Summary
Her presenterer vi en protokoll som beskriver teknikken veno-venøs ekstrakorporal membran oxygenation (ECMO) i en ikke-intubated, spontan pusting mus. Denne murine modellen av ECMO kan bli effektivt implementert i eksperimentelle studier av akutt og sluttstadiet lungesykdommer.
Abstract
Bruk ekstrakorporal membran oxygenation (ECMO) har økt betydelig de siste årene. ECMO har blitt en pålitelig og effektiv behandling for akutt samt sluttstadiet lungesykdommer. Med økningen i klinisk etterspørsel og langvarig bruk av ECMO er fremgangsmåter for optimalisering og forebygging av flere organskade av avgjørende betydning. Målet med denne protokollen er å presentere en detaljert teknikk for veno-venøs ECMO i en ikke-intubated, spontan pusting musen. Denne protokollen demonstrerer den tekniske utformingen av ECMO og kirurgisk trinnene. Denne murine ECMO modellen vil lette studiet av patofysiologi relatert til ECMO (f.eks betennelse, blødning og thromboembolic hendelser). På grunn av overflod av genmodifiserte mus, kan det også være dissekert molekylære mekanismer involvert i ECMO-relaterte komplikasjoner.
Introduction
Ekstrakorporal membran oksygenering (ECMO) er en midlertidig liv støttesystem som tar over funksjonene til lungene og hjertet å tillate tilstrekkelig gassutveksling og perfusjon. Hill et al1 beskrevet den første bruken av ECMO hos pasienter i 1972; Imidlertid ble det bare utbredt etter vellykket programmet under H1N1 influensa pandemi i 20092. I dag brukes rutinemessig ECMO som en livreddende prosedyre i sluttstadiet hjerte og lunge sykdommer3. Veno-venøs ECMO er stadig ansatt som et alternativ til invasiv mekanisk ventilasjon i våken, ikke-intubated, spontan pusting pasienter med ildfaste respirasjonssvikt4.
Til tross for utbredt wireheading, er mangfoldig komplikasjoner rapportert for ECMO5,6,7. Komplikasjoner som kan oppleves av pasienter på ECMO inkluderer blødning, blodpropp, sepsis, trombocytopeni, enhetsrelaterte feil og air embolism. Videre er en systemisk inflammatorisk respons syndrom (herrer) resulterer i flere organskade godt beskrevet både klinisk og eksperimentelle studier8,9. Nevrologiske komplikasjoner som hjernen hjerteinfarkt rapportert også ofte hos pasienter gjennomgår langsiktige ECMO terapi. For å forvirre saker, er det ofte vanskelig å skille komplikasjoner forårsaket av ECMO selv eller oppstår fra underliggende lidelser følger akutt og sluttstadiet sykdommer.
Å spesielt studere effekter av ECMO på en sunn organisme, må en pålitelig eksperimentelle dyr modell opprettes. Det er svært få rapporter på ytelsen til ECMO på små dyr og er alle begrenset til rotter. Hittil har har ingen musemodell av ECMO blitt beskrevet i litteraturen. Grunn av tilgjengelighet av et stort antall genmodifiserte musen stammer, ville etablering av en mus ECMO modell tillate ytterligere undersøkelse av molekylære mekanismer involvert i ECMO-relaterte komplikasjoner10,11.
Basert på vår beskrevet tidligere murine modell hjerte bypass (CPB)12, har vi utviklet en stabil metode for veno-venøs ECMO i ikke-intubated, spontan pusting mus. ECMO kretsen (figur 1), som inneholder utløp og tilsig cannulas, peristaltiske pumpe, oxygenator og luft-fangst reservoaret, ligner vår beskrevet tidligere modell murine CPB12 med unntak av å ha en mindre grunning volum (0,5 mL). Denne protokollen viser detaljert teknikker, fysiologiske overvåking, og blod gass analyse involvert i en vellykket ECMO-prosedyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter ble utført på mannlige C57BL/6 mus, alderen 12 uker. Denne studien ble utført i samsvar med retningslinjene i tysk dyr loven protokollen TSA 16/2250.
1. materialet forberedelse
Merk: Alle trinnene utføres under ren, ikke-steril forhold. Sterile forhold vil være nødvendig dersom dyret er å være overlevd postoperatively.
- Innføre 3 fenestrations i en 2-Fr polyuretan rør med et kirurgisk blad under et mikroskop med 16 X forstørrelse.
Merk: Alle fenestrations må være plassert i den distale tredje av kanyle å sikre optimal blod drenering. - Forberede grunning løsningen (Materialer tabell). Inkluder 30 IU/mL heparin og 2,5% v/v av en 8,4% løsning i NaHCO3. Kjøle denne løsningen på 4 ° C før det er klart til bruk. Prime kretsen med 500 uL grunning løsning.
- Plasser ut kanyle i grunning løsningen og fyll ECMO maskinen ved å slå på peristaltiske pumpen. Fortsette å sirkulere grunning løsningen gjennom maskinen for de neste 30 min på en strømningshastighet på 1 mL/min.
- Gi 0,5 L/min 100% oksygen til oxygenator.
2. anestesi
- Stedet dyr i en induksjon kammer fylt med en 2,5% v/v isoflurane/oksygen blanding. Gi 0,5 L/min 100% oksygen til vaporizer. Før kirurgi, kan du kontrollere at full narkose oppnås ved å teste pedal uttak og smerte reflekser. Bruk øye gel for å hindre tørking skade.
- Bruke en oppvarming pad for å opprettholde kroppstemperatur på 37 ° C.
- Utfør innånding maske anestesi ved hjelp av en isoflurane fordamper og injisere 5 mg/kg carprofen subcutaneously.
- Regelmessig observere spontan pusting og justere konsentrasjonen av isoflurane slik at det er mellom 1,3 og 2,5%.
3. kirurgi
- Utsett venstre vena jugularis ved hjelp av en lateral huden snitt 4 mm ved hjelp av fine Sakser på venstre side av halsen. Sammen med skarpe og butte forberedelse på mikro-tang og bomull vattpinner, bruke bipolar koagulering av små fartøyene.
- Når venstre vena jugularis er utsatt, ligate den distale del med en 8-0 silke Sutur med hjelp av mikro-tang.
- Plass en løkke rundt heklenålen ved den proksimale enden av venen. Incise fremre veggen i venen med mikro-saks.
- For å oppnå full heparinization, injisere 2,5 IU/g heparin i vena jugularis via en 26 G braunula.
- Heve hodet siden av dyr puten ved 30° å unngå overdreven blodtap fra venen under innsetting av kanyle.
- En 2-Fr polyuretan (PU) kanyle inn den proksimale delen av vena jugularis, rotere det litt mens skyve den til en dybde på 4 cm; mens dermed oppnås iliaca bifurkasjonen dårligere vena cava (IVC).
- Sikker kanyle med 8-0 silke knop ved hjelp av microforceps.
- Utsett høyre vena jugularis ved hjelp av fremgangsmåten i 3.1, 3.2 og 3.3.
- Cannulate høyre vena jugularis med en 1-Fr PU kanyle og forsiktig flytte den 5 mm i retning av høyre atrium.
- Gjenta trinn 3.7.
- Catheterize venstre femoral subclavia med en 1-Fr PU kanyle og bruke den for invasiv trykk overvåking og blod prøvetaking for blod gass analyse (BGA).
- Sett inn elektrokardiogram (ECG) nåler koblet til en data oppkjøpet enheten subcutaneously i begge forelimbs og i venstre thorax veggen.
- Sett inn en endetarms termometeret koblet til en data oppkjøpet enhet.
4. Veno-venøs ekstrakorporal membran oksygenering og blod gass analyse
Merk: Hvis en skjematisk av komplett ECMO krets, se figur 1.
- Starte ECMO på dyret ved å slå på pumpen med en innledende strømningshastighet på 0,1 mL/min. justere infusjonshastigheten av pumpen i neste 2 min til 3-5 mL/min.
- Ved luft sug i utløp kanyle via cannulation området, redusere og legge til 0,1 mL grunning løsning krets via en luft-fangst-reservoaret.
- Under stabil flyt, Fortsett å overvåke i sanntid alle viktige parametere via data oppkjøpet enheten.
- Stadig observere tilbakestrømming fra venøs drenering og overvåke nivået av blodet i luft-pelsjeger reservoaret.
- Samle alle blod lekker fra sår i en 1 cc syringe med spissen av en 24 G branula andreturn det ECMO krets via luft-fangst reservoaret.
- BGA, bruk en blod prøvetaking patron samle ca 75 µL av arteriell blod på følgende tidspunkt og fra følgende plasseringer:
- 10 min etter initiering av ECMO, samle blod fra IVC via en ekstra rør bygget i før oxygenator, via lignende ekstra rør etter oxygenator (kontroll), og direkte fra arteria femoral.
- 30 min etter initiering av ECMO, samle blod fra arteria femoral.
- Gi en ekstra 0,1 mL grunning løsning å kompensere for intravasal flytende tap hver 45 min via luft-trapper eller femoral arterien kateter eller suge luftbobler gjennom blod drenering kanyle.
- BGA, bruk en blod prøvetaking patron samle ca 75 µL av arteriell blod:
- 1 time etter initiering av ECMO fra arteria femoral.
- 2t etter initiering av ECMO, samle blod fra IVC via en ekstra rør bygget i før oxygenator, via lignende ekstra rør etter oxygenator (kontroll), og direkte fra arteria femoral.
- Etter 2 h, redusere flow rate på pumpen gradvis (i løpet av 5 minutter), og dermed stoppe ECMO.
- Fortsette å spille viktige parametere for en annen 10 min.
- Fullføre eksperimentet av exsanguinating dyr og høsting blod og organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver metoden for veno-venøs ECMO i en mus. Denne modellen er pålitelig og reproduserbar og forhold til vår beskrevet tidligere modell av CPB med respiratory og sirkulasjons arrestasjonen12,13, er det mindre teknisk krevende å etablere.
ECMO flyt i det venøse systemet ble opprettholdt mellom 1,5 og 5 mL/min. Mener arteriell trykket ble holdt mellom 70 og 85 mmHg ved å legge til ekstra grunning løsning i ECMO krets. Vanligvis lar legge 0,1 ml grunning løsning krets under ECMO substitusjon av blodvolum. Alle volum erstatte eller bufring løsninger ble gitt via femoral arterien eller luft-fangst reservoaret.
Fysiologiske parametere ble registrert hvert 10 min og data fra en representant ECMO eksperimentere presenteres i figur 2. BGA data fra en vellykket ECMO er vist i tabell 1.
Hematologisk parametere viste relevante hemodilution under ECMO; men var ingen blodoverføring nødvendig å kompensere for moderat anemi (tabell 1). Oksygenering parameterne fra BGA vist riktig ytelse av oxygenator på en oksygen/luft blanding FiO2 1.0 (tabell 1).
Metabolske forandringer under ECMO viste åndedretts alkalose i starten og moderat acidose på slutten av eksperimentet (tabell 1). Uten ekstra bufring blod ble utført.
Figur 1: ECMO oppsett i en mus. Blod er drenert fra de mindreverdige vena cava (IVC) via venstre vena jugularis og oksygenrikt blod er pumpet inn den overlegne vena cava (SVC) via høyre vena jugularis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: fysiologiske parametre målt under 2 timer med ECMO. En = hjertefrekvens, B = mener arteriell trykk (VS = volum substitusjon), og C = endetarms temperatur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 10 min | 30 min | 1 h | 2 h | |||||
| Parametere | O | FA | IVC | FA | FA | O | FA | IVC |
| pH | 7.67 | 7.51 | 7.31 | 7.57 | 7.5 | 7.6 | 7.57 | 7.34 |
| pCO2 (mmHg) | 24,5 | 24 | 52 | 26 | 25 | 22 | 26 | 51,1 |
| pO2 (mmHg) | 707 | 656 | 135 | 643 | 621 | 638 | 573 | 101 |
| HCO3 (mmol/L) | 28,3 | 25.3 | 26 | 24 | 23 | 27 | 23 | 25 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 99 | 100 | 100 | 100 | 100 | 98 |
| HCT (%) | 24 | 23 | 23 | 20 | 18 | 17 | 17 | 16 |
| HB (g/dl) | 8.8 | 8.6 | 8.5 | 8 | 7.8 | 7.6 | 7.2 | 7 |
| Lac (mmol/L) | 1.9 | 1.7 | 1.8 | 2.1 | 2.4 | 3.2 | 3.1 | 3.3 |
Tabell 1: BGA resultater i løpet av eksperimentet. O = oxygenator, FA = femoral arterien og IVC = dårligere vena cava.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskrevet tidligere, en vellykket modell av CPB i en mus12,13. Implementere slik modell for akutt eller sluttstadiet lunge lidelser vi utviklet en lett-å-bruke veno-venøs ECMO krets for mus. Forskjellige CPB modellen veno-venøs ECMO krever ikke komplisert kirurgiske prosedyrer som sternotomy og clamping aortabuen, dermed redusere risikoen for såret blødning i en fullt heparinized dyr. For å unngå embolisering av oxygenator med blodpropp, er 2,5 IE heparin/kg gitt til hvert dyr. Denne dose var basert på tidligere målinger av er aktivert koagulasjonstid (ACT) som viste full anticoagulation blod (fungere > 800 sek). Fraværet av heparin belegg på mikro-oxygenator, var vår anticoagulation protokollen holdt ligner på vår CPB prosedyre.
I forhold til CPB krets, kunne vi redusere samlet grunning volumet til 0,5 mL ved å redusere volumet av luft-trapper og mikro-oxygenator. Videre var en tregere flyt nødvendig for å holde tilstrekkelig oksygenering av dyret. Intravasal tap av blodvolum resulterte i en gradvis nedgang betyr arteriell press. Legge til en ekstra 0,1 mL grunning volumet til dyret førte til en økning i blodtrykket over 20 mmHg, men liten lineær redusert arterial press over de neste 30 min var alltid til stede. Volum substitusjon ble kalt for hvis luften ble sugd gjennom drenering kanyle eller var det et fall i blodtrykket under 75 mmHg.
Den vanskeligste utfordringen i kirurgiske prosedyren for mus ECMO modell er plasseringen av kanyle via venstre vena jugularis i IVC. For å etablere denne metoden, ulike typer cannulas ble testet, og en laparotomy ble utført i musen levningene perfekt plassering kanyle tips til IVC like før iliaca bifurkasjonen. Noen ganger, i større dyr, kan plassering av kanyle føre til forvridning av kanyle i høyre nyre venen. Likevel kunne hele blod fra alle segmenter av IVCEN godt drenert på grunn av siden fenestrations av kanyle.
Foreløpig forsøk utført vi cannulation via femur venen. Dessverre bare en 1-Fr kanyle kan plasseres i femur venen, som resulterer i utilstrekkelig blodstrøm (≤ 1 mL/min). 1-Fr katetre presset i IVCEN alle vist nok tilbakestrømming. For å oppnå betydelige tilbakestrømming, må begge femur venene bli cannulated; Derfor vi forlot denne fremgangsmåten og oppnådd tilstrekkelig drenering via en 2-Fr kanyle i IVC via vena jugularis. Blodtap under plassering av kanyle i vena jugularis er veldig typisk. Derfor før plassering, er hodet slutten av dyr puten reist 30-40°, så tilbakestrømming fra venen er betydelig redusert.
En gradvis reduksjon i hemoglobin og hematokrit er forklart av hemolyse og repeterende blod prøvetaking tatt å vise ytelsen til enheten. For overlevelse eksperimenter, for å unngå blodoverføringer, bør blodprøve være svært begrenset eller selv unngås. Videre på slutten av eksperimentet, skal blod fra ECMO kretsen returneres til dyret. Survivability av modellen har imidlertid å bli studert i et eget prosjekt bruker en mindre invasiv protokoll.
Blodstrøm under våre ECMO går var mellom 3 og 5 mL/min. Normal mus cardiac output er rapportert å være mellom 6 og 9 mL/min; Derfor gjennomsnittlig var vi i stand til å oppnå en ECMO flyt av 54% av musen er cardiac utgang. Vanligvis krever veno-venøs ECMO lavere blodstrøm sammenlignet veno-arteriell ECMO, som overperfusion av høyre atrium kan føre til høyre ventrikkel overbelastning og dermed hjertesvikt. Klinisk, for å oppnå tilstrekkelig oksygenering, er en veno-venøs ECMO flyt av 50-75% av cardiac output nok for tilstrekkelig oksygenering i ventilert eller spontant pustende pasienter. Unødvendig øke ECMO flyten kan føre til mer skade forårsaket av SIRS og hemolyse og ubrukelig resirkulering av venøs blod mellom IVC og SVC. Videre har observert vi at ved å øke flyt i det veno-venøs ECMO, overdreven negative trykket fører til luft sug på stedet av cannulation. Våre dyr mottatt 100% oksygen under isoflurane anestesi, og med hjelp av veno-venøs ECMO, var hyper-oksygenert. I modellen har vi forsøkt å gjenskape forholdene på "våken ECMO"4 har mindre skade lungene.
Molekylære mekanismer involvert i ECMO-relaterte komplikasjoner kan nå bli undersøkt på grunn av overflod av genmodifiserte musen stammer tilgjengelig. Det er også mer enn åtti stammer mus med lunge lidelser som kan simulere ECMO i forbindelse med disse underliggende sykdommer. Derfor tror vi at våre veno-venøs ECMO musemodell kan implementeres i flere synergistisk prosjekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av KFO 311 stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | in 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | in 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 IU per ml of priming |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotide artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1,3 -2,5% | |
| Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany | invasive pressure, ECG, t °C | |
| i-STAT portable device | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old | Charles River Laboratories | housed 1 week before |
References
- Hill, J. D., et al. Prolonged Extracorporeal Oxygenation for Acute Post-Traumatic Respiratory Failure (Shock-Lung Syndrome). New England Journal of Medicine. 286 (12), 629-634 (1972).
- Noah, M. A., et al. Referral to an Extracorporeal Membrane Oxygenation Center and Mortality Among Patients With Severe 2009 Influenza A(H1N1). Journal of the American Medical Association. 306 (15), 1659 (2011).
- Maslach-Hubbard, A., Bratton, S. L. Extracorporeal membrane oxygenation for pediatric respiratory failure: History, development and current status. World Journal of Critical. Care Medicine. 2 (4), 29-39 (2013).
- Langer, T., et al. "Awake" extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): pathophysiology, technical considerations, and clinical pioneering. Critical Care. 20 (1), 150 (2016).
- Esper, S. A.
- Millar, J. E., Fanning, J. P., McDonald, C. I., McAuley, D. F., Fraser, J. F. The inflammatory response to extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): a review of the pathophysiology. Critical Care. 20 (1), 387 (2016).
- Lubnow, M., et al. Technical complications during veno-venous extracorporeal membrane oxygenation and their relevance predicting a system-exchange--retrospective analysis of 265 cases. Public Library of Science One. 9 (12), e112316 (2014).
- Passmore, M. R., et al. Inflammation and lung injury in an ovine model of extracorporeal membrane oxygenation support. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), L1202-L1212 (2016).
- Vaquer, S., de Haro, C., Peruga, P., Oliva, J. C., Artigas, A. Systematic review and meta-analysis of complications and mortality of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation for refractory acute respiratory distress syndrome. Annals of Intensive Care. 7 (1), 51 (2017).
- Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 111 (1), 131-150 (2012).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovascular Pathology. 15 (6), 318-330 (2006).
- Madrahimov, N., et al. Novel mouse model of cardiopulmonary bypass. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 53 (1), 186-193 (2017).
- Madrahimov, N., et al. Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach. J. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
