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Medicine

마우스에 Veno 정 맥 체 외 막 산소

doi: 10.3791/58146 Published: October 24, 2018
* These authors contributed equally

Summary

여기 선물이 아닌 intubated에 veno 정 맥 체 외 막 산 소화 (ECMO)의 기술, 저절로 호흡 마우스를 설명 하는 프로토콜. ECMO murine 모델 실험 연구의 급성 및 말기 폐 질환에 효과적으로 구현할 수 있습니다.

Abstract

체 외 막 산 소화 (ECMO)의 사용은 최근 몇 년 동안에서 크게 증가 했다. ECMO는 안정적이 고 효과적인 치료 되고있다 말기 폐 질환 뿐만 아니라 급성. 임상 수요에 ECMO의 장기간된 사용 증가 함께 절차 최적화 및 다중 장기 손상의 예방 중요 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 비-intubated, veno 정 맥 ECMO의 상세한 기술을 제시 하 마우스를 자연스럽 게 호흡 이다. 이 프로토콜 ECMO 수술 단계의 기술적인 디자인을 보여 줍니다. 이 murine ECMO 모델 이상 ECMO (예를 들어, 염증, 출혈 및 thromboembolic 이벤트) 관련 연구를 촉진 한다. 유전자 변형된 생쥐의 풍부 때문에 ECMO 관련 합병증에 관련 된 분자 메커니즘 수 있습니다 또한 수 해 부.

Introduction

체 외 막 산 소화 (ECMO) 적절 한 가스 교환 및 관류 하는 폐와 심장의 기능을 수행 하는 임시 생명 지원 시스템입니다. 힐 외1 1972 년; 환자에 ECMO 처음 사용 설명 그러나, 그것은 단지 되었다 널리 이용 된다 20092유행 성 H1N1 인플루엔자 중 그것의 성공적인 신청 후. 오늘, ECMO 말기 심장 및 폐 질환3인명 구조 절차로 정기적으로 사용 됩니다. Veno 정 맥 ECMO는 점점 고용에서 침략 적 기계 환기 하는 대신 깨어, intubated, 자발적으로 내 화 호흡4환자 호흡.

그것의 대폭적인 채용에도 불구 하 고 다양 한 합병증 ECMO5,,67에 대 한 보고 되었습니다. ECMO에 환자에 의해 경험 될 수 있는 합병증에는 출혈, 혈전 증, 패 혈 증, 혈소판, 장치 관련 오작동 및 공기 색 전 증 포함 됩니다. 또한, 조직의 염증 반응 증후군 (해보자) 다중 장기 손상의 결과로 임상과 실험적인 연구8,9에 잘 설명 되어 있습니다. 뇌 경색 등의 신경학 상 합병증 환자 장기 ECMO 치료에에서도 자주 보고 됩니다. 혼동 문제, 그것은 종종 합병증 ECMO 자체에 의해 발생 하거나 기본 장애 동반 급성 및 말기 질환에서 발생 하는 여부를 구별 어렵다.

특별히 건강 한 유기 체에 ECMO의 효과 연구, 신뢰할 수 있는 실험 동물 모델을 설정 해야 합니다. 작은 동물과 쥐에 모든 제한에 ECMO의 성능에 거의 보고 있다. 날짜 하려면, 아무 마우스 모델 ECMO의 문학에서 설명 하고있다. 유전자 변형된 마우스 긴장의 많은 수의 가용성으로 인해 마우스 ECMO 모델의 설립 허용 추가 조사 분자 메커니즘의 ECMO 관련 합병증10,11에 관련 된.

심장과 폐 우회 (CPB)12의 앞에서 설명한 murine 모델을 바탕으로, 우리 veno 정 맥 ECMO에서의 안정적인 방법을 개발 했습니다 비-intubated, 저절로 호흡이 쥐. 유출 및 유입 뉼, 연동 펌프, oxygenator, 그리고 공기 트래핑 저수지, ECMO 회로 (그림 1)은 작은 못쓰게 데 제외한 murine CPB12 의 앞에서 설명한 우리의 모델과 유사 볼륨 (0.5 mL)입니다. 이 프로토콜에는 상세한 기술, 생리 적 모니터링 및 혈액 가스 분석 성공적인 ECMO 절차에 관련 된 방법을 보여 줍니다.

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Protocol

실험 12 주 세 남성 C57BL/6 마우스에 수행 했다. 이 연구는 프로토콜 TSA 16/2250 아래 독일 동물성 법률의 지침에 따라 실시 되었다.

1. 재료 준비

참고: 모든 단계는 깨끗 한, 비 살 균 조건 하에서 수행 됩니다. 무 균 조건 동물 postoperatively 살아 있을 경우 필요한 것입니다.

  1. 16 X 확대와 함께 현미경 수술 블레이드를 사용 하 여 2-Fr 폴리우레탄 튜브에 3 fenestrations를 소개 합니다.
    참고: 모든 fenestrations는 최적의 혈액 배수 되도록 정의 원심 세 번째에 위치 해야 합니다.
  2. 못쓰게 솔루션 (자료 테이블)을 준비 합니다. 30 IU/mL 헤 파 린 및 2.5 %v / v NaHCO3의 8.4% 솔루션을 포함 합니다. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서이 솔루션을 냉동. 프라임 프라이 밍 솔루션의 500 ul 회로.
  3. 못쓰게 솔루션으로 유출 정 맥을 놓고 ECMO 기계 연동 펌프에 전환 하 여 입력 합니다. 1 mL/min의 유량에 다음 30 분 동안 컴퓨터를 못쓰게 솔루션을 회람 하기 위하여 계속 한다.
  4. oxygenator를 0.5 L/분 100% 산소를 제공 합니다.

2입니다. 마 취

  1. 장소는 유도 챔버에서 동물 2.5 %v / v isoflurane/산소 혼합으로 가득합니다. 0.5 L/분 100% 산소는 기화 기를 제공 합니다. 수술 전에 그 전체 마 취 페달 통증과 철수 반사를 테스트 함으로써 확인 합니다. 아이 젤 건조 피해를 방지 하기 위해 적용 됩니다.
  2. 37 ° c.에 체온을 유지 하기 위해 온난 패드를 사용 하 여
  3. 흡입 마스크 마 취 isoflurane 기화 기를 사용 하 여 수행 하 고 carprofen 5 mg/kg을 피하 주사 합니다.
  4. 정기적으로 자연 스러운 호흡을 관찰 하 고 isoflurane의 농도 조정 하는 1.3 ~ 2.5%.

3입니다. 수술

  1. 좋은 위 목의 왼쪽에의 도움으로 4 mm의 옆 피부 절 개를 사용 하 여 왼쪽된 경 정 맥을 노출 합니다. 마이크로-집게 및 면 면봉을 사용 하 여 선명 하 고 무딘 준비, 함께 사용 하 여 작은 혈관의 바이 폴라 응고.
  2. 일단 왼쪽된 경 정 맥 노출, 선 마이크로 겸의 도움으로 8-0 비단 봉합 사를 사용 하 여 원심 부분.
  3. 장소는 정 맥의 근 위 끝에 슬립 매듭. 마이크로-가 위를 사용 하 여 정 맥의 앞쪽 벽 incise
  4. 를 달성 하기 위해 전체 heparinization 2.5 IU/g 덤플링을 26 G braunula 통해 경 정 맥에 주사.
  5. 손실을 방지 하기 위해 과도 한 혈액 정 맥에서은 정의 삽입 동안 30 °에 의해 동물 패드의 머리 쪽을 올립니다.
  6. 2-Fr 폴리우레탄 (PU) 정 4 c m;의 깊이에 그것을 밀고 있는 동안 약간 회전 경 정 맥의 근 위 부분에 삽입 이렇게, 하는 동안 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)의 장 골 분기점에 도달 것입니다.
  7. Microforceps를 사용 하 여 8-0 실크 노트와는 정을 보안 합니다.
  8. 3.1, 3.2, 3.3에 설명 된 단계를 사용 하 여 바로 경 정 맥을 노출 합니다.
  9. Cannulate 1-Fr PU 정으로 바로 경 정 맥 혈관을 부드럽게 오른쪽 아 트리 움의 방향으로 5 m m 이동.
  10. 3.7 단계를 반복 합니다.
  11. 다른 1-Fr PU 정으로 왼쪽된 대 퇴 동맥을 catheterize 하 고 침략 적 압력 혈액 가스 분석 (BGA)에 대 한 혈액 샘플링 뿐만 아니라 모니터링에 대 한 그것을 사용 하 여.
  12. 두 앞 발 그리고 왼쪽된 흉 벽 피하 데이터 수집 디바이스에 연결 하는 심전도 (ECG) 바늘을 삽입 합니다.
  13. 직장 온도계 데이터 수집 디바이스에 연결을 삽입 합니다.

4. Veno-정 맥 체 외 막 산소 및 혈액 가스 분석

참고: 완전 한 ECMO 회로의 회로도, 그림 1참조.

  1. 0.1 mL/분 3-5 mL/min에 다음 2 분 이내 펌프의 유량 조정의 초기 유량으로 펌프 하 여 동물에 ECMO를 시작 합니다.
  2. 공기 흡입 cannulation 사이트를 통해 유출 정 맥에서 경우 흐름을 줄일 수 고 공기 트래핑 저수지를 통해 회로를 못쓰게 솔루션의 0.1 mL를 추가 합니다.
  3. 안정적인 흐름에서 실시간 모드에서 데이터 수집 디바이스를 통해 모든 중요 한 매개 변수를 모니터링을 계속 합니다.
  4. 지속적으로 정 맥 배수에서 역류를 관찰 하 고 공기 사냥꾼 저수지에서 혈액의 수준을 모니터링.
  5. 에서 새 상처 1 cc 주사기 24 G branula andreturn의 팁으로 그것은 공기 트래핑 저수지 통해 ECMO 회로에 어떤 혈액을 수집 합니다.
  6. BGA에 대 한 혈액 샘플링 카트리지 사용 하 여 다음 위치에서 다음 시간 포인트에서 동맥 혈액의 약 75 µ L를 수집.
    1. ECMO, oxygenator (제어), 후 비슷한 여분의 튜브를 통해 oxygenator 전에 내장 여분의 튜브를 통해 IVC와 대 퇴 동맥에서 직접 수집 혈액의 개시 후 10 분.
    2. ECMO, 대 퇴 동맥에서 수집 혈액의 개시 후 30 분.
  7. Intravasal 액체 손실을 매 45 분 공기-사냥꾼 또는 대 퇴 동맥 카 테 터를 통해 또는 혈액 배수 정 맥을 통해 공기 거품을 빠는 하 여 보상을 못쓰게 솔루션의 여분의 0.1 mL를 제공 합니다.
  8. BGA를 사용 하 여 혈액 샘플링 카트리지 동맥 혈액의 약 75 µ L 수집:
    1. 대 퇴 동맥에서 ECMO의 개시 후 1 h.
    2. ECMO, oxygenator (제어), 후 비슷한 여분의 튜브를 통해 oxygenator 전에 내장 여분의 튜브를 통해 IVC와 대 퇴 동맥에서 직접 수집 혈액의 개시 후 2 h.
  9. 2 시간 후 줄일 유량 펌프에 점차적으로 (의 과정을 통해 5 분), 그로 인하여 중지 ECMO.
  10. 계속 또 다른 10 분에 대 한 중요 한 매개 변수를 기록 합니다.
  11. 실험 동물을 exsanguinating 하 고 혈액과 장기를 수확 하 여 마무리.

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Representative Results

이 프로토콜 veno 정 맥 ECMO는 마우스에서의 방법을 설명합니다. 이 모델은 신뢰할 수 있는 하 고 재현할 수, 호흡과 순환 상 검거12,13CPB의 앞에서 설명한 모델에 비해, 그것은 덜 기술적으로 확립을 요구.

정 맥 시스템에 ECMO 흐름 1.5와 5 mL/min 사이 유지 되었다. 평균 동맥 압력 ECMO 회로에 여분의 못쓰게 솔루션을 추가 하 여 70, 85 mmHg 사이 유지 했다. 일반적으로, 추가 못쓰게 솔루션의 0.1 mL의 회로에 ECMO 동안 혈액 볼륨의 대체 수 있습니다. 모든 볼륨 대체 또는 버퍼링 솔루션을 통해 대 퇴 동맥 또는 공기 트래핑 저수지 부여 했다.

생리 적인 매개 변수 마다 10 분을 기록 했다 고 대표 ECMO 실험에서 데이터는 그림 2에 표시 됩니다. 성공적인 ECMO에서 BGA 데이터는 표 1에 나와 있습니다.

보여주 관련 hemodilution ECMO; 동안 혈액 매개 변수 그러나, 아무 수혈 적당 한 빈 혈 (표 1)에 대 한 보상 해야 했습니다. BGA에서 산소 매개 변수 oxygenator FiO2 1.0 (표 1)에서 산소/공기 혼합물에서의 적절 한 성능을 보여주었다.

ECMO 동안 대사 변경 시작 호흡 alkalosis 및 실험 (표 1)의 끝에 적당 한 증을 보여주었다. 추가 혈액의 버퍼링이 수행 되었다.

Figure 1
그림 1: 마우스에 ECMO 레이아웃. 혈액은 왼쪽된 경 정 맥을 통해 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)에서 배수 하 고 산소를 혈액으로는 뛰어난 베 나 정 맥 (SVC) 바로 경 정 맥을 통해 양수 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: ECMO의 2 h 동안 생리 적인 매개 변수 측정. = 심장 박동, B = 평균 동맥 압력 (VS = 볼륨 대체), 그리고 C = 직장 온도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

10 분 30 분 1 h 2 h
매개 변수 O FA IVC FA FA O FA IVC
pH 7.67 7.51 7.31 7.57 7.5 7.6 7.57 7.34
pCO2 (mmHg) 24.5 24 52 26 25 22 26 51.1
pO2 (mmHg) 707 656 135 643 621 638 573 101
HCO3 (mmol/L) 28.3 25.3 26 24 23 27 23 25
sO2 (%) 100 100 99 100 100 100 100 98
HCT (%) 24 23 23 20 18 17 17 16
Hb (g/dl) 8.8 8.6 8.5 8 7.8 7.6 7.2 7
락 (mmol/L) 1.9 1.7 1.8 2.1 2.4 3.2 3.1 3.3

표 1: 실험의 과정을 통해 BGA 결과. O = oxygenator, FA 대 퇴 동맥, IVC = = 열 등 한 베 나 정 맥.

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Discussion

이전에 우리는 마우스12,13CPB의 성공적인 모델을 설명합니다. 같은 모델을 구현 하기 위해 급성 또는 말기 폐 질환 마우스는 사용 하기 쉬운 veno 정 맥 ECMO 회로 개발. CPB 모델, veno 정 맥에 다른 ECMO 필요 하지 않습니다 sternotomy 대동맥의 클램핑 등 복잡 한 수술 절차 따라서 완전히 heparinized 동물에 상처 출혈의 위험을 감소. 혈전과 oxygenator의 색전술을 피하기 위해, 2.5 IU 덤플링을/kg의 각 동물에 주어 집니다. 이 복용량의 활성화 된 응고 시간 (ACT)는 혈액의 전체 anticoagulation 이전 측정에 근거 했다 (> 800 초 법). 마이크로-oxygenator에서 헤 파 린 코팅의 부재로 인해 우리의 anticoagulation 프로토콜 우리의 CPB 절차와 유사한 것 유지 했다.

CPB 회로 비해 우리 전체를 줄일 수 공기 사냥꾼 및 마이크로 oxygenator의 볼륨을 줄여 0.5 mL를 못쓰게 볼륨. 또한, 느린 흐름 동물의 적절 한 산소를 유지 하는 데 필요한 했다. 혈액 볼륨의 intravasal 손실 평균 동맥 압력의 점차적인 하락 귀착되는. 동물을 못쓰게 볼륨의 여분의 0.1 mL를 추가 증가 혈압 20 mmHg, 아니라 다음 30 분 동안 동맥 압력에 있는 작은 선형 감소는 항상 존재. 공기 배수 정 맥을 통해 빨려 했다 또는 75 mmHg 아래 혈액 압력에 있는 하락 했다 대체 볼륨에 대 한 불렀다.

마우스 ECMO 모델에 대 한 수술에서 가장 어려운 과제는 IVC로 왼쪽된 경 정 맥을 통해 정 맥의 위치입니다. 이 메서드를 설정 하려면 다양 한 유형의 뉼 테스트, 그리고는 개복 술 장 골 분기점 직전 IVC로 정 팁의 위치를 완벽 하 게 마우스 시신에서 수행 되었다. 가끔, 더 큰 동물에는 정 맥의 위치는 오른쪽 신장 정 맥에는 정 맥의 전위를 이어질 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고,는 IVC의 모든 세그먼트에서 전체 혈액 때문에 정 맥의 측면 fenestrations 잘 배수 될 수 있습니다.

예비 실험에서 우리는 통해 대 퇴 정 맥 cannulation 수행. 불행히도, 단지 1-Fr 정 대 퇴 정 맥, 불 충 분 한 혈액의 흐름에 결과에 놓일 수 있다 (≤ 1 mL/min). 1-Fr 카 모두 표시 된 부족 한 역류는 IVC로 밀 었 다. 상당한 역류를 달성 하기 위해 두 대 퇴 정 맥 필요가 cannulated; 따라서, 우리이 절차를 중단 하 고 경 정 맥을 통해 IVC에 배치 2-Fr 정 맥을 통해 적절 한 배수 달성. 경 정 맥에는 정 맥의 배치 중 혈액 손실이 매우 일반적입니다. 따라서, 배치, 전에 동물 패드의 끝 머리 발생 30-40 °, 그래서 정 맥에서 혈 류 크게 감소 합니다.

헤모글로빈에 보통 점진적 감소 혈 및 소자의 성능을 입증 하 게 하는 반복적인 혈액 samplings에 의해 설명 된다. 생존 실험을 피하기 위해 수혈, 혈액 샘플링 해야 될 매우 제한 또는 피할. 또한, 실험의 끝에, ECMO 회로에서 피는 동물에 반환 되어야 합니다. 그러나, 모델의 생존 덜 침략 프로토콜을 사용 하 여 별도 프로젝트에서 공부 했다.

우리의 ECMO 실행 중 혈 3 사이 되었고 5 mL/분 일반 마우스 심장 출력 사이 6과 9 mL/min; 것으로 알려졌다 따라서, 평균, 우리가 마우스의 심장 출력의 54%의 ECMO 흐름을 달성 수 있었다. 일반적으로, veno 정 맥 ECMO 필요 veno-동맥 ECMO에 비해 낮은 혈액 흐름 오른쪽 아 트리 움의 overperfusion 오른쪽 심 실 과부하 결과적으로 심장 마비를 일으킬 수 합니다. 임상, 충분 한 산소를 위해 심장 출력의 50-75%의 veno 정 맥 ECMO 흐름 통풍 또는 자연 호흡 환자에서 충분 한 산소에 대 한 충분 하다. ECMO 흐름을 불필요 하 게 증가 한이 있고 혈 IVC와 SVC 사이 정 맥 혈액의 대부분의 쓸모 없는 재순환으로 인 한 피해를 더 이어질 수 있습니다. 또한, 우리는 veno 정 맥 ECMO에서 흐름의 증가, 과도 한 음압 cannulation의 사이트에서 흡입 공기를 리드 관찰 했다. 우리의 동물 받은 100% 산소 isoflurane 마 취와 정 맥 veno ECMO의 도움으로 하이퍼 산소 했다. 우리의 모델에서 우리가 "깨어 ECMO"4 데 폐에 더 적은 손상의 상태를 재현 하려고 했습니다.

ECMO 관련 합병증에 관련 된 분자 메커니즘 사용할 수 있는 유전자 변형된 마우스 긴장의 과다 때문 이제 조사 수 있습니다. 또한 이러한 기본 질병의 맥락에서 ECMO를 시뮬레이션할 수 있습니다 폐 장애를 가진 쥐의 이상의 80 긴장 있다. 따라서, 우리는 우리의 veno 정 맥 ECMO 마우스 모델 여러 시너지 프로젝트에 구현 될 수 있습니다 믿습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 프로젝트는 도이치 가운데에서 KFO 311 그랜트에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterofundin B.Braun Petzold GmbH PZN:8609189 in 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% Solution B. Braun Melsungen AG PZN: 05565416 in 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000 Ratiopharm GmbH PZN: 3029843 2,5 IU per ml of priming
NaHCO3 8,4% Solution B. Braun Melsungen AG PZN: 1579775 3% in priming solution
Carprofen Zoetis Inc., USA PZN:00289615 5mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter Instechlabs INC., USA C10PU-MCA1301 carotide artery
2 Fr PU Catheter Instechlabs INC., USA C20PU-MJV1302 jugular vein
8-0 Silk suture braided Ashaway Line & Twine Co., USA 75290 ligature
Isoflurane Piramal Critical Care GmbH PZN:9714675 narcosis
Spring Scissors - 6mm Blades Fine Science Tools GmbH 15020-15 instruments
Spring Scissors - 2mm Blades Fine Science Tools GmbH 15000-03 instruments
Halsted-Mosquito Hemostat Fine Science Tools GmbH 13009-12 instruments
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools GmbH 11295-51 instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm Fine Science Tools GmbH 12060-02 instruments
Micro Serrefines Fine Science Tools GmbH 18555-01 instruments
Bulldog Serrefine Fine Science Tools GmbH 18050-28 instruments
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 Drägerwerk AG & Co. KGaA anesthesia 1,3 -2,5%
Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany invasive pressure, ECG, t °C
i-STAT portable device Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA blood gas analysis
i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA blood gas analysis
C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old Charles River Laboratories housed 1 week before

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References

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Madrahimov, N., Khalikov, A., Boyle, E. C., Natanov, R., Knoefel, A. K., Siemeni, T., Hoeffler, K., Haverich, A., Maus, U., Kuehn, C. Veno-Venous Extracorporeal Membrane Oxygenation in a Mouse. J. Vis. Exp. (140), e58146, doi:10.3791/58146 (2018).More

Madrahimov, N., Khalikov, A., Boyle, E. C., Natanov, R., Knoefel, A. K., Siemeni, T., Hoeffler, K., Haverich, A., Maus, U., Kuehn, C. Veno-Venous Extracorporeal Membrane Oxygenation in a Mouse. J. Vis. Exp. (140), e58146, doi:10.3791/58146 (2018).

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