Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Published: July 28, 2018 doi: 10.3791/58139
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry
* These authors contributed equally

Summary

Wij bieden een protocol voor in vitro zelforganisatie testen van geest en mij op een ondersteunde lipide dubbelgelaagde in een open huis. Daarnaast beschrijven we hoe omsluiten de bepaling in lipide-geklede PDMS microcompartments na te bootsen in vivo voorwaarden door reactie opsluiting.

Abstract

Veel aspecten van de fundamentele Spatio organisatie van cellen worden beheerst door reactie-diffusie type systemen. In vitro reconstitutie van dergelijke systemen voorziet in gedetailleerde studies van hun onderliggende mechanismen die zou niet haalbaar in vivo. Wij bieden hier, een protocol voor het in vitro reconstitutie van het MinCDE systeem van Escherichia coli, die de posities van de celdeling tussenschot in het midden van de cel. De bepaling is ontworpen voor het leveren van alleen de benodigde onderdelen voor zelf-organisatie, namelijk een membraan, de twee eiwitten geest en mijne en energie in de vorm van ATP. Wij fabriceren daarom een kamer open reactie op een dekglaasje aan, waarop een ondersteunde lipide dubbelgelaagde wordt gevormd. Het open ontwerp van de kamer zorgt voor optimale voorbereiding van het lipide dubbelgelaagde en gecontroleerde manipulatie van de inhoud van de bulk. De twee eiwitten, gedachten en mij, evenals ATP, worden vervolgens toegevoegd in de bulk-volume boven het membraan. Beeldvorming is mogelijk door het vele optische microscopies, als de ontwerp ondersteunt confocal, breed-gebied en TIRF microscopie gelijk. In een variatie van het protocol, wordt de lipide dubbelgelaagde gevormd op een patroon ondersteuning, op cel-vormige PDMS microstructuren, in plaats van glas. Het verlagen van de bulk oplossing aan de rand van deze compartimenten omsluit de reactie in een kleinere compartiment en biedt grenzen waarmee het nabootsen van in vivo oscillerende gedrag. Tezamen, beschrijven we protocollen om te reconstrueren van het MinCDE systeem zowel met als zonder ruimtelijke opsluiting, waardoor onderzoekers precies alle aspecten patroonformatie, zoals concentratie bereiken en toevoeging van andere factoren beïnvloeden beheren of eiwitten, en systematisch toe de complexiteit van het systeem in een relatief eenvoudige experimentele opzet.

Introduction

Spatio patronen zijn essentieel in de natuur, reguleren beide complexe taken op meercellige en cellulaire niveau van voedselproductie aan gereglementeerde celdeling1,2. Reactie-diffusie systemen spelen een belangrijke rol bij de vaststelling van deze patronen, maar zijn nog steeds niet goed begrepen. Een schoolvoorbeeld van een reactie-verspreiding en het beste gekarakteriseerd biologische systeem is tot nu toe de Escherichia coli MinCDE systeem3,4,5,6,7. Het MinCDE systeem oscilleert vanaf pole van cel naar cel pool in E. coli om te bepalen van het midden van de cel als de toekomstige indeling site. Dit systeem is gebaseerd op de ATPase-geest, het activeren van eiwit, MinE, en het membraan als een ruimtelijke reactie matrix8ATPase. MinC maakt geen deel uit van het mechanisme voor de vorming van patroon, maar is de werkelijke functionele agent: een inhibitor van de omwenteling van het voornaamste divisome eiwit FtsZ5,6. MinC bindt aan gedachten en daarom volgt de oscillaties, resulterend in een tijd-gemiddeld eiwit concentratie verloop dat is aan de Polen van de cel maximale en minimale op het midden van de cel, waardoor alleen FtsZ te polymeriseren in midcell9,10 . Het MinCDE-systeem maakt deel uit van de grotere familie van Walker A ATPases die zijn de sleutel tot de spatio organisatie in bacteriën2, voor positioneren en transporteren van eiwitten complexen11 en plasmiden12 en voor het reguleren van de cel afdeling13 en chromosoom segregatie14. Vandaar, de MinCDE reactie-diffusie systeem niet alleen vertegenwoordigt een archetypische reactie-diffusie-systeem, maar ook de aandacht getrokken vanwege de relevantie ervan voor de spatio organisatie bij bacteriën.

Gedetailleerde functionele studies van het MinCDE systeem in vivo zijn ingewikkeld, aangezien manipulatie van eiwitten en gene verwijdering meestal resulteren in defecten van de celdeling. Bovendien verandert de samenstelling van het membraan of de eigenschappen van het cytosol in vivo is zeer uitdagend15,16. Wijzigingen in het systeem en het beïnvloeden van de factoren zijn moeilijk te interpreteren in de complexe omgeving van de cel, nog meer als het wordt verstoord in deze een wezenlijke functie als celdeling. Wij en anderen hebben daarom wendde zich tot een in vitro reconstitutie aanpak, vermindering van het systeem tot de kernonderdelen: MinD, mijne, ATP als energiebron en de ondersteunde lipide dubbelgelaagde als een reactie matrix6,17, 18. deze bottom-up benadering maakt het mogelijk om de sonde van het mechanisme van zelforganisatie in detail zonder de complexiteit van een levende cel. De eiwitten vorm reizen oppervlak golven6 en andere soorten patronen17,19 onder deze omstandigheden, zij het met een golflengte dat is meestal over een omvang die groter is dan in vivo. Het gebruik van een open kamer vergemakkelijkt precieze controle over alle aspecten beïnvloeden patroonformatie: eiwit concentraties6, eiwit eigenschappen20membraan samenstelling10, buffer samenstelling en ATP concentratie 6, evenals toevoeging van andere factoren, zoals verdringing agenten21 en andere divisome eiwitten22. Ter vergelijking: de reconstitutie in vitro van het systeem van de MinCDE in een flow-cel18,19,23 kan worden gebruikt om de sonde van de invloed van stroom17,23, eiwit beperking van voorwaarden19, membraan samenstelling19 en volledige 3D opsluiting18 op eiwit patronen, maar maakt een exacte controle van eiwit/component concentratie en sequentiële component toevoeging veel meer ingewikkeld.

Met behulp van dit open huis, we ook het patroon van de steun van de bilayers van de vlakke lipide waaraan kan een sonde hoe geometrische grenzen invloed patroon formatie21, een fenomeen dat onlangs heeft ook al onderzocht in vivo met behulp van bacteriën gegoten in microstructuren7. Wij ook gebruikt deze test om te onderzoeken hoe gedefinieerde mutaties in de mijne patroonformatie van de invloed van het systeem20. Bovendien, dezelfde fundamentele assay indeling heeft gewerkt om te onderzoeken hoe patroonformatie kan worden gecontroleerd door het licht, invoering van een azobenzeen-kruisverwijzende MinE peptide in de test en imaging met TIRF microscopie24.

We vonden dat, om te repliceren de MinDE patroon formatie waargenomen in vivo in een systeem, in vitro opsluiting was sleutel. Met behulp van staafvormig microcompartments, met de afmetingen aangepast aan de grotere golflengte van MinDE in vitro (10 x 30 µm), bekleed met een ondersteunde lipide dubbelgelaagde toegestaan de reconstitutie van MinDE paal-aan-polig oscillaties en eiwit kleurovergang vorming 10,25. In deze test, zijn de ondersteunde lipide-bilayers gestort op een patroon PDMS substraat waarin verschillende honderd replica's van staafvormig microcompartments dat aan de bovenkant open blijven. De reactie kan worden ingesteld in een open zaal door dit, en vervolgens de buffer is verlaagd tot de rand van de microcompartments, waardoor de reactie op een klein volume beperken. Hoewel deze compartimenten beschikt over een lucht-buffer-interface aan de ene kant en vandaar niet een volledige 3D opsluiting door membraan vertegenwoordigen, deed de dynamiek van de eiwitten in vivo oscillaties10,25. Vergeleken met volledige 3D opsluiting, waaruit blijkt zeer vergelijkbaar18resultaten, de open microstructuren assay is relatief eenvoudig en gemakkelijk te verwerken en kunnen ook worden uitgevoerd door laboratoria die niet zijn uitgerust met apparatuur van de gespecialiseerde microfluidics en schoon-kamervoorzieningen.

Hier presenteren we een experimenteel protocol voor de bijenpopulatie patroonformatie op ondersteund lipide bilayers in vitro met behulp van een open kamer die voor controle van alle onderdelen en gemakkelijke toegang door optische microscopie en, met minderjarige zorgt MinCDE wijzigingen, is ook geschikt voor oppervlakte-sonde technieken26. Naast vlakke ondersteunde lipide bilayers, we laten ook zien hoe eiwitten opsluiting kan worden verkregen met behulp van eenvoudige patroon ondersteunde lipide bilayers op staafvormig PDMS microstructuren. Deze testen, kunnen hoewel geoptimaliseerd voor het MinCDE-systeem, ook worden overgedragen aan andere eiwit-systemen die op een soortgelijke manier met het membraan, zoals FtsZ27 of een minimale actine cortex28 werken.

Protocol

1. de eiwitproductie

  1. Eiwit expressie
    1. Transformeren van E. coli BL21 (DE3) pLysS met de respectieve plasmide voor uitdrukking van gedachten6, EGFP-MinD29, mRuby3-MinD24, mijn6 of MinC30. Zie aanvullende informatie voor plasmide kaarten.
    2. Een overnachting cultuur in LB medium met een één kolonie met behulp van de respectieve antibiotica (b.v.,100 µg/mL ampicilline of 50 µg Mo/mL kanamycine) beënten en incuberen bij 37 ° C gedurende 14-16 h terwijl het schudden.
    3. TB opslagmedium met het respectieve antibioticum met de nachtelijke cultuur (1:200 verdunning) 500 mL beënten en incuberen cultuur bij 37 ° C terwijl het schudden bij 180 t/min.
    4. Induceren van eiwit expressie door toevoeging van 0,5 mM IPTG wanneer de cultuur een optische dichtheid bij 600 bereikt nm van 0,5-0,7. In geval van EGFP-MinD of mRuby3-geest, cellen verschuiven naar een broedmachine met 16 ° C en groeien van cellen voor 14-16 h, en in het geval van MinC, geest of MinE, groeien van cellen voor 3-4 uur bij 37 ° C na inductie.
      Opmerking: Inductie van MinC, geest of MinE expressie is giftig voor de cellen, als overexpressie resultaten in celdeling gebreken; Vandaar, is het belangrijk dat de incubatietijd bij 37 ° C wordt gehouden onder 4 h. Als meer eiwit nodig is, verhoging van het bedrag van de cultuur, maar niet de incubatietijd.
    5. Nadat de respectieve incubatietijd oogsten van cellen door centrifugeren bij 4000 x g gedurende 10 minuten en op te slaan van de cel pellet-80 ° c tot verder gebruik.
  2. Eiwitreiniging
    Opmerking: Eiwitten kunnen worden gezuiverd met behulp van voorverpakte Ni-NTA kolommen op een geautomatiseerde eiwit zuivering systeem of met behulp van Ni-NTA kralen voor de zwaartekracht-flow Bank zuivering.
    1. Voor zuivering met voorverpakte Ni-NTA kolommen op geautomatiseerde eiwit zuivering systemen gebruik buffer A1 (50 mM natriumfosfaat pH 8.0, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol), buffer B1 (50 mM natriumfosfaat pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol) en buffer C1 (50 mM natrium fosfaat pH 8.0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol). Voor de zwaartekracht-flow Bank zuivering met behulp van Ni-NTA kralen gebruiken buffer A2 (50 mM Tris-HCl pH 8,0 300 mM NaCl, 10 mM imidazol), B2 (50 mM Tris-HCl pH 8,0 300 mM NaCl, 20 mM imidazol) buffer en buffer C2 (50 mM Tris-HCl pH 8,0 300 mM NaCl, 250 mM imidazol). Aanvulling op alle buffers met 10 mM ß-mercaptoethanol of 0,4 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) als reductiemiddel vlak voor gebruik.
    2. Resuspendeer cellen in 20-30 mL buffer A1 of A2 aangevuld met EDTA-vrije proteaseinhibitor, 100 µg/mL lysozym, ~ 250 U/mL DNase en 0,2 mM Mg2 +- ADP (Mg2 +- ADP in geval van geest of EGFP-MinD zuivering alleen uit een 100 mM ADP voorraad in 100 mM MgCl 2 met pH aangepast aan 7.5).
    3. Lyse cellen met behulp van een tip ultrasoonapparaat (30% amplitude, 2,5 min, 30 s pols, 30 s af) terwijl de flacon met de cellen in een ijsbad.
    4. Verwijderen van puin van de cel door centrifugeren van de cel lysate voor 45 min bij 25.000 x g- en 4 ° C.
    5. Incubeer het supernatant op Ni-NTA kolom of Ni-NTA kralen.
      1. Bij voorverpakte Ni-NTA kolommen, plaatst u het monster op de kolom met behulp van de steekproef pomp van een geautomatiseerde eiwit zuivering systeem.
      2. Voor de zuivering van de Bank-top, Incubeer het monster met Ni-NTA kralen in een tube van 50 mL reactie op een roterende shaker bij 4 ° C gedurende 1 uur. Breng de Ni-NTA kralen in een lege kolom met behulp van een precisiepipet 25 mL voor de daaropvolgende stappen.
    6. Wassen met ten minste 5 kolom hoeveelheid buffer A1 of A2.
    7. Wassen met ten minste 5 kolom hoeveelheid buffer B1 of B2.
    8. Elueer eiwit met buffer C1 of C2.
    9. Eiwit zuiverheid via SDS-pagina te beoordelen.
    10. Optioneel: Zuiveren verder eiwit door het toe te passen op een gel filtratie kolom geëquilibreerd in opslag buffer (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP, (0,2 mM Mg2 +- ADP in geval van geest) van 10% glycerol).
      Opmerking: Gel filtratie wordt aanbevolen voor geest geaggregeerde eiwitoplossing verwijderen.
    11. Indien geen gel-filtratie wordt gebruikt, wisselen Ni-NTA elutie buffer aan opslag buffer (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glycerol, 0.1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP, (0.2 mM Mg-ADP in geval van geest)) met behulp van een zwaartekracht flow demineralisatie kolom (Zie Tabel van materialen).
    12. Schok-freeze eiwitten in porties in vloeibare stikstof en winkel bij-80 ° C tot verder gebruik.
    13. Voorraad eiwitconcentratie met behulp van de analyse van Bradford meten en bepalen eiwit activiteit met een ATPase assay20.
      Opmerking: Beoordeelt niet de eiwitconcentratie met behulp van absorptie op 280 nm. De aanwezigheid van nucleotide tijdens het zuiveringsproces ongehinderd de geest en het gebrek aan tryptophans in de mijne verstoren een280 concentratie metingen. Gebruik Bradford of BCA testen voor het meten van de concentraties van de eiwitten in plaats daarvan.
  3. Labelen van eiwit
    Opmerking: De samensmelting van een fluorescente proteïne aan de kleine eiwit mijne induceert belangrijke veranderingen tot haar diffusive eigenschappen en functie; Vandaar, chemische labeling van het eiwit (cysteïne op positie 51) heeft de voorkeur over fusie aan fluorescerende eiwitten.
    1. Los van 0,125 mg voor maleimide-kleurstof conjugate in 5-10 µL van DMSO (dimethylsulfoxide) en voeg onder schudden een 0,5 ml mijne aliquoot in opslag buffer met een pH van 7,2, bereid als hierboven beschreven.
    2. Incubeer gedurende 2 h naar girale bij 4 ° C of 2 h op RT onder zacht schudden of roeren.
    3. Aparte kleurstof en eiwit met behulp van een stroom van de zwaartekracht ontzouten kolom geëquilibreerd met opslag buffer (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glycerol, 0.1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP).
    4. Schakel verder niet-vastgemaakte kleurstof, dialyze het eiwit tegen een overmaat van opslag buffer.
    5. Controleer geslaagde etikettering door het meten van de extinctie bij het maximum voor de respectieve kleurstof en berekenen van de geschatte labeling efficiëntie. Raadpleeg de instructies van de fabrikant van de kleurstof voor een gedetailleerde protocol op het schatten van de mate van labeling. Analyseren met SDS-pagina en te bepalen van de totale massa van massaspectrometrie voor verdere nuttige informatie over monster homogeniteit en labeling succes.

2. kleine Unilamellar Vesikel (SUV) voorbereiding

  1. Generatie van multilamellar blaasjes
    1. Bereken de hoeveelheid lipid(s) in chloroform voor uw gewenste mengsel en SUV eindvolume. De concentratie moet 4 mg/mL van lipiden in Min buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.5, van 150 mM KCl, 5 mM MgCl2). Voor een standaard Min assay is een mengsel van 7:3 DOPC:DOPG (mol procent) aanbevolen. Met behulp van E. coli polar lipide uitpakken, voor alle stappen van de voorbereiding SLB buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.5, van 150 mM KCl) gebruikt.
      Opmerking: Het is niet aanbevolen voor beginnende gebruikers te gebruiken van E. coli polar lipide extract als de generatie van homogene SLBs met dit mengsel veel moeilijker is.
    2. Met behulp van een pipet volumetrische met glas tips, meng de lipiden in chloroform in een 1,5 mL glazen ampul.
      1. Droog de lipiden onder een lichte stikstof stroom terwijl langzaam verandert de flacon. Plaats de lipiden onder een sterkere stikstof stroom gedurende 10 tot 20 minuten. Plaats de ampul met de gedroogde lipide-film in een vacuüm exsiccator en vacuüm voor ten minste 1 uur toe te passen.
    3. Hydrateren de lipiden in Min buffer door vortexing bij kamertemperatuur totdat het mengsel homogeen ondoorzichtig is.
      Opmerking: Voor de opwekking van kleine unilamellar blaasjes uit multilamellar blaasjes, lipiden kunnen ofwel worden geëxtrudeerd zoals beschreven in punt 2.2. of sonicated zoals beschreven in punt 2.3. Extrusie levert in het algemeen een smallere grootteverdeling die met de vorming van ondersteunde lipide bilayers helpen kan.
  2. SUV voorbereiding door extrusie
    1. Breken van lipide aggregaten en multilamellar structuren en verder solubilize lipiden door voor 7 tot en met 10 cycli bevriezen-ontdooien.
      1. Bereiden een bekerglas met water bij 70° C tot 99° C op een hete plaat en een container met vloeibare stikstof.
      2. Houd de flacon in vloeibare stikstof met grote pincet totdat de stikstof niet meer koken. Breng het flesje om warm water totdat de oplossing is volledig ontdooid. Herhaal deze stappen totdat het mengsel lipide duidelijk voor het oog, afhankelijk van het mengsel blijkt.
    2. Monteren van een lipide extruder en vooraf spoelen van het systeem met Min buffer. Het lipide-mengsel tussen 35 en 41 maal door middel van een membraan van 50 nm poriegrootte extruderen. Zorg ervoor dat eindigt op een oneven aantal passen om te voorkomen dat aggregaten die nooit het membraan doorkruist.
  3. SUV voorbereiding met het ultrasoonapparaat
    1. Beter los stelt lipiden in de buffer, zet de glazen ampul met de oplossing in een warmte blok u op 37 ° C en vortex elke 20 minuten gedurende 1 minuut. Incubeer in totaal voor ongeveer 1U.
    2. Dompel de bodem van de ampul in een ultrasoonapparaat bad (in dit werk 1.91 L, 80 W) door het aanbrengen van de flacon op een stand van de klem op de gewenste hoogte.
    3. Instellen van het waterniveau in het bad ultrasoonapparaat zodat de oplossing rond de flacon grondig wordt geschud door de pulsen en bewerk ultrasone trillingen ten het lipide-mengsel voor ongeveer 20 minuten. Selectievakje voor succesvolle ultrasoonapparaat door de helderheid van lipiden te bepalen.
  4. SUV's kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor maximaal een week of bevroren bij-20 ° C in kleine porties (~ 20 µL) en verschillende weken bewaard. Flesjes of buizen op kamertemperatuur ontdooien en bewerk ultrasone trillingen ten opnieuw zoals beschreven onder 2.2.3 of 5.3 totdat de oplossing helder is, voordat het gebruik van SUV's voor bereiding van lipide bilayers (SLBs) ondersteund. Houd er rekening mee dat de smalle grootteverdeling van SUV's door extrusie verkregen is verloren na ontdooien en bevriezen en de daaropvolgende ultrasoonapparaat.

3. het reinigen van glas Coverslips

Opmerking: Reinigings- en hydrophilization van glas-coverslips is een belangrijke factor voor homogene en vloeiende ondersteunde lipide bilayers. Glazen coverslips kan worden gereinigd met behulp van een oplossing van de piranha, gemaakt van een verhouding van 7:2 zwavelzuur, 50% waterstofperoxide (3.1), of met een zuurstof-plasma in een plasma reiniger (3.2). Beide methoden oplevert vergelijkbare resultaten.

  1. Piranha reiniging van coverslips
    1. Piranha-oplossing toepassen
      1. Glazen coverslips op een omgekeerde glazen petrischaaltje of andere inerte oppervlak verdelen. Met een glazen pipet, voeg 7 druppels geconcentreerd zwavelzuur (98%) naar het midden van elke dekglaasje aan.
        Let op: zwavelzuur is sterk zuur en bijtende. Werken in een zuurkast en met de juiste beschermende uitrusting alleen.
      2. Voeg twee druppels 50% waterstofperoxide aan het midden van de zure druppels.
        Let op: waterstofperoxide is corrosief voor de ogen en de huid.
      3. Bedek de reactie en incubeer gedurende ten minste 45 minuten.
        Opmerking: De maximale wachttijd hier is niet essentieel is voor de uitkomst van het experiment en tot enkele dagen kan worden verlengd.
    2. Wash piranha gereinigd coverslips.
      1. Pak de coverslips individueel met pincet en zuur met ultrazuiver water afspoelen. Plaats de gewassen coverslips in niet-stick houders of soortgelijk apparaat van vervoer.
      2. Spoel elke dekglaasje aan uitgebreid met ultrazuiver water en droog het oppervlak met hydrofoor gas (stikstof, lucht alleen als olie-vrij). Markeer de schoongemaakte kant van het dekglaasje aan met permanente marker.
  2. Plasma reiniging van coverslips
    1. Coverslips met overtollige ethanol en daarna met overtollige ultrazuiver water spoelen. Droge coverslips met hydrofoor gas. Assembleren kamer zoals beschreven in 4.
    2. Na montage van de kamer als bedoeld in 4 Neem de coverslips met bijgevoegde kamer en plaats in het plasma schoner met zuurstof als proces gas. Schoon coverslips met plasma (in dit werk 30% stroom, 0.3 mbar zuurstof druk voor 1 min werd gebruikt). De schoonmaak doen vlak voordat SLB vorming zoals beschreven in 5, als het hydrophilizing effect van plasma reiniging na verloop van tijd verdwijnt.
      Opmerking: Timing en kracht van plasma reiniging moeten worden geoptimaliseerd met behulp van fluorescently geëtiketteerde membranen, als te weinig of excessieve plasma schoonmaken kan zowel leiden tot immobiel membranen of membranen met gaten.

4. kamer vergadering

  1. Met een scherpe schaar, afgesneden en het deksel en de kegelvormig deel van een 0,5 mL reactiebuis negeren. UV-lijm toepassen op de bovenste rand van de buis en gelijkmatig verdelen met behulp van een pipet tip.
  2. Lijm de buis ondersteboven aan de eerder schoongemaakte dekglaasje aan. Zorg ervoor dat lijm deze aan de schone kant van het glas in het geval van de piranha schoonmaken. De UV-lijm genezen door het plaatsen van meerdere kamers onder een 360 nm lamp of LED voor 5 tot 15 minuten.

5. ondersteunde lipide dubbelgelaagde (SLB) vorming

  1. Verwarm de warmte blok tot 37 ° C en 2 mL reactie buizen met Min of SLB buffer, 1 tube per kamer uit te broeden.
  2. Klap stikstof in de geassembleerde en genezen kamers te verwijderen van stof of andere deeltjes die kunnen hebben vereffend tijdens het UV-uitharden en de assemblage. Plasma schoon zoals beschreven in punt 3.2, als u niet uw coverslips met Piranha-oplossing (3.1) hebt schoongemaakt. Plaatsen kamers op warmte blok.
  3. Een hoeveelheid van 20 µL van duidelijke lipiden (op 4 mg/mL) met 130 µL van Min buffer of SLB buffer in het geval van E. coli polar lipide extract, opbrengst van een concentratie van de werken van 0.53 mg/mL verdund. In het geval dat lipiden zijn bevroren, bewerk eerst ultrasone trillingen ten door de buis te houden in een bad ultrasoonapparaat voordat buffer wordt toegevoegd, dan bewerk opnieuw ultrasone trillingen ten met buffer.
  4. 75 µL van lipide mengsel toevoegen aan elke kamer en een timer instelt op 3 minuten (voor DOPC/DOPG mengsels; langer incubatie nodig kan zijn voor andere lipide-mengsels). In het geval van E. coli polar lipide extract, Pipetteer CaCl2 uit een voorraad van 100 mM in de kamer om een eindconcentratie van 3 mM. Tijdens de incubatietijd, de blaasjes barsten op de hydrofiele glasoppervlak en zekering om te vormen van een coherente SLB.
  5. Na zestig seconden toevoegen u 150 µL van Min buffer aan elke kamer.
  6. Wassen van de kamers: nadat een andere 120 seconden (3 minuten totale) elke kamer door toe te voegen 200 µL van Min of SLB buffer, wassen zorgvuldig pipetteren omhoog en omlaag een paar keer, verwijderen en toevoegen van een andere 200 µL.
    1. Na elke kamer een keer wassen heeft, gaat u verder met de eerste kamer grondig wassen tot de 2 mL buffer zijn opgebruikt. Wassen van SLBs moet enige ervaring te perfectioneren van de omvang van de bewegingen in de kamer en het vinden van de juiste wassen intensiteit.
      Opmerking: Verwijder nooit alle vloeistof uit de zaal om te voorkomen dat het drogen van de SLB.
      Opmerking: Op de top van wassen, membraan eigenschappen is afhankelijk van veel meer factoren: Type van lipiden en hun relatieve concentraties in lipide mengsels, voorbereiding methode voor SUV's, oppervlakte behandeling en voorafgaande schoonmaken van ondersteuning.

6. zelforganisatie Assay

  1. Volume van de buffer in de zaal aan 200 µL Min buffer verminderd met de hoeveelheid eiwitten en ATP oplossing, dan toevoegen van gedachten, het label van de geest, de mijne, en, indien gewenst, MinC. Voorzichtig mengen van componenten door pipetteren. Voorbeeld concentraties zijn 1 µM MinD (doped met 30% EGFP-MinD), 1 µM MinE (doped met 10% chemisch label mijne) en 0.05 µM MinC, maar patronen vormen over een bereik van concentraties6,10,20,30 .
  2. 2.5 mM ATP (van 100 mM ATP voorraad in 100 mM MgCl2, pH 7.5) om te beginnen met de zelforganisatie van MinDE toevoegen.
    Opmerking: De volgorde van de toevoeging van de component (Psyche, MinE en ATP) kan worden gevarieerd en zal geen invloed hebben op de uiteindelijke patroon resultaat4.
  3. Observeren van MinDE zelforganisatie op de fluorescentie Microscoop (Zie Tabel van materialen). MinDE zelforganisatie kan ook worden waargenomen met behulp van microscopie van TIRF. Gebruik voor imaging eGFP-MinD, 488 nm Argon laser of een vergelijkbare diodelaser (bijvoorbeeld 490 nm). Voor imaging mRuby3-geest is het het beste om een 561 nm diodelaser in dienst.
    Opmerking: Voorkomen dat hoge niveaus van excitatie voor langere tijden als wij en anderen hebben17 fototoxiciteit waargenomen in de MinDE systeem, wat leidt tot polymerisatie van onomkeerbare eiwit op de membraan.

7. PDMS microstructuren

Opmerking: PDMS (Polydimethylsiloxaan) is een polymeer dat kan worden gebruikt voor de productie van microstructuren en microfluidic apparaten. Een patroon silicium wafer fungeert als een mal voor het gieten van het PDMS structuren. De PDMS structuren dan dienen als ondersteuning voor SLB vorming en gehaltebepaling van setup.

  1. Ofwel produceren silicium wafer met microcompartments zelf met behulp van fotolithografie (Zie Zieske en Schwille voor een gedetailleerde protocol31 of Gruenberger, et al. voor een video protocol32) of bestel uw gewenste silicium wafer uit een gieterij . Zie aanvullende informatie voor het patroon van het zegel gebruikt hierin.
  2. Productie van PDMS microstructuren van patroon silicium wafers.
    1. Gebruik een plastic beker te weeg 10 g voor PDMS base en 1 g PDMS crosslinker. Ofwel gebruik van een menginrichting te mengen en ontgas het PDMS mengsel of handmatig mengen de PDMS en vervolgens ontgas onder vacuüm.
    2. Gebruik een pipet tip te laten vallen een kleine hoeveelheid PDMS direct op de structuur op de silicium wafer.
      Opmerking: Wees voorzichtig niet te krabben het silicium wafer.
    3. Onmiddellijk een dekglaasje #1 aan op de daling van de PDMS plaats en neem het bovenste uiteinde van een tip van de schone pipet zachtjes drukken het dekglaasje aan op het silicium wafer. De PDMS moet dun worden verspreiding tussen het dekglaasje aan en het silicium wafer.
    4. De wafer met de coverslips in de oven plaatsen en genezen van het PDMS voor 3-4 uur of overnachting bij 75 ° C. Verwijder het zegel uit de oven en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Met een scheermesje, verwijder voorzichtig het dekglaasje aan met de bijgevoegde PDMS van SI wafer.
      Opmerking: Om te verhinderen dat de silicium wafer krijgen vuil of beschadigd, altijd betrekking hebben op de microstructuren met PDMS en een dekglaasje aan. Echter, PDMS leeftijden, resulterend in scheuren in de microstructuren, dus gebruik geen PDMS structuren die ouder dan twee tot drie weken zijn.

8. zelf-organisatie in PDMS microstructuren

  1. Gebruik coverslips met PDMS microstructuren te hechten een kamer als beschreven jonger dan 4 jaar.
  2. Schoon en hydrophilize oppervlak in een zuurstof-plasma reiniger zoals beschreven onder 3.2.2. Doen niet piranha schone PDMS substraten.
  3. Setup een MinDE zelforganisatie test zoals beschreven onder 6.
  4. Na het opzetten van de test, Controleer op regelmatige MinDE patroonformatie en goed gevormde microstructuren op de fluorescentie Microscoop.
  5. Wanneer regelmatige MinDE patronen hebben gevormd (10-30 min), Pipetteer zachtjes op en neer tweemaal te mengen van componenten en verwijder vervolgens de buffer stap voor stap met pipetteren. Het grote merendeel van de buffer met behulp van een precisiepipet µL 100 verwijderen en verwijder daarna voorzichtig de rest met behulp van een precisiepipet 10 µL.
    Opmerking: Deze stap wellicht enige oefening. Als teveel buffer is genomen of het proces te lang duurt, zal de microstructuren worden gedroogd als te weinig wordt genomen, de eiwitten niet zal worden beperkt in de microstructuren, maar blijven vormen reizen oppervlaktegolven.
  6. Onmiddellijk sluit de zaal met een deksel om te voorkomen dat het drogen van de resterende buffer in de microstructuren.
  7. Als u wilt toestaan voor langere imaging tijden, sluit een bevochtigde stukje spons in de kamer en sluit met deksel. Zorg ervoor dat de spons niet contact op met het oppervlak van het dekglaasje aan.
  8. Voor de beeldvorming van de microstructuren controle op het oppervlak dat de buffer genoeg, werd verlaagd, zodat in het oppervlak boven de microstructuren MinDE patroonformatie heeft stopgezet. Afbeelding MinDE oscillaties in microstructuren. Controleer of microstructuren niet zijn uitgedroogd of tijdens imaging zijn uitdrogen.
    Opmerking: Gooit u coverslips met microcompartments na elk gebruik zoals scheuren in de vorm van het PDMS.

9. analyse van MinDE patroonformatie

  1. Kwantificeren golflengte, de snelheid van de Golf en de Golf profielen van de zelforganisatie van MinDE op vlakke ondersteunde lipide bilayers. FIJI met de standaard set van verpakte plugins is voldoende voor basisanalyse33.
  2. Paal-aan-polig oscillaties in microcompartments analyseren door het verkrijgen van kymographs en tijd-gemiddeld eiwit concentratie profielen. Fundamentele kymographs kunnen worden verkregen door het opnieuw snijden een tijdreeks langs een lijn selectie in FIJI.

Representative Results

Eiwitreiniging volgens onze protocol moet Min proteïnen van voldoende zuiverheid opleveren. Als referentie geeft Figuur 1 een beeld van de SDS-pagina van geest, fluorescently geëtiketteerd geest, MinE en MinC. De afzonderlijke stappen van de procedure voor het uitvoeren van een MinDE zelforganisatie assay op niet-patroon ondersteunde lipide bilayers worden beschreven in Figuur 2. Met behulp van dit protocol, kan regelmatige MinDE reizen oppervlakte golven worden waargenomen in de kamer (Figuur 3). De golflengte binnen de kamer kan verschillen, maar in het algemeen lijken er patronen. De randen van de kamer moeten niet worden gebruikt voor de kwantitatieve vergelijkingen, zoals membranen dat formulier op de UV lijm lijken te hebben verschillende eigenschappen dan op het glas oppervlak (Zie Figuur 3 c). De reizende oppervlakte golven kunnen worden geanalyseerd door het uitzetten van de intensiteit in de richting van de voortplanting (figuur 3B). Terwijl de geest fluorescentie randplateau nogal snel uit de voorrand van de Golf en vervolgens sterk afneemt bij de afvallende flank, mijn fluorescentie verhoogt bijna lineair vanaf het begin van de geest-Golf en bereikt zijn maximum na gedachten bij de afvallende flank, waar het aanzienlijk6eraf.

Naast eiwitten de kwaliteit is de kwaliteit van de ondersteunde lipide-bilayers meest kritische voor een regelmatige zelforganisatie van MinCDE. Aan de ene kant als het membraan ook overdreven gewassen wordt of het onderliggende oppervlak heeft zijn gereinigd en dus te sterk belast, gaten kunnen vormen in het membraan (figuur 6A, top). Aan de andere kant het membraan wordt niet goed gewassen of het onderliggende oppervlak niet schoongemaakt/hydrophilized, blaasjes zal vasthouden aan het membraan of de vloeibaarheid membraan zal worden aangetast (figuur 6A, beneden). Hoewel niet zo duidelijk als bij het observeren van het membraan rechtstreeks via gelabelde lipiden, deze problemen kunnen ook worden gedetecteerd van het achterhoofd fluorescentie signaal, zoals patronen niet regelmatig zijn en de fluorescentie in de maxima is niet homogeen, maar bevat "gaten" of heldere vlekken zoals weergegeven in het middelste deelvenster van figuur 6A.

De procedure is voor de MinDE zelforganisatie in staafvormig PDMS microstructuren samengevat in Figuur 4. Verschillende stappen van het protocol hoeft niet te worden herhaald, zoals eiwitten en lipiden kunnen worden hergebruikt. Als op niet-patroon ondergronden, de ondergrond wordt gereinigd en hydrophilized (door plasma-reiniging), een ondersteunde lipide dubbelgelaagde wordt gevormd op het PDMS en de bepaling van zelforganisatie in een volume van 200 µL is ingesteld. Om te controleren dat er een juiste membraan heeft gevormd en MinDE zelf op het membraan organiseert, zijn de kamers beeld. Wanneer een juiste membraan heeft gevormd, MinDE formulieren regular oppervlaktegolven reizen op het oppervlak van het PDMS tussen de individuele microstructuren en zelf ook aan de onderkant van de microstructuren organiseert als de golven vrijelijk kunnen verplaatsen over de hele membraan bedekte oppervlak (figuur 5A). Na verwijdering van de buffer, mag het oppervlak tussen de compartimenten geen eventuele teeltmateriaal MinDE patronen (figuur 5B), tonen als het moet volledig droog zijn. Als MinDE patronen nog steeds zijn, moet meer buffer worden verwijderd. De eiwitten zijn nu in de microcompartments staafvormig beperkt door de membraan beklede PDMS en door de lucht op de bovenste interface (figuur 5C), waarin ze zelf zal organiseren. Onder deze omstandigheden kunnen de twee eiwitten paal-aan-polig oscillaties uitvoeren zoals weergegeven in figuur 5D. Als een fractie van de geest en de mijne altijd membraan-gebonden is, ook zijn tijdens het verwijderen van de buffer, de concentraties na verwijdering van de buffer niet vergelijkbaar is met ingang van concentraties. Als gevolg van dit effect variëren de concentraties ook tussen individuele microstructuren op de dezelfde dekglaasje aan zoals zij zijn afhankelijk van de positie van de patronen voordat zij zijn afgehaald van de buffer. Silicium wafer productie of PDMS molding van het silicium wafer kan leiden tot onvolledige microstructuren die niet kunnen worden gebruikt voor analyse (figuur 6B). Anderzijds te wijten aan de buffer verwijdering microstructuren tijdens het proces kunnen uitdrogen, en dus moeten worden uitgesloten van verdere analyse (figuur 6B). Als gevolg hiervan toont slechts een fractie van de microstructuren in één kamer de gewenste paal-aan-polig oscillaties. Om de dynamiek van de eiwitten in de microstructuren te analyseren, kan een Kymograaf worden verkregen door een selectie te trekken over de gehele structuur (figuur 5E). Wanneer MinCDE oscilleren vanaf pole-naar-pole, zal MinC en geest tonen een gradiënt van de concentratie tijd-gemiddeld met maximumconcentratie aan de Polen compartiment en minimale concentratie in het midden van het compartiment (figuur 5F).

Figure 1
Figuur 1: SDS-pagina met de eindproducten van eiwit zuivering. Zijn-geest (33.3 kDa), zijne-eGFP-MinD (60,1 kDa), zijne-mRuby3-MinD (59,9 kDa), zijne-MinE (13.9 kDa) en zijn-MinC (28.3 kDa) worden weergegeven in volgorde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: proces flow diagram toont de verschillende stappen en de timing van het protocol voor een zelf-organisatie op ondersteunde lipide niet-patroon bilayers (stappen 1-6). Gestippelde vakken geven aan dat een van deze twee opties kan worden gebruikt voor het reinigen. Pijlen gemarkeerd door cirkels geven aan waar het protocol kan worden onderbroken en later hervat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Imaging van MinDE assay door confocale microscopie. A) regelmatige Min spiraal, welke Golfvoortplantingssnelheid, de plot van de intensiteit en de snelheid metingen kunnen worden verkregen. Gebruikte concentraties: 0,6 µM MinD (30% eGFP-MinD), 1.8 µM zijn-MinE (30% zijn-MinE-Alexa647) B) voorbeeld genormaliseerde intensiteit perceel voor de regio gemarkeerd in de A. C) overzicht van hele assay kamer (schaal bar: 1 mm, hetzelfde eiwit concentraties als hierboven). Spiralen draaien beide richtingen evengoed als doel patronen kunnen worden waargenomen. Het vergrote gebied toont hoe golfpatronen verschillen op de UV-lijm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: proces flow diagram toont de verschillende stappen en de timing van het protocol voor zelf-organisatie in staafvormig microstructuren (stappen 1-5, 7, 8). Grijze vakjes geven aan stappen waar producten kunnen worden hergebruikt uit het protocol op niet-patroon ondersteunde lipide bilayers. Pijlen gemarkeerd door cirkels geven aan waar het protocol kan worden onderbroken en later hervat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: representatieve resultaten voor MinDE patroon formatie in staafvormig PDMS microcompartments. A) MinDE zelf organiseren op het oppervlak van het PDMS vormen reizen oppervlakte golven (1 µM MinD (30% EGFP-MinD), 2 µM mijne en 2,5 mM ATP). B) nadat de buffer is verlaagd tot de hoogte van de microstructuren, de zelforganisatie van eiwit stopt op het vlakke oppervlak tussen de microcompartments. C) schematische van een staafvormig microcompartment. D) representatieve beelden van MinDE paal-aan-polig oscillaties na verwijdering van de buffer. E) Kymograaf van de oscillaties langs de gemarkeerde lijn weergegeven in D). F) beeld en profiel van de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde van de tijdreeks weergegeven in D) waaruit duidelijk blijkt het eiwit verloop thats op microcompartment Polen maximale en minimale op compartiment midden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: voorbeelden van negatieve experimentele resultaten. A) te veel gewassen membranen accumuleren gaten, terwijl suboptimaal vesikel preparaten en lipide composities leiden tot vasthouden van de blaasjes. De twee center-panelen tonen een combinatie van problemen en hoe ze worden zichtbaar wanneer observeren Min oscillaties. Membranen zijn geëtiketteerd met 0,05% Atto655-DOPE. (schaal bars: 50 µm) B) BOVENPANEEL: uitgedroogd microcompartments kan worden veroorzaakt door teveel buffer verwijdering of wanneer de buffer na verloop van tijd verdampt. Onderste paneel: onvolledige compartimenten kunnen worden gevormd tijdens wafer productie of PDMS molding. (schaal bars: 30 µm) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende bestand 1: De kaart van de plasmide voor zijn-geest. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 2: De kaart van de plasmide voor zijn-EGFP-MinD. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 3: De kaart van de plasmide voor zijn-mRuby3-MinD. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 4: De kaart van de plasmide voor zijn-MinE. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 5: De kaart van de plasmide voor zijn-MinC. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 6: CAD-bestand voor silicium wafer van staafvormig microcompartments. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

We hebben een protocol beschreven voor de in vitro reconstitutie van zelforganisatie van het MinCDE op vlakke lipide bilayers ondersteunde en in de lipide dubbelgelaagde vallen 3D structuren, met behulp van het voorbeeld van staafvormig PDMS microstructuren. Waardevol om gegevens te verkrijgen van deze testen, zijn de belangrijkste factoren om te bepalen kwaliteit eiwit en membraan.

Om kwaliteit eiwit, eiwit massa moet worden bevestigd met behulp van SDS-pagina en massaspectrometrie. Voorts dient te worden geverifieerd dat eiwitten zijn oplosbaar en niet geaggregeerde, met behulp van analytische gel filtratie of Dynamische lichtverstrooiing. Gel filtratie kan worden gebruikt om te verwijderen waarbij het geaggregeerde gedeelte van eiwitten. Zorgvuldige pH-waarde en de kwaliteit van toegevoegde nucleotiden is van cruciaal belang, als de toevoeging van niet-gecorrigeerde of gedeeltelijk aangetaste nucleotide aan proteïne voorraden of zelf-organiserende testen is voldoende om te elimineren eiwit activiteit, dus afschaffen zelf-organisatie.

Naast eiwitten de kwaliteit, membraan kwaliteit is meest kritische en onjuiste membraan vorming is meestal de oorzaak van de defecte zelforganisatie en de oorsprong van artefactual oppervlakte structuren.

Bij het uitvoeren van het protocol voor de eerste keer, is het nuttig om het label van de ondersteunde lipide-bilayers door gelabelde lipiden zoals Atto-655-DOPE of DiI lage molaire percentages (0.05%). Waardoor kunnen de eigenschappen en de kwaliteit van het membraan worden beoordeeld direct. FRAP gebruikt, kan de vloeibaarheid van het membraan worden beoordeeld. Bovendien kan een direct beoordelen de kwaliteit van het wassen van de SLB, als er zal ofwel te veel blaasjes, geen vloeistof membraan of geen membraan helemaal niet, als het is afgewassen. De open kamer aanpak maakt het mogelijk om strikt wassen het membraan, en dus ook voor het verwijderen van blaasjes die op het oppervlak van de SLB steken. De meest cruciale factoren voor het verkrijgen van vloeistof en homogene ondersteunde lipide, bilayers zijn de reinigings- en hydrophilicity van het oppervlak van de steun en de juiste grootte en de homogeniteit van de SUVs. kunnen het nuttig om te controleren SUV grootte en het gebruik van de distributie van de grootte Dynamische lichtverstrooiing. Voor smalle grootte distributies raden we de blaasjes diepte in plaats van het sonicating hen. Andere methoden van reiniging coverslips, bijvoorbeeld, behandelingen met sterke basen, fundamentele detergentia of coverslips te gebruiken direct na het spoelen met water, kunnen goede resultaten opleveren, afhankelijk van de toepassing en lipide mengsel.

De eerste helft van het protocol gepresenteerd hier, in vitro reconstitutie op vlakke ondersteunde lipide bilayers in open kamers, heeft het voordeel van destructie van het oppervlak toegankelijk voor optische microscopies, zoals TIRF microscopie30, FRAP analyse6, single-deeltje bijhouden34, evenals oppervlakte sonde technieken zoals atomaire kracht microscopie26. De grote homogene omgeving zorgt voor betere statistieken bij gedefinieerde concentraties. Bovendien kan de open kamer aanpak nauwkeurig bepalen eiwitconcentratie en een snelle en eenvoudige toevoeging van andere onderdelen, vandaar het toelaat om Titreer eiwitconcentratie in een enkele kamer20. De bepaling kan ook worden uitgebreid door de toevoeging van andere onderdelen van de bacteriële divisome zoals FtsZ22,35, ZipA22 of de chimeer eiwit FtsZ-YFP-MTS10,35.

Andere groepen hebben een soortgelijke aanpak genomen om de krachten de Min systeem in vitro, maar gebruik een stroom-cel in plaats van een open kamer17,18,19. Stroom-cellen hebben bepaalde voordelen, met name wanneer een volledig gesloten 3D-omgeving nodig18, de invloed van stroom17,19,23 is of membraan samenstelling23 op MinCDE patronen onderzocht, of als eiwit patronen worden waargenomen onder eiwit voorwaarden19te beperken. Lokaal beheer van moleculaire concentraties is echter moeilijker. Eiwit onderdelen, vooral gedachten, sterk binden aan het membraan ze eerste ontmoeting18,19. In onze ervaring vertonen de eiwitten vaak niet-specifieke binding aan buizen, inhammen, spuiten en andere delen van de microfluidic. Vandaar, lokale eiwit concentratie verschillen van input concentraties18 en ook variëren over de lengte van de stroom-cel, wat resulteert in een verscheidenheid van verschillende eiwitten patronen op de membraan tussen de inlaat en uitlaat, zoals waargenomen door anderen19.

De tweede helft van het protocol gepresenteerd hier, de reconstitutie in vitro in staafvormig microstructuren opnieuw met behulp van de open kamer aanpak op een patroon drager lipide vallende bilayers voorziet in een eenvoudige nabootsen van in vivo eiwit gedrag Hoewel nauwkeurige controle over eiwit concentraties is verloren als gevolg van de verwijdering van de buffer. Merk op dat omdat de golflengte van MinDE is ongeveer één orde van grootte groter in vitro dan in vivo de staafvormig microcompartments zijn ook over één orde van grootte groter (10 x 30 µm) dan een staafvormig E. coli cel.

Globaal, dit protocol voorziet in de nauwkeurige controle van alle voorwaarden, met inbegrip van de eiwitconcentratie, buffer samenstelling en eigenschappen van het membraan. Het gebruik van 3D gestructureerde ondersteunt kan de reactie worden bestudeerd onder ruimtelijke opsluiting, het nabootsen van in vivo gedrag zonder de noodzaak voor complexe microfluidics apparatuur.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Michael Heymann en Frank Siedler voor productie van silicium wafers, Core faciliteit MPI-B voor bijstandsverlening in EiwitReiniging en Simon Kretschmer en Leon Harrington voor opmerkingen over het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
DOPG Avanti Polar Lipids 840475
E.coli polar lipid extract Avanti Polar Lipids 100600
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate Roche
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma A5285-1G
Sodium chloride VWR 27810.295
Potassium chloride Roth 6781.1
Tris-base Sigma Aldrich T1503-1kg
Hydrochloric acid Roth 9277.1
TCEP-HCl Termo Fisher Scientific 20491
Ethylene Diamine Tetraacetate Merck Millipore 1.08418.1000
Sulfuric Acid 98% Applichem 173163.1611
Hydrogen Peroxide 50% Applichem 147064.1211
HEPES Biomol 05288.1
dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 102950 Uvasol
Glycerol 86% Roth 4043.1
TB medium
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roth 2316.x
Atto-655-DOPE Atto Tec AD 655-161
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
PDMS base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
PDMS crosslinker Dow Corning Corporation
Materials
UV Glue Norland Products 6801 #68 and #63 both work well
Coverslips #1.5 24x24 mm Menzel Gläser
Coverslips #1 24x24 mm Menzel Gläser used only for PDMS microstructures
0.5 ml reaction tube Eppendorf  0030123301
culture flask 2L Corning e.g. 734-1905
His-Trap HP GE Healthcare Life Sciences
Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG GE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column Biorad 7322010
dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL Termo Fisher Scientific 66333 or 66330
razor blade
Instruments
ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems Merck
automated protein purification system: Äkta Pure GE Healthcare Life Sciences
bath sonicator Branson e.g. Model 1510
ARE-250 mixer Thinky Corporation
Plasma cleaner Zepto Diener electronic use oxygen as process gas
positive displacement pipettes Brand Transferpettor models with glass tips
LSM780 confocal laser scanning microscope Zeiss Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective
Plasmids
pET28a-His-MinD_MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield
pET28a-His-MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinE
pET28a-His-EGFP-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-mRuby3-MinD
pET28a-His- MinC Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control. Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).
  2. Lutkenhaus, J. The ParA/MinD family puts things in their place. Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).
  3. Shih, Y. -L., Zheng, M. Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli. Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).
  4. Halatek, J., Frey, E. Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics. Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).
  5. Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli. J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320 (5877), 789-792 (2008).
  7. Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures. Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).
  8. Hu, Z., Lutkenhaus, J. Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid. Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).
  9. Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).
  10. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems. Elife. 3, e03949 (2014).
  11. Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).
  12. Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria. Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).
  13. Thanbichler, M., Shapiro, L. MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  14. Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation. Elife. 3, e02758 (2014).
  15. Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo. J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).
  16. Renner, L. D., Weibel, D. B. Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).
  17. Ivanov, V., Mizuuchi, K. Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).
  18. Caspi, Y., Dekker, C. Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers. Elife. 5, e19271 (2016).
  19. Vecchiarelli, A. G., et al. Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).
  20. Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence. PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).
  21. Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. Geometry sensing by self-organized protein patterns. Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).
  22. Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves. Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).
  23. Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro. Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).
  24. Glock, P., et al. Optical control of a biological reaction-diffusion system. Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).
  25. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments. Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).
  26. Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator. Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).
  27. Ramirez, D., et al. Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture. PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).
  28. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. Elife. 2, e00116 (2013).
  29. Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. Surface topology assisted alignment of Min protein waves. FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).
  30. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).
  31. Zieske, K., Schwille, P. Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments. Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).
  32. Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation. J Vis Exp. (82), e50560 (2013).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. Protein self-organization: Lessons from the min system. Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).
  35. Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).

Tags

Biochemie kwestie 137 In vitro reconstitutie gedachten MinE ondersteunde lipide dubbelgelaagde patroonformatie microstructuren zelforganisatie
<em>In Vitro</em> Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P.… More

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P. In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (137), e58139, doi:10.3791/58139 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter