Summary
Här presenterar vi ett protokoll som beskriver den teknik för veno-venös extrakorporeal membransyresättning (ECMO) i en icke-intuberade, spontant andning mus. Denna murina modell av ECMO kan genomföras effektivt i experimentella studier av akut och slutstadiet lungsjukdomar.
Abstract
Användning av extrakorporeal membransyresättning (ECMO) har ökat kraftigt under de senaste åren. ECMO har blivit en pålitlig och effektiv terapi för akut samt slutstadiet lungsjukdomar. Med ökningen av kliniska efterfrågan och långvarig användning av ECMO är processuella optimering och förebyggande av skador på flera organ av avgörande betydelse. Syftet med detta protokoll är att presentera en detaljerad teknik av veno-venös ECMO i en icke-intuberade, andas spontant mus. Detta protokoll visar den tekniska utformningen av ECMO och kirurgiska åtgärder. Denna murina ECMO-modell kommer att underlätta studiet av patofysiologi relaterade till ECMO (t.ex. inflammation, blödning och tromboemboliska händelser). På grund av överflödet av genetiskt modifierade möss, kan de molekylära mekanismerna som är involverade i ECMO-relaterade komplikationer också vara dissekeras.
Introduction
Extrakorporeal membransyresättning (ECMO) är en tillfällig livsuppehållande system tar över fungerar av lungor och hjärta för att möjliggöra adekvat gasutbyte och perfusion. Hill et al1 beskrivs den första användningen av ECMO patienter 1972; men blev det bara används allmänt efter sin framgångsrika ansökan under den H1N1 influensan pandemin 20092. Idag används rutinmässigt ECMO som livräddande förfarande i slutstadiet hjärt- och lung sjukdomar3. Veno-venös ECMO är alltmer anställd som ett alternativ till invasiv mekanisk ventilation i vaken, icke-intuberade, patienter med refraktär andningssvikt4.
Trots dess utbrett införande, har olika komplikationer rapporterats för ECMO5,6,7. Komplikationer som kan upplevas av patienter på ECMO är blödning, trombos, sepsis, trombocytopeni, enhet-relaterade störningar och luftemboli. En systemisk inflammatorisk reaktion syndrom (SIRS) vilket resulterar i flera organskador är dessutom väl beskrivna både kliniskt och i experimentella studier8,9. Neurologiska komplikationer såsom hjärnan infarkt rapporteras också ofta hos patienter som genomgår långvarig ECMO behandling. För att förvirra frågor, är det ofta svårt att urskilja om komplikationer orsakade av ECMO själv eller uppkommer av underliggande sjukdomar som åtföljer akut och slutstadiet sjukdomar.
För att specifikt studera effekterna av ECMO på en frisk organism, måste en pålitlig experimentell djurmodell fastställas. Det finns mycket få rapporter på utförandet av ECMO på smådjur och alla begränsade till råttor. Hittills har har ingen musmodell av ECMO beskrivits i litteraturen. På grund av tillgången till ett stort antal genetiskt modifierade mus stammar, skulle inrättandet av en musmodell ECMO tillåta ytterligare utredning av molekylära mekanismer involverade i ECMO-relaterade komplikationer10,11.
Baserat på våra tidigare beskrivna murina modell hjärt bypass (CPB)12, har vi utvecklat en stabil metod för veno-venös ECMO i icke-intuberade, andas spontant möss. ECMO kretsen (figur 1), som innehåller utflöde och inflöde kanyler, en Peristaltisk pump, oxygenator och air-trapping reservoar, är liknar våra tidigare beskrivna modellen av murina CPB12 med undantag för att ha en mindre priming volym (0,5 mL). Detta protokoll visar den detaljerade tekniker, fysiologiska övervakning och blod gasar analys en framgångsrik ECMO-förfarande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten utfördes på manliga C57BL/6 möss, åldern 12 veckor. Denna studie genomfördes i enlighet med riktlinjerna i den tyska djur lagen enligt protokollet TSA 16/2250.
1. material förberedelse
Obs: Alla åtgärder utförs under rena, icke-sterila förhållanden. Sterila förhållanden skulle krävas om djuret är att vara överlevde postoperativt.
- Införa 3 fenestrations i en 2-Fr polyuretan slang med en kirurgisk kniv under ett Mikroskop med 16 X förstoring.
Obs: Alla fenestrations måste finnas i den distala tredjedelen av kanylen att säkerställa optimal blod dränering. - Bered den priming (Material tabell). Inkludera 30 IE/mL heparin och 2,5% v/v av en 8,4% lösning av NaHCO3. Kylskåp denna lösning vid 4 ° C tills den är klar att använda. Ladda kretsen med 500 uL priming lösning.
- Utflöde kanylen i priming lösning och fyll ECMO maskinen genom att byta på den peristaltiska pumpen. Fortsätta att cirkulera priming lösningen genom maskinen för de nästa 30 min med en flödeshastighet av 1 mL/min.
- Ger 0,5 L/min 100% syre till oxygenator.
2. anestesi
- Plats djuret i en induktion kammare fylld med en 2,5% v/v isofluran och oxygen. Ge 0,5 L/min 100% syre till spridare. Före operation, kontrollera att narkos uppnås genom att testa pedal tillbakadragande och smärta reflexer. Tillämpa ögongel torkning kan skadas.
- Använd en värmande pad för att upprätthålla kroppstemperaturen vid 37 ° C.
- Utföra inandning mask anestesi med en isofluran spridare och injicera 5 mg/kg karprofen subkutant.
- Regelbundet Observera spontan andning och justera koncentrationen av isofluran så att det är mellan 1,3 och 2,5%.
3. kirurgi
- Utsätta den vänstra halsvenen med en lateral huden snitt 4 mm med hjälp av fina sax på vänster sida av halsen. Tillsammans med vassa och trubbiga Tillredning via micro-tången och bomull svabb, använda bipolär koagulering i de små blodkärlen.
- När vänster halsvenen utsätts, ligera den distala delen med en 8-0 silk sutur med hjälp av mikro-pincett.
- Placera en slip Knut på den proximala änden av venen. Incisionsfilm den främre väggen i venen med mikro-sax.
- För att uppnå full heparinization, injicera 2,5 IE per g heparin i halsvenen via en 26 G braunula.
- Höja den head sidan av animaliskt pad med 30° för att undvika kraftig blodförlust från venen under införande av kanylen.
- Infoga en 2-Fr polyuretan (PU) kanyl i den proximala delen av halsvenen, rotera den något medan skjuta den till ett djup av 4 cm; samtidigt göra det, kommer att iliaca bifurkation av sämre vena cava (IVC) nås.
- Fäst kanylen med 8-0 silk knop med microforceps.
- Exponera rätt halsvenen med stegen som beskrivs i 3.1, 3.2 och 3.3.
- Cannulate rätt halsvenen med en 1-Fr PU kanyl och försiktigt flytta den 5 mm mot riktningen av höger förmak.
- Upprepa steg 3,7.
- Catheterize vänster femoralartären med en annan 1-Fr PU kanyl och använda den för invasiv pressar övervakning samt blodprovstagning för blod gasar analys (BGA).
- Infoga elektrokardiogram (EKG) nålar ansluten till en anordning för förvärv av uppgifter subkutant i båda frambenen och till vänster bröstkorg väggen.
- Infoga en rektal termometer ansluten till en anordning för förvärv av uppgifter.
4. Veno-venös extrakorporeal membransyresättning och blod gasar analys
Obs: För en schematisk av komplett ECMO kretsen, se figur 1.
- Inleda ECMO på djuret genom att vrida på pumpen med ett inledande flöde 0,1 mL/min. justera flödet klassar av pumpen inom de nästa 2 min till 3-5 mL/min.
- Vid air sug i utflödet kanylen via webbplatsen kanylering, minska flödet och tillsätt 0,1 mL priming lösning till kretsen via en air-trapping behållare.
- Under stabilt flöde, fortsätta att övervaka i realtid läge alla vitala parametrar via enhetens data förvärv.
- Ständigt observera backflöde från venös dränering och övervaka nivån på blodet i reservoaren luft-trapper.
- Samla in blod läcker från sår in en 1 cc spruta med spetsen på en 24 G branula andreturn det till ECMO kretsen via air-trapping reservoaren.
- För BGA, Använd en blod provtagning för att samla ca 75 µL av arteriellt blod vid följande tidpunkter och från följande platser:
- 10 min efter inledningen av ECMO, samla blod från IVC via en extra rör byggdes innan oxygenator, via liknande extra rör efter oxygenator (kontroll), och direkt från femoralartären.
- 30 min efter inledningen av ECMO, samla blod från femoralartären.
- Ge extra 0,1 mL av priming lösning att kompensera intravasal flytande förlust varje 45 min via luft-trapper eller lårbensartären kateter eller genom att suga luftbubblor genom blod dränerande kanylen.
- För BGA, Använd en blod provtagning för att samla ca 75 µL av arteriellt blod:
- 1 h efter inledningen av ECMO från femoralartären.
- 2 h efter inledningen av ECMO, samla blod från IVC via en extra rör byggdes innan oxygenator, via liknande extra rör efter oxygenator (kontroll), och direkt från femoralartären.
- Efter 2 h, minska flödet på pumpen gradvis (under loppet av 5 min), därmed stoppa ECMO.
- Fortsätta att registrera viktiga parametrar för en annan 10 min.
- Avsluta experimentet med exsanguinating djur och skörd i blod och organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det här protokollet beskriver metoden för veno-venös ECMO i en mus. Denna modell är tillförlitliga och reproducerbara, och jämfört med våra tidigare beskrivna modell av CPB med andnings-och cirkulationsstillestånd12,13, är det mindre tekniskt krävande att upprätta.
ECMO flödet i det venösa systemet bibehölls mellan 1,5 och 5 mL/min. Det genomsnittliga arteriella trycket hölls mellan 70 och 85 mmHg genom att lägga till extra priming lösning in i ECMO-krets. Vanligtvis, tillåter tillägg av 0,1 mL av priming lösning till kretsen under ECMO substitution av blodvolymen. Alla volym att ersätta eller buffring lösningar gavs via femoralisartären eller air-trapping reservoar.
Fysiologiska parametrar registrerades varje 10 min och data från en representant som ECMO experimentera presenteras i figur 2. BGA data från en framgångsrik ECMO visas i tabell 1.
Hematologiska parametrar visade relevanta hemodilution under ECMO; men var ingen blodtransfusion nödvändigt att kompensera för måttlig anemi (tabell 1). Syresättningen parametrar från BGA visade korrekt utförande av oxygenator på en syre/luft blandningen på FiO2 1.0 (tabell 1).
Metabola förändringar under ECMO visade respiratorisk alkalos i början och måttlig acidos i slutet av experimentet (tabell 1). Inga extra buffert i blodet utfördes.
Figur 1: ECMO layout i en mus. Blod är dräneras från den sämre vena cava (IVC) via den vänstra halsvenen och syresatt blod pumpas in den överlägsna vena cava (SVC) via den rätta halsvenen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: fysiologiska parametrar mättes under 2 h av ECMO. En = hjärtfrekvens, B = genomsnittliga arteriella trycket (VS = volym substitution), och C = rektaltemperatur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 10 min | 30 min | 1 h | 2 h | |||||
| Parametrar | O | FA | IVC | FA | FA | O | FA | IVC |
| pH | 7,67 | 7,51 | 7.31 | 7,57 | 7.5 | 7,6 | 7,57 | 7.34 |
| pCO2 (mmHg) | 24,5 | 24 | 52 | 26 | 25 | 22 | 26 | 51,1 |
| pO2 (mmHg) | 707 | 656 | 135 | 643 | 621 | 638 | 573 | 101 |
| HCO3 (mmol/L) | 28,3 | 25,3 | 26 | 24 | 23 | 27 | 23 | 25 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 99 | 100 | 100 | 100 | 100 | 98 |
| HCT (%) | 24 | 23 | 23 | 20 | 18 | 17 | 17 | 16 |
| HB (g/dl) | 8,8 | 8,6 | 8,5 | 8 | 7,8 | 7,6 | 7.2 | 7 |
| Lac (mmol/L) | 1.9 | 1.7 | 1.8 | 2.1 | 2.4 | 3.2 | 3.1 | 3.3 |
Tabell 1: BGA resultat under loppet av experimentet. O = oxygenator, FA = lårbensartären och IVC = sämre vena cava.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare har beskrivit vi en framgångsrik modell för CPB i en mus12,13. Att genomföra en sådan modell för akut eller slutstadiet lungsjukdomar som vi utvecklat en lätt-till-använda veno-venös ECMO krets för möss. Olika till CPB modellen, veno-venös ECMO kräver inte komplicerade kirurgiska ingrepp såsom sternotomi och fastspänning av aorta, vilket minskar risken för sår blödning i ett fullt hepariniserad djur. För att undvika embolisering av oxygenator med blodproppar, ges 2,5 IE heparin/kg till varje djur. Denna dos baserades på tidigare mätningar av den aktiverad koagulationstid (ACT) som visade full antikoagulation av blod (agera > 800 SEK). På grund av avsaknad av heparin beläggning i den mikro-oxygenator hölls vårt antikoagulation protokoll liknande våra CPB förfarandet.
I jämförelse med den CPB kretsen, kan vi minska övergripande priming volym till 0,5 mL genom att minska volymen av luft-trapper och mikro-oxygenator. Dessutom var ett långsammare flöde nödvändigt att hålla tillräcklig syresättning av djuret. Intravasal förlust av blodvolymen resulterade i en gradvis nedgång av genomsnittlig artärtryck. Lägga till en extra 0,1 mL av priming volym till djuret ledde till en ökning av blodtryck över 20 mmHg, men en liten linjär minskning i blodtryck över de nästa 30 min var alltid närvarande. Volym substitution kallades för om luft sögs genom dränering kanylen eller det var ett blodtrycksfall under 75 mmHg.
Den svåraste utmaningen i det kirurgiska ingreppet för ECMO musmodell är placeringen av kanylen via den vänstra halsvenen i IVC. För att fastställa denna metod, olika typer av kanyler testades och en laparotomi utfördes i mus kadaver till perfekt positionering av kanyl spetsen i IVC strax före iliaca bifurkation. Ibland, i större djur, kan placering av kanylen leda till förskjutningar av kanylen i högra njuren venen. Dock kunde hela blod från alla segment av IVC vara väldränerad på grund av sida fenestrations av kanylen.
I preliminära prövningar utfört vi kanylering via femoral ven. Tyvärr, bara en 1-Fr kanyl kan placeras i femorala venen, vilket resulterar i otillräcklig blodflödet (≤ 1 mL/min). 1-Fr katetrar tryckte i IVC alla visas tillräckliga återflöde. För att uppnå betydande återflöde, skulle båda femorala vener behöva vara kanylerade; därför vi övergav proceduren och uppnått tillräcklig dränering via en 2-Fr kanylen placeras i IVC via halsvenen. Blodförlust under placeringen av kanylen i halsvenen är mycket typiskt. Därför innan placering, är huvudändan av animaliskt pad upp 30-40°, så backflöde från venen reduceras avsevärt.
En gradvis minskning i hemoglobin och hematokrit förklaras av hemolys och repetitiva blod provtagningar att demonstrera prestanda för enheten. För överlevnad experiment, för att undvika blodtransfusioner, blodprovstagning bör vara extremt begränsas eller även undvikas. Dessutom vid slutet av experimentet, ska blodet från ECMO kretsen returneras till djuret. Överlevnadsförmåga av modellen har dock studeras i ett separat projekt som använder en mindre invasiv protokoll.
Blodflödet under våra ECMO-körningar var mellan 3 och 5 mL/min. Normal mus hjärtminutvolym rapporteras vara mellan 6 och 9 mL/min; Därför, i genomsnitt kunde vi uppnå en ECMO flödet av 54% av musens hjärtminutvolym. Vanligtvis kräver veno-venös ECMO lägre blodflöde jämfört veno-arteriell ECMO, eftersom overperfusion av höger förmak kan leda till höger kammare överbelastning och följaktligen hjärtsvikt. Kliniskt, för att uppnå adekvat syresättning, är ett veno-venös ECMO-flöde 50-75% av hjärtminutvolym tillräckligt för tillräcklig syresättning i ventilerade eller spontant andning patienter. Onödan öka ECMO flödet kan leda till fler skador orsakade av SIRS och hemolys och värdelös återcirkulation av större delen av venöst blod mellan IVC och SVC. Dessutom observerade vi att genom att öka av flödet i den veno-venös ECMO, överdrivet negativa tryck leder till luft sug på platsen för kanylering. Våra djur fick 100% oxygen under isofluran anestesi, och med hjälp av veno-venös ECMO, var hyper-syresatt. I vår modell har vi försökt att reproducera förhållanden ”vaken ECMO”4 med mindre skada på lungorna.
De molekylära mekanismerna som är involverade i ECMO-relaterade komplikationer kan nu utredas på grund av överflödet av genmodifierad mus stammar tillgängliga. Det finns också mer än åttio stammar av möss med lungsjukdomar som kan simulera ECMO i samband med dessa underliggande sjukdomar. Därför anser vi att vår veno-venös ECMO musmodell får genomföras i flera samverkande projekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt stöds av KFO 311 Grant från Deutsche Forschungsgemeinschafts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | in 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | in 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 IU per ml of priming |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotide artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1,3 -2,5% | |
| Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany | invasive pressure, ECG, t °C | |
| i-STAT portable device | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old | Charles River Laboratories | housed 1 week before |
References
- Hill, J. D., et al. Prolonged Extracorporeal Oxygenation for Acute Post-Traumatic Respiratory Failure (Shock-Lung Syndrome). New England Journal of Medicine. 286 (12), 629-634 (1972).
- Noah, M. A., et al. Referral to an Extracorporeal Membrane Oxygenation Center and Mortality Among Patients With Severe 2009 Influenza A(H1N1). Journal of the American Medical Association. 306 (15), 1659 (2011).
- Maslach-Hubbard, A., Bratton, S. L. Extracorporeal membrane oxygenation for pediatric respiratory failure: History, development and current status. World Journal of Critical. Care Medicine. 2 (4), 29-39 (2013).
- Langer, T., et al. "Awake" extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): pathophysiology, technical considerations, and clinical pioneering. Critical Care. 20 (1), 150 (2016).
- Esper, S. A. Extracorporeal Membrane Oxygenation. Advances in Anesthesia. 35 (1), 119-143 (2017).
- Millar, J. E., Fanning, J. P., McDonald, C. I., McAuley, D. F., Fraser, J. F. The inflammatory response to extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): a review of the pathophysiology. Critical Care. 20 (1), 387 (2016).
- Lubnow, M., et al. Technical complications during veno-venous extracorporeal membrane oxygenation and their relevance predicting a system-exchange--retrospective analysis of 265 cases. Public Library of Science One. 9 (12), e112316 (2014).
- Passmore, M. R., et al. Inflammation and lung injury in an ovine model of extracorporeal membrane oxygenation support. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), L1202-L1212 (2016).
- Vaquer, S., de Haro, C., Peruga, P., Oliva, J. C., Artigas, A. Systematic review and meta-analysis of complications and mortality of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation for refractory acute respiratory distress syndrome. Annals of Intensive Care. 7 (1), 51 (2017).
- Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 111 (1), 131-150 (2012).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovascular Pathology. 15 (6), 318-330 (2006).
- Madrahimov, N., et al. Novel mouse model of cardiopulmonary bypass. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 53 (1), 186-193 (2017).
- Madrahimov, N., et al. Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach. J. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
