Summary
Здесь мы представляем Протокол описания техника Вено венозная экстракорпоральной мембранной оксигенации (Эмо) в не интубированных, спонтанно дыхание мыши. Мышиных модель Эмо может быть эффективно реализован в экспериментальных исследований острого и терминальной стадии заболевания легких.
Abstract
Использования экстракорпоральной мембранной оксигенации (Эмо) существенно возросла в последние годы. Эмо стал надежной и эффективной терапии для острой и терминальной стадии заболевания легких. С увеличением клинической спроса и длительном использовании Эмо процедурные оптимизации и предотвращения повреждения нескольких органов имеют важнейшее значение. Целью настоящего Протокола является представить подробную методику Вено венозная Эмо в не интубированных, спонтанно дыхание мыши. Этот протокол демонстрирует технический дизайн Эмо и хирургические шаги. Эта модель мышиных Эмо облегчит изучения патофизиологии, связанных с Эмо (например, воспаление, кровоточивость и тромбоэмболических событий). Благодаря обилию генетически измененных мышей молекулярные механизмы, участвующие в осложнений, связанных с Эмо также может быть расчлененный.
Introduction
Экстракорпоральной мембранной оксигенации (Эмо) является системой поддержки временной жизни, которая берет на себя функции легких и сердца разрешить обмен адекватный газообмен и перфузии. Хилл и др1 описал первый использования Эмо больных в 1972 году; Однако он только стал широко используется после ее успешного применения в ходе H1N1 пандемии гриппа в 20092. Сегодня Эмо обычно используется как спасательные процедуры в терминальной стадии сердца и легких заболеваний3. Вено венозная Эмо все чаще используется как альтернатива инвазивной механической вентиляции в awake, не интубированных, спонтанно дыхание пациентов с огнеупорной дыхательной недостаточности4.
Несмотря на широкое принятие разнообразных осложнений были зарегистрированы для Эмо5,6,7. Осложнения, которые могут быть испытаны больных на Эмо включают кровотечение, тромбоз, сепсис, тромбоцитопения, сбоев, связанных с устройством и эмболии. Кроме того синдрома системного воспалительного ответа (SIRS), что приводит к повреждению мульти органа хорошо описано, как клинически, так и в экспериментальных исследованиях8,9. Неврологических осложнений, таких как инфаркт мозга также часто поступают в пациентов, подвергающихся длительной терапии Эмо. Чтобы запутать дело, часто бывает трудно отличить ли осложнений, вызванных Эмо, сам или возникают из базовых расстройств, сопровождающих острый и терминальной стадии заболевания.
Конкретно изучить последствия Эмо для здорового организма, необходимо создать модель надежных экспериментальных животных. Есть очень мало сообщений о производительности Эмо на мелких животных и все ограничиваются крыс. На сегодняшний день, нет мыши модель Эмо был описан в литературе. Из-за наличия большого числа штаммов генетически модифицированные мыши создание эмо модель мыши позволит дальнейшее изучение молекулярных механизмов участвующих в осложнений, связанных с Эмо10,11.
Основываясь на наших ранее описанных мышиных модели искусственного кровообращения (КПБ)12, мы разработали метод стабильной Вено венозная Эмо в не интубированных, спонтанно дыхание мышей. Эмо цепи (рис. 1), содержащий отток и приток канюли, Перистальтический насос, Оксигенатор и воздух треппинга водохранилище, похож на нашей ранее описанные модели мышиных КПБ12 , за исключением имеющих меньший грунтовки объем (0,5 мл). Этот протокол показывает подробные методики, физиологических мониторинг и анализ газа крови участвующих в успешной процедуры Эмо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты были проведены на самцов мышей C57BL/6, в возрасте 12 недель. Это исследование было проведено в соответствии с требованиями немецкого животного закона под протокол TSA 16/2250.
1. материалы, подготовка
Примечание: Все шаги выполняются в чистой, не стерильных условиях. Стерильные условия потребуются, если животное не выжил после операции.
- Ввести 3 ярусе в 2-Fr полиуретановые трубки с помощью хирургического лезвия под микроскопом с 16 X увеличением.
Примечание: Все ярусе должен быть расположен в дистальной трети канюля для обеспечения оптимального крови дренажа. - Приготовляют раствор грунтовки (Таблица материалов). Включать 30 МЕ/мл гепарина и 2,5% v/v 8,4% раствора NaHCO3. Охладите это решение на 4 ° C, до тех пор, пока он готов к использованию. Премьер цепи с 500 uL грунтование решения.
- Место отток канюли в раствор грунтовки и заполнить Эмо машина, переключившись на перистальтических насосов. Продолжают циркулировать решение грунтование через машину для следующей 30 минут со скоростью потока 1 мл/мин.
- Дать Оксигенатор 0,5 Л/мин 100% кислорода.
2. анестезия
- Место животного в индукции камеру наполненные смесью изофлюрановая/кислорода 2,5% v/v. Обеспечивают 0,5 Л/мин 100% кислорода в испаритель. До операции проверьте что полной анестезии достигается путем тестирования педали вывода и боль рефлексов. Примените гель для глаз для предотвращения повреждения сушки.
- Используйте потепление площадку для поддержания температуры тела при 37 ° C.
- Выполните ингаляционной анестезии маски с помощью изофлюрановая испарителем и придать carprofen 5 мг/кг подкожно.
- Регулярно наблюдать спонтанного дыхания и регулировка концентрации изофлюрановая, так что это между 1.3 и 2,5%.
3. хирургия
- Разоблачить левой яремной вены с помощью боковой разрез 4 мм с помощью тонкой ножницы на левой стороне шеи. Вместе с острым и тупым подготовки с помощью микро щипцы и ватные тампоны используйте биполярной коагуляции малых судов.
- Как только левая яремной подвергается, перевязать дистальной части с помощью 8-0 Шелкового шва с помощью микро пинцет.
- Место сучка скольжения в проксимальном конце Вену. Надрезать передней стенки вен с помощью микро ножницы.
- Для достижения полного Гепаринизация, inject 2,5 МЕ/г гепарина в яремную Вену через 26 G braunula.
- Поднимите головы сторону животных pad на 30°, чтобы избежать чрезмерной кровопотери из Вены во время вставки канюли.
- Вставка 2-Fr полиуретан (PU) канюли в проксимальной части яремной вены, повернув его слегка прижимая его на глубину 4 см; При этом будет достигнута подвздошных бифуркации нижней полой вены (IVC).
- Закрепите катетер с 8-0 шелк узлов с помощью microforceps.
- Предоставляют право яремной вены, используя шаги, описанные в 3.1, 3.2 и 3.3.
- Иглу правой яремной вены с 1-Fr пу канюлей и осторожно переместить его 5 мм в направлении правого предсердия.
- Повторите шаг 3.7.
- Catheterize левой бедренной артерии с другой 1-Fr пу канюлей и использовать его для инвазивного давления, мониторинг, а также забор крови для анализа газов крови (BGA).
- Вставьте иглы электрокардиограммы (ЭКГ), подключенных к устройству приобретение данных подкожно в обе передние конечности и в левой грудной стенки.
- Вставьте ректального термометра, подключенных к устройству приобретение данных.
4. Вено венозная экстракорпоральной мембранной оксигенации и анализ газа крови
Примечание: Схема замкнутой цепи Эмо, см. Рисунок 1.
- Инициировать Эмо на животных, повернув на насос с первоначального 0,1 мл/мин Отрегулируйте расход насоса в течение следующего 2 мин до 3-5 мл/мин.
- В случае забора воздуха в отток канюля через сайт катетеризации уменьшить поток и добавить 0,1 мл раствора грунт в контуре через резервуар воздуха треппинга.
- При стабильным потоком продолжать контролировать в режиме реального времени всех жизненно важных параметров через устройство сбора данных.
- Постоянно наблюдать обратный от венозного оттока и контролировать уровень крови в резервуар воздуха охотник.
- Соберите любые кровь из раны в 1 cc шприц с кончика ивернуть branula 24 G его утечки в Эмо цепи через резервуар воздуха треппинга.
- Для BGA используйте картридж проб крови для сбора примерно 75 мкл артериальной крови в следующих точках времени и из следующих местоположений:
- 10 мин после начала Эмо, собрать кровь из МКВ через дополнительную трубку, построен до Оксигенатор, через аналогичные дополнительную трубку после Оксигенатор (управления) и непосредственно из бедренной артерии.
- 30 мин после начала Эмо, собирают кровь из бедренной артерии.
- Дать дополнительные 0,1 мл раствора грунтовки для компенсации потерь интравазальное жидкости каждые 45 мин через воздух охотник или бедренной артерии катетер или сосание пузырьки воздуха через кровь крылом канюли.
- Для BGA используйте картридж проб крови для сбора примерно 75 мкл артериальной крови:
- 1 ч после начала Эмо из бедренной артерии.
- 2 ч после начала Эмо, собрать кровь из МКВ через дополнительную трубку, построен до Оксигенатор, через аналогичные дополнительную трубку после Оксигенатор (управления) и непосредственно из бедренной артерии.
- После 2 ч сократить расход насоса постепенно (в течение 5 мин), тем самым остановки Эмо.
- Продолжать записывать жизненно важные параметры для еще 10 мин.
- Завершите эксперимент, exsanguinating животное и заготовки крови и органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает метод Вено венозная Эмо в мыши. Эта модель является надежных и воспроизводимых и по сравнению с нашей ранее описанные модели КПБ с дыхательной и кровеносной ареста12,13, это менее технически требует установить.
Эмо потока в венозной системе сохранялся между 1,5 и 5 мл/мин. Среднее артериальное давление находился между 70 и 85 мм рт.ст, добавив дополнительные грунтование решения в контуре Эмо. Как правило Добавление 0,1 мл раствора грунт к цепи во время Эмо позволяет замещения объема крови. Все тома замены или буферизации решения были даны через бедренную артерию или воздух треппинга водохранилище.
Физиологические параметры были записаны каждые 10 мин и на рисунке 2представлены данные от представителя Эмо эксперимент. В таблице 1приводятся данные BGA с успешным Эмо.
Гематологические параметры показали соответствующих гемодилюции Эмо; Однако не переливание крови необходимо компенсировать умеренной анемии (Таблица 1). Оксигенации параметры из BGA продемонстрировал надлежащего исполнения Оксигенатор на смеси кислорода и воздуха на FiO2 1.0 (Таблица 1).
Метаболические изменения во время Эмо показал дыхательных алкалоз в начале и умеренные ацидоз в конце эксперимента (Таблица 1). Никаких дополнительных буферизации крови была выполнена.
Рисунок 1: Эмо макет в мышь. Кровь уходит из нижней полой вены (IVC) через левый яремной вены и кислородом кровь закачивается в верхней полой вены (SVC) через правый яремной вены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: физиологические параметры, измеряемые в течение 2 ч Эмо. = ЧСС, B = среднее артериальное давление (VS = объем замещения) и C = ректальной температуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| 10 мин | 30 мин. | 1 ч | 2 h | |||||
| Параметры | O | FA | IVC | FA | FA | O | FA | IVC |
| pH | 7.67 | 7.51 | 7.31 | 7.57 | 7.5 | 7.6 | 7.57 | 7.34 |
| pCO2 (mmHg) | 24.5 | 24 | 52 | 26 | 25 | 22 | 26 | 51.1 |
| Ро2 (mmHg) | 707 | 656 | 135 | 643 | 621 | 638 | 573 | 101 |
| HCO3 (ммоль/Л) | 28.3 | 25.3 | 26 | 24 | 23 | 27 | 23 | 25 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 99 | 100 | 100 | 100 | 100 | 98 |
| HCT (%) | 24 | 23 | 23 | 20 | 18 | 17 | 17 | 16 |
| HB (g/dl) | 8.8 | 8.6 | 8.5 | 8 | 7.8 | 7.6 | 7.2 | 7 |
| Лак (ммоль/Л) | 1.9 | 1.7 | 1.8 | 2.1 | 2.4 | 3.2 | 3.1 | 3.3 |
Таблица 1: результаты BGA в течение эксперимента. O = Оксигенатор, FA = бедренной артерии и IVC = нижней полой вены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ранее мы описали успешной моделью КПБ в мыши12,13. Для реализации такой модели для острой или терминальной стадии заболевания легких, мы разработали схемы Вено венозная Эмо easy-to-use для мышей. Различные модели КПБ, Вено венозная Эмо не требует сложных хирургических процедур, таких как стернотомии и пережатие аорты, тем самым уменьшая риск рана кровоточит в полностью гепаринизированным животных. Чтобы избежать эмболизации Оксигенатор с сгустки крови, 2,5 МЕ гепарин/кг предоставляется для каждого животного. Эта доза была основана на предыдущих измерений активированное время свертывания (ACT) показали полное антикоагуляционную крови (Закон > 800 сек). Из-за отсутствия покрытия гепарина в микро Оксигенатор наши Антисвертывающая протокол был сохранен аналогичного нашей процедуре КПБ.
По сравнению с КПБ цепи, мы могли бы сократить общий объем грунтовки до 0,5 мл путем уменьшения объема воздуха охотник и микро Оксигенатор. Кроме того необходимо сохранить адекватной оксигенации животного было медленнее потока. Интравазальное потеря объема крови привели к постепенной падение артериального давления. Добавление дополнительных 0,1 мл грунтование тома к животным привело к увеличению кровяного давления свыше 20 мм рт.ст., но всегда присутствовал небольшое линейное снижение артериального давления в течение следующих 30 мин. Объем замещения был вызван для, если воздух был всасывается через канюлю дренажа или падение артериального давления ниже 75 мм рт.ст..
Наиболее сложная проблема в хирургической процедуры для Эмо модель мыши является размещение канюля через левый яремной вены в МКВ. Установить этот метод, были протестированы различные типы канюли, и лапаротомии была исполнена в мыши трупов в идеальное позиционирование кончик канюли в МКВ непосредственно перед подвздошной бифуркации. Иногда в больших животных, размещение канюлю может привести к вывиха катетер в Вену правой почки. Тем не менее цельная кровь от всех сегментов МКВ могут быть хорошо дренированной, из-за боковой ярусе канюли.
В предварительных испытаниях мы провели катетеризации через бедренной вены. К сожалению, только 1-Fr катетер может быть помещен в бедренной вены, что приводит к неадекватным кровотока (≤ 1 мл/мин). 1-Fr катетеры толкнул в МКВ все отображаемые недостаточно противотока. Для достижения существенных противотока, оба бедренной вены будет нужно быть канюлированной; Таким образом мы отказались от этой процедуры и добиться адекватного слив через 2-Fr катетер, помещены в МКВ через яремной вены. Потери крови во время размещения канюли в яремной очень типично. Таким образом перед размещением, головной конец животных pad возникает 30-40°, поэтому обратного потока из Вены значительно уменьшается.
Постепенное снижение гемоглобина и гематокрита объясняется гемолиза и повторяющихся крови сэмплинги, принятых продемонстрировать производительность устройства. Для выживания экспериментов чтобы избежать переливаний крови, забор крови следует быть крайне ограниченный или даже избежать. Кроме того в конце эксперимента, кровь из Эмо цепи должен быть возвращен в животное. Однако живучести модели должен изучаться в отдельный проект, используя менее инвазивные протокол.
Поток крови во время нашего Эмо работает между 3 и 5 мл/мин нормальные мыши сердечного выброса, как сообщается, между 6 и 9 мл/мин; Таким образом в среднем, мы смогли достичь поток Эмо 54% мыши сердечного выброса. Обычно Вено венозная Эмо требуется меньший поток крови, по сравнению с Вено артериальная Эмо, как overperfusion правого предсердия может привести к перегрузке правого желудочка и, следовательно, сердечной недостаточности. Клинически чтобы добиться адекватной оксигенации, Вено венозная Эмо поток 50-75% сердечного выброса является достаточно для достаточной оксигенации в вентилируемых или самопроизвольно дыхание пациентов. Излишне увеличение Эмо потока может привести к более ущерб от Господа и гемолиз и бесполезно рециркуляции главной частью венозной крови между МКВ и SVC. Кроме того мы наблюдали, что путем увеличения потока в Вено венозная Эмо, чрезмерного отрицательного давления приводит к воздуха всасывание на сайте катетеризации. Наши животные получили 100% кислорода под изофлюрановая наркозом и с помощью Вено венозная Эмо, были, гипер кислородом. В нашей модели мы попытались воспроизвести условия «проснулся Эмо»4 имея меньше повреждение легких.
Молекулярные механизмы, участвующие в осложнений, связанных с Эмо теперь могут быть исследованы вследствие многочисленных штаммов генетически модифицированные мыши доступны. Есть также более чем восьмидесяти штаммов мышей с легких расстройств, которые могут имитировать Эмо в контексте этих основных заболеваний. Поэтому мы считаем, что наши Вено венозная эмо модель мыши может быть реализовано несколько синергических проектов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан KFO 311 грант от Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | in 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | in 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 IU per ml of priming |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotide artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1,3 -2,5% | |
| Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany | invasive pressure, ECG, t °C | |
| i-STAT portable device | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old | Charles River Laboratories | housed 1 week before |
References
- Hill, J. D., et al. Prolonged Extracorporeal Oxygenation for Acute Post-Traumatic Respiratory Failure (Shock-Lung Syndrome). New England Journal of Medicine. 286 (12), 629-634 (1972).
- Noah, M. A., et al. Referral to an Extracorporeal Membrane Oxygenation Center and Mortality Among Patients With Severe 2009 Influenza A(H1N1). Journal of the American Medical Association. 306 (15), 1659 (2011).
- Maslach-Hubbard, A., Bratton, S. L. Extracorporeal membrane oxygenation for pediatric respiratory failure: History, development and current status. World Journal of Critical. Care Medicine. 2 (4), 29-39 (2013).
- Langer, T., et al. "Awake" extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): pathophysiology, technical considerations, and clinical pioneering. Critical Care. 20 (1), 150 (2016).
- Esper, S. A.
- Millar, J. E., Fanning, J. P., McDonald, C. I., McAuley, D. F., Fraser, J. F. The inflammatory response to extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): a review of the pathophysiology. Critical Care. 20 (1), 387 (2016).
- Lubnow, M., et al. Technical complications during veno-venous extracorporeal membrane oxygenation and their relevance predicting a system-exchange--retrospective analysis of 265 cases. Public Library of Science One. 9 (12), e112316 (2014).
- Passmore, M. R., et al. Inflammation and lung injury in an ovine model of extracorporeal membrane oxygenation support. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), L1202-L1212 (2016).
- Vaquer, S., de Haro, C., Peruga, P., Oliva, J. C., Artigas, A. Systematic review and meta-analysis of complications and mortality of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation for refractory acute respiratory distress syndrome. Annals of Intensive Care. 7 (1), 51 (2017).
- Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 111 (1), 131-150 (2012).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovascular Pathology. 15 (6), 318-330 (2006).
- Madrahimov, N., et al. Novel mouse model of cardiopulmonary bypass. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 53 (1), 186-193 (2017).
- Madrahimov, N., et al. Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach. J. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
