Summary
我々 は開いた区域の脂質の心と私の自己組織化アッセイの in vitroのプロトコルを提供します。さらに、我々 は反応閉じ込めによる生体内での条件を模倣する脂質被覆 PDMS microcompartments のアッセイを囲む方法をについて説明します。
Abstract
細胞の基本的な時空間組織の多くの側面は、反応拡散型システムによって支配されます。このようなシステムのin vitro再構成が実行できない彼らのメカニズムの詳細な研究が可能になります体内。ここでは、MinCDEエシェリヒア属大腸菌細胞中の細胞分裂隔壁の位置する系の生体外の再構成のプロトコルを提供します。アッセイは、のみに必要なコンポーネントの自己組織すなわち膜、心の 2 つの蛋白質と私と ATP の形でエネルギーを供給する設計されています。我々 したがってサポートされている脂質二重膜が形成が観察にオープン反応チャンバーを作製します。商工会議所のオープンな設計は、脂質二重層の最適な準備と一括コンテンツの制御操作します。2 つの蛋白質の心と、私と同様、ATP、細胞膜上一括ボリュームに追加されます。イメージングは、共焦点、広視野設計支援と同様の全反射型顕微鏡として、多くの光学系によって可能です。プロトコルのバリエーションとして、脂質二重膜は、PDMS のミクロのセル状構造、ガラスではなくパターンのサポートに形成されます。これらのコンパートメントの縁に一括ソリューションを下げるより小さいコンパートメントで反応を囲み、体内振動現象の模倣ができる境界を提供します。一緒に取られて、私たちプロトコルについて説明して空間拘束なしの MinCDE システムを再構成する濃度範囲など他の要因の追加のパターン形成に影響を与えるすべての側面を正確に制御する研究者を許可します。または蛋白質、体系的に比較的単純な実験のセットアップでシステムの複雑さを増加します。
Introduction
時空間パターンは規制の細胞分裂1,2形態から多細胞と細胞レベルで、複雑なタスクを調整する性質に不可欠です。反応拡散系は、これらのパターンの確立に重要な役割を果たすが、まだよく理解されています。これまでのところ反応拡散系と特徴づけられる最高の生物学的システムの典型的な例は大腸菌・ MinCDE システム3,4,5,6,7です。MinCDE システムはフューチャー部門サイトとしてセルの中心を決定するエシェリヒア属大腸菌の細胞極に細胞極から発振します。このシステムは、鉱山と空間反応行列8として膜蛋白質のアクティブ化 atp アーゼ、atp アーゼ心に基づいています。ミンツはパターン形成機構の一部ではないが、実際の機能エージェント: 主な divisome 蛋白質 FtsZ5,6の阻害剤。ミンツの心にバインドし、従って続く振動、細胞極で極大値と極小セル中央には、タンパク質の時間平均濃度勾配の結果のみを midcell9,10 時忘 FtsZ を許可.MinCDE システムは細菌2、時空間の組織配置と輸送タンパク質複合体11とプラスミド12およびセルを調整するための鍵は、ウォーカーの Atpase の大きな家族の一員部門13と染色体分離14。したがって、MinCDE 反応拡散系だけでなく、典型的な反応拡散系を表しますもの関連性細菌における時空間の組織のため注目を集めています。
MinCDE システムは、生体内での機能を解明は、タンパク質と遺伝子の削除の操作は通常細胞分裂の欠陥の結果、複雑です。さらに、膜の組成や生体内で細胞質のプロパティを変更することは非常にチャレンジングな15,16。システムと影響因子を変更は細胞分裂としてそのような本質的な機能に邪魔されてさらにその細胞の複雑な環境で解釈するは難しい。私たちと他の人ためになっているの in vitro再構成アプローチ、コア コンポーネントにシステムの削減: 心、鉱山、エネルギー源として ATP と反応行列6,17,として脂質18. このボトムアップ ・ アプローチにより、生きている細胞の複雑な詳細に自己組織化のメカニズムを調査します。旅行表面蛋白質フォーム波の波長、通常体内のより大きい大きさについてとはいえ6とパターン17,19これらの条件の下での他の種類。パターン形成に影響を与えるすべての側面を正確に制御を容易に開いた区域の使用: ATP 濃度、バッファー組成、膜組成10蛋白質プロパティ20タンパク質濃度66、としてエージェント21と他の divisome 蛋白質22混雑感など他の要因を追加。比較では、フローセル18,19,23 MinCDE システムの in vitro再構成を流れ17,23, タンパク質の影響を調査する使用ことができます。条件19、膜組成19完全 3次元閉じ込め18タンパク質パターンの制限、蛋白質/成分濃度および複雑なシーケンシャル コンポーネントを加えてより多くの正確なコントロールをレンダリングします。
この開いた区域を使用して、我々 も、1 つはどのように幾何学的な境界の影響パターン形成21、最近現象を調べることができる平面脂質二重層のサポートをパターン化調査生体内で細菌を使用されても微細構造7に成形。システム20の影響パターン形成も私にどのように定義された突然変異を調査するこのアッセイを採用しました。さらに、光、アッセイに鉱山、アゾベンゼン架橋のペプチドを導入し、全反射顕微鏡24イメージングによるパターン形成を制御できる方法を調査する同じ基本的な法形式を採用されています。
わかった、だがパターンを複製するために形成を観察生体内での in vitroシステム,監禁されたキー。サポートされている脂質二重膜で覆われただが生体外で(10 x 30 μ m) の大きい波長に調整寸法ロッド型 microcompartments の使用許可だがポール - 振動とタンパク質の勾配形成の再構成10,25。このアッセイで人工脂質膜が上に開いたまま棒状の microcompartments のいくつかの百のレプリカが含まれるパターンの PDMS 基板上に堆積します。これにより、開いた区域の反応を設定できます、それにより小さいボリュームに反応を拘束、microcompartments の縁にバッファーを下げたその後。にもかかわらず、これらのコンパートメントは片側空気バッファー インターフェイスを持って、表さない膜にフル 3 D の閉じ込めがそれ故に、蛋白質ダイナミクス体内振動10、25の真似。フル 3 D の閉じ込めと比べると、18の結果非常に類似を表わす、オープン微細構造分析は比較的単純で簡単に処理し、専門マイクロ装備整ってない所で実行することも、クリーン ルーム設備。
ここでは、提案する脂質二分子膜の in vitro光学顕微鏡によると、マイナーですべてのコンポーネントとの容易なアクセスの制御は、オープンのチャンバーを用いたパターン形成サポート MinCDE の再構成のための実験プロトコル変更、表面プローブ技術26適応可能であるも。平面脂質二分子膜の横にある蛋白質の閉じ込めにできる方法も紹介ロッド型 PDMS の微細組織に及ぼす単純なパターン化されたサポートされている脂質二重層を使用して取得します。これらのアッセイ MinCDE システム向けに最適化が転送することも FtsZ27や28最小限アクチン皮質などの膜を同様の方法で操作する他の蛋白質のシステムに。
Protocol
1. タンパク質の生産
- 蛋白質の表現
- 大腸菌BL21 を変換 (DE3) pLysS ミンク30や鉱山6 mRuby3 心24EGFP 心29心6の式のそれぞれのプラスミドを持つ。プラスミド マップの補足情報を参照してください。
- それぞれの抗生物質 (例えば100 μ g/mL アンピシリンまたは 50 μ G/ml カナマイシン) を使用して単一コロニーの LB 培地で一晩培養を接種して揺れながら 14-16 h の 37 ° C で孵化させなさい。
- 一晩かけて培養 (希釈 1: 200) とそれぞれの抗生物質を含んでいる TB 媒体の 500 mL を接種して 180 rpm で揺れながら 37 ° C で文化を孵化させなさい。
- 文化 600 の光学濃度に達すると 0.5 mM IPTG を追加することでタンパク質の発現を誘導する 0.5 0.7 nm。EGFP 心や mRuby3 心の場合 16 ° C で培養する細胞をシフトし 14-16 h、ミンツ、心や鉱山の場合細胞の成長、誘導後の 37 ° C で 3-4 時間の細胞の成長します。
注: 誘導ミンツ、心または鉱山の式は過剰発現細胞分裂の欠陥の結果として細胞の毒性したがって、37 ° C で培養時間が 4 時間以下に保たれることが重要です。多くのタンパク質が必要な場合は、文化はなく、インキュベーション時間の量を増やします。 - それぞれの培養時間 10 分 4000 × g で遠心分離によって細胞を収穫し、-80 ° c まで細胞ペレットを格納後はさらに使用します。
- 蛋白質の浄化
注: プレパックド Ni NTA 列自動タンパク質精製システム上またはを使用して Ni NTA ビーズ重力流ベンチ浄化のため、蛋白質を浄化することが。- プレパックド Ni 国税庁で列を含む自動タンパク質精製システム使用バッファー A1 (50 mM リン酸ナトリウム pH 8.0, 500 mM, 10 mM のイミダゾールの塩化ナトリウム)、バッファー B1 (50 mM リン酸ナトリウム pH 8.0、500 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール) の精製およびバッファー C1 (50 mM ナトリウムリン酸塩 pH 8.0、500 mM の NaCl、250 mM のイミダゾール)。Ni 国税庁を使用して重力流ベンチ精製ビーズ バッファー A2 (トリス塩酸 pH 8.0 では、300 mM の NaCl、10 mM のイミダゾール 50 mM) を使用、バッファー B2 (50 mM トリス塩酸 pH 8.0 では、300 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール) とバッファー C2 (50 mM トリス塩酸 pH 8.0 では、300 mM の NaCl、250 mM のイミダゾール)。補完すべてのバッファーを 10 mM β-メルカプトエタノールまたは 0.4 mM TCEP (使用前に還元剤として tris(2-carboxyethyl)phosphine)。
- Mg2 +-ADP EDTA 無料プロテアーゼ阻害剤、100 μ g/mL リゾチーム 〜 250 U/mL DNase、0.2 mM を添加したバッファー A1 または A2 の 20-30 mL の細胞を再懸濁します (Mg2 +-ADP 心や EGFP 心浄化のみの場合 100 mM ADP から在庫の 100 mM MgCl2 pH は 7.5 に調整されます。)
- 先端の超音波発生装置を使用して細胞を溶解 (30 2.5 分、30 s パルス振幅 30% オフ s) 氷浴のセルを含むバイアルを維持しながら。
- 25,000 x g で 45 分と 4 ° C の溶解液の細胞を遠心分離によって細胞の残骸を削除します。
- Ni NTA 列または Ni NTA ビーズに上澄みを孵化させなさい。
- プレパックド Ni NTA 列の自動タンパク質精製システムのサンプル ポンプを使用して、列にサンプルをロードします。
- ベンチ上の浄化、4 ° C で 1 時間の回転シェーカーで 50 mL の反応管内の Ni NTA ビーズ サンプルをインキュベートします。後続の手順では、25 mL のピペットを使用して空の列に Ni NTA ビーズを転送します。
- 少なくとも 5 列 A1 または A2 のバッファー量で洗います。
- B1 または B2 のバッファーの少なくとも 5 列ボリュームで洗ってください。
- C1 または C2 のバッファーが付いている蛋白質を溶離する。
- SDS ページを介してタンパク質の純度を評価します。
- オプション: ストレージ バッファー (50 mM HEPES/島 pH 7.2, 150 mM KCl、10% グリセロール、0.1 ミリメートルの EDTA、0.4 mM TCEP、(0.2 mM Mg2 +-ADP の心の場合)) のゲルろ過カラムにそれを適用することによってタンパク質をさらに浄化します。
注: 集計タンパク質画分を削除する心のためには、ゲル濾過の使用をお勧めします。 - ゲルろ過を採用してない場合交換 Ni NTA 溶出バッファー記憶域バッファー (50 mM HEPES/島 pH 7.2, 150 mM KCl、10% グリセロール 0.1 ミリメートルの EDTA、0.4 mM TCEP、心 (mM 0.2 Mg ADP)) に重力を使用した脱塩カラムの流れ (材料の表を参照してください)。
- ショック-凍結因数で蛋白質液体窒素、-80 ° c 店でそれ以上の使用まで。
- ブラッドフォードの試金を使用して蛋白質ストック濃度を測定し、atp アーゼ アッセイ20の蛋白質の活動を決定します。
注: は 280 で吸収を用いたタンパク質濃度を評価できません nm。心の浄化中のヌクレオチドの存在と鉱山でトリプトファンの不足は、280濃度測定を歪めます。使用ブラッドフォードまたは BCA の代わりにタンパク質濃度を測定する試金します。
- タンパク質ラベリング
注: 鉱山を誘発する小さなタンパク質に蛍光タンパク質融合の主要な拡散プロパティと関数への変更それ故に、蛋白質 (システイン位置 51) の化学分類より優先されます蛍光タンパク質を融合。- DMSO (ジメチルスルホキシド) の 5-10 μ L のマレイミド色素共役の 0.125 mg を溶解し、揺れを 0.5 mL 鉱山 ph 7.2, ストレージ バッファーに分注上記の詳細を準備の下に追加。
- 4 ° C で一晩に 2 h または穏やかな揺れや攪拌下で RT で 2 時間インキュベートします。
- 別の染料とストレージ バッファー (50 mM HEPES/島 pH 7.2, 150 mM KCl、10% グリセロール 0.1 ミリメートルの EDTA、0.4 mM TCEP) と列を脱塩重力流れを使用して蛋白質。
- さらにすべての未接続の色素を削除するには、余分なストレージ バッファーに対してタンパク質を dialyze します。
- それぞれの色素の最大の絶滅を測定することによって成功したラベルを確認し、推定ラベル付け効率を計算します。ラベリングの程度を推定に関する詳細なプロトコルの染料メーカーの指示を参照してください。Sds-page 分析し、総質量によって質量分析サンプルの均質性とラベリングの成功についてさらに有益な情報を決定します。
2. 小型単層ベシクル (SUV) 準備
- 多重層膜ベシクルの生成
- 望ましい混合物の最終の SUV 巻クロロホルム lipid(s) の量を計算します。濃度は 4 mg/mL 分バッファー (25 mM トリス塩酸 pH 7.5、150 mM KCl、5 mM MgCl2) 脂質をする必要があります。標準的な最小の試金のための 7:3 DOPC:DOPG (mol %) 混合物の使用をお勧めします。大腸菌極性脂質を使用して抽出するときは、すべての準備手順の SLB バッファー (25 mM トリス塩酸 pH 7.5、150 mM KCl) を使用します。
メモ: この混合物と同種 SLBs の生成は、はるかに困難な大腸菌極性脂質抽出を使用する初めてのユーザーの勧めがないです。 - ガラスのヒントと肯定的な変位のピペットを使用して、1.5 mL ガラス瓶のクロロホルムで脂質をミックスします。
- バイアルをゆっくりと回しながらわずかな窒素気流下における脂質を乾燥します。10 〜 20 分間強く窒素気流下における脂質を配置します。バイアル真空デシケータで乾燥した脂質膜を配置し、少なくとも 1 時間のための真空を適用します。
- 混合物が均一に不透明になるまで室温で最小バッファーで脂質を補給します。
注: 多重層膜ベシクルから小さなベシクルの世代、脂質も押し出せる 2.2 で説明されているよう。または熱量 2.3 で説明されているようです。一般に、押出人工脂質膜の形成で助けることができる狭いサイズ分布が得られます。
- 望ましい混合物の最終の SUV 巻クロロホルム lipid(s) の量を計算します。濃度は 4 mg/mL 分バッファー (25 mM トリス塩酸 pH 7.5、150 mM KCl、5 mM MgCl2) 脂質をする必要があります。標準的な最小の試金のための 7:3 DOPC:DOPG (mol %) 混合物の使用をお勧めします。大腸菌極性脂質を使用して抽出するときは、すべての準備手順の SLB バッファー (25 mM トリス塩酸 pH 7.5、150 mM KCl) を使用します。
- 押出成形による SUV 作製
- 脂質集計および多重構造を分解し、さらに 7 に 10 サイクルの凍結融解によって脂質可溶化します。
- ホット プレート上 99 ° C に 70 の ° c の水でビーカーと液体窒素の容器を準備します。
- 窒素を停止沸騰するまで液体窒素で大きなピンセットでバイアルを保持します。お湯のソリューションは、完全に解凍するまでバイアルを転送します。脂質混合物は混合物によっての目にはっきり表示されるまでこの手順を繰り返します。
- 脂質の押出機を組み立てるし、事前分バッファーを使用してシステムをすすいでください。35、41 回 50 nm の細孔膜を介して脂質混合物を押し出します。膜は通過されない骨材を回避するパスの数が奇数に終了することを確認します。
- 脂質集計および多重構造を分解し、さらに 7 に 10 サイクルの凍結融解によって脂質可溶化します。
- Sonication によって SUV の準備
- 溶解ヒート ブロックのソリューションを含むガラスの瓶を置くバッファー内の脂質 37 ° C と渦を 20 分ごとに 1 分に設定します。約 1 時間の合計で孵化させなさい。
- 必要な高さでクランプ スタンドにバイアルをアタッチすることにより (この作業は 1.91 L、80 W) の超音波発生装置バースのバイアルの底を浸します。
- バイアルを取り巻くソリューションが徹底的にパルスによって攪拌されるので、超音波発生装置のお風呂の水の高さを設定し、脂質混合物を約 20 分間超音波。脂質の明瞭さを評価することによって成功した超音波処理をチェックします。
- Suv は一週間までの 4 ° C で保存または-20 ° c (~ 20 μ L) の小さい因数で冷凍し、数週間保存できます。バイアルまたは室温でチューブを解凍し、脂質二重層 (SLBs) はサポートの準備のための Suv を使用する前に、ソリューションがクリアされるまで、2.2.3 または 5.3 で説明したように再度超音波。ください Suv の狭いサイズ分布を用いて押出メモは、凍結とその後融解および超音波処理後失われます。
3. クリーニング ガラス Coverslips
注: クリーニング、ガラス coverslips の親水化同種と流体サポートされている脂質の重要な要因です。50% 過酸化水素 (3.1)、またはプラズマ クリーナー (3.2) で酸素プラズマを用いた比 7:2 硫酸から作られたピラニア溶液を用いたガラス coverslips を洗浄できます。両方のメソッドは、同じような結果をもたらします。
- ピラニア coverslips のクリーニング
- ピラニア溶液を適用します。
- 逆ガラス シャーレまたは他の不活性の表面にガラス coverslips に配布します。ガラス ピペットでそれぞれ coverslip の中心に濃硫酸 (98%) の 7 が値下がりしましたを追加します。
注意: 硫酸は強く酸性で腐食性です。適切な保護具のみとシリカフューム戸棚で作業します。 - 酸の滴の中に 50% 過酸化水素の 2 滴を追加します。
注意: 過酸化水素は目や皮膚を腐食です。 - 反応をカバーし、少なくとも 45 分間インキュベートします。
注: 最大の待機時間をここで実験の結果のために重要ではない、いくつかの日まで延長することができます。
- 逆ガラス シャーレまたは他の不活性の表面にガラス coverslips に配布します。ガラス ピペットでそれぞれ coverslip の中心に濃硫酸 (98%) の 7 が値下がりしましたを追加します。
- 洗浄ピラニア coverslips を掃除しました。
- ピンセットを使用して個別に coverslips をピックアップし、超純水、酸を洗い流します。非スティック ホルダーまたは類似の輸送装置で洗浄 coverslips を配置します。
- 純水を広く各 coverslip をすすいで加圧ガス (窒素、空気オイルフリーする場合のみ) で表面を乾燥します。永久的なマーカーと、カバーガラスの洗浄面をマークします。
- ピラニア溶液を適用します。
- プラズマ洗浄 coverslips
- Coverslips 余分なエタノールとその後余分な純水をすすいでください。高圧ガスと coverslips を乾燥させます。4 で説明したように、商工会議所を組み立てます。
- 商工会議所アセンブリ 4 で説明したよう後添付を納めた coverslips とプラズマ プロセスのガスとして酸素とよりきれいに配置。きれいにプラズマを用いた coverslips (この作業 30% 電力 0.3 mbar 酸素圧 1 分を使用した)。SLB 形成プラズマ クリーニングの hydrophilizing 効果として前述の 5 では、切れる時間をかけて前に右の洗浄を行います。
注: タイミングとプラズマ クリーニングの力をする必要があります少しすぎると蛍光に分類された膜を使用して最適化するまたは両方の不動膜や膜孔につながる過剰なプラズマ クリーニングすることができます。
4. チャンバー アセンブリ
- 鋭いハサミで切って、ふたをし、0.5 mL の反応管の円錐形の部品を破棄します。UV 接着剤をチューブの上部の縁に適用し、ピペット チップを使用して均等に配布します。
- 以前洗浄 coverslip 逆さまにチューブを接着します。ピラニア洗浄の場合、ガラスの洗浄面に接着することを確認します。360 nm ランプまたは 5 〜 15 分の LED の下に複数の部屋を配置することによって UV 接着剤を治します。
5. 脂質二分子膜 (SLB) 形成
- 予熱の熱は 37 ° c をブロックし、Min または SLB バッファー、商工会議所あたり 1 管 2 mL 反応管を孵化させなさい。
- 任意のほこりや UV 硬化とアセンブリの間に解決するかもしれない他の粒子を削除する組み立ておよび硬化の部屋に打撃窒素。プラズマきれいあなた coverslips ピラニア ソリューション (3.1) を掃除しているいない場合、3.2 で説明するように。熱ブロックでチャンバーを配置します。
- エシェリヒア属大腸菌の極性脂質抽出物、0.53 mg/mL の作業濃度を降伏の場合 SLB バッファーまたはバッファー分の 130 μ で (4 mg/mL) で明確な脂質の 20 μ L 因数を希釈します。脂質は、凍結された場合に備えて風呂超音波発生装置にバッファーを追加する前に、チューブを保持することによって最初に超音波照射し、バッファーに再度超音波。
- 各チャンバーに脂質混合物の 75 μ L を追加し、タイマーを 3 分に設定 (ダイレクトオン/DOPG の混合物; 長い潜伏必要がありますその他の脂質混合物の)。エシェリヒア属大腸菌の極性脂質抽出の場合 3 mM の最終的な集中に商工会議所に CaCl2 100 mM の在庫からのピペットします。培養時間の間に、小胞は親水性のガラス表面にバーストしてコヒーレント SLB を形成するヒューズします。
- 60 秒後に、各商工会議所に 150 μ L 分バッファーを追加します。
- 洗浄室: 別 120 秒 (合計 3 分) 洗浄する各商工会議所分または SLB のバッファーの追加の 200 μ L を慎重にピペッティング ダウンを数回削除し、別の 200 μ L を追加後。
- 各商工会議所は、一度洗浄されている後 2 mL のバッファーが使用されるまで、最初の部屋を徹底的に洗うに進みます。SLBs の洗濯は商工会議所の動きの範囲を完璧にし正しい洗濯強度を見つけるいくつかの経験が必要です。
注: は、SLB の乾燥を避けるためにチャンバーからすべての液体を取り外さないでください。
注意: 洗浄の上に多くの追加要素によって異なりますが膜特性: 脂質の種類と製法、suv、脂質混合物で相対濃度表面処理とサポートの事前清掃します。
- 各商工会議所は、一度洗浄されている後 2 mL のバッファーが使用されるまで、最初の部屋を徹底的に洗うに進みます。SLBs の洗濯は商工会議所の動きの範囲を完璧にし正しい洗濯強度を見つけるいくつかの経験が必要です。
6. 自己組織化アッセイ
- タンパク質と ATP ソリューションの量を引いた 200 μ L 分のバッファーに商工会議所にバッファーのボリュームを調整し、私の心、心、ラベルを追加、に応じて、ミンツ。軽くピペッティングしてコンポーネントをミックスします。例の濃度は、1 μ M の心 (30% 添加した EGFP 心)、1 μ M 鉱山 (鉱山を化学的にラベル 10% 添加) と 0.05 μ M ・ ミンクがパターンを形成する濃度6,10,20,30の範囲で.
- だの自己組織化を開始するためには、(100 mM 100 mM MgCl2、pH 7.5 に ATP 在庫) から 2.5 mM ATP を追加します。
注: 構成部品の追加 (心、私と ATP) の順序変えることができるし、最終的なパターン結果4に影響しません。 - 蛍光顕微鏡のだが自己組織化を観察 (材料の表を参照してください)。だが自己組織化は、全反射顕微鏡を用いた観察することも。EGFP 心をイメージング、488 nm アルゴン レーザーまたは匹敵するダイオード レーザー (例えば、 490 nm) を使用します。イメージング mRuby3-心、561 nm ダイオード レーザーを採用することをお勧めします。
注: 高レベルを避けるため私たちと他の人より長い時間のための励起の17は、不可逆的なタンパク質重合膜をリードだがシステムで光毒性を観察しています。
7. PDMS の微細構造
注: PDMS (ポリジメチルシロキサン) は高分子の微細構造とマイクロ流体デバイスの生産のために使用できます。パターン化されたシリコンウエハーは、PDMS 構造を鋳造用の鋳型として機能します。PDMS 構造は SLB の形成のためのサポートとして機能し、セットアップを試金。
- Microcompartments による si ウエハ写真平版を使用して自分自身を生成いずれか (詳しいプロトコル31または提供していますらビデオ プロトコル32のための Zieske および Schwille を参照) またはファウンドリからあなたの希望のシリコンウエハを注文.ここで使用されるウェーハのパターンの補足情報を参照してください。
- PDMS 微細パターン化されたシリコン基板からの生産。
- プラスチック製のカップを使用して、PDMS ベースと PDMS 架橋剤 1 g 10 g の重量を量る。いずれかを混ぜるとドガの PDMS 混合物または手動で、PDMS をミックスし、減圧し、その後に混合装置を使用します。
- シリコン基板上の構造に直接 PDMS の小さな量をドロップするのにピペット チップを使用します。
注: シリコン基板に傷を付けないように気をつけてください。 - すぐに PDMS ドロップに #1 coverslip を置き、軽く押して、シリコンウエハ上に coverslip きれいなピペットの先端の上部の端を取る。Coverslip とシリコン基板間、PDMS が薄く広がっている必要があります。
- オーブンに、coverslips にウェーハを配置、3 ~ 4 時間、PDMS を治すか、または 75 ° C で一晩ウェハをオーブンから除去し、室温まで冷ます。かみそりの刃を持つ SI ウェハから添付の PDMS の coverslip を慎重に取り外します。
注: si ウェハの汚れや破損を得ることを防ぐために、常に PDMS 観察と微細構造をカバーします。ただし、PDMS の年齢の微細構造のひびの結果はそれゆえ、2 〜 3 週間より古い PDMS 構造を使用しません。
8. PDMS 微細構造の自己組織化
- として商工会議所をアタッチする PDMS の微細構造と使用 coverslips 下 4 をについて説明します。
- 清潔で酸素プラズマ クリーナー 3.2.2 で説明したように表面を hydrophilize します。PDMS 基板上、ピラニア クリーンを行います。
- 前述の 6 未満だが自己組織化アッセイをセットアップします。
- アッセイの設定後、正規だがパターン形成と蛍光顕微鏡を適切に形成された微細構造を確認します。
- 正規だがパターンが形成される (10-30 分) と、優しく上下のコンポーネントをミックスしてピペッティングして一歩一歩バッファーを削除 2 回ピペットします。100 μ L ピペットを使用してバッファーの大量削除し、10 μ L ピペットを使用して残りの部分を慎重に取り外します。
注: この手順は、いくつかの練習を必要があります。やられてあまりにも多くのバッファー処理時間がかかりすぎる場合、微細構造、乾燥;もしあまりにも少しは取られ、蛋白質、微細構造では、限定されませんが、表面波の旅を。 - すぐにチャンバー内に微細構造の残留バッファーの乾燥を避けるために蓋を閉じます。
- 撮像時間が長くできるように、チャンバー内スポンジ湿らせた作品をプラグインして蓋を閉じます。スポンジが、カバーガラスの表面に接触しないことを確認します。
- 表面微細構造だがパターン形成の上で停止して、バッファーが十分に低下した、表面微細構造チェックのイメージングの前に微細構造のイメージだが振動します。微細構造乾燥しないイメージング中に乾いていることを確認します。
注: は、PDMS フォームのひびとして各使用後 microcompartments と coverslips を破棄します。
9. だがパターン形成過程の解析
- 波長、波速度および人工脂質平面膜のだが自己組織化の波プロファイルを定量化します。パッケージ化されたプラグインの標準的なセットでフィジーで基本的な分析33十分です。
- Microcompartments ポール - 振動を分析するには、kymographs とタンパク質の時間平均濃度プロファイルを取得します。基本的な kymographs は、フィジーでの行の選択に沿って時系列を再スライスして取得できます。
Representative Results
蛋白質の浄化のプロトコルを次には、Min タンパク質は十分な純度が得られるはず。参考として図 1は心、心、鉱山、ミンツを蛍光標識の SDS-PAGE イメージを提供します。人工脂質膜の非パターン化のだが自己組織化分析を実行するプロシージャの個々 のステップは、図 2のとおりです。このプロトコルを使用すると、(図 3) 庫内正規だが表面波の旅を観察できます。波長で、チャンバ内で多少異なりますが、一般的なパターンのよいます。UV 接着剤のフォームがガラスのプロパティと異なるプロパティを持っているように見える膜表面が (図 3を参照)、定量的な比較は、商工会議所の端を使用しないでください。表面波は伝搬方向 (図 3 b) 強度をプロットすることによって分析できます。心蛍光波のリーディング エッジから高速ではなく高原は、後縁は急激に少なくし、鉱山蛍光心波の開始からほぼ直線的に増加、心後トレーリング エッジでその最大数に達した、それ6著しく落ちる。
蛋白質品質の横にある人工脂質膜の品質は MinCDE の定期的自己組織化にとって最も重要なです。一方で、膜はあまりにも過度に洗浄または基になる表面が洗浄され、従って余りに強く荷電、穴が膜で形作ることができる (図 6 a上)。一方、膜をきちんと洗っていない、または基になる表面はきれいに hydrophilized、小胞膜に固執するだろうまたは膜の流動性が損なわれます (図 6 a下)。でも明らかではない、直接標識脂質膜を観察し、これらの問題も検出できます心蛍光信号から、パターンが通常、および、マキシマの蛍光は同種ではないが、「穴」が含まれています、または図 6Aの中央のパネルのように、明るい。
PDMS 組織の棒状だが自己組織化の手順は図 4のとおりです。いくつかのプロトコルの手順は、タンパク質や脂質を再利用できるよう、繰り返される必要はありません。ようなパターン化した基板上に基板を洗浄して (プラズマ クリーニング) で hydrophilized、PDMS にサポートされている脂質二重層を形成、自己組織化の試金が 200 μ L のボリュームに設定されています。適切な膜を形成して、だが膜の自己組織化をチェックするには、部屋が作成されます。適切な膜形成、だがフォームが通常個々 の微細構造間、PDMS の表面に表面波を旅されているし、また自己組織化微細構造の下部に波を自由にすることができます、全体の上に移動します。膜で覆われた表面 (図 5 a)。バッファー除去後コンパートメント間表面を表示しない伝搬だがパターン (図 5 b)、それは完全に乾燥する必要があります。だがパターンは、まだ動いていますより多くのバッファーを削除する必要があります。タンパク質は、膜に覆われた PDMS、自己組織化は、上部インターフェイス (図 5) の空気に、棒状 microcompartments 今閉じ込められました。これらの条件の下で 2 つの蛋白質は図 5に示すように、極から極へ振動を実行できます。私の心の一部は、膜結合型では常に、またバッファー除去中にバッファー除去後の濃度は濃度を入力に匹敵します。この効果によりバッファー除去前にパターンの位置に依存するいると、濃度がまた同じ coverslip の個々 の微細構造によって異なります。シリコンのウエハ生産やシリコンウエハーから PDMS 成形は、不完全な微細構造分析 (図 6 b) に使用できませんで起因できます。さらに、バッファーのため除去組織は、プロセス中に乾く可能性があり、それ故に、さらなる分析 (図 6 b) から除外します。結果として 1 つのチャンバーに微細構造のほんの一部は目的のポール - 振動を示しています。微細構造タンパク質の動態を分析するには、kymograph は、全体構造 (図 5 e) 選択範囲を描画することによって取得できます。MinCDE はポールのポールから振動、ミンツと心はコンパートメント (図 5 階) の真ん中にコンパートメント極で最大濃度と最小濃度の時間平均濃度勾配が表示されます。
図 1: SDS-PAGE によるタンパク質精製の最終製品を表示します。彼の心 (33.3 kDa)、彼の eGFP-心 (60.1 kDa)、彼の mRuby3-心 (59.9 kDa)、彼鉱山 (13.9 kDa)、彼ミンツ (28.3 kDa) が順に表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: プロセス フロー図の個々 の手順を示すと非パターン化脂質二重膜 (手順 1-6) の自己組織化のプロトコルのタイミング。破線のボックスは、クリーニングでこれら 2 つのオプションのいずれかが使用できることを示します。円で印の付いた矢印を示すプロトコルを一時停止および後で再開できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: だがアッセイの共焦点顕微鏡によるイメージングします。A)正規分のスパイラル、どの波伝搬速度や強度プロット速度からの測定を得ることができます。使用濃度: 0.6 μ M (30 %egfp の心) を気 1.8 μ M 彼の地雷 (30% 彼-鉱山-Alexa647) B) A の地域の例を正規化輝度プロット マークC)全体アッセイ商工会議所の概要 (スケール バー: 1 mm、タンパク質濃度に等しい上記)。スパイラルと同様ターゲット パターンを観察することができますどちらの方向を回します。拡大領域は、UV 接着剤に波のパターンの異なる方法を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: プロセス フロー図の個々 の手順を示すと棒状の微細構造 (手順 1-5、7、8) における自己組織化のプロトコルのタイミング。灰色の箱手順を示す製品が再利用できるプロトコルから人工脂質膜の非パターン化に。円で印の付いた矢印を示すプロトコルを一時停止および後で再開できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 代表的な決算だがパターン PDMS microcompartments の棒状に形成します。A)だが進行表面波を形成する PDMS 表面の自己組織化 (1 μ M 心 (30 %egfp 心)、2 μ M 鉱山、2.5 mM ATP)。B) 、microcompartments 間の平面サーフェス上のタンパク質の自己組織化を停止バッファーは、微細構造の高さを下げたが後、。C) 1 つの棒状の microcompartment の回路図。D)バッファー除去後だがポール - 振動の代表的なイメージ。E) D に示すように強調表示された線に沿って振動の Kymograph)。F)画像と D に示すように時系列の平均蛍光強度の分布) microcompartment 極で極大値と極小区画の中央には、タンパク質のグラデーションを明確にします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 否定的な実験結果の例です。A)過剰洗浄膜小胞の付着につながる最適な小胞の準備と脂質組成穴を蓄積されます。中央の 2 つのパネルは、問題となる表示分振動を観察する方法の両方の組み合わせを示します。膜が 0.05% で標識された Atto655 ドープ。(バーをスケール: 50 μ m)B)上部パネル: 乾燥してあまりにも多くのバッファー除去またはバッファーが時間の経過とともに蒸発するとき、microcompartments が発生することが。底板: ウエファーの生産や PDMS 成形中に不完全なコンパートメントを形作ることができます。(バーをスケール: 30 μ m)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
1 の補足ファイル:彼の心のためのプラスミド マップ。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
2 の補足ファイル:彼の EGFP 心のプラスミド マップ。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
3 の補足ファイル:彼の mRuby3 心のプラスミド マップ。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
4 の補足ファイル:その鉱山のプラスミド マップ。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
5 の補足ファイル:彼ミンツのプラスミド マップ。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
6 の補足ファイル:Microcompartments のロッド型のシリコン基板の CAD ファイルです。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Discussion
プロトコルを説明しました MinCDE 平面上の自己組織化の in vitro再構成サポート脂質二重膜、脂質二分子膜覆われて立体構造 PDMS 微細構造の棒形の例を使用します。これらの試金から貴重なデータを取得するために制御する最も重要な要因、蛋白質および膜の品質です。
蛋白質、蛋白質品質を確実に SDS-PAGE と質量分析法を使用して質量を確認する必要があります。さらに、タンパク質、水溶性いない集計データ、分析ゲルろ過や動的光散乱による検証する必要があります。ゲル濾過法は、タンパク質の集約された端数を削除する使用できます。慎重な pH 調整と追加されたヌクレオチドの質が重要なタンパク質に非調整または部分的に劣化したヌクレオチドの付加として株式や自己組織化の試金は蛋白質の活動、そのため廃止を除去するために十分です自己組織化。
蛋白質品質の横にある膜の品質は最も重要な不適切な膜形成はほとんどの場合、欠陥の自己組織化と artefactual 表面構造の起源のための原因。
初めてのプロトコルを実行している場合、人工脂質膜を含む低モル パーセントの Atto-655-ドープなど DiI 標識脂質 (0.05%) でラベル付けに便利です。それによりプロパティおよび膜の品質は直接判断することができます。FRAP を用いた膜の流動性を評価できます。さらがいずれかのすべてでは、あまりにも多くの小胞やないの流体膜ない膜になる洗浄されている場合、直接、SLB の洗浄品質を評価 1 つできます。開いた区域により厳密な膜を洗浄して、それゆえまた、SLB の表面に付着、小胞を削除します。クリーニングと支持面と正しいサイズの親水性、対SU の均質性膜は、流体と同質の脂質を取得するための最も重要な要因それは SUV サイズとサイズ分布を使用してチェックすると便利することができます。動的光散乱します。狭い粒径分布、膜小胞を押し出すのではなく、sonicating それらをお勧めします。クリーニング coverslips、強塩基、基本的な洗剤または水で洗浄した後に直接 coverslips を使用してトリートメントなどの他の方法は、アプリケーションと脂質の混合物によって、良好な結果をもたらす可能性があります。
紹介、オープンの部屋で平面のサポートされている脂質膜の in vitro再構成プロトコルの最初の半分が全反射顕微鏡30、FRAP などの光学系のアクセス可能な表面のレンダリングの利点分析6、単一粒子追跡原子間力顕微鏡26など表面プローブ技術と同様に、34。大均一領域で定義された濃度でより良い統計できます。さらに開いた区域アプローチは蛋白質の集中そしてさらにコンポーネント、それゆえシングルチャンバー20の蛋白質の集中を滴定する許可を迅速かつ簡単な追加を正確に制御できます。アッセイは、FtsZ22,35、ZipA22キメラタンパク質 FtsZ YFP MTS10,35など他の細菌 divisome のコンポーネントを追加して拡張できます。
他のグループは、分システム、体外、代わりに開いた区域17,18,19使用流体セルの再構成に似たようなアプローチをとっています。フロー セル利点がある、特に完全に囲まれた 3 D 環境が必要な18、流れ17,19,23の影響または膜組成23 MinCDE のパターンには調査、または蛋白質パターンは、タンパク質制限条件19の下で観察される場合。それにもかかわらず、分子の濃度の局所制御が難しくなります。膜に強く結合するタンパク質成分、特に心、彼らの出会い18,19。私たちの経験では蛋白質は頻繁チューブ、入り江、注射器やその他のマイクロ部品に非特異的結合を展示します。したがって、ローカル蛋白質濃度入力濃度18とは異なります、またフローセル、19他の人によって観測されたさまざまな異なるタンパク質パターンの入口と出口の間膜上の結果の長さの異なります。
2 番目のプロトコルの半分は、ここで提示棒状組織脂質で覆われているパターンのサポートに開いた区域アプローチを再使用の in vitro再構成膜は、生体内の蛋白質の動作の単純な模倣にもかかわらず蛋白質濃度を正確に制御がバッファー除去のため失われます。だの波長は約 1 桁大きい体外体内より棒状 microcompartments がについて 1 つ桁違いに大きい (10 x 30 μ m) 棒状大腸菌よりもセルに注意してください。
全体的に、このプロトコルは、タンパク質濃度、バッファー組成、膜特性を含むすべての条件を正確に制御できます。3 D の構造化されたサポート使用する空間拘束、生体内の複雑なマイクロ流体装置を必要とせず動作を模倣に師事する反応。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
私たちはマイケル ・ ヘイマンに感謝し、フランク入植者のケイ素の生産のためのウェーハ、コア施設 MPI-B 蛋白質の浄化およびサイモン クレッチマーの支援のため、原稿のコメントのレオン ・ ハリントン。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| DOPG | Avanti Polar Lipids | 840475 | |
| E.coli polar lipid extract | Avanti Polar Lipids | 100600 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate | Roche | ||
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma | A5285-1G | |
| Sodium chloride | VWR | 27810.295 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| Tris-base | Sigma Aldrich | T1503-1kg | |
| Hydrochloric acid | Roth | 9277.1 | |
| TCEP-HCl | Termo Fisher Scientific | 20491 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetate | Merck Millipore | 1.08418.1000 | |
| Sulfuric Acid 98% | Applichem | 173163.1611 | |
| Hydrogen Peroxide 50% | Applichem | 147064.1211 | |
| HEPES | Biomol | 05288.1 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 102950 | Uvasol |
| Glycerol 86% | Roth | 4043.1 | |
| TB medium | |||
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roth | 2316.x | |
| Atto-655-DOPE | Atto Tec | AD 655-161 | |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| PDMS base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| PDMS crosslinker | Dow Corning Corporation | ||
| Materials | |||
| UV Glue | Norland Products | 6801 | #68 and #63 both work well |
| Coverslips #1.5 24x24 mm | Menzel Gläser | ||
| Coverslips #1 24x24 mm | Menzel Gläser | used only for PDMS microstructures | |
| 0.5 ml reaction tube | Eppendorf | 0030123301 | |
| culture flask 2L | Corning | e.g. 734-1905 | |
| His-Trap HP | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column | Biorad | 7322010 | |
| dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL | Termo Fisher Scientific | 66333 or 66330 | |
| razor blade | |||
| Instruments | |||
| ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems | Merck | ||
| automated protein purification system: Äkta Pure | GE Healthcare Life Sciences | ||
| bath sonicator | Branson | e.g. Model 1510 | |
| ARE-250 mixer | Thinky Corporation | ||
| Plasma cleaner Zepto | Diener electronic | use oxygen as process gas | |
| positive displacement pipettes | Brand | Transferpettor models with glass tips | |
| LSM780 confocal laser scanning microscope | Zeiss | Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective | |
| Plasmids | |||
| pET28a-His-MinD_MinE | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield | |
| pET28a-His-MinE | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinE | |
| pET28a-His-EGFP-MinD | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-EGFP-MinD | |
| pET28a-His-mRuby3-MinD | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-mRuby3-MinD | |
| pET28a-His- MinC | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinC |
References
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