Summary
Vi leverer en protokol for in vitro- selvorganisering assays af sind og MinE på en understøttet lipid tolagede i en åben kammer. Desuden, beskriver vi, hvordan du omslutte analysen i lipid-klædte PDMS microcompartments at efterligne i vivo betingelser ved reaktion indeslutning.
Abstract
Mange aspekter af det grundlæggende spatiotemporelle organisation af celler er underlagt reaktion-diffusion type systemer. In vitro rekonstituering af sådanne systemer giver mulighed for detaljerede undersøgelser af deres underliggende mekanismer, hvilket ikke ville være muligt in vivo. Her, leverer vi en protokol for in vitro- rekonstituering af MinCDE systemet af Escherichia coli, som placerer celledeling septum i celle midten. Analysen er designet til at levere kun de nødvendige komponenter til selvorganisering, nemlig en membran, de to proteiner sind og MinE og energi i form af ATP. Vi fabrikere derfor en åben reaktionskammeret på en coverslip, hvor en understøttet lipid tolagede er dannet. Det åbne design af kammeret giver mulighed for optimal forberedelse af lipid tolagede og kontrolleret manipulation af bulk indhold. De to proteiner, sind og MinE, samt ATP, føjes derefter til bulk volumen over membranen. Tænkelig er muligt ved mange optisk microscopies, som design understøtter Konfokal, wide-felt og JOHANNAS mikroskopi ens. I en variation af protokollen, er lipid tolagede dannet på en mønstret støtte på celle-formet PDMS mikrostrukturer, i stedet for glas. Sænke bulk løsning til randen af disse rum omslutter reaktionen i et mindre rum og giver grænser, der giver mulighed for efterligne i vivo oscillerende adfærd. Taget sammen, beskriver vi protokoller for at rekonstruere MinCDE systemet både med og uden rumlige indeslutning, giver forskerne at præcist styre alle aspekter påvirker mønster dannelse, som koncentrationsintervaller og tilsætning af andre faktorer eller proteiner, og at systematisk øge systemkompleksitet i en relativt simpel eksperimentel opsætning.
Introduction
Spatiotemporelle mønstre er afgørende i naturen, regulering af komplekse opgaver både på de flercellede og cellulære niveau, fra morfogenese til regulerede celledeling1,2. Reaktion-diffusion systemer spiller en vigtig rolle ved fastlæggelsen af disse mønstre, men er stadig ikke godt forstået. Et godt eksempel på en reaktion-diffusion system og de bedst karakteriserede biologiske system er hidtil Escherichia coli MinCDE system3,4,5,6,7. MinCDE systemet svinger fra celle pole til celle pol i E. coli til at bestemme i midten af cellen som fremtidige division site. Dette system er baseret på ATPase sind, ATPase aktivering protein minen, og membran som en fysisk reaktion matrix8. MinC er ikke en del af mønster formation mekanisme, men er den faktiske funktionelle agent: en hæmmer af vigtigste divisome protein FtsZ5,6. MinC binder sig til sind og derfor følger svingningerne, hvilket resulterer i en tid-gennemsnit protein koncentration forløb, der er maksimal ved celle polerne og minimal på midten celle kun tillader FtsZ at polymerisere på midcell9,10 . MinCDE systemet er en del af den større familie af Walker A ATPases der er nøglen til den spatiotemporelle organisation i bakterier2, til positionering og transport af protein komplekser11 og plasmider12 og regulerer celle division13 og kromosom segregation14. Derfor MinCDE reaktion-diffusion systemet ikke kun repræsenterer en arketypisk reaktion-diffusion system, men har også tiltrukket sig opmærksomhed på grund af dets relevans for den spatiotemporelle organisation i bakterier.
Detaljerede funktionelle studier af MinCDE system i vivo er kompliceret, da manipulation af proteiner og gen sletning typisk resultere i celledeling defekter. Desuden ændrer membran sammensætning eller egenskaber i cytosol i vivo er meget udfordrende15,16. Ændringer i systemet og påvirke faktorer er svære at fortolke i det komplekse miljø i cellen, endnu mere så hvis det er forstyrret i sådan en afgørende funktion som celledeling. Vi og andre har derfor vendt til en in vitro- rekonstitution tilgang, reducerer systemet til sin kernekomponenter: sind, MinE, ATP som energikilde, og understøttede lipid tolagede som en reaktion matrix6,17, 18. denne bottom-up-tilgang giver mulighed for at sonde mekanisme af selvorganisering i detaljer uden kompleksiteten af en levende celle. Formen proteiner rejser overflade bølger6 og andre former for mønstre17,19 under disse betingelser, omend med en bølgelængde der er som regel om en størrelsesorden større end in vivo. Brugen af en åben kammer letter præcis kontrol over alle aspekter påvirker mønster dannelse: protein koncentrationer6, protein egenskaber20, membran sammensætning10, buffer sammensætning og ATP koncentrationen 6, såvel som tilføjelsen af andre faktorer såsom fortrængning agenter21 og andre divisome proteiner22. I sammenligning, kan in vitro- rekonstituering af MinCDE systemet i en flow-celle18,19,23 bruges til at probe indflydelse af flow17,23, protein begrænsende betingelser19, membran sammensætning19 og fuld 3D indespærring18 på protein mønstre, men gengiver en nøjagtig kontrol af protein/komponent koncentration og sekventiel komponent desuden meget mere kompliceret.
Bruger åben her, vi også mønstrede støtte af planar lipid dobbeltlag som kan en sonde hvordan geometriske grænser indflydelse mønster dannelse21, et fænomen, der har for nylig også blevet undersøgt i vivo ved hjælp af bakterier støbt ind mikrostrukturer7. Vi har også ansat denne analyse at undersøge hvordan definerede mutationer i MinE påvirker mønster dannelsen af system20. Endvidere, de samme grundlæggende assay format har været ansat til at undersøge, hvordan mønster dannelse kan kontrolleres af lys, at indføre en azobenzen-crosslinked minen peptid i analysen, og imaging med JOHANNAS mikroskopi24.
Vi har fundet, at for at replikere MinDE mønster konstateret dannelse, i vivo i en in vitro- system, nedkomst var nøglen. Ved hjælp af stang-formede microcompartments, med dimensioner tilpasses den større bølgelængde af MinDE i vitro (10 x 30 µm), beklædt med en understøttet lipid tolagede tilladt rekonstituering af MinDE Pol til pol svingninger og protein gradient dannelsen 10,25. I denne analyse, er understøttede lipid dobbeltlag deponeret på en mønstret PDMS substrat, der indeholder flere hundrede reproduktioner af stang-formede microcompartments at forbliver åben på toppen. Af dette, reaktionen kan sættes op i en åben kammer, og efterfølgende bufferen er sænket til randen af microcompartments, dermed begrænser reaktion på en lille mængde. Selv om disse rum har en luft-buffer interface på den ene side og dermed ikke repræsenterer en fuld 3D indespærring af membran, efterlignede protein dynamikken i vivo svingninger10,25. Sammenlignet med fuld 3D indespærring, som viser meget lignende resultater18, åben mikrostrukturer assay er relativt enkel og let at håndtere og kan også udføres af laboratorier, der ikke er udstyret med specialiserede mikrofluidik udstyr og rense-værelsesfaciliteter.
Her præsenterer vi en forsøgsplan for erstatningsgodtgørelse MinCDE mønster dannelse på understøttede lipid dobbeltlag i vitro ved hjælp af en åben kammer, der giver mulighed for kontrol af alle komponenter og nem adgang af Optisk mikroskopi og med mindre ændringer, kan også tilpasses for overflade-probe teknikker26. Ved siden af planar understøttede lipid dobbeltlag, viser vi også, hvordan protein indespærring kan være fremstillet ved hjælp af simple mønstrede understøttede lipid dobbeltlag på stavformet PDMS mikrostrukturer. Disse assays, kan Selvom optimeret til MinCDE systemet, også blive overført til andre protein-systemer, der interagerer på en lignende måde med membran, som FtsZ27 eller en minimal actin cortex28.
Protocol
1. protein produktion
- Protein udtryk
- Omdanne E. coli BL21 (DE3) pLysS med de respektive plasmid for udtryk for øje6, EGFP-sind29, mRuby3-MinD24, MinE6 eller MinC30. For plasmid kort, henvises til supplerende oplysninger.
- Podes en overnight kultur i LB medium med en enkelt koloni ved hjælp af de respektive antibiotika (fx100 µg/mL Ampicillin eller 50 µg/mL Kanamycin) og inkuberes ved 37 ° C til 14-16 h under omrystning.
- Podes 500 mL af TB medium indeholdende de respektive antibiotikum med overnight kultur (1:200 fortynding) og inkuberes kultur ved 37 ° C under omrystning på 180 rpm.
- Fremkalde protein udtryk ved at tilføje 0,5 mM IPTG, når kulturen når en optisk tæthed på 600 nm på 0,5-0,7. EGFP-sind eller mRuby3-sind, Ryk celler til en inkubator med 16 ° C og vokser celler for 14-16 h, og hvis MinC, sind eller min, dyrke celler i 3-4 timer ved 37 ° C efter induktion.
Bemærk: Induktion MinC, sind eller MinE udtryk er giftigt for celler, som overekspression resultater i celledeling defekter; Derfor er det vigtigt, at inkubationstiden ved 37 ° C er holdt under 4 h. Hvis der kræves mere protein, øge mængden af kultur, men ikke inkubationstiden. - Efter respektive inkubationstiden høste celler ved centrifugering ved 4000 x g i 10 min. og gemme celle pellet ved-80 ° C indtil videre brug.
- Protein oprensning
Bemærk: Proteiner kan renses, enten ved hjælp af færdigpakkede Ni-NTA kolonner på en automatiseret protein luftrensning system eller ved hjælp af Ni-NTA perler for alvor-flow bench rensning.- For rensning med færdigpakkede Ni-NTA kolonner på automatiseret protein oprensning systemer brug buffer A1 (50 mM natriumfosfat pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol), buffer B1 (50 mM natriumfosfat pH 8,0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol) og buffer C1 (50 mM natrium fosfat pH 8,0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol). For alvor-flow bench rensning ved hjælp af Ni-NTA perler bruge buffer A2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol), buffer B2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol), og buffer C2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol). Supplere alle buffere med 10 mM ß-mercaptoethanol eller 0,4 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) som reduktionsmiddel lige før brug.
- Resuspend celler i 20-30 mL buffer A1 eller A2 suppleret med EDTA-fri protease inhibitor, 100 µg/mL Lysozym, ~ 250 U/mL DNase og 0,2 mM Mg2 +- ADP (Mg2 +- ADP i tilfælde af sind eller EGFP-sind rensning kun, fra en 100 mM ADP lager i 100 mM MgCl 2 med pH justeret til 7.5).
- Lyse celler ved hjælp af et tip sonikator (30% amplitude, 2,5 min, 30 s puls, 30 s off) samtidig holde hætteglasset med cellerne i isbad.
- Fjern celle debris ved centrifugering cellen lysate for 45 min på 25.000 x g og 4 ° C.
- Inkuber supernatanten på Ni-NTA kolonne eller Ni-NTA perler.
- For færdigpakkede Ni-NTA kolonner, indlæse eksemplet kolonne ved hjælp af prøven pumpen på en automatiseret protein luftrensning system.
- Bænk-top rensning, Ruger prøve med Ni-NTA perler i en 50 mL reaktion røret på en roterende shaker ved 4 ° C i 1 time. For de efterfølgende skridt, skal du overføre Ni-NTA perler ind i en tom kolonne ved hjælp af en 25 mL pipette.
- Vask med mindst 5 kolonne mængder af buffer A1 eller A2.
- Vask med mindst 5 kolonne mængder af buffer B1 eller B2.
- Elueres protein med buffer C1 eller C2.
- Vurdere protein renhed via SDS-PAGE.
- Valgfrit: Rense yderligere protein ved at anvende det til en gel filtrering kolonne ekvilibreres i opbevaring buffer (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glycerol, 0.1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP, (0.2 mM Mg2 +- ADP i tilfælde af sind)).
Bemærk: Gel filtrering anbefales for sindet at fjerne aggregerede proteinfraktion. - Hvis ingen gel-filtrering er ansat, udveksle Ni-NTA eluering buffer til lagring buffer (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glycerol, 0.1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP, (0.2 mM Mg-ADP i tilfælde af sind)) ved hjælp af en tyngdekraft flow udvanding kolonne (Se Tabel af materialer).
- Chok-freeze proteiner i delprøver i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C indtil videre anvendelse.
- Måle stock proteinkoncentration ved hjælp af Bradford Assay, og bestemme protein aktivitet med en ATPase assay20.
Bemærk: Ikke vurdere proteinkoncentration ved hjælp af absorption på 280 nm. Tilstedeværelsen af nukleotid under sind rensningen og manglen på tryptophans i MinE fordreje en280 koncentration målinger. Brug Bradford eller BCA-undersøgelser for at måle protein koncentrationer i stedet.
- Protein mærkning
Bemærk: Fusion af en fluorescerende proteiner til den lille protein MinE inducerer større ændringer til dens diffuserende egenskaber og funktion; Derfor, kemiske mærkning af protein (cysteine på position 51) foretrækkes frem for fusion til fluorescerende proteiner.- 0,125 mg maleimide-dye konjugat i 5-10 µL af DMSO (dimethylsulfoxid) opløses og tilsæt under omrystning til en 0,5 mL MinE alikvot i opbevaring buffer på pH 7,2, forberedt som beskrevet ovenfor.
- Der inkuberes i 2 h til natten over ved 4 ° C eller 2 h i RT under blid omrystning eller omrøring.
- Separat farvestof og protein ved hjælp af en tyngdekraft flow afsaltning kolonne ekvilibreres med opbevaring buffer (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glycerol, 0.1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP).
- Du kan yderligere fjerne enhver løstliggende farvestof, dialyze protein mod et overskud af opbevaring buffer.
- Bekræft vellykket mærkning ved at måle ekstinktion ved maksimum for de respektive farvestof og beregne den anslåede mærkning effektivitet. Henvises til farvestof producentens anvisninger for en detaljeret protokol på estimering af graden af mærkning. Analysere med SDS-PAGE og bestemme samlede masse af massespektrometri yderligere nyttige oplysninger om prøven homogenitet og mærkning succes.
2. lille Unilamellar vesikel (SUV) forberedelse
- Generation af multilamellar blærer
- Beregning af lipid(s) i chloroform til din ønskede blanding og endelige SUV volumen. Koncentrationen skal være 4 mg/mL af lipider i Min buffer (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2). En blanding af 7:3 DOPC:DOPG (mol procent) anbefales for en standard Min assay. Når ved hjælp af E. coli polar lipid ekstrakt, bruge SLB buffer (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl) for alle præparationstrin.
Bemærk: Det anbefales ikke for første gang brugere at bruge E. coli polar lipid ekstrakt som generation af homogen SLBs med denne blanding er meget mere udfordrende. - Ved hjælp af en positiv forskydning pipette med glas tips, bland lipider i chloroform i en 1,5 mL hætteglas.
- Tørre lipider under en lille kvælstof strøm mens langsomt dreje hætteglasset. Placer lipider under en stærkere kvælstof stream for 10 til 20 minutter. Placer hætteglasset indeholdende tørrede lipid filmen i et vakuum ekssikkator og anvende vakuum i mindst 1 time.
- Rehydrere lipider i Min buffer af vortexing ved stuetemperatur, indtil blandingen er ensartet uigennemsigtig.
Bemærk: For generation af små unilamellar vesikler fra multilamellar vesikler, lipider kan enten være ekstruderet som beskrevet i punkt 2.2. eller sonicated som beskrevet i punkt 2.3. I almindelighed, udbytter ekstrudering en smallere størrelse distribution, som kan hjælpe med dannelsen af understøttede lipid dobbeltlag.
- Beregning af lipid(s) i chloroform til din ønskede blanding og endelige SUV volumen. Koncentrationen skal være 4 mg/mL af lipider i Min buffer (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2). En blanding af 7:3 DOPC:DOPG (mol procent) anbefales for en standard Min assay. Når ved hjælp af E. coli polar lipid ekstrakt, bruge SLB buffer (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl) for alle præparationstrin.
- SUV forberedelse af ekstrudering
- Bryde lipid aggregater og multilamellar strukturer og yderligere solubilize lipider af fryse-optøning for 7 til 10 cyklusser.
- Forberede et bægerglas med vand ved 70° C til 99° C på en varm tallerken og en beholder med flydende kvælstof.
- Holde hætteglasset i flydende kvælstof med store pincet, indtil kvælstof stopper kogende. Derefter overføre hætteglas til varmt vand, indtil løsningen er helt optøet. Gentag disse trin, indtil lipid blandingen vises klart for øje, afhængigt af blandingen.
- Samle en lipid ekstruder og pre skylles system med Min buffer. Presse lipid blanding mellem 35 og 41 gange gennem en membran af 50 nm porestørrelse. Sørg for at ende på et ulige antal passerer at undgå aggregeringer, der aldrig gennemkøres membranen.
- Bryde lipid aggregater og multilamellar strukturer og yderligere solubilize lipider af fryse-optøning for 7 til 10 cyklusser.
- SUV forberedelse ved hjælp af sonikering
- Til bedre opløses sat lipider i buffer, sætte hætteglasset indeholdende løsning i en varme blok til 37 ° C og vortex hver 20 minutter til 1 minut. Inkuber i alt i ca 1 time.
- Fordyb i bunden af hætteglasset i en sonikator bad (i dette arbejde 1,91 Larsen, 80 W) ved at knytte hætteglas på en klemme stå i den ønskede højde.
- Angive vandhøjden i sonikator badet, så den løsning omkring hætteglasset er grundigt ophidset af impulser og sonikeres lipid blandingen i ca 20 minutter. Check for vellykket sonikering ved at vurdere klarheden af lipider.
- SUV'er kan opbevares ved 4 ° C i op til en uge eller frosset ved-20 ° C i små prøver (~ 20 µL) og opbevares i flere uger. Tø hætteglas eller rør ved stuetemperatur og Læg instrumenterne i ultralydsbad igen som beskrevet under 2.2.3 eller 5,3 indtil løsningen er klar før understøtter brug af SUV'er til forberedelse af lipid dobbeltlag (SLBs). Bemærk er venligst at den smalle størrelse fordeling af SUV'er fremstillet ved ekstrudering tabt efter nedfrysning og efterfølgende optøning og sonikering.
3. rengøring glas Coverslips
Note: Rengøring og hydrophilization af glas coverslips er en vigtig faktor for homogen og væske understøttede lipid dobbeltlag. Glas coverslips kan rengøres med en piranha løsning, fremstillet forholdet 7:2 svovlsyre, 50% hydrogenperoxid (3.1), eller med en ilt plasma i en plasma renere (3.2). Begge metoder giver tilsvarende resultater.
- Piranha rengøring af coverslips
- Anvende piranha løsning
- Distribuere glas coverslips på en omvendt glas petriskål eller andre inerte overflade. Med et glas pipette, skal du tilføje 7 dråber koncentreret svovlsyre (98%) til midten af hver coverslip.
Forsigtig: svovlsyre er stærkt syreholdige og ætsende. Arbejde i et stinkskab og med rette beskyttende udstyr kun. - Tilføj to dråber af 50% brintoverilte til midten af de syre dråber.
Forsigtig: brintoverilte er ætsende at øjne og hud. - Dække reaktionen og Inkuber i mindst 45 minutter.
Bemærk: Den maksimale ventetid her er ikke afgørende for resultatet af eksperimentet og kan udvides op til flere dage.
- Distribuere glas coverslips på en omvendt glas petriskål eller andre inerte overflade. Med et glas pipette, skal du tilføje 7 dråber koncentreret svovlsyre (98%) til midten af hver coverslip.
- Vask piranha renset coverslips.
- Afhente coverslips individuelt med pincet og skyl af syre med ultrarent vand. Placere den vasket coverslips i ikke-stick indehavere eller lignende transport enhed.
- Skyl hver coverslip flittigt med ultrarent vand og tørre overfladen med trykisoleret gas (nitrogen, luft kun hvis olie-fri). Markere den rensede side af coverslip med permanent markør.
- Anvende piranha løsning
- Plasma rengøring af coverslips
- Skyl coverslips med overskydende ethanol og bagefter med overskydende ultrarent vand. Tørre coverslips med trykbærende gas. Samle kammer, som beskrevet i 4.
- Efter samling i kammeret som beskrevet i 4 Tag coverslips med vedlagte kammer og plads i plasma renere med ilt som proces gas. Rengør coverslips med plasma (i dette arbejde 30% strøm, 0,3 mbar ilt pres for 1 min blev brugt). Gør rengøringen lige før SLB dannelse som beskrevet i 5, som den hydrophilizing effekt af plasma rengøring aftager over tid.
Bemærk: Timing og strøm af plasma rengøring bør optimeres ved hjælp af fluorescently mærket membraner, som alt for lidt eller overdreven plasma rengøring kan både føre til immobile membraner eller membraner med huller.
4. afdeling forsamling
- Med skarpe saks, skåret og skille sig af med låget og den koniske del af en 0,5 mL reaktion tube. Gælder UV-lim til den øverste kant af røret og distribuere jævnt ved hjælp af en pipette tip.
- Lim på røret op og ned til den tidligere rensede coverslip. I tilfælde af piranha rengøring Sørg for at fastklæb den til den rengjorte side af glasset. Helbrede UV-lim ved at placere flere kamre nedenunder en 360 nm lampe eller LED i 5 til 15 minutter.
5. understøttede Lipid tolagede (SLB) dannelse
- Før varmen varme blokere til 37 ° C, og der inkuberes 2 mL reaktion rør med Min eller SLB buffer, 1 rør pr. kammer.
- Blow kvælstof i de samlet og hærdede kamre til at fjerne støv eller andre partikler, der kan have afgjort under UV hærdende og forsamling. Plasma ren som beskrevet i punkt 3.2, hvis du ikke har renset din coverslips med Piranha løsning (3.1). Placer kamre på varme blok.
- Fortyndes 20 µL alikvot af klare lipider (på 4 mg/mL) med 130 µL af Min buffer eller SLB buffer i tilfælde af E. coli polar lipid ekstrakt, giver en arbejdende koncentration af 0,53 mg/mL. I tilfælde af lipider blev frosset, sonikeres først ved at holde røret ind i et badekar sonikator før du tilføjer buffer, så sonikeres igen med buffer.
- Tilføje 75 µL af lipid blanding til hvert kammer og indstille en timer til 3 minutter (til DOPC/DOPG blandinger; længere inkubation kan være nødvendigt for andre lipid blandinger). I tilfælde af E. coli polar lipid ekstrakt, der afpipetteres CaCl2 fra en 100 mM bestand i salen til en endelig koncentration på 3 mM. Under inkubationstiden, vesikler brast på hydrofile glasoverfladen og lunte til at danne en sammenhængende SLB.
- Efter 60 sekunder, Tilføj 150 µL af Min buffer til hver afdeling.
- Vask kamrene: efter en anden 120 sekunder (3 minutter total) vask hver afdeling af tilføje 200 µL af Min eller SLB buffer, omhyggeligt pipettering op og ned et par gange, fjerne og tilføje en anden 200 µL.
- Efter hvert kammer har været vasket en gang, fortsætte med at vaske første afdeling grundigt indtil 2 mL af bufferen er brugt op. Vask af SLBs brug for nogle erfaringer at perfekt omfanget af bevægelser i salen og finde den korrekte vask intensitet.
Bemærk: Fjern aldrig alle væske fra herhen for at undgå udtørring af SLB.
Bemærk: På toppen af vask, membran egenskaber vil variere afhængigt af mange andre faktorer: typen af lipider og deres relative koncentrationer i lipid blandinger, forberedelse metode til SUV'er, overflade behandling og forudgående rengøring af støtte.
- Efter hvert kammer har været vasket en gang, fortsætte med at vaske første afdeling grundigt indtil 2 mL af bufferen er brugt op. Vask af SLBs brug for nogle erfaringer at perfekt omfanget af bevægelser i salen og finde den korrekte vask intensitet.
6. selvorganisering Assay
- Justere buffer lydstyrken i salen til 200 µL Min buffer minus mængden protein og ATP løsning og derefter tilføje sind, mærket sind, MinE, og, hvis det ønskes, MinC. Bland forsigtigt komponenter af pipettering. Eksempel koncentrationer er 1 µM sind (doteret med 30% EGFP-sind), 1 µM minen (doteret med 10% kemisk mærket MinE) og 0,05 µM MinC, men mønstre danne over en række koncentrationer6,10,20,30 .
- Tilføje 2,5 mM ATP (fra 100 mM ATP lager i 100 mM MgCl2, pH 7,5) for at starte selv-organisering af MinDE.
Bemærk: Rækkefølgen af komponent tilsætning (sind, MinE, og ATP) kan varieres og vil ikke påvirke det endelige mønster resultat4. - Observere MinDE selvorganisering på fluorescens mikroskop (Se Tabel af materialer). MinDE selvorganisering kan også observeres ved hjælp af JOHANNAS mikroskopi. Imaging eGFP-sind, bruge en 488 nm Argon laser eller sammenlignelige diodelaser (f.eks. 490 nm). Imaging mRuby3 sindet er det bedst at ansætte en 561 nm diodelaser.
Bemærk: Undgå høje niveauer af excitation for længere tid som vi og andre konstateret17 fototoksicitet i MinDE system, fører til irreversible protein polymerisering på membranen.
7. PDMS mikrostrukturer
Bemærk: PDMS (Polydimethylsiloxan) er en polymer, der kan bruges til fremstilling af mikrostrukturer og mikrofluid enheder. En mønstrede silicium wafer fungerer som en støbeform til støbning PDMS strukturer. PDMS strukturer derefter fungere som en støtte til SLB dannelse og assay setup.
- Enten producerer silicium wafer med microcompartments dig selv ved hjælp af fotolitografi (Se Zieske og Schwille for en detaljeret protokol31 eller Gruenberger et al. for en video protokol32) eller bestille din ønskede silicium wafer fra et støberi . Se supplerende oplysninger for mønstret af wafer anvendes heri.
- Produktion af PDMS mikrostrukturer fra mønstrede silicium wafers.
- Brug en plastik kop til vejer 10 g af PDMS base og 1 g af PDMS crosslinker. Enten bruge en Blanderens at blande og degas PDMS blanding eller manuelt Bland PDMS og derefter degas under vakuum.
- Bruge en pipette tip til at droppe en lille mængde af PDMS direkte på strukturen på silicium wafer.
Bemærk: Pas på ikke at ridse silicium wafer. - Umiddelbart placerer en #1 coverslip på PDMS drop og tage den øverste ende af en ren pipette tip at trykke forsigtigt på coverslip på silicium wafer. PDMS bør sprede meget mellem coverslip og silicium wafer.
- Placere wafer med coverslips i ovn og helbrede PDMS for 3-4 timer eller natten over på 75 ° C. Fjerne wafer fra ovnen og lad det køle ned til stuetemperatur. Med et barberblad, Fjern forsigtigt coverslip med den vedlagte PDMS fra SI wafer.
Bemærk: For at forhindre, at silicium wafer at få snavset eller beskadiget, altid dække mikrostrukturer med PDMS og en coverslip. PDMS aldre, hvilket resulterer i revner i mikrostrukturer, skal derfor dog ikke bruge PDMS strukturer, der er ældre end to til tre uger.
8. selvorganisering i PDMS mikrostrukturer
- Brug coverslips med PDMS mikrostrukturer vedhæfte et kammer som beskrevet under 4.
- Ren og hydrophilize overflade i en ilt plasma renere som beskrevet under 3.2.2. Gør ikke piranha ren PDMS substrater.
- Setup en MinDE selvorganisering assay, som beskrevet under 6.
- Efter opsætning af analysen, kontrollere for regelmæssig MinDE mønster dannelse og korrekt udformet mikrostrukturer på fluorescens mikroskop.
- Når regelmæssige MinDE mønstre har dannet (10-30 min), forsigtigt pipetteres op og ned to gange for at blande komponenterne og derefter fjerne buffer trin for trin af pipettering. Fjerne de store hovedparten af buffer ved hjælp af en 100 µL pipette og udtag derefter forsigtigt resten ved hjælp af en 10 µL pipette.
Bemærk: Dette trin muligvis nogle praksis. Hvis for meget buffer er taget ud eller processen tager for lang tid, vil mikrostrukturer være tørret ud; Hvis også lidt er taget, proteiner vil ikke være begrænset i mikrostrukturer, men fortsætter med at danne rejser overflade bølger. - Straks lukke kammer med et låg til at undgå udtørring af de resterende buffer i mikrostrukturer.
- For at give mulighed for længere imaging gange, stik en fugtet stykke af svamp inde i salen og luk med låg. Kontroller, at svampen ikke kontakte overfladen af coverslip.
- Før billeddannelse af mikrostrukturer check på overfladen, bufferen var sænket nok, så at i overfladen over mikrostrukturer MinDE mønster dannelse er standset. Billede MinDE svingninger i mikrostrukturer. Kontroller, at mikrostrukturer ikke er tørret ud eller er udtørring under imaging.
Bemærk: Smid coverslips med microcompartments efter hver brug, som revner i formen PDMS.
9. analyse af MinDE mønster dannelse
- Opgøre bølgelængde, bølge hastighed og bølge profiler af MinDE selvorganisering på planar understøttede lipid dobbeltlag. FIJI med standardsæt i pakket plugins er tilstrækkelig for grundlæggende analyse33.
- Analysere Pol til pol svingninger i microcompartments ved at indhente kymographs og tid-gennemsnit protein koncentration profiler. Grundlæggende kymographs kan opnås ved re udskæring en tidsserie langs en linje udvalg i FIJI.
Representative Results
Protein oprensning efter vores protokol bør give Min proteiner af passende renhed. Som reference indeholder figur 1 en SDS-PAGE billede af sindet, fluorescently mærket sind, MinE, og MinC. De enkelte trin i proceduren til at udføre en MinDE selvorganisering assay på ikke-mønstrede understøttede lipid dobbeltlag er beskrevet i figur 2. Ved hjælp af denne protokol, kan regelmæssigt MinDE rejser overflade bølger iagttages i hele salen (figur 3). Bølgelængden kan variere lidt i kammeret, men generelt mønstre ligne. Kanterne af salen bør ikke anvendes til kvantitativ sammenligninger, som membraner, form på UV-lim synes at have andre egenskaber end på glasset overfladen (Se figur 3 c). De omrejsende overflade bølger kan analyseres ved at plotte intensitet langs formering retning (figur 3B). Mens tankerne fluorescens plateauer temmelig hurtigt fra forkanten af bølgen og derefter kraftigt falder på bagkanten, MinE fluorescens øger næsten lineært fra starten af MinD wave og når sit maksimum efter sind på bagkanten, hvor det falder af markant6.
Ved siden af protein kvalitet er kvaliteten af understøttede lipid dobbeltlag mest kritiske for en regelmæssig selv-organisering af MinCDE. På den ene side hvis membranen er vasket for overdrevent eller den underliggende overflade er blevet renset og dermed opkrævet alt for stærkt, huller kan danne i membranen (figur 6A, top). På den anden side hvis membranen ikke er vaskede ordentligt eller den underliggende flade er ikke renset/hydrophilized, blærer vil holde sig til membranen eller membran fluiditet vil blive kompromitteret (figur 6A, nederst). Selv om ikke så synlige som når observere membran direkte via mærket lipider, disse problemer kan også påvises fra sind fluorescens signal, som mønstre er ikke regelmæssig og fluorescens i maxima er ikke homogene, men indeholder "huller" eller lyse pletter som vist i det midterste panel af figur 6A.
For MinDE selvorganisering i stavformet PDMS mikrostrukturer er proceduren sammenfattet i figur 4. Flere protokollen trin behøver ikke at blive gentaget, som proteiner og lipider kan genbruges. Som på ikke-mønstrede underlag, underlaget er renset og hydrophilized (af plasma-rengøring), en understøttet lipid tolagede er dannet på PDMS og selvorganisering assay er sat op i et volumen på 200 µL. For at kontrollere, at en ordentlig membran har dannet og MinDE selv arrangerer på membranen, er kamrene afbildet. Når en ordentlig membran er blevet dannet, MinDE former regelmæssige rejser overflade bølger på overfladen af PDMS mellem de enkelte mikrostrukturer og også selv arrangerer på bunden af mikrostrukturer som bølgerne kan frit flytte over hele membran-dækket overflade (figur 5A). Efter buffer fjernelse vise overflade mellem rum ikke nogen formeringsmaterialets MinDE mønstre (figur 5B), som det skal være helt tør. Hvis MinDE mønstre er stadig bevæger sig, skal flere buffer fjernes. Proteinerne er nu er begrænset i den stang-formede microcompartments af membran-klædte PDMS og luft på den øvre grænseflade (figur 5 c), hvor de selv organiserer. Disse betingelser kan de to proteiner udføre Pol til pol svingninger, som vist i figur 5 d. Som en brøkdel af sind og MinE er altid membran-bundet, også kan under buffer fjernelse, koncentrationer efter buffer fjernelse ikke sammenlignes med input koncentrationer. På grund af denne effekt variere koncentrationerne også mellem individuelle mikrostrukturer på den samme coverslip som de afhænger af placeringen af mønstre før buffer fjernelse. Silicium wafer produktionen eller PDMS molding fra silicon wafer kan resultere i ufuldstændig mikrostrukturer, der ikke kan bruges til analyse (fig. 6B). Desuden, på grund af bufferen fjernelse mikrostrukturer kan tørre ud under processen, og derfor bør udelukkes fra yderligere analyse (fig. 6B). Som et resultat viser kun en brøkdel af mikrostrukturer i ét kammer de ønskede Pol til pol svingninger. For at analysere protein dynamik i mikrostrukturer, kan en kymograph opnås ved at trække en markering over hele strukturen (figur 5E). Når MinCDE svinger fra Pol til pol, vil MinC og sind vise en tid i gennemsnit koncentration gradient med maksimal koncentration på rum polakker og minimal koncentration i midten af rummet (figur 5F).
Figur 1: SDS-PAGE viser de endelige produkter af protein purifications. Hans sind (33.3 kDa), hans-eGFP-sind (60,1 kDa), hans-mRuby3-sind (59.9 kDa), hans-minen (13,9 kDa) og hans-MinC (28,3 kDa) er vist i rækkefølge. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: proces flow diagram viser de enkelte trin og timing af protokollen til en selvstændig organisation på ikke-mønstrede understøttede lipid dobbeltlag (trin 1-6). Stiplede bokse angiver, at en af disse to muligheder kan bruges til rengøring. Pilene mærket af cirkler angiver hvor protokollen kan pause og genoptages senere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Imaging af MinDE assay af konfokalmikroskopi. A) regelmæssig Min spiral, fra hvilke bølge formering hastighed, intensitet plot og hastighed målinger kan fås. Koncentrationerne anvendes: 0,6 µM sind (30% eGFP-sind), 1,8 hans µM MinE (30% hans-MinE-Alexa647) B) eksempel normaliseret intensitet plot for området markeret i A. C) overblik over hele analysen kammer (skalalinjen: 1 mm, samme protein koncentrationer som ovenfor). Spiraler dreje begge retninger samt target mønstre kan observeres. Det forstørrede område viser, hvordan bølge mønstre er forskellige på UV-lim. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: proces flow diagram viser de enkelte trin og timing af protokollen til selvorganisering i stavformet mikrostrukturer (trin 1-5, 7, 8). Grå bokse angiver trin hvor produkter kan genbruges fra protokollen på ikke-mønstrede understøttede lipid dobbeltlag. Pilene mærket af cirkler angiver hvor protokollen kan pause og genoptages senere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative resultater for MinDE mønster dannelse i stavformet PDMS microcompartments. A) MinDE selv organisere på overfladen af PDMS danner rejser overflade bølger (1 µM sind (30% EGFP-sind), 2 µM MinE og 2,5 mM ATP). B) efter bufferen er sænket til højden af mikrostrukturer, protein selvorganisering stopper på den plane overflade mellem microcompartments. C) skematisk af en stang-formede microcompartment. D) repræsentative billeder af MinDE Pol til pol svingninger efter buffer fjernelse. E) Kymograph af svingninger langs den markerede linje vist i D). F) Image og profil af gennemsnitlige fluorescens-intensiteten af tidsserierne vist i D) tydeligt viser den protein forløb, der er maksimal ved microcompartment poler og minimal på rum midten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: eksempler på negative eksperimentelle resultater. A) over vasket membraner ophobes huller, mens suboptimal vesikel præparater og lipid kompositioner føre til stikning vesikler. To center panelerne viser en kombination af både problemer og hvordan de bliver synlige, når observeret Min svingninger. Membraner var mærket med 0,05% Atto655-DOPE. (skala barer: 50 µm) B) øverste panel: tørret ud microcompartments kan være forårsaget af for meget buffer fjernelse eller når bufferen fordamper med tiden. Bundpanelet: ufuldstændige rum kan være dannet under wafer produktionen eller PDMS støbning. (skala barer: 30 µm) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: Plasmid kort for hans sind. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Plasmid kort for hans-EGFP-sind. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Plasmid kort for hans-mRuby3-sind. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: Plasmid kort for hans-minen. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 5: Plasmid kort for hans MinC. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 6: CAD-filen for silicium plade af stang-formede microcompartments. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Vi har beskrevet en protokol for in vitro- rekonstituering af MinCDE selvorganisering på planar støttet lipid dobbeltlag og i lipid tolagede dækket 3D strukturer, med stang-formede PDMS mikrostrukturer eksempel. For at få værdifulde data fra disse assays, er de vigtigste faktorer til kontrol af protein og membran kvalitet.
At sikre protein, protein masse bør bekræftes ved hjælp af SDS-PAGE og massespektrometri. Derudover bør det kontrolleres, at proteiner er opløselige og ikke samlet, ved hjælp af analytisk gel filtrering eller dynamisk lysspredning. Gel filtrering kan bruges til at fjerne eventuelle aggregerede brøkdel af proteiner. Omhyggelig pH justering og kvaliteten af tilsat nukleotider er kritisk, som tilsætning af ikke-justerede eller delvist nedbrudte nukleotid til protein bestande eller selvorganiserende assays er tilstrækkelig til at eliminere protein aktivitet, derfor afskaffe selvorganisering.
Ved siden af protein kvalitet, membran kvalitet er mest kritiske og forkert membran dannelse er oftest årsag til defekte selvorganisering og oprindelsen af artefactual overflade strukturer.
Når du udfører protokollen for første gang, er det nyttigt at mærke understøttet lipid dobbeltlag af herunder mærket lipider som Atto-655-DOPE eller DiI på lav kindtand procent (0,05%). Dermed kan egenskaber og kvalitet af membranen bedømmes direkte. Bruger FRAP, kan bevægeligheden på membranen vurderes. Desuden kan en direkte vurdere kvaliteten af vask af SLB, som der vil enten være for mange blærer, ingen væske membran eller ingen membran på alle, hvis det er blevet vasket. Den åbne afdeling tilgang gør det muligt at grundigt vaske membranen, og dermed også at fjerne blærer, som holder fast på overfladen af SLB. De mest afgørende faktorer for at opnå væske og homogen understøttede lipid dobbeltlag er rengøring og hydrofiliciteten support overflade og den korrekte størrelse og homogenitet af SUvs kan det være nyttigt at kontrollere SUV størrelse og størrelse distribution ved hjælp af dynamisk lysspredning. For smalle størrelse distributioner anbefaler vi strengpresning af vesikler i stedet sonicating dem. Andre metoder til rengøring coverslips, fx behandlinger med stærke baser, grundlæggende rengøringsmidler eller ved hjælp af coverslips direkte efter skylning med vand, kan give gode resultater, afhængigt af anvendelse og lipid blandingen.
Den første halvdel af protokollen præsenteres her, in vitro- rekonstitution på planar understøttede lipid dobbeltlag i åbne kamre, har fordelen for præstationen overfladen tilgængeligt for optisk microscopies, såsom JOHANNAS mikroskopi30, FRAP analyse6, enkelt-partikel tracking34, samt overflade probe teknikker såsom atomic force mikroskopi26. Det store homogene område giver mulighed for bedre statistikker på definerede koncentrationer. Desuden åbent kammer tilgang gør det muligt at netop kontrol proteinkoncentration og en hurtig og enkel tilføjelse af yderligere komponenter, dermed tillade for at titrere proteinkoncentration i en enkelt afdeling20. Analysen kan også udvides ved tilsætning af andre bakterielle divisome komponenter såsom FtsZ22,35, ZipA22 eller kimære protein FtsZ-YFP-MTS10,35.
Andre grupper har taget en lignende tilgang til at retablere Min system i vitro, men brug en flow-celle i stedet for en åben afdeling17,18,19. Flow-celler har visse fordele, navnlig når en fuldstændig lukket 3D miljø er nødvendige18, påvirkning af flow17,19,23 eller membran sammensætning23 på MinCDE mønstre undersøgt, eller hvis protein mønstre at være observeret under protein begrænsende betingelser19. Ikke desto mindre, lokale kontrol med fusioner og molekylær er vanskeligere. Proteinkomponenter, især sind, stærkt binder sig til membranen de første møde18,19. Vores erfaring udviser proteinerne ofte ikke-specifik binding til slanger, fjorde, sprøjter og andre mikrofluid dele. Derfor, lokale protein koncentrationer afviger fra input koncentrationer18 og også variere over længden af den flow-celle, hvilket resulterer i en række forskellige protein mønstre på membranen mellem indsugnings- og udstødningsporte, som bemærket af andre19.
Den anden halvdel af protokollen præsenteres her, in vitro- rekonstituering i stavformet mikrostrukturer igen ved hjælp af metoden open kammer på en mønstret støtte omfattet af lipid dobbeltlag giver mulighed for en simpel efterligner i vivo protein adfærd selv om præcis kontrol over protein koncentrationer er tabt på grund af buffer fjernelse. Bemærk, at fordi bølgelængde af MinDE om en størrelsesorden større i vitro end in vivo stavformet microcompartments er også om en størrelsesorden større (10 x 30 µm) end en stavformet E. coli celle.
Samlet set denne protokol giver mulighed for præcis kontrol af alle betingelser herunder proteinkoncentration, buffer sammensætning og membran egenskaber. Brugen af 3D struktureret understøtter muliggør reaktion studeres under rumlige indeslutning, efterligne i vivo adfærd uden behov for komplekse mikrofluidik udstyr.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Michael Heymann og Frank Siedler for produktion af silicium wafers, Core facilitet MPI-B for bistand i protein oprensning og Simon Kretschmer og Leon Harrington for kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| DOPG | Avanti Polar Lipids | 840475 | |
| E.coli polar lipid extract | Avanti Polar Lipids | 100600 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate | Roche | ||
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma | A5285-1G | |
| Sodium chloride | VWR | 27810.295 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| Tris-base | Sigma Aldrich | T1503-1kg | |
| Hydrochloric acid | Roth | 9277.1 | |
| TCEP-HCl | Termo Fisher Scientific | 20491 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetate | Merck Millipore | 1.08418.1000 | |
| Sulfuric Acid 98% | Applichem | 173163.1611 | |
| Hydrogen Peroxide 50% | Applichem | 147064.1211 | |
| HEPES | Biomol | 05288.1 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 102950 | Uvasol |
| Glycerol 86% | Roth | 4043.1 | |
| TB medium | |||
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roth | 2316.x | |
| Atto-655-DOPE | Atto Tec | AD 655-161 | |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| PDMS base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| PDMS crosslinker | Dow Corning Corporation | ||
| Materials | |||
| UV Glue | Norland Products | 6801 | #68 and #63 both work well |
| Coverslips #1.5 24x24 mm | Menzel Gläser | ||
| Coverslips #1 24x24 mm | Menzel Gläser | used only for PDMS microstructures | |
| 0.5 ml reaction tube | Eppendorf | 0030123301 | |
| culture flask 2L | Corning | e.g. 734-1905 | |
| His-Trap HP | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column | Biorad | 7322010 | |
| dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL | Termo Fisher Scientific | 66333 or 66330 | |
| razor blade | |||
| Instruments | |||
| ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems | Merck | ||
| automated protein purification system: Äkta Pure | GE Healthcare Life Sciences | ||
| bath sonicator | Branson | e.g. Model 1510 | |
| ARE-250 mixer | Thinky Corporation | ||
| Plasma cleaner Zepto | Diener electronic | use oxygen as process gas | |
| positive displacement pipettes | Brand | Transferpettor models with glass tips | |
| LSM780 confocal laser scanning microscope | Zeiss | Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective | |
| Plasmids | |||
| pET28a-His-MinD_MinE | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield | |
| pET28a-His-MinE | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinE | |
| pET28a-His-EGFP-MinD | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-EGFP-MinD | |
| pET28a-His-mRuby3-MinD | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-mRuby3-MinD | |
| pET28a-His- MinC | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinC |
References
- Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control. Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).
- Lutkenhaus, J. The ParA/MinD family puts things in their place. Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).
- Shih, Y. -L., Zheng, M. Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli. Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).
- Halatek, J., Frey, E. Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics. Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).
- Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli. J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320 (5877), 789-792 (2008).
- Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures. Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).
- Hu, Z., Lutkenhaus, J. Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid. Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).
- Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).
- Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems. Elife. 3, e03949 (2014).
- Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).
- Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria. Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).
- Thanbichler, M., Shapiro, L. MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
- Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation. Elife. 3, e02758 (2014).
- Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo. J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).
- Ivanov, V., Mizuuchi, K. Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).
- Caspi, Y., Dekker, C. Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers. Elife. 5, e19271 (2016).
- Vecchiarelli, A. G., et al. Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).
- Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence. PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).
- Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. Geometry sensing by self-organized protein patterns. Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).
- Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves. Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).
- Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro. Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).
- Glock, P., et al. Optical control of a biological reaction-diffusion system. Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).
- Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments. Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).
- Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator. Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).
- Ramirez, D., et al. Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture. PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).
- Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. Elife. 2, e00116 (2013).
- Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. Surface topology assisted alignment of Min protein waves. FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).
- Zieske, K., Schwille, P. Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments. Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).
- Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation. J Vis Exp. (82), e50560 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. Protein self-organization: Lessons from the min system. Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).
- Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).
