugerat till en fluorophore vid 1/200 spädning i PBS med 4% icke-joniskt rengöringsmedel för 4 h på RT.
2. Tvätta hjärnan skivor 3 x 10 min i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning på RT och montera avsnitten på glasskivor med en vattenlösning monteringsmedium. Placera sidorna som injicerades uppåt, täckglas glasen och täta dem med nagel-lack.
Uppenbarelse med DAB
Obs: DAB (3,3-Diaminobenzidin) uppenbarelse kan användas när fluorescens inte kan användas. I detta fall bör endast en uppenbarelse metod användas för att göra jämförelser.
1. Tvätta hjärnan skivor 3 x 10 min i PBS på RT. Inkubera sektorerna i PBS + H₂O₂ 0,5% i 1 timme vid RT.
2. Skölj skivor 3 x 10 min i PBS på RT. Sedan, inkubera skivor i en avidinen-biotin komplexa färglösningen består av PBS och 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel + avidinen-biotin komplexa peroxidas standard färgning satsreagenser på 1/100 för 24 timmar vid RT.
3. Skölj skivor 3 x 10 min i PBS på RT, inkubera dem i en lösning av PBS + badda 0,05% för 20 min på RT, och överföra dem till en lösning av PBS + badda 0,05% + H₂O₂ 0,5%.
  Varning: DAB är skadligt. Använd skyddsutrustning i en ventilerad huv. Färg reaktionen stoppas när skivor överförs i PBS.
4. Skölj skivor 5 x 10 min i PBS på RT, montera avsnitten på glasskivor (möta sidorna som injicerades uppåt) och låt dem torka på en bild som torkning bänk övernattning på 34 ° C.
5. Sänk objektglas för 1 min i flera alkohol bad på 70%, 95% och 100% och slut med ett bad i xylen för 1 min.
6. Montera glas glasen använder en toluenbaserade konsthartsbas montering medium. Placera coverslips på bilderna och täta dem med nagellack.

5. network Imaging

Visualisera de astrocytic nätverk med skanning confocal Mikroskop utrustad med 20 X och 4 X mål (eller ett lämpligt mål för att visualisera hela kärnan där nätverket ligger) och en laser för att upptäcka fluorophore (i detta fall, Alexa-594 är används).
Använda 20 X förstoring för att göra ett z-stack i nätverket av märkta celler. Använd en upplösning på 800 x 800 pixlar och skanna hastighet på 12,5 μs/pixel.
Obs: För att bild hela nätverket, flera stackar krävs vanligen och antalet staplar behöver justeras för varje nätverk. Upplösning och scan hastighet kan ändras, men se till att använda samma inställningar för alla bilddata.
Använd 4 X förstoring att ta bilder av nätverk och regionen av intresse.
Obs: 4 X imaging används för att bestämma nätverksposition inom kärnan av intresse. Alltid bild samma fält i genomlysning. Denna bild kommer att vara användbart om du inte kan fastställa gränsen av kärnan i confocal fluorescerande bilden.

6. bildanalys

Förberedelse av data
1. Använd programmet ImageJFIJI (Ladda ner det på https://fiji.sc/). Öppna filen och klicka på OK i fönstret ”alternativ för Import av Bio-format”.
2. Om du vill omdefiniera en z-stacken som innehåller endast de optiska skivor som behövs för den slutliga z-stacken (figur 2A), klicka på ”Stack” knappen i verktygsfältet (att hitta, Välj först stk | Z-projektet). Välj ”Max intensitet” i projektionstypen inställning (figur 2A). Spara filen och namnge det ”stack fil”.
3. Om imaging filen innehåller flera kanaler, dela upp den för att spara endast kanalen med av astrocytic network imaging (bild | Färg | Dela kanaler).
4. Kontrollera bilden pixel inställningar [bild | Boenden | Pixel (med ”1” för pixeldimension)].
5. Använd verktyget subtrahera bakgrunden (Process | Subtrahera bakgrunden) ta bort bakgrunden av biocytin märkning. Använda funktionen förhandsgranska ställa rullande boll radien, som allmänt är inställd på 50 pixlar (figur 2B).
6. Använda verktyget ta bort outliers (Process | Buller | Ta bort avskilda) om det behövs efter steget subtrahera bakgrunden. Välj ”Bright” i inställningen ”som avvikare” (figur 2 c). Använda funktionen förhandsgranska ställa in radie och tröskel. Var försiktig med detta verktyg, eftersom det kan oskärpa data, som visas i figur 2D.
  Obs: Verktyget tar bort de små fläckar som orsakats av ospecifika fyndigheter av streptavidine (som visas av de vita pilarna i figur 2B och 2 C före och efter behandling, respektive).
7. Justera tröskeln (bild | Justera | Tröskelvärdet). Markera ”standard” och ”B & W”-läge (figur 2E). Klicka på ”Apply”.
  Obs: Automatisk justering kan användas, men manuell justering med de två skjutreglagen är att föredra. Syftet med detta steg är att minska buller till max utan att förlora någon märkt celler.
8. Konvertera bilden till en binär bild med verktyget binära processen (Process | Binärt | Gör binära) som visas i figur 2F. Spara filen som en TIFF-filen och namnge det ”binär fil”.
Cell räknar
1. Kontrollera inställningen av funktionen åtgärd (analysera | Ange mått). Välj alternativet ”centroiden”.
2. Använd verktyget ”analysera partiklar” på ”binära filen” (figur 3A) produceras i föregående steg (analysera | Analysera partikel) (figur 3 c till vänster). Markera ”konturer” i inställningen ”Show” (figur 3 c). Detta genererar en ny fil som visar resultatet av detektion (figur 3B).
3. Spela med parametrar: storlek (för att upptäcka endast celler, använda värden mellan 30 och 6000) och loopkontroll (för att fastställa ett intervall mellan 0 till 1, där ”1” definierar en perfekt cirkel och ”0” en slumpmässig form) att förfina upptäckten (figur 3 c, lämnade portion). Kör identifieringen genom att klicka på ”OK”.
  Obs: Två tabeller visas efter detektion: 1) en med titeln ”sammanfattning” som ger antalet upptäckta celler, och 2) en tabell med titeln ”resultat” (figur 3 c, högra delen) som ger de x - och y-koordinaterna för varje cell.
4. Kopiera värdena och klistra in dem i ett kalkylbladsprogram. Spara tabellen under namnet ”upptäckt bordet”. En fil med en tomt på upptäckta celler visas också (figur 3B). Spara filen som en TIFF-fil under namnet ”upptäckt filen”.
5. Om en grupp av 2 eller fler märkta celler i nätverket upptäcks som en enda cell med verktyget analysera partiklar eftersom de är alltför nära varandra, använda verktyget vattendelare (Process | Binärt | Vattendelare) på den binära bilden innan du applicerar de analysera partiklarna-verktyg, och gör om stegen analysera partiklar.
  Obs: Verktyget vattendelare skapar en avgränsning av 1 pixel bred mellan extremt nära celler. En cell counter plug-in kan användas när märkning är entydig och kan utföras manuellt.
Mäta astrocytic nätområde
1. För att mäta ytan på nätverk, använda filen upptäckt använder bild J.
2. Använd polygon markeringsverktyget (vänster klicka på knappen i verktygsfältet för att markera den) att spåra en polygon som ansluter alla celler ligger i externa peripheryen av nätverket (figur 4A). Vänster Klicka för att börja spåra polygonen och högerklicka för att stänga den.
  Obs: Denna polygon definieras som ett område av intresse (ROI) och dess yta kommer att mätas för att bestämma ytan av nätverket.
3. Öppna fönstret set mätning (analysera | Ställ mätning) och välj alternativet ”område”. Öppna hanteraren för ROI (analysera | Verktyg | ROI Manager) (figur 4B). Sedan lägga till spårade polygonen i ROI Manager genom att klicka på '' Lägg '' (figur 4B) och köra mätningen genom att klicka på '' åtgärd '' i ROI Manager.
  Obs: Området mätning visas i en tabell och uttryckas i pixlar. Glöm inte att konvertera värdet med konverteringsfaktorn för mikroskopet för att erhålla ett värde i μm².
Bestämning av vektorn som huvudriktning
1. Bestämning av cellen lappat
  1. Öppna stackfilen i ImageJFIJI och identifiera cellen lappat i stackfilen baserat på dess starkare märkning intensitet (figur 4 c). Sedan öppna filen som heter ”upptäckt bord” i ett kalkylbladsprogram och hitta det nummer som är associerat till den lappat cellen och dess motsvarande koordinater.
  2. Om det inte går att exakt fastställa den lappat cellen, omger området där insättningen av biocytin är tätare i avbildad nätverket av kopplade celler, med verktyget Polygon i ImageJFIJI, och hänvisa till denna ståndpunkt som lappat cellen (figur 4 d).
  3. Använd ROI Manager (analysera | Verktyg | ROI Manager). Sedan rita en ROI på lappat cellplats och lägga till den till ROI Manager (se figur 4B).
  4. Ange en mätning (analysera | Ställ mätning) och välj alternativet ”centroiden”.
  5. I ROI Manager, klicka på ”åtgärd” för att få koordinaterna för centroiden av området spåras. Använd dessa koordinater som referenspunkt för detta specifika nätverk.
2. Refererande Översättning
  1. Beräkna koordinaterna för varje cell med hänvisning till den lappat Astrocyten med hjälp av följande formel:
    
    Med: som koordinaterna för en viss cell; som koordinaterna för cellen lappat (eller refererande peka av nätverket); och som koordinaterna för en viss cell i den nya refererande.
    Obs: Att uttrycka koordinaterna för varje cell med hänvisning till den lappat Astrocyten är ett viktigt steg i beräkningen av vektorer från den lappat Astrocyten. Var försiktig när du använder ImageJFIJI som den refererande för varje bild finns i det övre vänstra hörnet av bilden.
3. Bestämning av huvudsakliga vektorn av förmånliga orientering
  1. Beräkna koordinaterna för den viktigaste vektorn förmånliga läggning med följande formel:
    
    Med: () som koordinaterna för huvudsakliga vektorn av förmånliga läggning. och som koordinaterna för varje cell av nätet erhålls med det lappat cell som refererande.
    Obs: För varje cell i nätverket, en vektor bestäms i förhållande till koordinaterna för den lappat Astrocyten. Den viktigaste vektorn förmånliga läggning av nätverket är summan av alla dessa vektorer.
  2. Dela längden på den viktigaste vektorn (tillhandahålls av de koordinater som framställts med hjälp av formeln ovan) av antalet celler i nätverket minus en (eftersom koordinaterna för den lappat cellen inte ingår), att normalisera värdena och möjliggöra jämförelser mellan nätverk. En schematisk vy av denna analys presenteras i figur 5.
Placering av analyserade nätverk i kärnan av intresse
1. Anpassningen av 20 X och 4 X bilder
  1. För att bestämma positionen för varje nätverk i kärnan av intresse (NVsnpr), använda 4 X image. Öppna den 4 X-image med en vektor bildredigerare.
  2. Välj 4 X bilden och ändra dess storlek genom att multipliceras med 5. Fönstret dimension ligger i den högra delen av det övre horisontella verktygsfältet. Exempelvis för en 4 X-image som har provtagits på 800 x 800 pixlar, ändra provtagning upplösningen till 4000 x 4000 pixlar (Ställ in arbetsenhet i pixlar, gå till ”dokumentet Setup” under fliken fil: fil | Dokumentformat). Exportera filen i TIFF-format och namn den ”storlek 4 X”.
  3. Justera det övre vänstra hörnet av bilden med det nedre vänstra hörnet av Adobe Illustrator-dokumentet.
    Obs: Programvaran innehåller koordinater från en refererande nedre vänstra hörnpunkt.
  4. Öppna 20 X bilden av nätverket. Använd '' binärfil '' eller '' upptäckt fil '' eftersom de är lättare att justera. Sedan spela med verktyget opacitet på den '' binära filen '' med 20 X bilden för att justera den med re-storlek 4 X bild.
    Obs: Verktyget opacitet är i övre horisontella verktyg bar.
  5. När justeringen är, Välj och håll verktyget Pipett så mätverktyget visas och markerar du den i vänstra verktygsfältet.
  6. Använd verktyget åtgärd att klicka på det övre vänstra hörnet av 20 X bilden för att få koordinaterna av 20 X refererande peka på de storleksändrade 4 X bild.
    Obs: Dessa koordinater, som benämns den 20 X refererande (20XR i figur 5), kommer att vara användbart för att uttrycka positionen för varje nätverk på en schematisk ritning av kärnan.
2. Normalisering av kärnan av intresse
  Obs: För att sammanfatta data, används en normalisering av kärnan (NVsnpr) som en rektangel. Stegen beskrivs nedan.
  1. Öppna 4 X storleksändras filen i ImageJFIJI, och använda polygonverktyget till omger kärnan (NVsnpr). Använda bild med genomlysning om gränsar av kärnan inte är kunna ses; i vilket fall, kom ihåg att ändra storlek på det först.
  2. Öppna hanteraren för ROI och lägga till den ritade ROI. ”Ställ mätning”, Välj alternativet '' omskrivande rektangel ''.
    Obs: Alternativet ”omskrivande rektangel” beräknar den minsta rektangeln runt ritade kärnan.
  3. Klicka på ”åtgärd”.
    Obs: En tabell visas med BX och BY, koordinaterna för det övre vänstra hörnet av rektangeln: '' rektangel Position'' och ger bredd och höjd. BX och BY är koordinaterna för begränsningsramens rektangeln refererande som benämns som och .
3. Uttryck för varje nätverksposition i normaliserade kärnan
  1. Express koordinaterna för varje cell med 4 X refererande (svart ruta i figur 5) med följande formel:
    
    Var: är cellkoordinater med 4 X refererande; cell koordinater med 20 X refererande (orange ruta i figur 5); och är koordinaterna för 20 X refererande punkt i 4 X-bilden (20XR).
  2. Express cell koordinaterna i markeringsramen rektangeln refererande (blå i figur 5) med följande formel:
    
    Var: är cellen koordinater i markeringsramen rektangeln refererande; är cellkoordinater i 4 X refererande; och är koordinaterna för begränsningsramens rektangeln refererande i 4 X bilden.
  3. Omvandla cell koordinaterna i markeringsramen rektangeln refererande till procentandelen av bredd och höjd av markeringsramens rektangeln med följande formel:
    
    Var: är cellen koordinater i procentandelen av bredd och höjd av markeringsramens rektangeln; är cellen koordinater i markeringsramen rektangeln refererande; är bredden på markeringsramen rektangeln mätt över i protokollet. och i markeringsramen rektangelns höjd mäts ovan i protokollet.
  4. För att representera alla nätverk på samma siffra, ta hänsyn till inriktningen av slice (vänster eller höger sida). För att standardisera data, tillämpas den refererande på vänster sida av segmentet. Överföra nätverk koordinaterna för höger till vänster genom att tillämpa följande formel endast x-koordinater:
    
    Var: är x-koordinaten på höger sida av segmentet; och är nya x-koordinaten uttryckt i den refererande på vänster sida av segmentet.
    Obs: Alternativt spegla bilden i ImageJFIJI innan analysen (bild | Omvandla | Vänd horisontellt).
  5. För att uttrycka koordinaterna för huvudsakliga vektorn av förmånliga orientering, följer du samma steg med cell koordinaterna (steg 6.5.3.1 till 6.5.3.4).
    Anmärkning: Uttrycket av koordinaterna i procentsatser gör en sammanställning av uppgifterna som en enda tomt där kärnan (NVsnpr) är utformad som en rektangel.
Studie av kantiga skillnaden av den viktigaste vektorn av förmånliga riktning
Obs: Kantiga skillnaden ett astrocytic nätverk används för att avgöra om dess förmånliga orientering mot mitten av kärnan av intresse. För att beräkna den kantiga skillnaden (α i figur 5), som är vinkeln mellan den viktigaste vektorn av förmånliga riktningen av nätverket (PD, röda linjen i figur 5) och den linje som förbinder P c, applicera Al-Kashi sats i triangeln PDC (se infälld bild 5 och Kompletterande metoder).
1. Först beräkna de olika längder med en tillämpning av Pythagoras sats i en kartesiska refererande med hjälp av följande ekvation:
  
  Var: koordinaterna för P och C är och respektive i markeringsramen rektangeln refererande (beräknat ovan).
2. Fastställa kantiga skillnaden i radianer med följande formel:
3. Konvertera den kantiga skillnaden i grader (t.ex. med funktionen grader i Excel programvara).
4. Sammanställa alla kantiga skillnader genom att rita dem i vertikal stapeldiagram (figur 7 c och 7 D) och avgöra om det finns en förmånlig riktning av astrocytic nätverk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Koppling mellan celler i hjärnan är inte statisk utan snarare dynamiskt reglerat av många faktorer. Metoderna utvecklades att analysera astrocytic nätverk avslöjade under olika förhållanden och förstå deras organisation i NVsnpr. Dessa resultat har varit redan publicerade¹. Vi utförde biocytin fyllning av enda astrocyter i ryggdelen av NVsnpr i tre olika förhållanden: i vila (under kontrollförhållanden i avsaknad av någon stimulering) i Ca^{2 +}-gratis villkor och efter elektrisk stimulering av sensoriska fibrer som projektet till kärnan. Experimentella inställningarna för biocytin påfyllning av astrocyter för varje villkor illustreras i figur 6A-Cvänster sidor.

Nätverk av biocytin-märkta celler observerades hos villkor kontroll och bekräftade en basal delstaten cell koppling mellan NVsnpr astrocyter i vila. I 11 testade fall visade biocytin diffusion nätverk består av 11 ± 3 celler (mellersta panelen i figur 6A, figur 6 d) sträcker sig över ett område av 34737 ± 13254 µm² (figur 6E). Carbenoxolon (CBX, 20 μM), en icke-specifik blockerare av gap-junctions, användes i oberoende uppsättning experiment för att säkerställa att den observerade märkning var ett resultat av biocytin diffusion genom gap-junctions och inte upptag av cellerna i biocytin, som kunde läcka i extracellulära från realiteten pressar tillämpas på patch pipetten före lapp. Bad tillämpningen av CBX minskas antalet märkta celler till 2 ± 0,5 celler (högra panelen i figur 6A, figur 6 d; Iman-Conover metod, P = 0,016; Holm-Sidak-test, P = 0,010) och området av biocytin spred sig till 2297 ± 1726 µm²(figur 6E; Iman-Conover metod, P = 0.0009; Holm-Sidak-test, P = 0,025).

Effekten av kalcium borttagning från medlet på den NVsnpr astrocytic nät testades eftersom låg extracellulära kalciumkoncentration är känt för att öppna connexins och gap föreningspunkter²⁰^,²¹^,²², och det kan användas som en massiv och enhetlig stimulans att öppna upp syncytium och maximera Spårämnediffusion genom gap-junctions. De astrocytic nätverk som uppenbarades i Ca^{2 +}-gratis villkor (n = 10) visade ett större antal celler än de nätverk som avslöjade i villkor för kontroll, med 37 ± 10 märkt celler (mellersta panelen i figur 6 c, figur 6 d; Iman-Conover metod, P = 0,016; Holm-Sidak-test, P < 0,001) täcker en yta på 108123 ± 27450 μm²(mellersta panelen i figur 6 c, figur 6E; Iman-Conover metod, P = 0,009; Holm-Sidak-test, P = 0,001).

Elektrisk stimulering av afferenta ingångar till kärnan av intresse jämfört med fullständig borttagning av kalcium från mediet, och är en mer fysiologisk stimulans som direkt involverar den neuronala kretsen av intresse. Resultaten från denna typ av manipulation kan följaktligen ge meningsfull information angående de funktionella konsekvenserna av de astrocytic nätverk som observerats. Till exempel, ingång från två olika vägar kan leda till olika effekter om basala celler koppling i ett visst område, eller det kan framkalla koppling mellan astrocyter i olika underavdelningar av kärnan. I vår krets, elektrisk stimulering av de sensoriska fibrerna som projektet till den NVsnpr 2-sekunders tåg 0,2 MS pulser vid 40-60 Hz (n = 11) producerade en ökning av kopplingen mellan NVsnpr astrocyter, i förhållande till de ostimulerade villkor, med 23 ± 6 celler (mellersta panelen i figur 6B, figur 6 d; Iman-Conover metod, P = 0,016; Holm-Sidak-test, P = 0,012) sprider ut sig över ett område på 814174 ± 15270 μm²(mellersta panelen i figur 6B, räkna 6E; Iman-Conover metod, P = 0,009; Holm-Sidak-test, P = 0,004).

Effekterna av dessa två typer av stimulering, avlägsnande av kalcium från mediet, och elektrisk stimulering av afferenta ingångar, störs alla av CBX. Astrocytic näten i detta tillstånd består endast 5 ± 1 celler i Ca^{2 +}-gratis aCSF (högra panelen i figur 6 c, figur 6 d; n = 4; Iman-Conover metod, P = 0,016; Holm-Sidak-test, P < 0,001) och 9 ± 2 celler med sensoriska fibrer stimulering (högra panelen i figur 6B, figur 6 d; n = 6; Iman-Conover metod, P = 0,016; Holm-Sidak-test, P = 0.023). De nätverk ytor reducerades också till 17987 ± 9843 µm² med Ca^{2 +}-gratis aCSF (figur 6E; n = 4; Iman-Conover metod, P = 0,009; Holm-Sidak-test, P = 0,004) och till 39379 ± 11014 µm² med sensoriska fibrer stimulering (figur 6E; n = 6; Iman-Conover metod, P = 0,009; Holm-Sidak-test, P = 0,055).

Anatomisk analys utfördes endast i fall där NVsnpr gränser kunde definieras tydligt på 4 X imaging, som erhölls för 9 av 10 nätverk med Ca^{2 +}-gratis aCSF och 8 av 11 nätverk erhållna med elektrisk stimulering. Plottning av alla analyserade astrocytic nätverk på en teoretisk NVnspr visar att de flesta celler består i näten var begränsade inom nucleus gränser (siffror 7A och 7B, vänster och mitten paneler). Under Ca^{2 +}-gratis aCSF, 4 av 9 astrocytic nätverk sprids utanför NVsnpr i riktning mot motorn kärnan ligger medialt till NVsnpr. I dessa 4 fall, var den stora majoriteten av de märkta cellerna begränsade till kärnan. Nätverk av märkta celler erhålls med elektrisk stimulering av de sensoriska fibrerna var mer begränsat. Endast 2 nätverk utvidgas över nucleus gränsar, där en spridda över den mediodorsal gränsen till området laterala supratrigeminal (mörka gröna nät i figur 7B, vänster och mitten paneler). I det andra fallet korsade 2 astrocyter i röda nätverket (figur 7B, vänster och mitten paneler) i den ventrala delen av NVsnpr.

Vectorial analysen för astrocytic nätverk förmånliga orientering (höger panel i figur 7A och 7B) produceras olika resultat beroende på den stimulans som används. Faktiskt, för de astrocytic nätverk som observerats med Ca^{2 +}-gratis aCSF, var alla utom en av vektorerna av förmånliga orientering orienterad mot mitten av NVsnpr. Dock för astrocytic nätverken observerats med elektrisk stimulering, var förmånliga orientering vektorer mestadels inriktade på gränsar av kärnan. Detta återspeglas av de beräknade kantiga skillnaderna i förmånliga orientering mellan astrocytic nätverken erhålls med Ca^{2 +}-gratis aCSF och den som uppnås med elektrisk stimulering av de sensoriska fibrerna. Under Ca^{2 +}-gratis aCSF, de vertikala stapeldiagram fördelningen av kantiga skillnaden visade att de flesta av nätverk av märkta celler har en kantig skillnaden mellan 0 och 40 grader, med ett medelvärde på kantiga skillnaden på 39,5 ± 12,7 grader ( Figur 7 c). Med elektrisk stimulering av sensoriska fibrer, fördelningen är mer enhetlig, och den genomsnittliga kantiga skillnaden (99,5 ± 17 grader) är signifikant (figur 7 d; student t-test, P = 0,012).

Dessa data visar att biocytin märkning analys tillåter oss att skilja effekterna av olika stimuli modulerande astrocytic koppling. Kartläggning av astrocytic näten i ett normaliserat nucleus följt av vectorial analys ger dessutom värdefull information om storlek och anatomiska organisation av dessa nät.

Figur 1: hela-cell patch-clamp i Astrocyten. (A) astrocyter märkt med en lastning av den markör sulforhodamine 101 (SR-101) i NVsnpr. En SR-101-märkt Astrocyten soma riktar med patch pipetten (vit streckad linje). Skalstapeln = 100 μm. (B) ett depolarizing ramp protokoll utförs i spänning-clamp (från -120 till 110mV) för att bedöma Astrocyten passiva egenskaper. (C) bedömning av avsaknaden av aktionspotential bränning i Astrocyten genom injektion av strömimpulser i ström-clamp-läge. Denna siffra är anpassade från Condamine o.a. (2018) ¹. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 2: behandling och analys av astrocytic nätverk med ImageJFIJI programvara. (A) Z-Stack skapelse från de confocal imaging ett astrocytic nätverk. På den övre vänstra, Z-stack fönstret i ImageJFIJI. (B) subtraktion bakgrundsprocess. Överst till vänster, subtrahera bakgrundsfönster i ImageJFIJI. Den prickade kretsen betonar området på bilden där effekten av kommandot subtrahera bakgrunden är mer uppenbart när jämfört med bilden i A. (C) Remove extremvärden process. Denna process tar bort de små fläckarna på grund av ospecifika insättningar av streptavidine kopplad till en Alexa 594. De vita pilarna visar insättningen innan (figur 2B) och efter (figur 2 c) kommandot har bearbetats. I det övre vänsterläst, ta bort extremvärden fönster i ImageJFIJI. (D) exempel på den oskarp effekt som kan produceras av en otillräcklig justering av ta bort outliers parametrar. Gula pilar visar några suddiga celler. (E) justera tröskeln processen. Överst till vänster, justera tröskeln fönster i ImageJFIJI. Rullningslisterna agera på tröskeln signal justeringen. (F) gör binära steg. Bilden konverteras till en binär fil i ImageJFIJI. Skalstapeln = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: upptäckt av celler i astrocytic nätverk med ImageJFIJI. (A) exempel på en binär bild av ett astrocytic nätverk som erhållits i ImageJFIJI. Skalstapeln = 100 μm. (B) illustrerar den ”Upptäck filen” erhålls efter tillämpa analysera partiklar processen på den binära filen. Formerna motsvara alla upptäckta celler med deras associerade nummer i rött. (C) vänstra delen: analysera partiklar fönster i ImageJFIJI. Funktionen upptäcker cellerna i nätverket i den binära bilden. Storleken på de upptäckta cellerna och deras loopkontroll kan justeras. Nummer som ska användas bör fastställas genom trial-and-error tills ett tillfredsställande resultat erhålls. Höger delen: upptäckt tabell genereras av analysera partiklar processen. X och Y kolumner lista koordinaterna för varje cell som upptäckts i bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: nätverk området analys och bestämning av den lappat cellen i ImageJFIJI. (A) använda polygonverktyget i ImageJFIJI, en ROI spåras runt kluster av upptäcks celler (röda linjen) som används för att bestämma ytan av nätverket. (B) ROI läggs till ROI Manager. (C) exempel på en astrocytic nätverk där cellen lappat (vit pil) är lätt att identifiera på grund av slående intensiteten av dess biocytin märkning. (D) exempel på en astrocytic nätverk där cellen lappat inte kunde identifieras, men där ett område med tätare märkning klart anger biocytin insättningar. En ROI är dras runt detta område och lagt till chefen ROI. Dess centroiden beräknas och ansedd som den lappat cellen att använda för vectorial analys. Skalstapeln = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Diagram över de olika referentials som används för astrocytic nätverk analys. Grå torget är 4 X bilden med den refererande punkt 4XR att vara i linje med det nedre vänstra hörnet av Adobe Illustrator-dokumentet. Den vita kvadraten omgiven i orange är 20 X bilden med den refererande punkt 20XR. Båda bilderna är i linje med varandra som beskrivs i protokollet. Markeringsramens rektangeln (blå) definierar NVsnpr (lila streckad linje) och skalas i procent med den refererande punkten (BR). Theoric mitten av ryggdelen av NVsnpr är schematized av dark blue dot (C). Astrocytic nätverket är schematized av lappat cellen (svart prick, P) och huvudsakliga vektorn av förmånliga riktningen (röda linjen). Varje Streckad svart linje är vektorn av varje cell av astrocytic nätverket. Kantiga skillnaden av astrocytic nätverket (α) är vinkeln mellan nationella förmånliga orientering av nätverket (röda linjen) och den svarta linjen som ansluter den lappat Astrocyten till stadens teoretiska kärnan. Infälld är en zoom av 20 X bilden visar triangeln PCD bildas av teoretisk mittpunkt i NVsnpr (C), lappat cellen och huvudsakliga vektorn av förmånliga riktning (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Astrocytic nätverk märkt med biocytin i NVsnpr under olika förhållanden visar olika storlekar. (A-C) Till vänster, en schematisk ritning av experimentella villkor. Under alla förhållanden, var en enda Astrocyten märkt av SR-101 måltavlan för hela-cell inspelning och fylld med biocytin (0,2%). Mittenkolumnen: mikrofotografier illustrerar de astrocytic nätverk som erhållits under kontroll villkor (A), efter elektrisk stimulering av V^thtarmkanalen (2 s tåg, 40-60 Hz, 10-300 µA, 0,2 ms pulser) (B); och efter perfusion med en Ca^{2 +}-gratis aCSF (C). Höger kolumn: mikrofotografier illustrerar astrocytic nätverken erhållits under samma förhållanden men i närvaro av CBX (20 μM) i Bad före. Skalstapeln = 100 μm. (D och E) Vertikalstreck diagram som representerar antalet kopplade celler och ytan, respektive biocytin-fyllda nätverk av astrocyter på tre experimentella villkor som presenteras ovan (A, B och C) i närvaro (kläckts) och frånvaro (solid) av CBX (20 ΜM). Data representeras som menar ± SEM. flera jämförelser (Holm-Sidak test): * = P < 0,05; ** = P < 0,001. Denna siffra är anpassade från Condamine o.a. (2018) ¹. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 7: Karakterisering av nätverk i NVsnpr under Ca^{2 +}-gratis aCSF och med elektrisk stimulering av V^th tarmkanalen. (A och B) Vänster: Alla celler märkt i 9 nätverk fylld under perfusion med Ca^{2 +}-gratis aCSF (A) eller i 8 nätverk fylld samtidigt stimulera den V^th tarmkanalen (B) ritas enligt deras position i en teoretisk NVsnpr kärna (grå rektangeln). Varje nätverk (och cellerna komponera det) representeras av en annan färg. Mellersta: gränserna för varje nätverk. Punkten i varje område representerar lappat cellen. Höger: Representation av huvudsakliga vektorn av förmånliga orienteringen för varje nätverk. Pricken representerar cellen lappat och pilen vektorn av förmånlig riktning. (C och D) Distribution av kantiga skillnader mellan huvudsakliga vektorn av förmånliga orientering och en rak linje som förbinder lappat cellen till mitten av ryggdelen av NVsnpr (ligger på 25% på dorsoventral axeln och 50% på mediolateral axeln) under den två villkor studerade. Den genomsnittliga kantiga skillnaden var 39,5 ± 12,7 grader i Ca^{2 +}-gratis aCSF, som anger en förmånliga inriktning mot centrum av kärnan och 99,5 ± 17 grader med elektrisk stimulering, som anger en förmånliga inriktning mot den periferin (student t-test, P = 0,012). Denna siffra är anpassade från Condamine o.a. (2018) ¹. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

sackaros-aCSF^*	mMol
Sackaros	219
KCl	3
KH₂PO₄	1,25
MgSO₄	4
NaHCO₃	26
Dextros	10
CaCl₂	0,2

Tabell 1: sammansättning av sackaros-baserade lösningen används för hjärnan skivning. (*) = pH och osmolaritet var justerade till 7,3-7,4 och 300-320 mosmol/kg, respektive.

aCSF^*	mMol
NaCl	124
KCL	3
KH₂PO₄	1,25
MgSO₄	1.3
NaHCO₃	26
Dextros	10
CaCl₂	1.6

Tabell 2: sammansättning av aCSF lösningen används för skiva lagring och hela-cell inspelning. (*) = pH och osmolaritet var justerade till 7,3-7,4 och 290-300 mosmol/kg, respektive.

Interna patch lösning^*	mMol
K-glukonat	140
NaCl	5
HEPES	10
EGTA	0,5
Tris ATP salt	2
Tris GTP salt	0,4

Tabell 3: sammansättning av interna lösningen används för hela-cell inspelning. (*) = pH och osmolaritet var justerade till 7,2-7,3 och 280-300 mosmol/kg, respektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns ett antal elektrofysiologiska metoder för att bedöma funktionell koppling mellan astrocyter²³^,²⁴. Dessa metoder ger dock inte information om det anatomiska arrangemanget av astrocytic nätverk. Ett antal studier har redan visat att ”dye - eller tracer-koppling”, som gjort här, uppstår bara på en bråkdel av kopplade celler som upptäcks av elektrofysiologiska metoder²⁵^,²⁶^,²⁷, tyder på att den antalet celler som upptäckts med denna metod är underskattat. Detta är dock fortfarande den bästa metoden för visualisering av koppling. Större dye-koppling erhålls när du använder molekyl spårämnen mindre än 1-1.2 KDa genomsyra gap föreningspunkter²⁰. Levande visualisering av kopplingen kan utföras genom att övervaka diffusion av fluorescerande glukos derivat (2-NBDG) eller en fluorescerande markör (som vissa Alexa färgämnen eller Lucifer gul)¹³, men på grund av sin mindre storlek, biocytin ger bättre resultat och möjliggör kvantifiering i fasta vävnad. Det bör alltså noteras att antalet celler som upptäckts med denna metod är till stor del underskattats. Några av cellerna kan däremot, märkas inte deras koppling, utan på grund av upptaget av tracer som har läckt ut i det extracellulära utrymmet. Omfattningen av märkning som härrör från läckage kan uppskattas i kontroll experiment med bad tillämpningar av en gap junction blockerare¹. Det kan dock antas att någon bias på grund av metoden skulle tillämpas på alla villkor.

Det bör slutligen understrykas att inte alla i kombination celler är astrocyter. Panglial nätverk där astrocyter är kopplade till oligodendrocyter har beskrivits i flera områden i hjärnan, inklusive lateral superior oliv⁸, thalamus¹⁶, hjärnbarken och hippocampus²⁸. Vårt mål var att utveckla en metod för att jämföra astrocytic nätverk avslöjade med dye-koppling under olika förhållanden att bedöma hypotesen att de bilda väldefinierade, distinkt funktionella domäner avslöjade av olika stimuli. Sedan i NVsnpr, trigeminala hjärnstammen kärnan där detta protokoll genomfördes, kopplingen mellan astrocyter är mycket begränsad under vila villkor, det var viktigt att först utveckla en tillförlitlig och objektiv metod för att upptäcka märkta celler. Detta uppnåddes med automatiserad detektion med ImageJFIJI. Det är ibland svårt att skilja svagt märkt celler från bakgrundsljud. Här stack imaging och en metod i ImageJFIJI används för att förbättra signalen, men bakgrundsljud kan fortfarande vara alltför hög och leda till data avvisande. I framtida studier användas förtydligande protokoll för att förbättra signal-brus-förhållandet. En clearing-protokollet är en intressant metod för förtydligande som bevarar vävnad morfologi (ingen krympning), påverkar inte lipider och är kompatibel med immunfärgning²⁹. En annan begränsning för metoden beskrivs är verktyget ”vattendelare” används för att diskriminera celler som är för nära varandra. Okulärbesiktning av upptäckta celler bör göras när du använder detta verktyg.

Om astrocytic nätverk utgör funktionella domäner, sedan de kan definiera gränserna för en kärna eller bör åtminstone begränsas till gränserna för en kärna. Avslöjade nätverk får alltid begränsas inom en kärna, mer så om de är mindre i storlek, om den lappat Astrocyten är i mitten (eller inom) kärnan. För att testa om astrocyter sitter nära gränsen till en nucleus helst par med andra astrocyter utanför kärnan eller med andra inom kärnan, behövde vi bestämma förmånliga riktningen som färgämnet spridas från den lappat Astrocyten. Flera andra studier har behandlat ett liknande problem i fat cortex, barreloid fält av thalamus, lukt glomeruli, hippocampus och lateral superior oliv, men de fokuserade analyser mestadels på distansera av diffusion av spårämne, elektrofysiologiska karakterisering av olika typer av astrocyter i funktion av deras lokalisering och spridningen av färgämne längs ortogonala axlar med avseende på dessa väl definierade strukturer⁸^,⁹^,¹⁰^, ¹³^,¹⁴^,¹⁶. Här, brukade vi vectorial analys bestämma dominerande riktningen av tracer sprids, som gavs av storlek och orientering av den normaliserade huvudsakliga vektorn. Små vektorer indikerar ingen tydlig ”dominerande” eller förmånliga orientering. Ett avgörande steg för vectorial analys är förmågan att korrekt identifiera den lappat Astrocyten, som är inte alltid möjligt. Ett intressant alternativ för att hitta den lappat Astrocyten är att lägga till en stor (icke-gap junction diffusionskoefficient) och fastställbara tracer, som dextrans, till lösning för inspelning. Om det inte är möjligt att fastställa den lappat cell eller patch läge, kan det vara bättre att utelämna dessa experiment från vektoranalysen.

Slutligen, för att analysera om egenskaperna för nätverk varierade enligt deras läge i kärnan, vi behövde en metod att uttrycka sin ståndpunkt i en ”normaliserade” kärna. Den bara kritiska steget i detta förfarande är förmågan att tydligt se gränsar av kärnan i låg förstoring bilder (4 X). En enkel lösning på detta problem, är om det ofta uppstår, att lägga till en standard histologiska färgning i vävnad behandling före analys.

Heterogenitet av astrocyter över regioner i hjärnan är klart etablerad, och en växande mängd bevis stöder konceptet som deras specialiseringar är särskilt anpassade för funktionen av kretsen att de är inbäddade i⁹^, ¹⁰^,³⁰^,³¹. Att vara sant, bör mellan astrocytic kommunikation begränsas till astrocyter som hör till samma krets. Observationer som stöder detta antagande växer fram i olika hjärnområden men är mer uppenbara i områden med klustrade representationer, som sensoriska maps i fat cortex eller luktbulben. Dock är de flesta rapporter av överlappning mellan kartor neuronala och astrocytic beskrivande och kvalitativa. De metoder som redovisas här kan användas för att objektifiera dessa observationer och utveckla verktyg för att bättre analysera astrocytic nätverk enligt deras position i en viss krets.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansieras av kanadensiska institut för hälsa forskning, Grant/Award nummer: 14392.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Chemicals	S671-3
KCl	Fisher Chemicals	P217-500
KH₂PO4	Fisher Chemicals	P285-500
MgSO₄	Fisher Chemicals	M65-500
NaHCO₃	Fisher Chemicals	S233-500
C₆H₁₂O₆ Dextrose anhydrous	Fisher Chemicals	D16-500
CaCl₂ dihydrated	Sigma	C70-500
Sucrose	Sigma	S9378
D-gluconic acid potassium salt	Sigma	G45001
MgCl₂anhydrous	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E4378
ATP_{Tris Salt}	Sigma	A9062
GTP_{Tris Salt}	Sigma	G9002
Biocytin	Sigma	B4261
Carbenoxolone disodium salt	Sigma	C4790
avidin-biotin complex : ABC kit	Vestor laboratories	PK-4000
Streptavidine-alexa 594	Molecular Probes	S11227
Triton	Fisher Chemicals	BP151-500
Xylene	Fisher Chemicals	X5-1
Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount	Fisher Chemicals	SP15-100
Slide Drying Bench	Fisherbrand	11-474-470
Vibratome	Leica	VT 1000S
Microscope cover glass	Fisherbrand	12-544A
Microscope slide ColorFrost	Fisherbrand	12-550-413
PFA	Fisherchemicals	04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope	Olympus
40X water-immersion lens	Olympus	LUMPLFLN40XW
20X water-immersion lens	Olympus	XLUMPLFL20XW
4X water-immersion lens	Olympus	XLFLUOR4X/340
Micropipette puller	Sutter Instrument	P97
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP 225
Camera CCD	Sony	CX-ST50
Black and white monitor	Sony	SSM-125
Digidata	Molecular devices	1322A
Patch Clamp amplifier	Axon instrument	Mulitclamp 700A
Electrophysiology acquisition software	Molecular devices	pClamp 8
Electrophysiology analysis software	Molecular devices	Clampfit 8
Imaging analysis software	ImageJFIJI	Open source software. FIJI version including plug in package.
Vector image editor	Adobe	Illustrator CS4
Spreadsheet application	Microsoft Office	Excel 2010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control? Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
Verkhratsky, A., Steinhauser, C. Ion channels in glial cells. Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).
Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).
Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neuroscience. 286, 45-59 (2015).
Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).
Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).
Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).

Neuroscience

Analysera den storlek, form och riktningen av nätverk av kopplade astrocyter

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.