Summary
静脈-静脈体外膜 (ecmo) 非挿管でのテクニック、自発的に呼吸マウスを記述したプロトコルをご紹介します。末期肺疾患と急性の実験研究で、ECMO のこのマウスモデルを効果的に実装できます。
Abstract
膜型人工肺 (ecmo) の使用は、近年大幅に増加しています。ECMO は信頼性と効果的な治療になって末期肺疾患および急性。臨床需要と ECMO の長期使用の増加に伴い、手続きの最適化と多臓器損傷の防止が重要です。このプロトコルの目的は、マウスを自発的に呼吸で挿管以外は、静脈-静脈 ECMO の詳細な手法を提示します。このプロトコルは、ecmo 非施行例と手術の手順の技術的な設計を示しています。このマウスモデル ECMO は ECMO (例えば炎症、出血、血栓塞栓性イベント) に関連する病態の研究を促進します。遺伝子改変マウスの豊富な ECMO 関連の合併症に関与する分子メカニズムを解剖もすることができます。
Introduction
膜型人工肺 (ecmo) は、肺や心臓の機能を引き継ぐ十分なガス交換と血流を許可する一時的な生活サポート システムです。丘ら1では、1972 年の患者の ECMO の最初の使用ただし、それだけになった広く使用 2009年2でパンデミック H1N1 インフルエンザ中の適用後。今日、ECMO は日常的に末期心臓と肺疾患3救命手順として使用されます。侵襲的な換気での代替として静脈-静脈 ECMO は採用ますます難治性呼吸不全4症例を自発的に呼吸目を覚まし、非挿管します。
その普及にもかかわらず ECMO5,6、7の多様な合併症を報告されています。ECMO の患者が経験することができます合併症には、出血、血栓症、敗血症、血小板減少症、デバイス関連の不具合、空気塞栓症が含まれます。また、多臓器損傷で生じる全身性炎症反応症候群 (SIRS) は、臨床的および実験的研究8,9でよく説明です。脳梗塞などの神経合併症もよく、ECMO の長期療法を受けている患者で報告されます。問題を混乱させる、合併症自体 ECMO によって引き起こされるまたは基になる障害を伴う急性、末期の病気から発生するかどうかを区別することは困難はしばしば。
健康的な有機体に ECMO の効果を具体的に勉強するには、信頼性の高い実験動物モデルが確立されなければなりません。ラットに限られた小動物の ECMO のパフォーマンスに非常にほとんどのレポートがありません。までに、ECMO のマウス ・ モデルで説明されている文献で。遺伝子組み換えマウスの大きい数の供給のため ECMO マウスモデルの確立によりさらに分子メカニズムの調査 ECMO 関連の合併症10,11に関与します。
心肺のバイパス (CPB)12私たちの前述のマウスのモデルに基づいて、安定した方法で静脈-静脈 ECMO を開発している非気管で、マウスを自発的に呼吸します。流出と流入カニューレ、蠕動性ポンプ、人工肺、および空気トラッピング貯水池を含む ECMO 回路 (図 1) がマウス体外循環12小さいプライミングをことを除いて、上記モデルに似たようなボリューム (0.5 mL)。このプロトコルは、詳細な技術、生理学的な監視、および成功した ECMO の手順に関与する血液ガスの分析を示しています。
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Protocol
12 週間を高齢者、男性の c57bl/6 マウスの実験を行った。本研究は、プロトコル TSA 16/2250 下ドイツ動物の法律のガイドラインに準拠して行った。
1 材料の準備
注: すべての手順は、きれいな、非無菌条件の下で実行されます。動物は術後生存する場合、滅菌条件が必要になります。
- 16 倍の倍率で、顕微鏡下での外科ブレードを使用して 2 Fr ポリウレタン チューブに 3 ピンホールを紹介します。
注: すべてのピンホールは最適な血の排水を確保するためカニューレの遠位 3 分の 1 に置く必要があります。 - 下塗り溶液 (材料表) を準備します。30 IU/mL ヘパリンおよび 2.5 %v/v NaHCO3の 8.4% 溶液が含まれます。4 ° C でこのソリューションを使用する準備ができるまで冷蔵庫で冷やします。首相のプライミング溶液 500 uL を持つ回路。
- プライミング溶液に流出カニューレを置き、ECMO マシンの蠕動性ポンプのスイッチを記入します。下塗り溶液を 1 mL/min の流速で次の 30 分のマシンを介して循環し続けます。
- 100% 酸素の 0.5 L/分を肺に与えます。
2. 麻酔
- 場所誘導室動物 2.5 %v/イソフルラン/酸素の混合物でいっぱい。気化器に 100% 酸素の 0.5 L/分を提供します。術前に完全麻酔はペダルの撤退と痛みの反射神経をテストすることによって達成を確認します。乾燥ダメージを防ぐために目のゲルを適用します。
- 37 ° C の体温を維持するために地球温暖化パッドを使用します。
- イソフルラン気化器を用いた吸入マスク麻酔を行い、カルプロフェン 5 mg/kg を皮下注入します。
- 定期的に自発呼吸を観察し、1.3 と 2.5% の間で、イソフルランの濃度を調整します。
3. 手術
- 首の左側にある高級はさみの助けを借りて、4 mm の横切開を使用して左頸静脈を公開します。一緒に鋭く、鈍い準備マイクロ鉗子、綿の綿棒を使用して、小型船舶のバイポーラ凝固を使用します。
- 一度左頸静脈を公開すると、マイクロ鉗子の助けを借りて 8-0 絹糸を使用して遠位部を縛る。
- 静脈の近位端にスリップ ノットを配置します。マイクロはさみを使用して静脈の前壁を切開します。
- 完全パリン投与群を達成するため、26 G braunula を介して頚静脈に 2.5 IU/g ヘパリンを注入します。
- カニューレの挿入中に静脈から血液の過剰損失を避けるために 30 ° によって動物のパッドのヘッド側を上げます。
- わずか 4 cm の深さに押しながら回転頸静脈の近位部分に 2 Fr ポリウレタン (PU) カニューレを挿入します。そうしながら下大静脈 (IVC) の腸骨の分岐に到達するでしょう。
- Microforceps を使用して 8-0 絹の結び目でカニューレを固定します。
- 3.1、3.2、3.3 で説明されている手順を使用して右の内頚静脈を公開します。
- 1 Fr PU のカニューレを右頸静脈を cannulate、そっと右心房の方向に 5 mm 移動します。
- 3.7 のステップを繰り返します。
- 別 1 Fr PU カニューレと左大腿動脈カテーテルを入れて下さいし、侵襲的圧血液ガス分析 (BGA) ための血液採取だけでなく、監視のために使用します。
- 心電図 (ECG) 針両前肢と左胸壁に皮下データ集録デバイスに接続を挿入します。
- データ集録デバイスに接続されている直腸温度計を挿入します。
4. 静脈-静脈体外膜型人工肺、血液ガスの分析
注: 完全な ECMO 回路の回路図は、図 1を参照してください。
- 動物に ECMO を開始するには、0.1 mL/分 3 5 mL/分次の 2 分以内でポンプの流量調整の初期流量とポンプをオンします。
- 空気カニュレーション サイトを介して流出カニューレで吸引の場合、流量が減少し、空気トラッピング貯留層を介して回路プライミング溶液 0.1 mL を追加します。
- 安定した流れの下でリアルタイム モードでデータ集録デバイスを介してすべて重要なパラメーターの監視を続行します。
- 常に静脈のドレナージからの逆流を観察、空気わな猟師貯留層における血のレベルを監視します。
- 漏洩の傷から 24 G branula チームカーの先端で 1 cc のシリンジに ecmo 空気トラッピング貯水池を経由する血を収集します。
- Bga、血液サンプリング カートリッジを使用して、動脈血次の時点で、次の場所からの約 75 μ L を収集します。
- ecmo、人工 (コントロール) 後と同様の余分なチューブを介しての肺の前に建てられた余分なチューブを介して下大静脈および大腿動脈から直接採血開始後 10 分。
- ecmo、大腿動脈から採血開始後 30 分
- Intravasal 液体損失空気わな猟師や大腿動脈カテーテルを介してまたは血液流出カニューレを通して空気泡を吸引することによってすべての 45 分を補うためのプライミング溶液の余分な 0.1 mL を与えます。
- Bga、血液サンプリング カートリッジを使用して、動脈の血液の約 75 μ L を収集します。
- 大腿動脈から ecmo 開始後 1 h。
- ecmo、人工 (コントロール) 後と同様の余分なチューブを介しての肺の前に建てられた余分なチューブを介して下大静脈および大腿動脈から直接採血開始後 2 h。
- 後 2 h を減らすポンプの流量徐々 に (以上 5 分のコース)、それにより停止 ECMO。
- さらに 10 分の重要なパラメーターを記録し続けます。
- 動物を exsanguinating、血液や臓器を収穫して、実験を終了します。
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Representative Results
このプロトコルでは、マウスに静脈-静脈 ECMO のメソッドについて説明します。このモデルは信頼性の高いと、再現と呼吸・循環の逮捕12,13CPB の上記モデルと比較して、それは以下の技術的に確立する厳しいです。
静脈システムに ECMO 流量は 1.5 と 5 mL/分の間維持されました。平均動脈圧は ECMO 回路に余分な下塗り溶液を加えることによって 70、85 mmHg の間保たれました。血液量の置換が通常、ECMO の中に回路にプライミング溶液 0.1 mL を追加できます。すべてのボリュームの置換またはバッファリング ソリューションを大腿動脈または空気トラッピング貯水池経由で与えられました。
生理学的なパラメーターは、10 分ごとが記録され、ECMO 実験代表者からのデータが図 2に掲載されています。成功した ECMO から BGA データは表 1のとおりです。
ECMO; 中に関連する血液希釈を示した血液学的パラメーターしかし、輸血は中程度の貧血 (表 1) を補うためには必要なかった。BGA から酸素化パラメーターは、FiO2 1.0 (表 1) で酸素/空気混合気で肺の適切な性能を示した。
Ecmo 離脱時の代謝変化は、開始時に呼吸性アルカローシスと実験 (表 1) の終わりに中等度のアシドーシスを示した。余分な血液のバッファリングを行った。
図 1: マウスの ECMO レイアウトします。血は左頚静脈を介して下大静脈 (IVC) から排出され、酸素を含んだ血液、上大静脈 (SVC) 右の頚静脈にポンプでくまれます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 生理学的パラメーター測定 ECMO の 2 h.= 心拍数、B = 平均動脈圧 (対ボリューム置換 =)、および C 直腸温を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 10 分 | 30 分 | 1 h | 2 h | |||||
| パラメーター | O | FA | 下大静脈 | FA | FA | O | FA | 下大静脈 |
| pH | 7.67 | 7.51 | 7.31 | 7.57 | 7.5 | 7.6 | 7.57 | 7.34 |
| co 2分圧 (mmHg) | 24.5 | 24 | 52 | 26 | 25 | 22 | 26 | 51.1 |
| pO2 (mmHg) | 707 | 656 | 135 | 643 | 621 | 638 | 573 | 101 |
| HCO3 (mmol/L) | 28.3 | 25.3 | 26 | 24 | 23 | 27 | 23 | 25 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 99 | 100 | 100 | 100 | 100 | 98 |
| HCT (%) | 24 | 23 | 23 | 20 | 18 | 17 | 17 | 16 |
| Hb (g/dl) | 8.8 | 8.6 | 8.5 | 8 | 7.8 | 7.6 | 7.2 | 7 |
| ラック (mmol/L) | 1.9 | 1.7 | 1.8 | 2.1 | 2.4 | 3.2 | 3.1 | 3.3 |
表 1: BGA 実験の経過結果。O 型人工肺、FA を = = 大腿動脈、下大静脈下大静脈を =。
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Discussion
マウス12,13CPB の成功モデルを前述しました。このようなモデルを実装する急性または末期肺疾患マウスの使いやすい静脈-静脈 ECMO 回路を開発しました。静脈-静脈体外循環モデルに異なる ECMO は必要ありません胸骨切開や、大動脈のクランプなど複雑な手術傷が完全にヘパリン動物における出血のリスクを減らします。血栓と肺塞栓を避けるためには、ヘパリン/kg の 2.5 の IU は、それぞれの動物に与えられます。この線量を示した完全凝固血液の活性化凝固時間 (法) の前の測定に基づいていた (法 > 800 秒)。マイクロ人工でヘパリン コーティングの不在のため私たちの抗凝固のプロトコルが CPB 手順と同様で保たれました。
CPB 回路と比較して我々 は、全体を減らすことができる空気わな猟師およびマイクロ人工肺のボリュームを減らすことで 0.5 mL にプライミング ボリューム。さらに、遅い流れ動物の十分な酸素化を維持する必要があります。血液量の intravasal 損失は、平均動脈圧の漸進的な低下で起因しました。以上 20 mmHg の血圧の上昇につながった動物にプライミング ボリュームの余分な 0.1 mL を追加が、次の 30 分以上の動脈圧の小さな減少は線形常にあった。排水カニューレを通して吸い込まれた空気または 75 mmHg 以下の血圧低下があった場合ボリューム代替が求められました。
ECMO マウスモデルの手術で最も困難な課題は、下大静脈に左頸静脈を介してカニューレの配置です。この方法の確立、カニューレの種類を調べたと腸骨の分岐の直前に下大静脈にカニューレの先端の位置を完璧にマウスの死体で開腹。時に、大きな動物は、カニューレの配置は、カニューレの転位に右腎静脈に可能性があります。それにもかかわらず、下大静脈のすべてのセグメントから全血はカニューレのサイド ピンホールによる水はけ可能性があります。
予備試験は、大腿静脈からの穿刺を行っております。不十分な血の流れの結果、大腿の静脈にのみ 1 Fr のカニューレを配置ことができます残念なことに、(≤ 1 mL/分)。1 Fr カテーテルは、表示されているすべての不十分な逆流を下大静脈に押し込んだ。実質的な逆流を成し遂げるためには、両方の大腿静脈は cannulated する; する必要があります。したがって、我々 は、この手順を放棄し、頚静脈を介して下大静脈に配置 2 Fr カニューレを介して十分な排水を実現します。頚静脈にカニューレの配置の間に血損失は非常に一般的です。したがって、配置、動物のパッドのヘッドエンドが発生する前に、30-40 °、ので、静脈からの逆流が大幅に減少します。
ヘモグロビンとヘマトクリット値の漸進的な減少を説明するには、溶血と繰り返し血液サンプリング装置の性能を発揮する回数が多い。生存実験のため輸血を避けるために採血する非常に限られたかも避けます。さらに、実験の最後に、ECMO 回路から血液が動物に返されます。ただし、モデルの生存は低侵襲のプロトコルを使用して別のプロジェクトで調査されます。
私たちの ECMO の実行中に血流 3 間、5 mL/分通常のマウス心臓出力は 6 と 9 mL/分の間と報告されてそのため、平均では、マウスの心拍出量の 54% の ECMO 流量を達成することができました。通常、静脈-静脈 ECMO では右心房の灌が右心負荷とその結果、心不全につながる可能性として、に比べて静脈動脈 ECMO 下の血流が必要です。臨床的に、十分な酸素化を達成するために心拍出量の 50-75% の静脈-静脈 ECMO 流量は十分な換気や自発呼吸患者の十分な酸素化のためです。ECMO 流不販売 SIRS と溶血と下大静脈と SVC の静脈血の大部分の役に立たない循環によって引き起こされるより多くの損傷につながる可能性があります。また、静脈-静脈 ECMO の流れの増加による過度の負圧が穿刺部位に吸引の空気につながることがわかった。イソフルラン麻酔下、静脈-静脈 ECMO の助けを借りて私たちを受け取った動物 100% 酸素は、ハイパー酸素だった。我々 のモデルで肺のより少ない損傷を持つ"目を覚まし ECMO"4の条件を再現を試みた。
ECMO 関連の合併症に関与する分子メカニズムは、遺伝子組み換えマウス系統利用の茄多のため現在調査することができます。また、これらの基礎疾患のコンテキストで ECMO をシミュレートすることが肺疾患を持つマウスの 80 以上の系統があります。したがって、複数の相乗的プロジェクトで静脈-静脈 ECMO マウス モデルも実現できることと考えています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、ドイツ研究振興協会から KFO 311 の助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | in 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | in 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 IU per ml of priming |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotide artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1,3 -2,5% | |
| Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany | invasive pressure, ECG, t °C | |
| i-STAT portable device | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old | Charles River Laboratories | housed 1 week before |
References
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