Summary
Nous présentons ici un protocole décrivant les technique d’oxygénation par membrane extracorporelle veino-veineuse (ECMO) dans un non-intubés, spontanément les souris de la respiration. Ce modèle murin d’ECMO peut être implémenté efficacement dans des études expérimentales de l’aigu et les pneumopathies terminale.
Abstract
L’utilisation d’oxygénation extracorporelle (ECMO) a considérablement augmenté ces dernières années. ECMO est devenu une thérapie efficace et fiable pour les aigus ainsi que les pneumopathies terminale. Avec l’augmentation de la demande clinique et l’utilisation prolongée d’ECMO, optimisation procédurale et prévention des dommages de plusieurs organes sont d’une importance cruciale. Le but du présent protocole est de présenter une technique détaillée d’une ECMO veino-veineuse dans un non-intubés, respirant spontanément des souris. Ce protocole illustre la conception technique de l’ECMO et étapes chirurgicales. Ce modèle murin d’ECMO facilitera l’étude de la physiopathologie associé à ECMO (p. ex., inflammation, événements hémorragiques et thromboemboliques). En raison de l’abondance des souris génétiquement modifiées, les mécanismes moléculaires impliqués dans les complications liées à l’ECMO peuvent également être disséqués.
Introduction
Oxygénation extracorporelle (ECMO) est un système de support de vie temporaire qui reprend les fonctions des poumons et cœur pour permettre la perfusion et échanges gazeux adéquat. Hill et al.1 décrit la première utilisation de l’ECMO chez les patients en 1972 ; Cependant, il seulement est devenu employé couramment après sa candidature est retenue au cours de la grippe H1N1 en 20092. Aujourd'hui, l’ECMO est régulièrement utilisée comme une procédure de sauvetage dans le coeur de terminale et de maladies pulmonaires3. ECMO veino-veineuse est plus en plus employée comme alternative à une ventilation mécanique invasive dans éveillé, non-intubés, respirant spontanément des patients présentant une insuffisance respiratoire réfractaire4.
Malgré son adoption généralisée, diverses complications ont été signalées pour ECMO5,6,7. Les complications qui peuvent être vécues par les patients sous ECMO incluent hémorragie, thrombose, septicémie, thrombocytopénie, dysfonctionnements liés au dispositif et embolie gazeuse. En outre, un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) dommages multi-organes est bien décrit, tant sur le plan clinique et des études expérimentales8,9. Complications neurologiques tels qu’infarctus du cerveau sont également fréquemment rapportées chez les patients suivant une thérapie à long terme de l’ECMO. Pour compliquer les questions, il est souvent difficile de distinguer si les complications sont provoquées par ECMO lui-même ou surviennent des troubles sous-jacents accompagnant aiguë et maladies de terminale.
Etudier précisément les effets d’une ECMO sur un organisme en bonne santé, un modèle animal expérimental fiable s’impose. Il y a très peu de rapports sur le rendement d’une ECMO sur petits animaux et sont tous limités à des rats. A ce jour, aucun modèle de souris de l’ECMO n’a été décrite dans la littérature. En raison de la disponibilité d’un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiées, mise en place d’un modèle de souris ECMO permettrait davantage investigation des mécanismes moléculaires impliqués dans les complications liées à l’ECMO10,11.
Basés sur notre modèle murin décrite précédemment extra-corporelle (CEC)12, nous avons développé une méthode stable ECMO veino-veineuse dans non-intubés, respirant spontanément des souris. Le circuit ECMO (Figure 1), contenant les flux sortant et canules d’afflux, pompe péristaltique, oxygénateur et réservoir d’air-piégeage, est similaire à notre modèle décrit antérieurement de murin CPB12 , à l’exception d’avoir un amorçage plus petit volume (0,5 mL). Ce protocole montre les techniques détaillées, monitorage physiologique et analyse des gaz sanguins impliqué dans une procédure d’ECMO réussie.
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Protocol
Des expériences ont été effectuées sur des souris C57BL/6 mâles, âgés de 12 semaines. Cette étude a été réalisée conformément aux directives de la loi allemande de Animal sous protocole TSA 16/2250.
1. matériel préparation
Remarque : Toutes les étapes sont effectuées dans des conditions propres, non stériles. Il faudrait des conditions stériles si l’animal doit être survécu après l’opération.
- Introduire 3 fenestrations dans un tube polyuréthane 2-Fr en utilisant une lame chirurgicale sous une loupe avec un grossissement de 16 X.
Remarque : Tous les fenestrations doivent se trouver dans le tiers distal de la canule pour assurer un drainage sanguin optimal. - Préparer la solution d’amorçage (Table des matières). Parmi 30 UI/mL héparine et 2,5 % v/v d’une solution de 8,4 % de NaHCO3. Réfrigérer cette solution à 4 ° C jusqu'à ce qu’il est prêt à l’emploi. Réamorcer le circuit avec 500 uL de solution d’amorçage.
- Placer la canule de sortie dans la solution d’amorçage et remplir la machine en activant la pompe péristaltique. Continuer à faire circuler la solution d’amorçage par le biais de la machine pendant le prochaine 30 min à un débit de 1 mL/min.
- Donne 0,5 L/min d’oxygène de 100 % à l’oxygénateur.
2. anesthésie
- Place l’animal dans une chambre à induction rempli d’un mélange d’isoflurane/oxygène 2.5 % v/v. Fournir 0,5 L/min d’oxygène de 100 % pour le vaporisateur. Avant l’opération, vérifier que l’anesthésie complète est obtenue en testant les réflexes de retrait et de la douleur pédales. Appliquer le gel ophtalmique pour éviter d’endommager de séchage.
- Utiliser un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 ° C.
- Réaliser l’anesthésie de masque d’inhalation à l’aide d’un vaporisateur isoflurane et injecter le carprofène 5 mg/kg par voie sous-cutanée.
- Observer la respiration spontanée et régulièrement ajuster la concentration d’isoflurane, afin qu’il soit entre 1,3 et 2,5 %.
3. chirurgie
- Exposer la veine jugulaire gauche à l’aide d’une incision de la peau latérale de 4 mm à l’aide de ciseaux fines sur le côté gauche du cou. Avec tranchant et contondant préparation à l’aide de tampons de coton et micro-pinces, utiliser la coagulation bipolaire des petits vaisseaux.
- Une fois la veine jugulaire gauche affleure, ligaturer la partie distale à l’aide d’une suture de soie de 8-0 avec l’aide de micro-pinces.
- Placez un noeud de glissement à l’extrémité proximale de la veine. Inciser la paroi antérieure de la veine à l’aide de micro-ciseaux.
- Pour atteindre la pleine héparinisation, injecter héparine 2,5 UI/g dans la veine jugulaire via un braunula de 26 G.
- Soulever le côté tête du pad animal de 30° pour éviter la perte excessive de sang de la veine lors de l’insertion de la canule.
- Insérer une canule (PU) en polyuréthane de 2-Fr dans la partie proximale de la veine jugulaire, tournant légèrement tout en poussant à une profondeur de 4 cm ; Ce faisant, la bifurcation iliaque de la veine cave inférieure (VCI) sera atteint.
- Fixer la canule avec noeuds de soie 8-0 à l’aide des Micropinces.
- Exposer la veine jugulaire droite en suivant les étapes décrites dans 3.1, 3.2 et 3.3.
- Cathétériser la veine jugulaire droite avec une canule de PU 1-Fr et déplacez-la doucement 5 mm dans la direction de l’oreillette droite.
- Répétez l’étape 3,7.
- Section de l’artère fémorale gauche avec un autre canule de PU 1-Fr et utilisez-le pour invasive de la pression de surveillance ainsi que des prélèvements pour analyse des gaz sanguins (BGA).
- Emmancher électrocardiogramme (ECG) connecté à un périphérique d’acquisition de données par voie sous-cutanée dans les deux pattes avant et dans la paroi thoracique gauche.
- Insérez un thermomètre rectal, connecté à un périphérique d’acquisition de données.
4. oxygénation extracorporelle veino-veineuse et analyse des gaz sanguins
Remarque : Pour une représentation schématique du circuit ECMO complet, voir la Figure 1.
- Initier une ECMO sur l’animal en activant la pompe avec un débit initial de 0,1 mL/min. ajuster le débit de la pompe dans les prochaine 2 min à 3 à 5 mL/min.
- En cas d’aspiration d’air dans la canule de sortie via le site de canulation, réduire la circulation et ajouter 0,1 mL de solution d’amorçage du circuit via un réservoir d’air-piégeage.
- Sous flux stable, continuent de surveiller en temps réel tous les paramètres vitaux via le matériel d’acquisition de données.
- Constamment observer disconnecteur du drainage veineux et de surveiller le niveau du sang dans le réservoir d’air-trapper.
- Recueillir le sang suinte du plaies dans une seringue de 1 cc avec la pointe d’un G 24 branula andreturn il au circuit ECMO par le réservoir d’air-piégeage.
- Pour BGA, utiliser une cartouche de prélèvement d’échantillons de sang pour collecter environ 75 µL de sang artériel aux points suivants de temps et à partir des emplacements suivants :
- 10 min après l’ouverture de l’ECMO, recueillir le sang de l’IVC via un tube supplémentaire construit en avant de l’oxygénateur, par l’intermédiaire de tube supplémentaire analogue après oxygénateur (contrôle) et directement de l’artère fémorale.
- 30 min après l’ouverture de l’ECMO, recueillir le sang de l’artère fémorale.
- Donner une supplémentaire 0,1 mL de solution d’amorçage pour compenser la perte liquide intravasal toutes les 45 min via l’air-trappeur ou un cathéter dans l’artère fémorale ou en suçant les bulles d’air dans la canule de drainage sanguin.
- Pour BGA, utiliser une cartouche de prélèvement d’échantillons de sang pour collecter environ 75 µL de sang artériel :
- 1 h après l’ouverture d’une ECMO de l’artère fémorale.
- 2 h après le début de l’ECMO, recueillir le sang de l’IVC via un tube supplémentaire construit en avant de l’oxygénateur, par l’intermédiaire de tube supplémentaire analogue après oxygénateur (contrôle) et directement de l’artère fémorale.
- Après 2 h, réduire le débit de la pompe progressivement (au cours de 5 min), donc arrêt ECMO.
- Continuent d’enregistrer des paramètres vitaux pendant 10 min.
- Terminer l’expérience en exsanguinating de l’animal et la récolte du sang et des organes.
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Representative Results
Ce protocole décrit la méthode de l’ECMO veino-veineuse chez une souris. Ce modèle est fiable et reproductible et par rapport à notre modèle décrit antérieurement de CEC avec arrêt respiratoire et circulatoire12,13, il est moins techniquement difficile à établir.
ECMO débit dans le système veineux a été maintenu entre 1.5 et 5 mL/min. La pression artérielle moyenne a été maintenue entre 70 et 85 mmHg en ajoutant des solution d’amorçage supplémentaires dans le circuit ECMO. Généralement, l’apport de 0,1 mL de solution d’amorçage sur le circuit au cours de l’ECMO permet de substitution du volume sanguin. Tous les volume son remplacement ou mise en mémoire tampon des solutions ont été données via l’artère fémorale ou le réservoir d’air-piégeage.
Paramètres physiologiques ont été enregistrées toutes les 10 min et d’un représentant de l’ECMO expérimenter, les données sont présentées à la Figure 2. Données BGA d’une ECMO réussie sont indiquées dans le tableau 1.
Paramètres hématologiques ont montré hémodilution pertinente au cours de l’ECMO ; Toutefois, aucune transfusion sanguine n’était nécessaire pour compenser une anémie modérée (tableau 1). Paramètres d’oxygénation de BGA a démontré la bonne exécution de l’oxygénateur à un mélange oxygène/air à FiO2 1.0 (tableau 1).
Les changements métaboliques au cours de l’ECMO a montré une alcalose respiratoire au début et acidose modérée à la fin de l’expérience (tableau 1). Pas de supplément mise en mémoire tampon du sang a été effectuée.
Figure 1 : mise en page de l’ECMO chez une souris. Sang est vidée de la veine cave inférieure (VCI) via la veine jugulaire gauche et sang oxygéné est injecté dans la veine cave supérieure (SVC) via la veine jugulaire droite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : paramètres physiologiques mesurés durant 2 h d’ECMO. Une fréquence cardiaque de =, B = pression artérielle moyenne (VS = substitution de volume) et C = température rectale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| 10 min | 30 min | 1 h | 2 h | |||||
| Paramètres | O | FA | IVC | FA | FA | O | FA | IVC |
| pH | 7,67 | 7.51 | 7.31 | 7.57 | 7.5 | 7.6 | 7.57 | 7.34 |
| pCO2 (mmHg) | 24,5 | 24 | 52 | 26 | 25 | 22 | 26 | 51.1 |
| pO2 (mmHg) | 707 | 656 | 135 | 643 | 621 | 638 | 573 | 101 |
| HCO3 (mmol/L) | 28,3 | 25.3 | 26 | 24 | 23 | 27 | 23 | 25 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 99 | 100 | 100 | 100 | 100 | 98 |
| HCT (%) | 24 | 23 | 23 | 20 | 18 | 17 | 17 | 16 |
| HB (g/dl) | 8.8 | 8.6 | 8.5 | 8 | 7.8 | 7.6 | 7.2 | 7 |
| Lac (mmol/L) | 1,9 | 1.7 | 1.8 | 2.1 | 2.4 | 3.2 | 3.1 | 3.3 |
Tableau 1 : résultats BGA au cours de l’expérience. O = oxygénateur, FA = artère fémorale et VCI = veine cave inférieure.
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Discussion
Nous avons décrit précédemment, un modèle réussi de la DGPC dans une souris12,13. Pour mettre en œuvre un tel modèle pour aiguë ou des troubles pulmonaires de terminale nous avons développé un circuit ECMO veino-veineuse de facile à utiliser pour la souris. Différentes du modèle de la DGPC, veino-veineuse ECMO n’exige pas des interventions chirurgicales complexes comme sternotomie et clampage de l’aorte, réduisant ainsi le risque de blessure saignements chez un animal entièrement hépariné. Pour éviter une embolisation de l’oxygénateur avec caillots de sang, 2,5 UI d’héparine/kg est donné à chaque animal. Cette dose était fondée sur des mesures antérieures du temps de coagulation activé (ACT) qui a montré l’anticoagulation pleine du sang (agir > 800 s). En raison de l’absence de revêtement d’héparine dans le micro-oxygénateur, notre protocole anticoagulation est resté similaire à notre procédure CPB.
En comparaison avec le circuit de la DGPC, nous pourrions réduire l’ensemble volume d’amorçage à 0,5 mL en réduisant le volume de l’air-trappeur et micro-oxygénateur. En outre, un débit plus lent était nécessaire pour maintenir une oxygénation adéquate de l’animal. Intravasal perte de volume sanguin a entraîné une chute graduelle de la pression artérielle moyenne. Ajoutant une appoint 0,1 mL du volume d’amorçage à l’animal a conduit à une augmentation de la pression artérielle plus de 20 mmHg, mais une petite réduction linéaire la pression artérielle au cours des 30 prochaine min était toujours présente. Substitution de volume a été appelée pour si l’air est aspiré par la canule de drainage ou il y avait une baisse de tension artérielle sous 75 mmHg.
Le défi le plus difficile dans l’approche chirurgicale pour modèle de souris ECMO est la mise en place de la canule via la veine jugulaire gauche dans la VCI. Pour établir cette méthode, on a testé différents types de canules et une laparotomie a été réalisée dans les cadavres de souris pour parfaire le positionnement de l’extrémité de la canule dans la VCI juste avant la bifurcation iliaque. Parfois, chez les animaux plus gros, mise en place de la canule peut entraîner la dislocation de la canule dans la veine rénale droite. Néanmoins, le sang de tous les segments de l’IVC pourrait être bien drainé en raison des fenestrations du côté de la canule.
Lors d’essais préliminaires, nous avons réalisé une canulation via la veine fémorale. Malheureusement, seulement une canule 1-Fr peut être placée dans la veine fémorale, qui se traduit par une circulation sanguine insuffisante (≤ 1 mL/min). 1-Fr cathéters poussé dans la VCI affichée tout refoulement insuffisant. Pour atteindre les reflux important, les deux veines fémorales devra être canulé ; donc, nous avons abandonné cette procédure et réalisé une vidange adéquate via une canule de 2-Fr placée dans la VCI via la veine jugulaire. Perte de sang pendant le placement de la canule dans la veine jugulaire est très typique. Par conséquent, avant le placement, la tête de ligne du tampon animaux est déclenché, 30-40°, pour reflux de la veine est considérablement réduit.
Une réduction progressive de l’hémoglobine et l’hématocrite s’explique par une hémolyse et des prélèvements sanguins répétés prises pour démontrer la performance de l’appareil. Pour des expériences de survie, afin d’éviter les transfusions sanguines, prélèvements sanguins devraient être extrêmement limitée ou même évitées. En outre, à la fin de l’expérience, le sang du circuit ECMO doit être retourné dans l’animal. Cependant, survivabilité du modèle doit être étudiée dans un projet distinct à l’aide d’un protocole moins invasif.
La circulation sanguine pendant nos essais d’ECMO était entre 3 et 5 mL/min. débit cardiaque de souris normales soient signalés à être comprise entre 6 et 9 mL/min ; donc, en moyenne, nous avons été en mesure d’atteindre un débit de l’ECMO de 54 % du débit cardiaque de la souris. L’ECMO veino-veineuse exige habituellement, le débit sanguin plus faible par rapport à l’ECMO veino-artériel, comme overperfusion de l’oreillette droite peut conduire à une surcharge ventriculaire droite et par conséquent, l’insuffisance cardiaque. Cliniquement, pour atteindre une oxygénation adéquate, un flux d’ECMO veino-veineuse de 50 à 75 % du débit cardiaque est suffisant pour une oxygénation suffisante chez les patients ventilés ou respiration spontanément. Augmentent inutilement l’écoulement de l’ECMO peut provoquer plus de dégâts causés par les Messieurs et une hémolyse et recirculation inutile de la majeure partie du sang veineux entre l’IVC et SVC. En outre, nous avons observé qu’en augmentant le débit dans l’ECMO veino-veineuse, pression négative excessive mène à le pour air d’aspiration sur le site de canulation. Nos animaux ont reçu 100 % d’oxygène sous anesthésie isoflurane et avec l’aide de l’ECMO veino-veineuse, étaient hyper oxygénés. Dans notre modèle, nous avons essayé de reproduire les conditions de « ECMO éveillé »4 ayant moins de dommages aux poumons.
Les mécanismes moléculaires impliqués dans les complications liées à l’ECMO peuvent maintenant être étudiés en raison de la pléthore des lignées de souris génétiquement modifiées disponibles. Il y a aussi plus de 80 souches de souris atteintes de maladies pulmonaires qui peuvent simuler une ECMO dans le contexte de ces maladies sous-jacentes. Par conséquent, nous pensons que notre modèle de souris ECMO veino-veineuse peut être mis en œuvre dans plusieurs projets synergiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a été soutenu par KFO 311 subvention du Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | in 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | in 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 IU per ml of priming |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotide artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1,3 -2,5% | |
| Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany | invasive pressure, ECG, t °C | |
| i-STAT portable device | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old | Charles River Laboratories | housed 1 week before |
References
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