Summary
本文介绍了一种非插管、自发呼吸小鼠静脉-静脉体外膜氧合 (ECMO) 技术的协议。这种小鼠 ECMO 模型可在急性和终末期肺部疾病的实验研究中得到有效的实施。
Abstract
近年来, 体外膜氧合 (ECMO) 的使用大幅度增加。ECMO 已成为急性和终末期肺部疾病的可靠和有效的治疗方法。随着临床需求的增加和 ECMO 的长期使用, 对多器官损伤的程序优化和预防具有重要的意义。本协议的目的是在非插管、自发呼吸的小鼠中提出静脉静脉 ECMO 的详细技术。本协议展示了 ECMO 和手术步骤的技术设计。这种小鼠 ECMO 模型将有助于研究与 ECMO 相关的病理生理学 (如炎症, 出血和血栓栓塞事件)。由于基因修饰小鼠的丰富性, ECMO 相关并发症的分子机制也可以被解剖。
Introduction
体外膜氧化 (ECMO) 是一种临时的生命支持系统, 接管肺和心脏的功能, 以允许适当的气体交换和灌注。希尔 et al1描述了1972年首次使用 ECMO 患者;然而, 它仅在22009年在甲型h1n1 流感大流行期间成功应用后才得到广泛使用。今天, ECMO 通常被用作在末期心脏病和肺部疾病3的救生程序。静脉静脉 ECMO 被越来越多地用于在清醒, 非插管, 自发性呼吸衰竭患者4的侵入性机械通气的替代。
尽管其广泛采用, ECMO5,6,7报告了各种各样的复杂化。ECMO 患者可能经历的并发症包括出血、血栓、败血症、血小板减少症、与设备有关的故障和空气栓塞。此外, 全身炎症反应综合征 (sir) 导致多器官损害是很好地描述了临床和实验研究8,9。在长期 ECMO 治疗的患者中也经常报告神经并发症, 如脑梗死。混淆问题, 通常很难区分并发症是由 ECMO 本身引起的, 还是源于伴随着急性和终末期疾病的基础紊乱。
为了具体研究 ECMO 对健康机体的影响, 必须建立可靠的实验动物模型。很少有关于 ECMO 在小动物身上的性能的报告, 都只限于老鼠。迄今为止, 文献中没有描述 ECMO 的小鼠模型。由于大量的转基因小鼠菌株的可用性, 建立一个小鼠 ECMO 模型将允许进一步调查涉及 ECMO 相关并发症的分子机制10,11。
根据我们先前描述的小鼠体外循环 (CPB) 模型12, 我们开发了一种稳定的静脉-静脉 ECMO 的方法, 在非插管, 自发呼吸鼠。ECMO 电路 (图 1), 包含流出和流入套管, 蠕动泵, 肺和气陷油藏, 类似于我们以前描述的小鼠 CPB12模型, 除了有一个较小的启动容积 (0.5 毫升)。该协议演示了在成功的 ECMO 过程中涉及的详细技术、生理监测和血气分析。
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Protocol
对雄性 C57BL/6 小鼠进行了实验, 年龄为12周。这项研究是按照《 TSA 16/2250 议定书》规定的德国动物法准则进行的。
1. 材料制备
注: 所有步骤均在清洁、非灭菌条件下执行。如果动物在术后存活, 将需要无菌条件。
- 使用16X 放大显微镜下的手术刀片, 将 3 fenestrations 引入2阻燃聚氨酯管中。
注意: 所有 fenestrations 必须位于套管的远端第三, 以确保最佳的血液引流。 - 准备启动液 (材料表)。包括 30 IU/毫升肝素和2.5% 伏/v 的8.4% 溶液的 NaHCO3。将此解决方案冷藏4摄氏度, 直到它可以使用。使用 500 uL 的启动解决方案对电路进行质数处理。
- 将流出套管放入启动液中, 并通过切换蠕动泵填充 ECMO 机。以1毫升/分钟的流速继续在机器上循环启动液, 接下来的30分钟。
- 给肺0.5 升/分钟100% 氧气。
2. 麻醉
- 将动物放置在充满2.5% 伏异氟醚/氧混合物的感应室中。为蒸发器提供100% 氧气的0.5 升/分钟。在手术前, 检查是否通过测试踏板撤回和疼痛反射来实现全身麻醉。涂抹眼凝胶, 防止干燥损坏。
- 使用暖垫保持体温在37摄氏度。
- 使用异氟醚蒸发器进行吸入面罩麻醉, 并注射5毫克/千克卡洛芬皮下注射。
- 定期观察自发呼吸, 调整异氟醚浓度, 使其介于1.3 和2.5% 之间。
3. 手术
- 通过在颈部左侧的细剪刀的帮助下, 使用4毫米的侧向皮肤切口暴露左颈静脉。使用微钳和棉签进行尖锐而钝的制备, 用小容器的双极性凝固。
- 一旦左颈静脉被暴露, 结扎远端部分使用8-0 丝缝合与帮助的微钳。
- 在静脉的近端放置一个滑移结。用微剪刀切割静脉前壁。
- 为达到完全肝素化, 通过 26 g braunula, 将 2.5 IU/g 肝素注入颈静脉。
- 通过30°提高动物垫的头部一侧, 以避免插入套管时静脉过度失血。
- 将 2-阻燃聚氨酯 (PU) 套管插入颈静脉的近端部, 将其略微旋转, 同时将其推至4厘米的深度;在这样做时, 将达到下腔静脉 (IVC) 的髂分岔。
- 使用 microforceps 固定8-0 丝结的套管。
- 使用3.1、3.2 和3.3 中描述的步骤暴露右颈静脉。
- 加压右颈静脉与 1-Fr PU 套管, 轻轻地移动它5毫米朝向右心房的方向。
- 重复步骤3.7。
- 导尿左股动脉与另一个 1-Fr PU 套管, 并使用它进行侵入性压力监测, 以及血液取样的血液气体分析 (BGA)。
- 插入心电图 (ECG) 针连接到一个数据采集装置皮下注射到两个前肢和左胸壁。
- 插入与数据采集设备连接的直肠温度计。
4. 静脉导管体外膜氧合及血气分析
注: 有关完整 ECMO 电路的示意图, 请参见图 1。
- 启动 ECMO 在动物上打开泵的初始流速为0.1 毫升/分钟. 在接下来的2分钟内调节泵的流速至3-5 毫升/分钟。
- 在排出套管中通过插管现场吸入空气时, 通过气藏储层减少流量并将0.1 毫升的启动溶液添加到电路中。
- 在稳定的流量下, 通过数据采集装置继续实时监控所有重要参数。
- 不断观察从静脉引流回流和监测在空气捕手水库的血液水平。
- 收集从伤口的任何血液泄漏到一个1毫升注射器与尖端的 24 G 布拉努拉返回它到 ECMO 电路通过空气俘获水库。
- 对于 BGA, 使用血液取样盒在以下时间点和以下位置收集大约75µL 的动脉血:
- ECMO 启动后10分钟, 通过肺前内置的额外管, 从静脉内采集血液, 通过肺 (控制) 后的类似额外管, 直接从股动脉中取血。
- ECMO 启动后30分钟, 从股动脉中收集血液。
- 给一个额外的0.1 毫升的启动解决方案, 以补偿 intravasal 液体损失每45分钟通过空气捕手或股动脉导管或通过吸空气气泡通过血液排出套管。
- 对于 BGA, 使用血液取样盒收集大约75µL 的动脉血:
- ECMO 从股动脉启动后1小时。
- 2小时 ECMO 启动后, 通过肺前内置的额外管从静脉内采集血液, 通过肺 (控制) 后的类似额外管, 直接从股动脉中取血。
- 2小时后, 逐渐降低泵的流速 (5 分钟以上), 从而停止 ECMO。
- 继续记录重要参数10分钟。
- 通过 exsanguinating 动物和采集血液和器官来完成实验。
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Representative Results
本协议描述了小鼠静脉 ECMO 的方法。这个模型是可靠的和可重现的, 并与我们先前描述的体外循环呼吸和循环阻滞模型12,13, 它是不太技术上要求建立。
ECMO 在静脉系统中的流动保持在1.5 和5毫升/分钟之间。通过在 ECMO 电路中加入额外的启动液, 将平均动脉压力保持在70到85毫米汞柱之间。通常情况下, 在 ECMO 期间添加0.1 毫升的启动溶液, 可以替代血量。所有体积替代或缓冲溶液通过股骨动脉或气藏储层给出。
每10分钟记录一次生理参数, 并在图 2中给出了代表性 ECMO 实验的数据。成功 ECMO 的 BGA 数据如表 1所示。
血液学参数显示 ECMO 中的相关血液稀释;然而, 没有输血是必要的, 以补偿中度贫血 (表 1)。BGA 中的氧合参数在 FiO2 1.0 (表 1) 中显示了肺在氧气/空气混合物中的正确性能。
在 ECMO 期间的新陈代谢变化显示呼吸性碱中毒在开始和中度酸中毒在实验结束时 (表 1)。没有对血液进行额外的缓冲。
图 1: 鼠标中的 ECMO 布局.血液从下腔静脉 (IVC) 通过左颈静脉排出, 氧合血通过右颈静脉泵入上腔静脉 (SVC)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 在 ECMO 2 小时内测量的生理参数.A = 心率, B = 平均动脉压力 (VS = 体积置换), C = 直肠温度。请点击这里查看这个数字的更大版本.
| 10分 | 30分 | 1小时 | 2小时 | |||||
| 参数 | O | 发 | IVC | 发 | 发 | O | 发 | IVC |
| Ph | 7.67 | 7.51 | 7.31 | 7.57 | 7。5 | 7。6 | 7.57 | 7.34 |
| pCO2 (毫米汞柱) | 24。5 | 24 | 52 | 26 | 25 | 22 | 26 | 51。1 |
| pO2 (毫米汞柱) | 707 | 656 | 135 | 643 | 621 | 638 | 573 | 101 |
| HCO3 (毫摩尔/升) | 28。3 | 25。3 | 26 | 24 | 23 | 27 | 23 | 25 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 99 | 100 | 100 | 100 | 100 | 98 |
| 红细胞 (%) | 24 | 23 | 23 | 20 | 18 | 17 | 17 | 16 |
| Hb (克/dl) | 8。8 | 8。6 | 8。5 | 8 | 7。8 | 7。6 | 7。2 | 7 |
| Lac (毫摩尔/升) | 1。9 | 1。7 | 1。8 | 2。1 | 2。4 | 3。2 | 3。1 | 3。3 |
表 1: 在实验过程中的 BGA 结果.O = 肺, FA = 股动脉, 和静脉 = 下腔静脉。
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Discussion
以前, 我们描述了一个成功的模型的 CPB 在鼠标12,13。为了实现急性或终末期肺部疾病的这种模式, 我们开发了一个易于使用的静脉-静脉 ECMO 电路的小鼠。不同于 CPB 模型, 静脉静脉 ECMO 不需要复杂的手术程序, 如胸骨和夹紧的主动脉, 从而减少伤口出血的风险在一个完全肝素化的动物。为避免肺血栓栓塞, 每只动物可获得 2.5 IU 肝素/千克。这种剂量是基于以前的活性凝血时间 (act) 的测量显示血液的完全抗凝血 (act > 800 秒)。由于微肺中缺乏肝素涂层, 我们的抗凝治疗方案与我们的 CPB 程序保持一致。
与 CPB 电路相比, 通过减少空气捕手器和微肺的体积, 我们可以将总启动体积降低到0.5 毫升。此外, 更慢的流动是必要的, 以保持足够的氧气的动物。Intravasal 失血量导致平均动脉压力逐渐下降。增加额外的0.1 毫升的启动体积的动物导致血压增加超过20毫米汞柱, 但在未来30分钟的动脉压力小线性减少总是存在。如果空气被吸进引流套管, 或者在75毫米汞柱以下的血压下降, 则要求进行体积置换。
在小鼠 ECMO 模型的手术过程中, 最困难的挑战是将导管通过左颈静脉植入到静脉内。为了建立这种方法, 对不同类型的套管进行了测试, 并在小鼠尸体上进行了剖腹手术, 以便在髂分岔前将导管尖端定位到静脉内。有时, 在较大的动物中, 套管的放置会导致导管脱位到右肾静脉。然而, 从静脉的所有部分的全血可能是良好的排水由于套管的侧 fenestrations。
在初步试验中, 我们通过股静脉进行插管。不幸的是, 只有 1-Fr 套管可以放置到股静脉, 导致血液流量不足 (≤1毫升/分钟)。1-Fr 导管推入下腔所有显示的回流不足。要实现大量回流, 两股静脉都需要中空;因此, 我们放弃了这个程序, 并通过颈静脉放置在静脉内的 2-Fr 套管达到足够的排泄。在导管放置到颈静脉的血液损失是非常典型的。因此, 在放置前, 动物垫的头端被提高 30-40°, 因此从静脉回流明显减少。
血红蛋白和红细胞压积的逐渐减少是通过溶血和重复血液采样来证明设备的性能来解释的。对于生存实验, 为了避免输血, 血液取样应极其有限甚至避免。此外, 在实验结束时, ECMO 回路中的血液应返回到动物身上。然而, 模型的生存性必须在一个单独的项目中使用一个较少侵入的协议进行研究。
在我们的 ECMO 运行期间的血流量是在3和5毫升/分钟. 正常小鼠心脏输出报告在6和9毫升/分钟之间;因此, 平均而言, 我们能够实现54% 的鼠标的心脏输出的 ECMO 流。通常情况下, 静脉静脉 ECMO 需要较低的血流量与静脉动脉 ECMO 相比, 右心房的 overperfusion 可能导致右心室超负荷, 因此, 心力衰竭。临床上, 为了达到足够的氧合, 在通风或自发呼吸的患者中, 50-75% 心脏输出的静脉静脉 ECMO 流量足以满足足够的氧合。不必要地增加 ECMO 流可能导致更多的损害由先生和溶血和无用循环的静脉血液的主要部分在 IVC 和 SVC 之间。此外, 我们观察到, 通过增加静脉静脉 ECMO 的流动, 过量的负压导致在插管部位吸入空气。我们的动物在异氟醚麻醉下接受了100% 氧气, 在静脉静脉 ECMO 的帮助下, 是超氧的。在我们的模型中, 我们尝试重现 "清醒 ECMO"4的条件, 对肺部的伤害较小。
由于有大量的转基因小鼠菌株, 现在可以调查涉及 ECMO 相关并发症的分子机制。也有超过八十株的肺紊乱的小鼠可能模拟 ECMO 在这些基础疾病的背景下。因此, 我们认为, 我们的静脉静脉 ECMO 小鼠模型可以在多个协同项目中实施。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目得到了德意志科技的肯德基311赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | in 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | in 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 IU per ml of priming |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotide artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1,3 -2,5% | |
| Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany | invasive pressure, ECG, t °C | |
| i-STAT portable device | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old | Charles River Laboratories | housed 1 week before |
References
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