Summary
Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van de techniek van veno-veneuze Extracorporale membraan oxygenatie (ECMO) in een niet-intubated, spontaan ademhaling muis. Dit lymfkliertest model van ECMO kan effectief worden geïmplementeerd in experimentele studies van acute en einde-fase longziekten.
Abstract
Het gebruik van extracorporele membraan oxygenatie (ECMO) sterk toegenomen in de afgelopen jaren. ECMO uitgegroeid tot een betrouwbare en effectieve therapie voor acute en einde-fase longziekten. Met de toename van het klinische vraag en langdurig gebruik van ECMO zijn procedurele optimalisatie en preventie van multi orgel schade van cruciaal belang. Het doel van dit protocol is een gedetailleerde techniek van veno-veneuze ECMO presenteren in een niet-intubated, spontaan ademhaling muis. Dit protocol toont het technisch ontwerp van de ECMO en chirurgische stappen. Dit lymfkliertest ECMO model vergemakkelijkt de studie van pathofysiologie gerelateerde aan ECMO (b.v., ontsteking, bloeding en trombo-embolische gebeurtenissen). Wegens de overvloed van genetisch gemodificeerde muizen, kunnen ook de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij ECMO-gerelateerde complicaties worden ontleed.
Introduction
Extracorporale membraan oxygenatie (ECMO) is een tijdelijke leven support systeem dat functies van de longen en het hart overneemt dat voldoende gaswisseling en perfusie. Hill et al.1 beschreef het eerste gebruik van ECMO bij patiënten in 1972; echter, het alleen werd wijd gebruikt na de succesvolle toepassing tijdens de H1N1 grieppandemie in 20092. Vandaag, is ECMO routinematig gebruikt als een levensreddende procedure in end-stage hart en Long ziekten3. Veno-veneuze ECMO is steeds werkzaam als alternatief voor invasieve beademing in wakker, niet-intubated, spontaan ademhaling van patiënten met vuurvaste respiratoir falen4.
Ondanks de wijdverspreide goedkeuring, diverse complicaties gemeld voor ECMO5,6,7. Complicaties die kunnen worden ervaren door patiënten op ECMO zijn bloedingen, trombose, sepsis, trombocytopenie, apparaat-gerelateerde storingen en lucht longembolie. Bovendien is een systemische inflammatoire respons-syndroom (heren), wat resulteert in meerdere orgel schade goed beschreven, zowel klinisch als in experimentele studies8,9. Neurologische complicaties zoals hersenen infarct worden ook vaak gerapporteerd bij patiënten die langdurig ECMO therapie ondergaan. Om te verwarren zaken, is het vaak moeilijk om te onderscheiden of complicaties worden veroorzaakt door ECMO zelf voortvloeien uit de onderliggende aandoeningen bij acute en einde-fase ziekten.
Als u wilt specifiek bestudeert de effecten van ECMO op een gezonde organisme, moet een betrouwbare experimentele diermodel komen. Er zijn weinig rapporten over de prestaties van ECMO op kleine dieren en zijn al beperkt is tot ratten. Tot op heden is geen muismodel van ECMO beschreven in de literatuur. Als gevolg van de beschikbaarheid van een groot aantal genetisch gemodificeerde muis stammen zou oprichting van een ECMO muismodel verder onderzoek in de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij ECMO-gerelateerde complicaties10,11.
Gebaseerd op onze eerder beschreven lymfkliertest model van cardiopulmonale bypass (CPB)12, hebben we een stabiele methode van veno-veneuze ECMO in niet-intubated, spontaan ademhaling muizen. Het ECMO circuit (Figuur 1), met uitstroom en instroom cannulas, een peristaltische pomp oxygenator en reservoir voor lucht-overlapping, is vergelijkbaar met ons eerder beschreven model van lymfkliertest CPB12 met uitzondering van het hebben van een kleinere priming volume (0,5 mL). Dit protocol toont de gedetailleerde technieken, fysiologische controle en gas bloedwaarden die betrokken zijn bij een succesvolle ECMO procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten werden uitgevoerd op mannelijke C57BL/6 muizen, leeftijd van 12 weken. Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren van de Duitse dier wet onder Protocol TSA 16/2250.
1. materialen voorbereiding
Opmerking: Alle stappen zijn uitgevoerd in schone, niet-steriele omstandigheden. Steriele condities zou nodig zijn als het dier is te postoperatief worden overleefd.
- 3 fenestrations in een 2-Fr polyurethaan buis met behulp van een chirurgisch mes onder een microscoop met 16 X vergroting introduceren.
Opmerking: Alle fenestrations moeten zich bevinden in het distale derde deel van de canule om optimale bloed drainage. - Bereiden de instructieoplossing (Materialen tabel). Omvatten 30 IU/mL heparine en 2,5% v/v van een 8,4% oplossing van NaHCO3. Deze oplossing bij 4 ° C koelen totdat het klaar is voor gebruik. Het circuit met 500 uL van instructieoplossing Prime.
- Schakel van de canule uitstroom in de instructieoplossing en vul de ECMO machine door over te schakelen op de peristaltische pomp. Blijven circuleren de instructieoplossing door de machine voor de volgende 30 min op een debiet van 1 mL/min.
- 0.5 L/min voor 100% zuurstof geven de oxygenator.
2. anesthesie
- Plaats het dier in een inductie kamer gevuld met een mengsel van 2,5% v/v Isofluraan/zuurstof. Bieden 0.5 L/min voor 100% zuurstof naar de verdamper. Voordat chirurgie, moet u controleren dat volledige verdoving wordt bereikt door het testen van de pedaal terugtrekking en pijn reflexen. Toepassing eye gel om drogen schade te voorkomen.
- Gebruik een opwarming pad te handhaven van de lichaamstemperatuur bij 37 ° C.
- Inademing masker anesthesie met behulp van een vaporizer Isofluraan uitvoeren en 5 mg/kg carprofen subcutaan te injecteren.
- Regelmatig observeren van spontane ademhaling en de concentratie van Isofluraan zodanig aanpassen dat het is 1,3 tot 2,5%.
3. operatie
- Bloot de linker halsslagader met behulp van een laterale huid incisie van 4 mm met behulp van fijn schaar aan de linkerkant van de nek. Gebruik samen met scherpe en botte voorbereiding met behulp van micro-pincet en katoenen wissers, bipolaire stolling van de kleine vaartuigen.
- Zodra de linker halsslagader is blootgesteld, afbinden het distale deel met behulp van een 8-0 zijde Sutuur (geologie) met behulp van micro-pincet.
- Plaats een slip knoop aan het proximale einde van de ader. Incise de voorste wand van de ader met behulp van de micro-schaar.
- Om te bereiken van volledige heparinization, door 2,5 IU/g heparine te injecteren in de halsslagader via een 26 G-braunula.
- Verhogen de hoofd kant van de dierlijke pad door 30° tot het vermijden van overmatig bloedverlies uit de ader tijdens het inbrengen van de canule.
- Invoegen van een 2-Fr polyurethaan (PU) canule in het proximale deel van de halsslagader, lichtjes draaien terwijl het duwen van het op een diepte van 4 cm; terwijl doen, zal de iliacale bifurcatie voor vena cava inferior (IVC) worden bereikt.
- Beveilig de canule met 8-0 zijde knopen met behulp van microforceps.
- Bloot de juiste halsslagader met behulp van de stappen die worden beschreven in 3.1, 3.2 en 3.3.
- Cannulate de juiste halsslagader met een 1-Fr PU canule en verplaats het zachtjes 5 mm in de richting van juiste atrium.
- Herhaal stap 3.7.
- Catheterize de linker femorale slagader met een ander 1-Fr PU canule en gebruiken voor invasieve druk toezicht, alsmede bloedmonsters voor gas bloedwaarden (BGA).
- Elektrocardiogram (ECG) naalden verbonden met een apparaat voor overname subcutaan in beide voorpoten en in de linker thoracale muur invoegen
- Een rectale thermometer aangesloten op een apparaat van de overname gegevens invoegen
4. Veno-veneuze Extracorporale membraan oxygenatie en bloed Gas-analyse
Opmerking: Voor een schematische voorstelling van het volledige ECMO circuit, Zie Figuur 1.
- Initiëren ECMO op het dier door te draaien op de pomp met een initiële debiet van 0,1 mL/min. aanpassen het debiet van de pomp binnen de volgende 2 min 3-5 mL/min.
- In het geval van de zuigkracht van de lucht in de uitstroom canule via de site cannulation, vermindering van de stroom en 0,1 mL van de instructieoplossing toevoegen aan het circuit via een lucht-overlapping reservoir.
- Blijven volgen in real-time modus alle vitale parameters via de data acquisitie apparaat onder stabiele stroom.
- Voortdurend terugvoer van de veneuze afvoer observeren en controleren van het niveau van het bloed in het lucht-trapper reservoir.
- Verzamelen van alle bloed lekt uit wonden in een 1 cc spuit met het puntje van een 24 G branula andreturn het aan de ECMO circuit via het lucht-overlapping reservoir.
- Voor BGA, gebruikt u een bloed bemonstering cartridge voor het verzamelen van ongeveer 75 µL van arteriële bloed op de volgende tijdstippen en vanaf de volgende locaties:
- 10 minuten na de inleiding van ECMO, verzamelen bloed vanuit het IVC via een extra buis gebouwd vóór de oxygenator, via vergelijkbare extra buis na oxygenator (controle), en direct vanaf de femorale slagader.
- 30 min na de inleiding van ECMO, verzamelen bloed uit de femorale slagader.
- Geven een extra 0,1 mL van de instructieoplossing te compenseren intravasal vloeibare elke 45 min via de lucht-trapper of de femorale slagader katheter of door te zuigen de luchtbellen via het bloed zuig canule.
- Voor BGA, gebruikt u een bloed bemonstering cartridge voor het verzamelen van ongeveer 75 µL van arteriële bloed:
- 1 h na de inleiding van ECMO van de femorale slagader.
- 2 h na de inleiding van ECMO, verzamelen bloed vanuit het IVC via een extra buis gebouwd vóór de oxygenator, via vergelijkbare extra buis na oxygenator (controle), en direct vanaf de femorale slagader.
- Na 2 uur, verminderen het debiet van de pomp geleidelijk (in de loop van 5 min), daarmee stoppen ECMO.
- Blijven registreren van vitale parameters voor een ander 10 min.
- Afwerking van het experiment door de exsanguinating van het dier en het oogsten van het bloed en de organen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft de methode voor veno-veneuze ECMO in een muis. Dit model is betrouwbaar en reproduceerbaar zijn, en in vergelijking met ons eerder beschreven model van het CPB met ademhalings- en bloedsomloop arrestatie12,13, is het minder technisch veeleisende vast te stellen.
ECMO stroming in het veneuze systeem werd gehandhaafd tussen de 1.5 en 5 mL/min. De gemiddelde arteriële druk werd gehouden tussen 70 en 85 mmHg door toevoeging van extra instructieoplossing in het circuit ECMO. Meestal, kunt de toevoeging van 0,1 mL instructieoplossing aan het circuit tijdens ECMO vervanging van bloed volume. Alle volume vervangen of buffer oplossingen werden gegeven via de femorale slagader of lucht-overlapping reservoir.
Fysiologische parameters elke 10 min werden geregistreerd en gegevens uit een vertegenwoordiger ECMO experimenteren worden gepresenteerd in Figuur 2. BGA gegevens uit een succesvolle ECMO staan vermeld in tabel 1.
Hematologische parameters relevante hemodilution toonde tijdens ECMO; Er was echter geen bloedtransfusie nodig zijn om te compenseren voor gematigde bloedarmoede (tabel 1). Oxygenatie parameters van BGA aangetoond goede uitvoering van de oxygenator op een mengsel van zuurstof/lucht met FiO2 1.0 (tabel 1).
Metabole veranderingen tijdens ECMO toonde respiratoire alkalose aan het begin en gematigde acidose aan het einde van het experiment (tabel 1). Geen extra buffer van het bloed werd uitgevoerd.
Figuur 1: ECMO lay-out in een muis. Bloed van de vena cava (IVC), inferior wordt afgevoerd via de linker halsslagader en zuurstofrijk bloed wordt in de superieure vena cava (SVC) via de juiste halsslagader gepompt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: fysiologische parameters gemeten gedurende 2 uur voor ECMO. Een = hartslag, B = gemiddelde arteriële druk (VS = volume vervangen), en C = rectale temperatuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| 10 min | 30 min | 1 h | 2 h | |||||
| Parameters | O | FA | IVC | FA | FA | O | FA | IVC |
| pH | 7.67 | 7,51 | 7.31 | 7.57 | 7.5 | 7.6 | 7.57 | 7.34 |
| pCO2 (mmHg) | 24,5 | 24 | 52 | 26 | 25 | 22 | 26 | 51.1 |
| pO2 (mmHg) | 707 | 656 | 135 | 643 | 621 | 638 | 573 | 101 |
| HCO3 (mmol/L) | 28.3 | 25.3 | 26 | 24 | 23 | 27 | 23 | 25 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 99 | 100 | 100 | 100 | 100 | 98 |
| HCT (%) | 24 | 23 | 23 | 20 | 18 | 17 | 17 | 16 |
| HB (g/dl) | 8.8 | 8.6 | 8.5 | 8 | 7,8 | 7.6 | 7.2 | 7 |
| Lac (mmol/L) | 1.9 | 1.7 | 1.8 | 2.1 | 2.4 | 3.2 | 3.1 | 3.3 |
Tabel 1: BGA resultaten in de loop van het experiment. O = oxygenator, FA = femorale slagader en IVC = vena cava inferior.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschreven eerder, een succesvol model van het CPB in een muis12,13. Om een dergelijk model voor acute of einde-fase longaandoeningen ontwikkelden we een easy-to-use veno-veneuze ECMO circuit voor muizen. Verschillende aan het CPB model, veno-veneuze ECMO vereist geen gecompliceerde chirurgische ingrepen zoals sternotomy en klemmen van de aorta, waardoor het risico van de wond bloeden in een volledig heparinized dier. Om te voorkomen dat de embolisatie kan leiden van de oxygenator met bloedstolsels, wordt 2.5 IU heparine/kg gegeven aan elk dier. Deze dosis was gebaseerd op eerdere metingen van de geactiveerde bloedstolling tijd (ACT), die volledige antistolling van het bloed toonde (> 800 sec handelen). Als gevolg van het ontbreken van heparine coating in de micro-oxygenator bleef ons anticoagulation protocol vergelijkbaar met onze CPB-procedure.
In vergelijking met het CPB circuit, kunnen we verminderen de totale vulvolume tot 0,5 mL door vermindering van het volume van de lucht-trapper en de micro-oxygenator. Bovendien, een tragere stroom moest houden voldoende oxygenatie van het dier. Intravasal nederlaag van het volume van bloed resulteerde in een geleidelijke daling van de gemiddelde arteriële druk. Toevoeging van een extra 0,1 mL vulvolume aan het dier leidde tot een stijging van de bloeddruk meer dan 20 mmHg, maar een kleine lineaire verlaging van de arteriële druk over de volgende 30 min was altijd aanwezig. Volume vervanging heette voor als lucht was gezogen via de canule drainage of er een daling van de bloeddruk onder 75 mmHg was.
De moeilijkste uitdaging in de chirurgische procedure voor ECMO muismodel is de plaatsing van de canule via de linker halsslagader in het IVC. Om vast te stellen van deze methode, verschillende soorten cannulas werden getest, en een laparotomie werd uitgevoerd in muis kadavers te perfectioneren de positionering van het uiteinde van de canule in het IVC vlak voor de iliacale bifurcatie. Soms in grotere dieren, kan plaatsing van de canule leiden tot de ontwrichting van de canule in de ader van de rechter nier. Toch zou de volbloed van alle segmenten van het IVC goed gedraineerde als gevolg van de fenestrations van de kant van de canule.
In de voorbereidende proeven, we cannulation via de femorale ader uitgevoerd. Helaas, slechts een 1-Fr canule kan worden geplaatst in de femorale ader, wat in onvoldoende bloedtoevoer resulteert (≤ 1 mL/min). 1-Fr katheters geduwd in het IVC alle weergegeven onvoldoende terugvoer. Om te bereiken aanzienlijk terugvoer, zou beide femorale aderen moeten worden gecanuleerd; dus we verlaten deze procedure en bereikt voldoende drainage via een 2-Fr canule geplaatst in het IVC via de halsslagader. Bloedverlies tijdens de plaatsing van de canule in de halsslagader is zeer typisch. Daarom wordt het hoofd einde van de dierlijke pad vóór plaatsing verhoogd van 30-40°, zodat de terugvoer van de ader is aanzienlijk verminderd.
Een geleidelijke afname van de hemoglobine en hematocriet wordt verklaard door hemolyse en repetitieve bloed bemonsteringen genomen om aan te tonen van de prestaties van het apparaat. Voor overleving experimenten, voorkom bloedtransfusies, moet bloedmonsters zeer beperkt of zelfs voorkomen. Bovendien aan het einde van het experiment, moet het bloed van het circuit ECMO worden teruggestuurd naar het dier. Overlevingskansen van het model moet echter worden bestudeerd in een ander project met een minder invasieve protocol.
Bloedstroom tijdens onze ECMO loopt was tussen 3 en 5 mL/min. cardiale output van de normale muis is gerapporteerd te worden tussen de 6 en 9 mL/min; Daarom, gemiddeld, we konden bereiken een ECMO stroom van 54% van de cardiale output van de muis. Veno-veneuze ECMO vereist meestal lagere doorbloeding ten opzichte van veno-arterial ECMO, zoals overperfusion van de juiste atrium tot recht ventriculaire overbelasting en bijgevolg, hartfalen leiden kan. Klinisch, om voldoende oxygenatie, is een veno-veneuze ECMO stroom van 50-75% van de cardiale output genoeg voor voldoende oxygenatie in geventileerde of spontaan ademhaling patiënten. De ECMO stroom onnodig te verhogen kan leiden tot meer schade veroorzaakt door heren en hemolyse en nutteloos recirculatie voor het grootste deel van het veneuze bloed tussen de IVC en SVC. Bovendien, we hebben vastgesteld dat door het verhogen van de stroom in de vo-veneuze ECMO, buitensporige negatieve druk leidt tot lucht zuig op de site van cannulation. Onze dieren ontvangen 100% zuurstof onder Isofluraan verdoving, en met de hulp van veno-veneuze ECMO, waren hyper-zuurstof. In ons model hebben we geprobeerd te reproduceren van de voorwaarden van "wakker ECMO"4 hebben minder schade aan de longen.
De moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij ECMO-gerelateerde complicaties kunnen nu worden onderzocht als gevolg van de overvloed van genetisch gemodificeerde muis stammen beschikbaar. Er zijn ook meer dan tachtig muizenstammen met longaandoeningen die ECMO in het kader van deze onderliggende ziekten kunnen simuleren. Wij zijn daarom van mening dat onze veno-veneuze ECMO muismodel in meerdere synergetische projecten kan worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door KFO 311 subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | in 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | in 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 IU per ml of priming |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotide artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1,3 -2,5% | |
| Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany | invasive pressure, ECG, t °C | |
| i-STAT portable device | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old | Charles River Laboratories | housed 1 week before |
References
- Hill, J. D., et al. Prolonged Extracorporeal Oxygenation for Acute Post-Traumatic Respiratory Failure (Shock-Lung Syndrome). New England Journal of Medicine. 286 (12), 629-634 (1972).
- Noah, M. A., et al. Referral to an Extracorporeal Membrane Oxygenation Center and Mortality Among Patients With Severe 2009 Influenza A(H1N1). Journal of the American Medical Association. 306 (15), 1659 (2011).
- Maslach-Hubbard, A., Bratton, S. L. Extracorporeal membrane oxygenation for pediatric respiratory failure: History, development and current status. World Journal of Critical. Care Medicine. 2 (4), 29-39 (2013).
- Langer, T., et al. "Awake" extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): pathophysiology, technical considerations, and clinical pioneering. Critical Care. 20 (1), 150 (2016).
- Esper, S. A.
- Millar, J. E., Fanning, J. P., McDonald, C. I., McAuley, D. F., Fraser, J. F. The inflammatory response to extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): a review of the pathophysiology. Critical Care. 20 (1), 387 (2016).
- Lubnow, M., et al. Technical complications during veno-venous extracorporeal membrane oxygenation and their relevance predicting a system-exchange--retrospective analysis of 265 cases. Public Library of Science One. 9 (12), e112316 (2014).
- Passmore, M. R., et al. Inflammation and lung injury in an ovine model of extracorporeal membrane oxygenation support. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), L1202-L1212 (2016).
- Vaquer, S., de Haro, C., Peruga, P., Oliva, J. C., Artigas, A. Systematic review and meta-analysis of complications and mortality of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation for refractory acute respiratory distress syndrome. Annals of Intensive Care. 7 (1), 51 (2017).
- Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 111 (1), 131-150 (2012).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovascular Pathology. 15 (6), 318-330 (2006).
- Madrahimov, N., et al. Novel mouse model of cardiopulmonary bypass. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 53 (1), 186-193 (2017).
- Madrahimov, N., et al. Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach. J. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
