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Biochemistry

इन विट्रो में स्व का पुनर्गठन-समर्थित लिपिड Bilayers पर प्रोटीन पैटर्न का आयोजन

Published: July 28, 2018 doi: 10.3791/58139
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry
* These authors contributed equally

Summary

हम में के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान इन विट्रो स्वयं मन की परख संगठन और एक खुला कक्ष में एक समर्थित लिपिड bilayer पर मेरा । इसके अतिरिक्त, हम वर्णन कैसे लिपिड पहने PDMS microcompartments में परख संलग्न करने के लिए प्रतिक्रिया परिशोधन द्वारा vivo शर्तों में नकल ।

Abstract

कोशिकाओं के मौलिक spatiotemporal संगठन के कई पहलुओं की प्रतिक्रिया-प्रसार प्रकार प्रणालियों द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं । इन विट्रो में ऐसी प्रणालियों के पुनर्गठन उनके अंतर्निहित तंत्र है जो vivo में संभव नहीं होगा की विस्तृत अध्ययन के लिए अनुमति देता है । यहां, हम इन विट्रो में के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान ई कोलाईके MinCDE प्रणाली है, जो कोशिका मध्य में कोशिका विभाजन पट पदों का पुनर्गठन । परख केवल स्वयं के लिए आवश्यक घटक संगठन, अर्थात् एक झिल्ली, दो प्रोटीन मन और मेरा और एटीपी के रूप में ऊर्जा की आपूर्ति के लिए डिज़ाइन किया गया है । इसलिए हम एक coverslip, जिस पर एक समर्थित लिपिड bilayer का गठन किया है पर एक खुली प्रतिक्रिया चैंबर बनाना । चैंबर के खुले डिजाइन लिपिड bilayer और थोक सामग्री के नियंत्रित हेरफेर की इष्टतम तैयारी के लिए अनुमति देता है । दो प्रोटीन, मन और मेरा, साथ ही एटीपी, तो झिल्ली के ऊपर थोक मात्रा में जोड़ रहे हैं । इमेजिंग कई ऑप्टिकल सूक्ष्मदर्शी द्वारा संभव है, के रूप में डिजाइन का समर्थन करता है फोकल, व्यापक क्षेत्र और TIRF माइक्रोस्कोपी एक जैसे । प्रोटोकॉल की एक भिन्नता में, लिपिड bilayer एक नमूनों का समर्थन पर, कोशिका के आकार का PDMS microstructures, बजाय कांच पर बना है. इन डिब्बों के रिम के लिए थोक समाधान कम एक छोटे डिब्बे में प्रतिक्रिया पडते और vivo थरथरानवाला व्यवहार में की नकल उतारने की अनुमति है कि सीमाओं प्रदान करता है. साथ में ले लिया, हम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए MinCDE प्रणाली दोनों के साथ और स्थानिक प्रसूति के बिना पुनर्गठन, शोधकर्ताओं ने ठीक से सभी पहलुओं को नियंत्रित करने के लिए पैटर्न गठन को प्रभावित करने की अनुमति, एकाग्रता पर्वतमाला और अन्य कारकों के अलावा जैसे या प्रोटीन, और व्यवस्थित करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल प्रयोगात्मक सेटअप में सिस्टम जटिलता में वृद्धि ।

Introduction

Spatiotemporal पैटर्न प्रकृति में आवश्यक हैं, दोनों कोशिकीय और सेलुलर स्तर पर जटिल कार्यों को विनियमित करने के लिए morphogenesis से विनियमित सेल डिवीजन1,2। प्रतिक्रिया-प्रसार प्रणालियों इन नमूनों की स्थापना में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, लेकिन अभी भी अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । एक प्रतिक्रिया का एक प्रमुख उदाहरण-प्रसार प्रणाली और सबसे अच्छा विशेषता जैविक प्रणाली अब तक ई कोलाई MinCDE प्रणाली3,4,5,6,7है । MinCDE प्रणाली सेल ध्रुव से ई. कोलाई में सेल ध्रुव के लिए भविष्य के विभाजन साइट के रूप में सेल के बीच निर्धारित करने के लिए झूलती है । इस प्रणाली ATPase मन पर आधारित है, प्रोटीन मेरा सक्रिय ATPase, और एक स्थानिक प्रतिक्रिया मैट्रिक्स8के रूप में झिल्ली । MinC पैटर्न गठन तंत्र का हिस्सा नहीं है, लेकिन वास्तविक कार्यात्मक एजेंट है: मुख्य divisome प्रोटीन FtsZ5,6के एक अवरोधक । MinC मन को बांधता है और इसलिए दोलनों, एक समय में जिसके परिणामस्वरूप औसत प्रोटीन एकाग्रता ढाल है कि सेल के खंभे पर अधिक से अधिक है और सेल मध्य में कम है, केवल midcell9,10 में polymerize को FtsZ की अनुमति . MinCDE प्रणाली वाकर के बड़े परिवार का हिस्सा है एक ATPases कि2बैक्टीरिया में spatiotemporal संगठन के लिए महत्वपूर्ण हैं, स्थिति के लिए और परिवहन प्रोटीन परिसरों11 और plasmids12 और सेल विनियमन के लिए विभाजन13 और गुणसूत्र अलगाव14। इसलिए, MinCDE प्रतिक्रिया-प्रसार प्रणाली न केवल एक ठेठ प्रतिक्रिया-प्रसार प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन यह भी बैक्टीरिया में spatiotemporal संगठन के लिए अपनी प्रासंगिकता की वजह से ध्यान आकर्षित किया है ।

vivo में MinCDE प्रणाली के विस्तृत कार्यात्मक अध्ययन प्रोटीन के हेरफेर के रूप में जटिल हैं, और जीन विलोपन कोशिका विभाजन दोष में आम तौर पर परिणाम. इसके अलावा, झिल्ली संरचना या vivo में cytosol के गुणों को बदलने के बहुत चुनौतीपूर्ण है15,16। प्रणाली में परिवर्तन और कारकों को प्रभावित करने के लिए सेल के जटिल वातावरण में व्याख्या कठिन हैं, और भी तो अगर यह कोशिका विभाजन के रूप में इस तरह के एक आवश्यक समारोह में परेशान है । हम और दूसरों को इसलिए एक इन विट्रो पुनर्गठन दृष्टिकोण में बदल गया है, अपने मूल घटकों के लिए प्रणाली को कम करने: मन, मेरा, एक ऊर्जा स्रोत के रूप में एटीपी, और समर्थित लिपिड bilayer एक प्रतिक्रिया मैट्रिक्स के रूप में6,17, 18. यह नीचे-ऊपर दृष्टिकोण एक जीवित कोशिका की जटिलता के बिना विस्तार में स्वयं संगठन के तंत्र की जांच करने के लिए अनुमति देता है । प्रोटीन की सतह लहरें यात्रा6 और अन्य प्रकार के पैटर्न17,19 इन शर्तों के तहत, हालांकि एक तरंग दैर्ध्य के साथ कि आमतौर पर एक परिमाण के बारे में vivo मेंसे बड़ा है. एक खुले चैंबर के उपयोग पैटर्न गठन को प्रभावित सभी पहलुओं पर सटीक नियंत्रण की सुविधा: प्रोटीन सांद्रता6, प्रोटीन गुण20, झिल्ली संरचना10, बफर संरचना, और एटीपी एकाग्रता 6, साथ ही अंय कारकों के अतिरिक्त जैसे भीड़ एजेंटों21 और अंय divisome प्रोटीन22। इसकी तुलना में इन विट्रो में एक प्रवाह में MinCDE प्रणाली के पुनर्गठन-सेल18,19,23 प्रवाह के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता17,23, प्रोटीन 19शर्तों, झिल्ली रचना19 और पूर्ण 3 डी प्रसूति प्रोटीन पैटर्न पर सीमित है, लेकिन प्रोटीन का एक सटीक नियंत्रण/घटक एकाग्रता और अनुक्रमिक घटक इसके अलावा और अधिक जटिल प्रदान करता है ।

इस खुले चैंबर का उपयोग करना, हम भी planar लिपिड bilayers के द्वारा जो एक जांच कर सकते है कैसे ज्यामितीय सीमाओं पैटर्न गठन21, एक घटना है कि हाल ही में भी विवो बैक्टीरिया का उपयोग कर जांच की गई है प्रभाव का समर्थन पैटर्न microstructures7में ढाला । हम भी इस परख कार्यरत कैसे मेरा में उत्परिवर्तन परिभाषित परिवर्तन प्रणाली20के पैटर्न के गठन को प्रभावित करते हैं । इसके अलावा, एक ही मूल परख प्रारूप की जांच कैसे पैटर्न गठन प्रकाश द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है कार्यरत है, परख में एक azobenzene-crosslinked मेरा पेप्टाइड शुरू करने, और TIRF माइक्रोस्कोपी24के साथ इमेजिंग ।

हमने पाया है कि, में आदेश मन पैटर्न गठन की नकल करने में vivo में मनाया एक में इन विट्रो प्रणाली, प्रसूति महत्वपूर्ण था । रॉड के आकार का प्रयोग microcompartments, के साथ इन विट्रो में दिमाग का बड़ा तरंग दैर्ध्य को समायोजित आयामों के साथ (10 x 30 µm), एक समर्थित लिपिड bilayer के साथ पहने की अनुमति दी के पुनर्गठन के मन पोल-ध्रुव दोलनों और प्रोटीन ढाल गठन 10,25. इस परख में, समर्थित लिपिड bilayers एक नमूनों PDMS सब्सट्रेट कि रॉड के आकार का microcompartments है कि शीर्ष पर खुला रहने के कई सौ प्रतिकृतियां शामिल हैं पर जमा हो जाती है । इस के द्वारा, प्रतिक्रिया एक खुले कक्ष में स्थापित किया जा सकता है, और बाद में बफर microcompartments के रिम को कम है, जिससे एक छोटी मात्रा के लिए प्रतिक्रिया को परिष्कृत । भले ही इन डिब्बों एक तरफ एक एयर बफर इंटरफेस है और इसलिए झिल्ली द्वारा एक पूर्ण 3 डी शोधन का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, प्रोटीन गतिशीलता vivo दोलनों में नकल उतार10,25. पूर्ण 3d शोधन, जो बहुत ही परिणाम18से पता चलता है की तुलना में, खुले microstructures परख अपेक्षाकृत सरल है और आसानी से संभाल और प्रयोगशालाओं द्वारा भी किया जा सकता है कि विशेष microfluidics उपकरण के साथ सुसज्जित नहीं कर रहे है और स्वच्छ कमरे सुविधाएं ।

यहां, हम एक खुला चैंबर कि सभी घटकों और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा आसान पहुंच के नियंत्रण के लिए अनुमति देता है का उपयोग कर इन विट्रो में समर्थित लिपिड bilayers पर MinCDE पैटर्न गठन के गठन के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल वर्तमान और, नाबालिग के साथ संशोधन, सतह के लिए भी अनुकूल है-जांच तकनीक26। planar समर्थित लिपिड bilayers के बगल में, हम यह भी बताएंगे कि कैसे प्रोटीन शोधन रॉड के आकार का PDMS microstructures पर सरल नमूनों का समर्थन लिपिड bilayers का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । इन परख, हालांकि MinCDE प्रणाली के लिए अनुकूलित भी अंय प्रोटीन प्रणालियों है कि इस तरह के FtsZ27 या एक ंयूनतम actin प्रांतस्था28के रूप में झिल्ली, के साथ एक समान तरीके से बातचीत करने के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है ।

Protocol

1. प्रोटीन उत्पादन

  1. प्रोटीन एक्सप्रेशन
    1. रूपांतरण ई. कोलाई BL21 (DE3) मन की अभिव्यक्ति के लिए संबंधित प्लाज्मिड के साथ pLysS6, EGFP-मन29, mRuby3-मन24, मेरा6 या MinC30। प्लाज्मिड मैप्स के लिए, कृपया अनुपूरक जानकारी देखें ।
    2. Inoculate पौंड माध्यम में एक रात संस्कृति संबंधित एंटीबायोटिक दवाओं (जैसे,१०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन या ५० µ जी/एमएल कनमीसिन) का उपयोग कर एक कॉलोनी के साथ और 14-16 एच के लिए ३७ ° c पर गर्मी जबकि मिलाते हुए ।
    3. Inoculate ५०० टीबी मध्यम रातोंरात संस्कृति (1:200 कमजोर पड़ने) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी संस्कृति के साथ संबंधित एंटीबायोटिक युक्त के एमएल जबकि १८० rpm पर मिलाते हुए ।
    4. ०.५ mM IPTG जब संस्कृति 0.5-0.7 के ६०० एनएम पर एक ऑप्टिकल घनत्व तक पहुंच जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित । EGFP के मामले में-मन या mRuby3-मन, 16 डिग्री सेल्सियस के साथ एक मशीन के लिए कोशिकाओं को शिफ्ट और 14-16 ज के लिए कोशिकाओं को विकसित, और MinC, मन या मेरा के मामले में, प्रेरण के बाद ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3-4 ज के लिए कोशिकाओं को विकसित ।
      नोट: MinC, मन या मेरा अभिव्यक्ति की प्रेरण कोशिकाओं के लिए विषाक्त है, कोशिका विभाजन दोष में व्यक्त परिणाम के रूप में; इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन समय 4 घंटे से नीचे रखा है । यदि अधिक प्रोटीन की जरूरत है, संस्कृति की मात्रा में वृद्धि, लेकिन समय नहीं मशीन ।
    5. 10 मिनट के लिए ४००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा संबंधित मशीन समय फसल कोशिकाओं के बाद और दुकान पर सेल गोली-८० डिग्री सेल्सियस तक आगे का उपयोग करें ।
  2. प्रोटीन शुद्धि
    नोट: प्रोटीन या तो एक स्वचालित प्रोटीन शोधन प्रणाली पर पैक नी-ंत् कॉलम का उपयोग कर या गुरुत्वाकर्षण प्रवाह पीठ शोधन के लिए ni-ंत् मोतियों का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है ।
    1. स्वचालित प्रोटीन शोधन प्रणालियों पर पैक नी-ंत् कॉलम के साथ शुद्धि के लिए बफर A1 का उपयोग करें (५० mM सोडियम फॉस्फेट पीएच ८.०, ५०० मिमी NaCl, 10 मिमी imidazole), बफर B1 (५० मिमी सोडियम फॉस्फेट पीएच ८.०, ५०० मिमी NaCl, 20 मिमी imidazole), और बफर C1 (५० मिमी सोडियम फॉस्फेट पीएच ८.०, ५०० mm NaCl, २५० mm imidazole). Ni-ंत् मोतियों का उपयोग कर गुरुत्वाकर्षण प्रवाह पीठ शुद्धि के लिए बफर A2 का उपयोग करें (५० mM Tris-HCl pH ८.०, ३०० मिमी NaCl, 10 मिमी imidazole), बफर B2 (५० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, ३०० मिमी NaCl, 20 मिमी imidazole), और बफर C2 (५० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, ३०० मिमी NaCl, २५० मिमी imidazole). सभी बफ़र्स के साथ 10 mm ß-mercaptoethanol या ०.४ mm TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine) का उपयोग करने से पहले सही एजेंट को कम करने के रूप में पूरक ।
    2. 20-30 मिलीलीटर बफर A1 या A2 के EDTA-मुक्त चिढ़ाना अवरोध करनेवाला के साथ पूरक में कोशिकाओं resuspend, १०० µ g/ml lysozyme, ~ २५० U/एमएल DNase और ०.२ मिमी मिलीग्राम2 +-adp (मिलीग्राम2 +-adp मन या EGFP के मामले में केवल एक १०० mm adp शेयर से १०० mm MgCl में ७.५ के लिए समायोजित पीएच के साथ 2 ) ।
    3. लाइसे एक टिप sonicator (30% आयाम, २.५ मिनट, 30 एस पल्स, 30 एस बंद) का उपयोग करते हुए एक बर्फ स्नान में कोशिकाओं से युक्त शीशी रखते हुए कोशिकाओं ।
    4. २५,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए सेल lysate केंद्रापसारक द्वारा सेल मलबे निकालें ।
    5. नी-ंत् कॉलम या नी-ंत् मोतियों पर supernatant की मशीन ।
      1. पैक की गई Ni-ंत् स्तंभों के लिए, नमूना को स्वचालित प्रोटीन शोधन प्रणाली के नमूना पंप का उपयोग कर स्तंभ पर लोड करें ।
      2. बेंच-टॉप शुद्धि के लिए, 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन शेखर पर एक ५० मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में Ni-ंत् मोतियों के साथ नमूना मशीन । बाद के चरणों के लिए, एक खाली कॉलम में एक 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग नी-ंत् मोतियों हस्तांतरण ।
    6. बफ़र A1 या A2 के कम से 5 स्तंभ वॉल्यूम से धो लें ।
    7. बफ़र B1 या B2 के कम से 5 स्तंभ वॉल्यूम से धो लें ।
    8. बफर C1 या C2 के साथ प्रोटीन Elute.
    9. एसडीएस के माध्यम से प्रोटीन शुद्धता का आकलन-पृष्ठ ।
    10. वैकल्पिक: आगे भंडारण बफर में एक जेल निस्पंदन कॉलम equilibrated को लागू करने के द्वारा प्रोटीन शुद्ध (५० mm HEPES/KOH pH ७.२, १५० mm KCl, 10% ग्लिसरॉल, ०.१ mm EDTA, ०.४ mm TCEP, (०.२ mm मिलीग्राम2 +-ADP मन के मामले में)) ।
      नोट: जेल निस्पंदन दिमाग के लिए सिफारिश की है एकत्रित प्रोटीन अंश को दूर करने के लिए ।
    11. कोई जेल निस्पंदन कार्यरत है, तो एक्सचेंज नी-ंत् रेफरेंस बफर भंडारण बफर करने के लिए (५० mM HEPES/कोह पीएच ७.२, १५० मिमी KCl, 10% ग्लिसरॉल, ०.१ मिमी EDTA, ०.४ मिमी TCEP, (०.२ मिमी मिलीग्राम-ADP मन के मामले में)) एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह लवण स्तंभ का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें).
    12. शॉक-फ्रीज प्रोटीन aliquots में तरल नाइट्रोजन में और दुकान पर-८० ° c आगे उपयोग तक ।
    13. उपाय प्रोटीन स्टॉक ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग एकाग्रता, और एक ATPase परख20के साथ प्रोटीन गतिविधि का निर्धारण ।
      नोट: २८० एनएम में अवशोषण का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का आकलन नहीं है । मन शुद्धि के दौरान न्यूक्लियोटाइड की उपस्थिति और मेरा में tryptophans की कमी एक२८० एकाग्रता माप विकृत । इसके बजाय प्रोटीन सांद्रता को मापने के लिए ब्रैडफोर्ड या बीसीए की परख का प्रयोग करें ।
  3. प्रोटीन लेबलिंग
    नोट: छोटे प्रोटीन मेरा करने के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन का फ्यूजन अपने प्रसार गुण और समारोह में बड़े बदलाव लाती है; इसलिए, रासायनिक प्रोटीन के लेबलिंग (५१ स्थिति पर cysteine) फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए संलयन से अधिक पसंद है ।
    1. भंग ०.१२५ maleimide के mg-डाई संयुग्मी में 5-10 µ l के DMSO (dimethyl sulfoxide) और एक ०.५ मिलीलीटर खदान aliquot करने के लिए मिलाते हुए भंडारण बफर में पीएच ७.२, ऊपर विस्तृत रूप में तैयार के तहत जोड़ें.
    2. 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या 2 एच में के लिए मशीन कोमल मिलाते हुए या सरगर्मी के तहत आर टी पर ।
    3. अलग डाई और प्रोटीन का उपयोग कर एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह भंडारण बफर के साथ स्तंभ equilibrated लवण (५० mm HEPES/KOH pH ७.२, १५० mm KCl, 10% ग्लिसरॉल, ०.१ mm EDTA, ०.४ mm TCEP) ।
    4. आगे किसी भी संलग्न डाई को हटाने के लिए, भंडारण बफर के एक अतिरिक्त के खिलाफ प्रोटीन dialyze ।
    5. संबंधित डाई के लिए अधिकतम पर विलुप्त होने को मापने और अनुमानित लेबलिंग दक्षता की गणना द्वारा सफल लेबलिंग की पुष्टि करें । लेबल की डिग्री का आकलन करने पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए डाई निर्माता के निर्देशों का संदर्भ लें । एसडीएस-पृष्ठ के साथ विश्लेषण और नमूना एकरूपता और लेबलिंग सफलता के बारे में आगे उपयोगी जानकारी के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा कुल द्रव्यमान का निर्धारण ।

2. स्मॉल Unilamellar पुटिका (एसयूवी) वडा

  1. multilamellar बुलबुले की पीढ़ी
    1. अपने वांछित मिश्रण और अंतिम एसयूवी मात्रा के लिए क्लोरोफॉर्म में लिपिड (एस) की राशि की गणना । एकाग्रता होना चाहिए 4 मिलीग्राम/एमएल लिपिड के ंयूनतम बफर में (25 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.५, १५० मिमी KCl, 5 मिमी MgCl2) । एक मानक ंयूनतम परख 7:3 DOPC का एक मिश्रण के लिए: DOPG (मॉल प्रतिशत) की सिफारिश की है । ई. कोलाई ध्रुवीय लिपिड निकालने का उपयोग करते हैं, सभी तैयारी चरणों के लिए SLB बफर (25 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.५, १५० mm KCl) का उपयोग करें ।
      नोट: यह पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए ई. कोलाई ध्रुवीय लिपिड निकालने का उपयोग करने के लिए अनुशंसित नहीं है इस मिश्रण के साथ समरूप SLBs की पीढ़ी के रूप में अधिक चुनौतीपूर्ण है ।
    2. कांच के सुझावों के साथ एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का प्रयोग, एक १.५ मिलीलीटर कांच की शीशी में क्लोरोफॉर्म में लिपिड मिश्रण ।
      1. लिपिड को थोड़ी सी नाइट्रोजन धारा के नीचे सुखाएं जबकि धीरे से शीशी को मोड़ लें । लिपिड एक मजबूत नाइट्रोजन धारा के तहत 10 से 20 मिनट के लिए रखें । एक वैक्यूम desiccator में सूख लिपिड फिल्म युक्त शीशी प्लेस और कम से 1 ज के लिए निर्वात लागू होते हैं ।
    3. जब तक मिश्रण homogeneously अपारदर्शी है कमरे के तापमान पर भंवर द्वारा ंयूनतम बफर में लिपिड हाइड्रेट ।
      नोट: multilamellar बुलबुले से छोटे unilamellar बुलबुले की पीढ़ी के लिए, लिपिड या तो २.२ में वर्णित के रूप में बाहर निकाला जा सकता है । या sonicated के रूप में वर्णित २.३ । सामांय में, बाहर निकालना पैदावार एक संकरा आकार वितरण जो समर्थित लिपिड bilayers के गठन के साथ मदद कर सकता है ।
  2. एसयूवी बाहर निकालना द्वारा तैयारी
    1. लिपिड समुच्चय और multilamellar संरचनाओं और आगे solubilize लिपिड फ्रीज द्वारा 7 से 10 चक्र के लिए गल तोड़ ।
      1. एक गर्म थाली और तरल नाइट्रोजन के साथ एक कंटेनर पर ७० डिग्री सेल्सियस से ९९ डिग्री सेल्सियस पर पानी के साथ एक चोंच तैयार करें ।
      2. शीशी तरल नाइट्रोजन में बड़ी चिमटी के साथ पकड़ जब तक नाइट्रोजन उबलते बंद हो जाता है । इसके बाद शीशी को गर्म पानी में तब तक ट्रांसफर करें जब तक समाधान पूरी तरह से गल न जाए । इन चरणों को दोहराएँ जब तक लिपिड मिश्रण आंख करने के लिए स्पष्ट दिखाई देता है, मिश्रण पर निर्भर करता है.
    2. एक लिपिड बाहर निकालना और पूर्व कुल्ला ंयूनतम बफर के साथ प्रणाली को इकट्ठा । ५० एनएम ताकना आकार की एक झिल्ली के माध्यम से ३५ और ४१ बार के बीच लिपिड मिश्रण बाहर निकालना । पास के एक अजीब संख्या पर अंत करने के लिए समुच्चय है कि झिल्ली पार कभी नहीं से बचने के लिए सुनिश्चित करें ।
  3. sonication द्वारा एसयूवी तैयारी
    1. बेहतर बफर में लिपिड भंग करने के लिए, कांच की शीशी एक गर्मी ब्लॉक में समाधान युक्त डाल ३७ डिग्री सेल्सियस और भंवर के लिए सेट 1 मिनट के लिए हर 20 मिनट । के बारे में 1 एच के लिए कुल में मशीन ।
    2. एक sonicator स्नान में शीशी के नीचे विसर्जित (इस काम में १.९१ एल, ८० डब्ल्यू) की आवश्यकता ऊंचाई पर एक क्लैंप स्टैंड पर शीशी संलग्न द्वारा ।
    3. sonicator स्नान में पानी की ऊंचाई निर्धारित करें ताकि शीशी के आसपास समाधान अच्छी तरह से दालों द्वारा उत्तेजित है और के बारे में 20 मिनट के लिए लिपिड मिश्रण sonicate । लिपिड की स्पष्टता का आकलन करके सफल sonication के लिए जांच करें ।
  4. एसयूवी 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह तक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है या में जमे हुए-20 ° c छोटे aliquots में (~ 20 µ l) और कई हफ्तों के लिए संग्रहीत । गल शीशियों या कमरे के तापमान और sonicate पर ट्यूबों फिर 2.2.3 या ५.३ के अंतर्गत वर्णित के रूप में जब तक समाधान समर्थित लिपिड bilayers (SLBs) की तैयारी के लिए एसयूवी का उपयोग करने से पहले स्पष्ट है । कृपया ध्यान दें कि बाहर निकालना द्वारा प्राप्त एसयूवी के संकीर्ण आकार वितरण ठंड और बाद में गल और sonication के बाद खो दिया है ।

3. ग्लास Coverslips क्लीनिंग

नोट: ग्लास coverslips की सफाई और hydrophilization समरूप और द्रव का समर्थन लिपिड bilayers के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है । ग्लास coverslips एक पिरांहा समाधान का उपयोग कर साफ किया जा सकता है, 7:2 सल्फर एसिड के अनुपात से ५०% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (३.१), या एक प्लाज्मा क्लीनर (३.२) में एक ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ बनाया । दोनों तरीकों समान परिणाम उपज ।

  1. coverslips की पिरांहा सफाई
    1. पिरांहा समाधान लागू करें
      1. एक औंधा गिलास पेट्री डिश या अन्य निष्क्रिय सतह पर कांच coverslips वितरित करें । एक गिलास पिपेट के साथ, केंद्रित सल्फर एसिड की 7 बूंदें (९८%) प्रत्येक coverslip के केंद्र में जोड़ें ।
        चेतावनी: सल्फर एसिड दृढ़ता से अंलीय और संक्षारक है । एक धुएं अलमारी में और उचित सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ ही काम करते हैं ।
      2. एसिड की बूंदों के बीच में ५०% हाइड्रोजन पेरोक्साइड की दो बूंदें जोड़ें ।
        चेतावनी: हाइड्रोजन पेरोक्साइड आंखों और त्वचा के लिए संक्षारक है ।
      3. कवर की प्रतिक्रिया और कम से ४५ मिनट के लिए गर्मी ।
        नोट: अधिकतम प्रतीक्षा समय यहां प्रयोग के परिणाम के लिए महत्वपूर्ण नहीं है और कई दिनों तक विस्तारित किया जा सकता है ।
    2. धो पिरांहा जरुर coverslips.
      1. व्यक्तिगत रूप से चिमटी का उपयोग कर coverslips उठाओ और ultrapure पानी के साथ बंद एसिड कुल्ला । गैर-स्टिक धारकों या समान परिवहन उपकरण में धुल coverslips रखें ।
      2. प्रत्येक coverslip बड़े पैमाने पर ultrapure पानी के साथ कुल्ला और दबाव गैस के साथ सतह सूखी (नाइट्रोजन, हवा ही अगर तेल मुक्त) । स्थाई मार्कर के साथ coverslip के साफ साइड मार्क ।
  2. प्लाज्मा coverslips की सफाई
    1. अतिरिक्त इथेनॉल और बाद में अतिरिक्त ultrapure पानी के साथ coverslips कुल्ला । दबाव गैस के साथ सूखी coverslips । 4 में वर्णित के रूप में चैंबर इकट्ठा ।
    2. चैंबर विधानसभा के रूप में 4 में वर्णित के बाद संलग्न चैंबर और प्रक्रिया गैस के रूप में ऑक्सीजन के साथ प्लाज्मा क्लीनर में जगह के साथ coverslips ले । प्लाज्मा के साथ स्वच्छ coverslips (इस काम में 30% बिजली, ०.३ mbar ऑक्सीजन दबाव 1 मिनट के लिए इस्तेमाल किया गया था) । SLB गठन से पहले सफाई का अधिकार के रूप में 5 में वर्णित है, प्लाज्मा सफाई के hydrophilizing प्रभाव के रूप में समय के साथ बंद पहनता है ।
      नोट: समय और प्लाज्मा सफाई की शक्ति फ्लोरोसेंट लेबल झिल्ली का उपयोग कर अनुकूलित किया जाना चाहिए, के रूप में बहुत कम या अत्यधिक प्लाज्मा सफाई दोनों मोबाइल झिल्ली या छेद के साथ झिल्ली के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

4. चेंबर विधानसभा

  1. तेज कैंची के साथ, कट और ढक्कन और एक ०.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब के शंकु हिस्सा त्यागें । ट्यूब के ऊपरी रिम पर यूवी गोंद लागू करें और एक पिपेट टिप का उपयोग करके समान रूप से वितरित.
  2. गोंद ट्यूब उल्टा पहले साफ coverslip के लिए नीचे । पिरांहा की सफाई के मामले में यह कांच की ओर साफ करने के लिए गोंद करने के लिए सुनिश्चित करें । एक ३६० एनएम लैंप के नीचे एकाधिक कक्षों रखकर या 5 से 15 मिनट के लिए नेतृत्व द्वारा यूवी गोंद का इलाज ।

5. समर्थित लिपिड Bilayer (SLB) गठन

  1. ३७ डिग्री सेल्सियस और गर्मी के लिए पूर्व हीट हीट ब्लॉक-मिनट या SLB बफर, चैंबर प्रति 1 ट्यूब के साथ 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों ।
  2. इकट्ठे और ठीक कक्षों में नाइट्रोजन उड़ा किसी भी धूल या अंय कणों कि यूवी इलाज और विधानसभा के दौरान तय हो सकता है हटाने के लिए । प्लाज्मा स्वच्छ ३.२ में वर्णित के रूप में यदि आप पिरांहा समाधान (३.१) के साथ अपने coverslips साफ नहीं किया है । गर्मी ब्लॉक पर मंडलों प्लेस ।
  3. एक 20 µ स्पष्ट लिपिड के एल aliquot पतला (4 मिलीग्राम/एमएल) १३० µ एल के साथ ंयूनतम बफर या SLB बफर के मामले में ई. कोलाई ध्रुवीय लिपिड निकालने, के एक काम एकाग्रता उपज ०.५३ मिलीग्राम/एमएल । मामले लिपिड में जमे हुए थे, बफर जोड़ने से पहले एक स्नान sonicator में ट्यूब पकड़ से पहले sonicate, तो sonicate फिर बफर के साथ ।
  4. प्रत्येक कक्ष के लिए लिपिड मिश्रण के ७५ µ एल जोड़ें और 3 मिनट के लिए एक टाइमर सेट (DOPC/DOPG मिश्रण के लिए अब गर्मी अंय लिपिड मिश्रण के लिए आवश्यक हो सकता है) । ई. कोलाई ध्रुवीय लिपिड निकालने के मामले में, पिपेट CaCl2 एक १०० मिमी स्टॉक से 3 मिमी के एक अंतिम एकाग्रता के लिए चैंबर में । मशीन समय के दौरान, हाइड्रोफिलिक कांच की सतह पर बुलबुले फट और एक सुसंगत SLB फार्म फ्यूज ।
  5. ६० सेकंड के बाद, प्रत्येक कक्ष के लिए ंयूनतम बफ़र के १५० µ l जोड़ें ।
  6. चैंबर्स धुलाई: एक और १२० सेकंड (3 मिनट कुल) के बाद २०० µ एल जोड़ने के द्वारा प्रत्येक चैंबर धो मिन या SLB बफर, ध्यान से ऊपर और नीचे कुछ समय pipetting, हटाने और एक और २०० µ एल जोड़ने
    1. के बाद प्रत्येक चैंबर एक बार धोया गया है, पहले चैंबर अच्छी तरह से धोने के लिए आगे बढ़ना जब तक बफर के 2 मिलीलीटर ऊपर इस्तेमाल कर रहे हैं । SLBs की धुलाई चैंबर में गति की हद तक सही और सही धोने तीव्रता खोजने के लिए कुछ अनुभव की जरूरत है ।
      नोट: SLB के सूखने से बचने के लिए चैंबर से सभी लिक्विड को कभी न निकालें ।
      नोट: धोने के शीर्ष पर, झिल्ली गुण कई अतिरिक्त कारकों के आधार पर भिन्न हो जाएगा: लिपिड के प्रकार और लिपिड मिश्रण में उनके रिश्तेदार सांद्रता, एसयूवी के लिए तैयारी विधि, सतह के उपचार और समर्थन की सफाई से पहले ।

6. स्वयं संगठन की परख

  1. २०० µ एल मिनट बफर करने के लिए चैंबर में बफर मात्रा को समायोजित प्रोटीन और एटीपी समाधान की मात्रा, तो मन जोड़ने, मन, मेरा लेबल, और, यदि वांछित, MinC. pipetting द्वारा धीरे मिश्रण घटकों । उदाहरण सांद्रता 1 µ एम मन कर रहे है (30% EGFP के साथ मैगनीज-मन), 1 µ मीटर मेरा (10% रासायनिक लेबल के साथ मैगनीज) और ०.०५ µ एम MinC, लेकिन सांद्रता की एक सीमा से अधिक पैटर्न फार्म6,10,20,30 .
  2. इसमें २.५ एमएम एटीपी (१०० एमएम एटीपी स्टॉक से १०० एमएम MgCl2, पीएच ७.५) में सेल्फ आर्गनाइजेशन ऑफ माइंड्स की शुरुआत करें ।
    नोट: घटक के अलावा (मन, मेरा और एटीपी) के आदेश विविध किया जा सकता है और अंतिम पैटर्न4परिणाम को प्रभावित नहीं करेगा ।
  3. निरीक्षण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर स्वयं संगठन मन ( सामग्री की तालिकादेखें) । स्वयं संगठन को भी TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मनाया जा सकता है । इमेजिंग eGFP-मन के लिए, एक ४८८ एनएम आर्गन लेजर या तुलनीय डायोड लेजर (जैसे, ४९० एनएम) का उपयोग करें । इमेजिंग mRuby3 के लिए-मन, यह सबसे अच्छा है एक ५६१ एनएम डायोड लेजर को रोजगार ।
    नोट: उत्तेजना के उच्च स्तर से बचने के लिए के रूप में हम और दूसरों को17 मन प्रणाली में मनाया phototoxicity, झिल्ली पर अपरिवर्तनीय प्रोटीन बहुलकीकरण के लिए अग्रणी ।

7. PDMS microstructures

नोट: PDMS (polydimethylsiloxane) एक बहुलक है कि microstructures और microfluidic उपकरणों के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक नमूनों सिलिकॉन वेफर PDMS संरचनाओं कास्टिंग के लिए एक सांचे में ढालना के रूप में कार्य करता है । PDMS संरचनाओं तो SLB गठन और परख सेटअप के लिए एक समर्थन के रूप में सेवा करते हैं ।

  1. या तो microcompartments अपने आप photolithography का उपयोग कर के साथ सिलिकॉन वेफर उत्पादन (देखें Zieske और Schwille एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए31 या Gruenberger एट अल. एक वीडियो प्रोटोकॉल३२के लिए) या एक फाउंड्री से अपने वांछित सिलिकॉन वेफर आदेश . के लिए इस्तेमाल किया वेफर के पैटर्न के साथ साथ यहां अनुपूरक जानकारी देख कृपया ।
  2. नमूनों सिलिकॉन वेफर्स से PDMS microstructures का उत्पादन ।
    1. एक प्लास्टिक कप का उपयोग करने के लिए 10 ग्राम PDMS बेस और PDMS crosslinker के 1 जी का वजन । या तो मिश्रण करने के लिए एक मिश्रण डिवाइस का उपयोग करें और PDMS मिश्रण degas या मैन्युअल मिश्रण PDMS और फिर वैक्यूम के तहत degas.
    2. सिलिकॉन वेफर पर संरचना पर सीधे PDMS की एक छोटी राशि ड्रॉप करने के लिए एक पिपेट टिप का प्रयोग करें ।
      नोट: सिलिकॉन वेफर खरोंच करने के लिए नहीं सावधान रहना ।
    3. तुरंत PDMS ड्रॉप पर एक #1 coverslip जगह और एक स्वच्छ पिपेट टिप के ऊपरी छोर लेने के लिए धीरे सिलिकॉन वेफर पर coverslip दबाएं । PDMS coverslip और सिलिकॉन वेफर के बीच पतले फैल जाना चाहिए ।
    4. एक ओवन में coverslips के साथ वेफर प्लेस और ७५ डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे या रात भर के लिए PDMS का इलाज । ओवन से वेफर निकालें और यह कमरे के तापमान के लिए शांत हो जाओ । एक उस्तरा ब्लेड के साथ, ध्यान से एसआई वेफर से संलग्न PDMS के साथ coverslip हटा दें ।
      नोट: गंदे या क्षतिग्रस्त हो रही से सिलिकॉन वेफर को रोकने के लिए, हमेशा PDMS और एक coverslip के साथ microstructures कवर । हालांकि, PDMS उंर, microstructures में दरारें में जिसके परिणामस्वरूप, इसलिए PDMS संरचनाओं कि दो से तीन सप्ताह से अधिक पुराने है का उपयोग नहीं करते ।

8. PDMS Microstructures में स्व-संगठन

  1. 4 के तहत वर्णित के रूप में एक कक्ष संलग्न करने के लिए PDMS microstructures के साथ coverslips का उपयोग करें ।
  2. 3.2.2 के तहत वर्णित के रूप में एक ऑक्सीजन प्लाज्मा क्लीनर में स्वच्छ और hydrophilize सतह । साफ PDMS सब्सट्रेट पिरांहा न करें ।
  3. सेटअप एक मन स्वयं संगठन के रूप में 6 के तहत वर्णित परख ।
  4. परख स्थापित करने के बाद, नियमित रूप से मन पैटर्न गठन के लिए जांच करें और ठीक से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर microstructures का गठन किया ।
  5. जब नियमित रूप से दिमाग पैटर्न (10-30 मिनट) का गठन किया है, धीरे से ऊपर और नीचे दो बार पिपेट घटकों मिश्रण है और फिर pipetting द्वारा कदम बफर कदम निकालें । एक १०० µ l पिपेट का उपयोग कर बफ़र के बड़े बल्क निकालें और फिर ध्यान से एक 10 µ l पिपेट का उपयोग कर बाकी निकालें ।
    नोट: यह चरण कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है । यदि बहुत अधिक बफ़र बाहर ले जाया जाता है या प्रक्रिया बहुत लंबी हो जाती है, तो microstructures सूख जाएगा; अगर बहुत कम लिया है, प्रोटीन microstructures में सीमित नहीं होगा, लेकिन यात्रा की सतह तरंगों के रूप में जारी है ।
  6. तुरंत एक ढक्कन के साथ चैंबर बंद microstructures में अवशिष्ट बफर के सूखने से बचने के लिए ।
  7. अब इमेजिंग समय के लिए अनुमति देने के लिए, कक्ष के अंदर स्पंज की एक गीला टुकड़ा प्लग और फिर ढक्कन के साथ बंद । सुनिश्चित करें कि स्पंज coverslip की सतह से संपर्क नहीं करता है ।
  8. सतह कि बफ़र पर्याप्त कम किया गया था पर microstructures जाँच की इमेजिंग करने से पहले, ताकि microstructures ऊपर सतह में पैटर्न के गठन को रोक दिया गया है । microstructures में छवि मन दोलनों । जांच करें कि microstructures सूख नहीं रहे है या इमेजिंग के दौरान बाहर सूख रहे हैं ।
    नोट: PDMS रूप में दरारें के रूप में प्रत्येक उपयोग के बाद microcompartments के साथ coverslips त्यागें ।

9. माइंड पैटर्न गठन का विश्लेषण

  1. तरंग लंबाई, तरंग वेग और planar पर मन स्वयं संगठन की लहर प्रोफाइल, लिपिड bilayers का समर्थन किया । पैक plugins के मानक सेट के साथ फिजी बुनियादी विश्लेषण३३के लिए पर्याप्त है ।
  2. kymographs और समय औसत प्रोटीन एकाग्रता प्रोफाइल प्राप्त करने के द्वारा microcompartments में पोल-टू-पोल दोलनों का विश्लेषण करें । मूल kymographs फिजी में एक पंक्ति चयन के साथ एक समय श्रृंखला पुनः टुकड़ा करके प्राप्त किया जा सकता है ।

Representative Results

प्रोटीन शुद्धि के बाद हमारे प्रोटोकॉल पर्याप्त शुद्धता के मिन प्रोटीन उपज चाहिए । एक संदर्भ के रूप में, चित्रा 1 मन की एक एसडीएस पृष्ठ छवि, फ्लोरोसेंट लेबल मन, मेरा, और MinC प्रदान करता है । प्रक्रिया के व्यक्तिगत कदम गैर पर एक मन स्वयं संगठन परख प्रदर्शन करने के लिए समर्थित लिपिड bilayers चित्रा 2में वर्णित हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, नियमित रूप से सतह तरंगों यात्रा ध्यान कक्ष (चित्रा 3) भर में मनाया जा सकता है । तरंग दैर्ध्य थोड़ा कक्ष के भीतर भिंन हो सकते हैं, लेकिन सामांय पैटर्न में इसी तरह लग रहे हो । कक्ष के किनारों मात्रात्मक तुलना के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए, के रूप में झिल्ली कि यूवी गोंद पर फार्म के लिए कांच की सतह पर से अलग गुण है लगता है ( चित्र 3सी देखें) । यात्रा की सतह तरंगों प्रचार दिशा (चित्र बी) के साथ तीव्रता की साजिश रचने के द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । जबकि मन प्रतिदीप्ति पठारों के बजाय लहर के अग्रणी किनारे से तेजी से और फिर तेज ट्रेलिंग एज में कम हो जाती है, मेरा प्रतिदीप्ति मन की लहर की शुरुआत से लगभग रैखिक बढ़ जाती है और अपनी अधिकतम पहुंच के बाद पीछे किनारे पर मन, जहां यह बंद हो जाता है स्पष्ट रूप से6।

प्रोटीन की गुणवत्ता के लिए अगले, समर्थित लिपिड bilayers की गुणवत्ता MinCDE के एक नियमित रूप से स्वयं संगठन के लिए सबसे महत्वपूर्ण है । एक तरफ अगर झिल्ली धोया भी जरूरत से ज्यादा है या अंतर्निहित सतह साफ किया गया है और इस तरह का आरोप लगाया भी जोरदार, छेद झिल्ली में फार्म कर सकते हैं (चित्रा 6A, शीर्ष). दूसरी ओर अगर झिल्ली ठीक से धोया नहीं है या अंतर्निहित सतह साफ नहीं है/hydrophilized, बुलबुले झिल्ली या झिल्ली तरलता समझौता किया जाएगा (चित्रा 6A, नीचे) के लिए रहना होगा । हालांकि के रूप में स्पष्ट नहीं के रूप में जब सीधे लेबल लिपिड के माध्यम से झिल्ली देख, इन समस्याओं को भी मन प्रतिदीप्ति संकेत से पता लगाया जा सकता है, पैटर्न के रूप में नियमित रूप से नहीं कर रहे है और maxima में प्रतिदीप्ति नहीं है समरूप लेकिन शामिल है "छेद" या चित्रा 6Aके मध्य पैनल में दिखाया गया के रूप में चमकीले धब्बे.

मन के लिए स्वयं-रॉड में संगठन के आकार का PDMS microstructures प्रक्रिया 4 चित्रामें संक्षेप है । कई प्रोटोकॉल चरणों दोहराया जा करने की आवश्यकता नहीं है, के रूप में प्रोटीन और लिपिड पुनः उपयोग किया जा सकता है । गैर-नमूनों सब्सट्रेट पर की तरह, सब्सट्रेट साफ है और hydrophilized (प्लाज्मा सफाई द्वारा), एक समर्थित लिपिड bilayer PDMS पर गठन किया है और स्वयं संगठन परख २०० µ एल की एक मात्रा में स्थापित है जांच करने के लिए कि एक उचित झिल्ली का गठन किया है और स्वयं दिमाग झिल्ली पर जमाती है, कक्षों छवि बना रहे हैं । जब एक उचित झिल्ली का गठन किया गया है, व्यक्तिगत microstructures और भी स्वयं के बीच PDMS की सतह पर नियमित रूप से यात्रा की सतह तरंगों रूपों मन microstructures के तल पर स्वयं का आयोजन के रूप में लहरों स्वतंत्र रूप से पूरे पर स्थानांतरित कर सकते है झिल्ली कवर सतह (आंकड़ा 5 ए) । बफर हटाने के बाद, डिब्बों के बीच की सतह किसी भी प्रचार मन पैटर्न (चित्रा 5B) नहीं दिखाना चाहिए, क्योंकि यह पूरी तरह से शुष्क किया जाना चाहिए । अगर दिमाग पैटर्न अभी भी बढ़ रहे हैं, और बफर को हटा दिया जाना चाहिए । प्रोटीन अब रॉड के आकार microcompartments में सीमित झिल्ली से ढंकी PDMS और ऊपरी अंतरफलक (चित्रा 5C), जिसमें वे स्वयं को व्यवस्थित करेंगे पर हवा से कर रहे हैं । इन शर्तों के तहत दो प्रोटीन्स चित्रा 5dमें दिखाए गए अनुसार ध्रुव-से-ध्रुव दोलनों को निष्पादित कर सकते हैं । मन और मेरा एक अंश के रूप में हमेशा झिल्ली बंधे है, भी बफर हटाने के दौरान, सांद्रता बफर हटाने के बाद इनपुट सांद्रता के लिए तुलनीय नहीं हैं । इस प्रभाव के कारण सांद्रता भी एक ही coverslip पर व्यक्तिगत microstructures के बीच भिंन के रूप में वे बफर हटाने से पहले पैटर्न की स्थिति पर निर्भर करते हैं । सिलिकन वेफर उत्पादन या सिलिकॉन वेफर से PDMS मोल्डिंग अपूर्ण microstructures है कि विश्लेषण (चित्रा घमण्ड) के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता में परिणाम कर सकते हैं । इसके अलावा, बफर हटाने की वजह से microstructures प्रक्रिया के दौरान सूख सकता है, और इसलिए, आगे विश्लेषण (फिगर घमण्ड) से बाहर रखा जाना चाहिए । एक परिणाम के रूप में केवल एक कक्ष में microstructures का एक अंश वांछित ध्रुव से पोल दोलनों को दर्शाता है । microstructures में प्रोटीन गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए, एक kymograph संपूर्ण संरचना (चित्रा 5E) पर एक चयन ड्राइंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । जब MinCDE पोल से दोलन करने वाली पोल, MinC और मन डिब्बे खंभे और डिब्बे के बीच में ंयूनतम एकाग्रता में अधिकतम एकाग्रता के साथ एक समय औसत एकाग्रता ढाल दिखाएगा (चित्रा 5F) ।

Figure 1
चित्रा 1: एसडीएस-प्रोटीन शुद्धि के अंतिम उत्पादों दिखा पृष्ठ । उनके-दिमाग (३३.३ केडीए), उनके-eGFP-माइंड (६०.१ केडीए), उनके-mRuby3-माइंड (५९.९ केडीए), उनकी-माइन (१३.९ केडीए) और उनकी-MinC (२८.३ केडीए) के आदेश दिखाए गए हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रक्रिया प्रवाह आरेख व्यक्तिगत कदम और प्रोटोकॉल के समय पर एक स्व-संगठन समर्थित लिपिड bilayers (चरण 1-6) के लिए दिखा । डैश्ड बॉक्स इंगित करते है कि इन दो विकल्पों में से एक का उपयोग सफाई के लिए किया जा सकता है । वृत्तों द्वारा चिह्नित तीर इंगित करते है कि प्रोटोकॉल कहां रोका जा सकता है और बाद में पुन: शुरू किया जाएगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मन की परख की इमेजिंग । एक) नियमित रूप से न्यूनतम सर्पिल, जो लहर से प्रसार की गति, तीव्रता भूखंड और गति माप प्राप्त किया जा सकता है । इस्तेमाल किया सांद्रता: ०.६ µ m मन (30% eGFP-मन), १.८ µ m उसका-मेरा (30% अपने-मेरा-Alexa647) ख ) उदाहरण में चिह्नित क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत तीव्रता साजिश एक. C) पूरे परख चैंबर का अवलोकन (स्केल बार: 1 मिमी, एक ही प्रोटीन सांद्रता के रूप में ऊपर) । बढ़ता है या तो दिशा के रूप में अच्छी तरह से लक्ष्य पैटर्न देखा जा सकता है । बढ़ाया क्षेत्र से पता चलता है कैसे लहर पैटर्न यूवी गोंद पर अलग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: प्रक्रिया प्रवाह आरेख-रॉड के आकार का microstructures में स्वयं संगठन के लिए प्रोटोकॉल के व्यक्तिगत कदम और समय दिखा रहा है (कदम 1-5, 7, 8) । ग्रे बक्से चरणों का संकेत है जहां उत्पादों गैर पैटर्न समर्थित लिपिड bilayers पर प्रोटोकॉल से reused किया जा सकता है । वृत्तों द्वारा चिह्नित तीर इंगित करते है कि प्रोटोकॉल कहां रोका जा सकता है और बाद में पुन: शुरू किया जाएगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: रॉड के आकार का PDMS microcompartments में पैटर्न गठन दिमाग के लिए प्रतिनिधि परिणाम । क) आत्म-PDMS की सतह पर व्यवस्थित करने के लिए यात्रा की सतह लहरें (1 µ एम मन (30% EGFP-मन), 2 µ m मेरा और २.५ mM एटीपी बनाने का आयोजन) । ख) बफर microstructures की ऊंचाई को कम करने के बाद, प्रोटीन स्वयं संगठन microcompartments के बीच planar सतह पर बंद हो जाता है । ग) एक छड़ी के आकार का microcompartment की योजनाबद्ध । D) बफ़र हटाने के बाद चित्त ध्रुव-से-ध्रुव दोलनों की प्रतिनिधि छवियां । E) D में दर्शाए गए हाइलाइट लाइन के साथ दोलनों की Kymograph) । च) छवि और समय की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की प्रोफाइल-श्रृंखला डी में दिखाया गया है) स्पष्ट रूप से प्रोटीन ढाल है कि microcompartment खंभे पर अधिक से अधिक है और डिब्बे के मध्य में ंयूनतम दिखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: नकारात्मक प्रयोगात्मक परिणामों के उदाहरण । एक) से अधिक धोया झिल्ली छेद जमा है, जबकि इष्टतम पुटिका तैयारी और लिपिड रचनाएं बुलबुले चिपके के लिए सीसा । दो केंद्र पैनलों दोनों समस्याओं का एक संयोजन दिखाने के लिए और कैसे वे दिखाई जब ंयूनतम दोलनों देख बन जाते हैं । झिल्ली ०.०५% Atto655-डोप के साथ लेबल थे । (स्केल बार्स: ५० µm) ख) शीर्ष पैनल: बाहर सूख microcompartments बहुत ज्यादा बफर हटाने के कारण हो सकता है या जब बफर समय के साथ लुप्त हो जाता है । नीचे पैनल: अपूर्ण डिब्बों वेफर उत्पादन या PDMS मोल्डिंग के दौरान गठित किया जा सकता है । (स्केल बार्स: 30 µm) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक फाइल 1: उसके-मन के लिए प्लाज्मिड नक्शा. कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक फाइल 2: उनके-EGFP-मन के लिए प्लाज्मिड नक्शा. कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक फाइल 3: उनके-mRuby3-मन के लिए प्लाज्मिड नक्शा. कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक फाइल 4: उसके लिए प्लाज्मिड नक्शा-मेरा. कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक फाइल 5: प्लाज्मिड अपने-MinC के लिए नक्शा. कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक फाइल 6: सीएडी छड़ी के आकार का microcompartments के सिलिकॉन वेफर के लिए फ़ाइल । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Discussion

हम में इन विट्रो पुनर्गठन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है MinCDE स्वयं संगठन पर planar समर्थित लिपिड bilayers और लिपिड bilayer में 3d संरचनाओं को कवर, रॉड का उदाहरण के आकार का उपयोग कर PDMS microstructures. आदेश में इन परख से मूल्यवान डेटा प्राप्त करने के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कारकों को नियंत्रित करने के लिए प्रोटीन और झिल्ली की गुणवत्ता हैं ।

प्रोटीन की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटीन मास एसडीएस-पृष्ठ और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर पुष्टि की जानी चाहिए । इसके अलावा, यह सत्यापित किया जाना चाहिए कि प्रोटीन घुलनशील और एकत्रित नहीं कर रहे हैं, विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन या गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग करके । जेल निस्पंदन प्रोटीन के किसी भी एकत्रित अंश को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सावधान पीएच समायोजन और जोड़ा गया न्यूक्लियोटाइड की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है, के अलावा के रूप में गैर समायोजित या आंशिक रूप से नीचा न्यूक्लियोटाइड प्रोटीन स्टॉक या आत्म-आयोजन परख करने के लिए प्रोटीन गतिविधि को खत्म करने के लिए पर्याप्त है, इसलिए समाप्त स्व संगठन ।

प्रोटीन की गुणवत्ता के बगल में, झिल्ली की गुणवत्ता सबसे महत्वपूर्ण है, और अनुचित झिल्ली गठन अक्सर दोषपूर्ण स्वयं संगठन और artefactual सतह संरचनाओं के मूल के लिए कारण है ।

पहली बार के लिए प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हैं, यह कम दाढ़ प्रतिशत (०.०५%) में एटो-६५५-डोप या दिी के रूप में लेबल लिपिड सहित द्वारा समर्थित लिपिड bilayers लेबल करने के लिए उपयोगी है । जिससे गुणों और झिल्ली की गुणवत्ता पर सीधे न्याय किया जा सकता है. frap है का प्रयोग, झिल्ली की तरलता का आकलन किया जा सकता है । इसके अलावा, एक सीधे SLB की धुलाई की गुणवत्ता का आकलन कर सकते हैं, के रूप में वहाँ भी कई बुलबुले हो जाएगा, कोई द्रव झिल्ली, या सभी पर कोई झिल्ली, अगर यह बंद धोया गया है. खुला चैंबर दृष्टिकोण कड़ाई से झिल्ली धोने के लिए अनुमति देता है, और इसलिए भी बुलबुले कि SLB की सतह पर चिपके हुए है हटाने के लिए । द्रव और समरूप समर्थित लिपिड bilayers प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारकों की सफाई और समर्थन सतह के hydrophilicity और सही आकार और सुबनाम की सजातीयता यह एसयूवी आकार और आकार वितरण की जांच करने के लिए सहायक हो सकता है का उपयोग कर गतिशील प्रकाश बिखरने । संकीर्ण आकार वितरण के लिए, हम उंहें sonicating के बजाय बुलबुले बाहर निकालना सलाह देते हैं । coverslips सफाई के अंय तरीकों, जैसे, मजबूत कुर्सियां, बुनियादी डिटर्जेंट, या पानी के साथ धोने के बाद सीधे coverslips का उपयोग कर के साथ उपचार, अच्छे परिणाम उपज सकते हैं, आवेदन और लिपिड मिश्रण पर निर्भर करता है ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की पहली छमाही, इन विट्रो में खुले कक्षों में planar समर्थित लिपिड bilayers पर पुनर्गठन, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के लिए सुलभ सतह प्रतिपादन का लाभ है, इस तरह के TIRF माइक्रोस्कोपी के रूप में30, frap है विश्लेषण6, एकल कण३४ट्रैकिंग, साथ ही साथ सतह जांच तकनीक जैसे परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी26। बड़े सजातीय क्षेत्र परिभाषित सांद्रता में बेहतर आंकड़ों के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा खुले चैंबर दृष्टिकोण को ठीक प्रोटीन एकाग्रता और आगे घटकों के एक तेजी से और सरल इसके अलावा, इसलिए एक एकल कक्ष20में अनुमापन प्रोटीन एकाग्रता की अनुमति के नियंत्रण की अनुमति देता है । परख भी FtsZ22,३५, ZipA22 या chimeric प्रोटीन FtsZ-YFP-MTS10,३५के रूप में अंय बैक्टीरियल divisome घटकों के अलावा द्वारा विस्तारित किया जा सकता है ।

अंय समूहों में इन विट्रो मेंंयूनतम प्रणाली का पुनर्गठन करने के लिए एक समान दृष्टिकोण ले लिया है, लेकिन एक प्रवाह सेल के बजाय एक खुले चैंबर17,18,19का उपयोग करें । प्रवाह कोशिकाओं को कुछ लाभ है, विशेष रूप से जब एक पूरी तरह से संलग्न 3 डी वातावरण की जरूरत है18, प्रवाह के प्रभाव17,19,23 या MinCDE पैटर्न पर झिल्ली23 रचना है जांच की है, या यदि प्रोटीन पैटर्न के तहत मनाया जा रहा है प्रोटीन शर्तों19सीमित । फिर भी, आणविक सांद्रता के स्थानीय नियंत्रण और अधिक कठिन है । प्रोटीन अवयव, विशेष रूप से मन, दृढ़ता से झिल्ली वे पहली मुठभेड़18,19को बांध । हमारे अनुभव में, प्रोटीन अक्सर गैर-विशिष्ट टयूबिंग, लेट्स, सीरिंज और अन्य microfluidic भागों के लिए बाध्यकारी प्रदर्शित करते हैं । इसलिए, स्थानीय प्रोटीन सांद्रता इनपुट सांद्रता18 से अलग और भी प्रवाह-सेल की लंबाई से अधिक भिंन है, प्रवेश और आउटलेट के बीच झिल्ली पर विभिंन प्रोटीन पैटर्न की एक किस्म में जिसके परिणामस्वरूप, के रूप में19दूसरों के द्वारा मनाया ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की दूसरी छमाही, इन विट्रो में पुनर्गठन रॉड के आकार का microstructures फिर से एक नमूनों पर खुले चैंबर दृष्टिकोण का उपयोग कर लिपिड bilayers द्वारा कवर की एक सरल नकल के लिए अनुमति देता है vivo प्रोटीन व्यवहार में भले ही प्रोटीन सांद्रता पर सटीक नियंत्रण बफर हटाने के कारण खो दिया है । ध्यान दें कि क्योंकि मन की तरंग दैर्ध्य के बारे में एक आदेश के बारे में है परिमाण में vivo की तुलना में बड़ा से एक छड़ के आकार का microcompartments भी है परिमाण के एक आदेश के बारे में बड़ा (10 x 30 µm) एक रॉड के आकार का ई. कोलाई सेल ।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल प्रोटीन एकाग्रता, बफर संरचना और झिल्ली गुण सहित सभी शर्तों के सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है । 3 डी संरचित का उपयोग का समर्थन करता है स्थानिक के तहत अध्ययन किया जा प्रतिक्रिया सक्षम बनाता है, vivo व्यवहार में जटिल microfluidics उपकरणों की आवश्यकता के बिना नकल उतार ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सिलिकॉन वेफर्स के उत्पादन के लिए माइकल Heymann और फ्रैंक Siedler धंयवाद, कोर सुविधा MPI-बी में सहायता के लिए प्रोटीन शुद्धि और साइमन Kretschmer और लियोन Harrington पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
DOPG Avanti Polar Lipids 840475
E.coli polar lipid extract Avanti Polar Lipids 100600
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate Roche
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma A5285-1G
Sodium chloride VWR 27810.295
Potassium chloride Roth 6781.1
Tris-base Sigma Aldrich T1503-1kg
Hydrochloric acid Roth 9277.1
TCEP-HCl Termo Fisher Scientific 20491
Ethylene Diamine Tetraacetate Merck Millipore 1.08418.1000
Sulfuric Acid 98% Applichem 173163.1611
Hydrogen Peroxide 50% Applichem 147064.1211
HEPES Biomol 05288.1
dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 102950 Uvasol
Glycerol 86% Roth 4043.1
TB medium
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roth 2316.x
Atto-655-DOPE Atto Tec AD 655-161
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
PDMS base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
PDMS crosslinker Dow Corning Corporation
Materials
UV Glue Norland Products 6801 #68 and #63 both work well
Coverslips #1.5 24x24 mm Menzel Gläser
Coverslips #1 24x24 mm Menzel Gläser used only for PDMS microstructures
0.5 ml reaction tube Eppendorf  0030123301
culture flask 2L Corning e.g. 734-1905
His-Trap HP GE Healthcare Life Sciences
Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG GE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column Biorad 7322010
dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL Termo Fisher Scientific 66333 or 66330
razor blade
Instruments
ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems Merck
automated protein purification system: Äkta Pure GE Healthcare Life Sciences
bath sonicator Branson e.g. Model 1510
ARE-250 mixer Thinky Corporation
Plasma cleaner Zepto Diener electronic use oxygen as process gas
positive displacement pipettes Brand Transferpettor models with glass tips
LSM780 confocal laser scanning microscope Zeiss Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective
Plasmids
pET28a-His-MinD_MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield
pET28a-His-MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinE
pET28a-His-EGFP-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-mRuby3-MinD
pET28a-His- MinC Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinC

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References

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मुद्दा १३७ जैव रसायन में इन विट्रो पुनर्गठन मन मेरा समर्थित लिपिड bilayer पैटर्न गठन microstructures स्व संगठन
इन <em>विट्रो में</em> स्व का पुनर्गठन-समर्थित लिपिड Bilayers पर प्रोटीन पैटर्न का आयोजन
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Ramm, B., Glock, P., Schwille, P.… More

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P. In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (137), e58139, doi:10.3791/58139 (2018).

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