Summary
어디 조사 부드럽게 자극 쥐 든 지 수 면 행동을 관찰 하는 부드러운 처리로 알려진 수 면 박탈 기술을 설명 합니다. 이 방법은 개발에 걸쳐 만성 수 면 제한 미래의 두뇌 생리학과 행동에 미칠 수 있는 효과 연구 하는 연구자를 수 있는 강력한 도구입니다.
Abstract
수 면은 적절 한 개발 및 신경가 소성에 대 한 중요 합니다. 또한, 비정상적인 수 면 패턴은 많은 neurodevelopmental 장애의 특성. 개발 기간 동안 공부 어떻게 만성 수 면 제한 성인 행동에 영향을 미칠 수 있습니다 neurodevelopmental 장애의 행동 증상의 출현에 대 한 우리의 이해에 추가할 수 있습니다. 설치류 강제 운동, 지속적인 중단, 혐오 자극 또는 전기 충격의 프레 젠 테이 션을 포함 한 수 면을 제한 하는 데 사용할 수 있는 많은 방법이 있지만, 이러한 방법의 많은 매우 스트레스 이며 신생아 쥐에 사용할 수 없습니다. 여기, 우리는 부드러운 처리, 사용 될 수 있는 만성 개발 내내 그리고 성년으로 수 면 금지를 달성 하는 수 면 박탈 기술 설명. 부드러운 처리 수 면 박탈 기간 동안 쥐의 가까운 관측을 포함 하 고 그들은 활성화 되지 않습니다 또는 수 면과 관련 된 동작을 표시할 때마다 동물을 부드럽게 자극 하는 연구원을 요구 한다. 뇌 파 기록 결합, 부드러운 처리 빠른 안구 운동 (REM) 수 면 등 수 면의 특정 단계를 선택적으로 방해 하 사용 될 수 있습니다. 부드러운 처리의 기술은 더 스트레스 절차 수 면 부족에 대 한 사용의 많은 circumvents 신생아 쥐에도 만성 수 면 제한의 효과의 연구를 위한 강력한 도구 이다.
Introduction
수 면은 신경가 소성 및 시 냅 스 형성 및 두뇌 개발1,2동안 제거에 중요 한 역할을 한다. 특히, 빠른 안구 운동 (REM) 수 면 모두 특정 시 냅 스와 시 냅 스 가지 치기2의 강화를 통해 안정적인 시 냅 스 회로 형성을 위해 필수적 이다. 인생에서 일찍 약리 수 면 부족 리드 많은 생리 및 행동 적자3,4. 약리학 자 뿐만 아니라 부족, 지속적인 떨고, 등 수 면 부족의 다른 형태의 강제 운동, 또는 혐오 자극의 프레 젠 테이 션 성인, 다른 동안 우울증 같은 증상에 연관 된 신경 활성화 패턴, 그리고 박탈5,,67다음 복구 기간 동안 수 면 시간과 수 면 연속성에 변화. 수 면은 만성 개발 과정 5 주 이상에 대 한 마우스에서 제한 됩니다 때 행동 적자 다음 수 면 복구8의 달 관찰 되었다. 함께 찍은, 이러한 연구 나중 수 면 패턴, 뇌 기능 및 행동 신생아 쥐에 수 면의 영향을 미칠 수 있다는 것이 좋습니다. 인간, 자폐증 스펙트럼 장애, 결 절 경화 증 복합, 허약한 X 증후군, 및 주의-결핍/과다 포함 한 neurodevelopmental 장애를 가진 많은 환자에서에서 정상적인 두뇌 개발을 위한 수 면의 중요성을 강조 장애, 행동 적자1의 다양 한 뿐만 아니라 수 면 패턴에 보고서 이상.
비정상적인 수 면 패턴에 연관 된 neurodevelopmental 장애의 수를 감안할 때, 그것은 수 면 부족 뇌 기능 및 행동에 미치는 이해 하는 것이 중요. 그러나, 데이터에도 불구 하 고를 개발, 대부분 방법론을 제한 하거나 성인에 수 면 초점의 동물을 박탈 하는 동안 수 면의 중요성을 지원 합니다. 이러한 기술을 운동 활동 (예: 상수 디딜 방 아), 일정 중단 (예를 들어, 스위퍼 바 또는 지속적인 소설 개체 프레 젠 테이 션 회전), 또는 방해의 개시에 동물을 강제로 요구 하는 테스트의 다양 한 포함 Rem 수 면 (예를 들어, 물 위에 플랫폼)9,10. 이러한 방법으로 성인 수 면 박탈과 관련 된 문제 효과적으로 나타났습니다, 하지만 아무도 이러한 메서드의 설치류 새끼에 대 한 적절 한 그들의 한정 된 기동성, 높은 수 면 드라이브, 그리고 일찍 인생에서에서 스트레스의 부작용 때문에 있습니다. 개발 하는 동안 수 면의 중요성, 성인 기 동안 신생아 강아지에 영향을 미치는 미래 행동에 어떻게 제한 된 수 면을 이해 하는 중요 한 되어 있습니다.
쥐 새끼에 사용할 수 있는 수 면을 제한 한 기술은 부드러운 처리 이다. 부드러운 처리 시간 수 면 동작을 관찰 하는 설치류와 직접 상호 작용 하는 조사를 포함 한다. 수 사관 물리적으로 신생아 설치류8,10,,1112,13,14 수 면을 방해 그들의 손, 붓, 또는 소설 개체의 프레 젠 테이 션을 사용할 수 있습니다. . 수 면 모터 활동, myoclonic 꿈 틀, 및 (더 오래 된 쥐 새끼)에 눈 폐쇄의 부족에 의해 행동 결정 될 수 있습니다. 뇌 파 유효성 검사는 이러한 행동에 따라 부드러운 처리와 수 면을 방해 총 수 면 시간 91% 감소 P12 쥐14에 확인. 젊은 쥐를 박탈 하는 데 사용 된 다른 기술은 전기 충격 등 불쾌 한 자극의 프레 젠 테이 션 하지만 이러한 기술을 만성 수 면 제한 사용할 수 있으며 부드러운 처리7, 보다 더 많은 스트레스 15. 만성 수 면 제한도 떨고 프로토콜 또는 EEG 전극 이식 및 관련된 컴퓨터 소프트웨어 없이 사용할 수 있는 통해 달성 될 수 있다 하지만이 프로토콜 모든 수 면을 방해 하지 않습니다 및 따라서 작습니다 제어 부드러운 처리4,16에 비해. 제한 하거나 마우스 특정 장비, 컴퓨터 소프트웨어, 또는 전극 이식 없이 많은 일에 대 한 수 면의 박탈 수 부드러운 처리 기술의 혜택입니다. 효과적으로 처리 하는 부드러운 통해 만성 수 면 제한 신생아 설치류에 수 면을 제한 하 고 행동 변화는 수 면 박탈 기간8,11,12, 다음의 다양 한 생산 17.
여기, 우리는 P42 출생 후 하루 5 (P5)에서 하루 3 시간 동안 만성 수 면 부족 크게 영향을 미치는 수 면은 방해 하지 30 일 복구 기간 뒤 쥐의 사교 성 결과 설명 합니다. 이러한 결과 미래 행동에 개발 하는 동안 만성 수 면 제한의 장기적인 효과 강조 표시합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: 모든 절차는 국립 연구소의 정신 건강 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었고 국립 연구소의 건강 지침 서 관심과 동물의 사용에 따라 수행.
1. 수 면 부족 설치
- 부드러운 페인트 용을 사용 하 여 부드럽게 때 자 쥐를 찌 르 지.
- 화 필 쥐 음식에 접근이 및 잠 박탈 동안 광고 libitum 물 마우스 케이지 급지대의 바 통해 들어갈 수 있는 다는 것을 확인 하십시오.
- 감 금 소 사이 향기의 이전을 방지 하기 위해 여러 개의 감 금 소에 대 한 페인트 용을 사용 하지 마십시오. 각 브러쉬는 할당 된 케이지 라벨 하 고 그의 감 금 소에 그것의 사용을 제한할 것이 좋습니다.
- 모든 수 면 부족 발생 합니다 룸을 지정 합니다.
2. 동물 설정
- 임의로 수 면 부족 또는 컨트롤 그룹을 각 케이지를 할당 합니다.
- 음식에 쥐 액세스할와 실험 기간 동안 광고 libitum 물.
- 쥐의 침구, 둥지, 또는 감 금 소에 농축 개체에 의해 제한 되지 않습니다 있는지 확인 합니다.
- 추가 침구 또는 쥐의 보기를 제한할 수 있는 농축 개체를 제거 합니다.
- 음식이 나 물 쥐의 보기 제한, 케이지 보기 제한 되지 않습니다의 영역에 마우스를 이동 합니다.
- 음식 장의 큰 부분을 차단 하는 경우 어떤 음식을 제거 하 고 수 면 박탈 기간 동안 음식에 대 한 액세스를 유지 하는 동물 감 금 소의 바닥에 펠 릿을 배치.
3. 동물 조건
참고: 우리는 수 면 박탈 기간 11 오전 때 그들의 비활성 단계 중간 마우스는 하지만 하루 중 시간 및 잠 박탈의 기간을 선택할 수 있습니다 원하는 실험 조건에 따라 3 시간을 시작 하기로 결정 했습니다.
- 제어 그룹입니다.
- P5, 개종 케이지에서 폐하를 제거 하 고 강아지에 이유 (P21)까지 하는 댐 두고.
- 마우스 수 면 부족을 제어 그룹에 할당 하며 부드럽게 자극 쥐 페인트 브러시와 함께 지속적으로 실험 하는 동안 하루 10 분 동안 이동 (P42에 P5).
- 이 분 후 룸을 들고 동물에 쥐를 반환 하 고 그들을 방해 하지 마십시오
- 수 면 부족 그룹입니다.
- P5, 개종 케이지에서 폐하를 제거 하 고 강아지에 이유 (P21)까지 하는 댐 두고.
참고: P5 전에 수 면 부족은 새끼의 cannibalization 발생할 수 있습니다. 우리는 상당한 cannibalization P5 및 나중에 관찰 하지 않았다.
참고: 젊은 강아지에서 잠을 드라이브는 매우 높은 요구 거의 일정 쓰 다듬어. 쥐 개발, 특히 이유, 후 수 면 압력 낮은 이며 그들은 일정 한 괴롭히는 필요 하지 않습니다. - 수 면 부족 P42까지 매일 계속 진행 합니다.
참고: 수 면 부족 프로토콜 길이에서 변화 하 고 원하는 경우 P42 확장 수 있습니다. - 이동 마우스 빛 주기 동안 매일 수 면 부족을 수 면 부족 그룹에 할당 된 그들은 모니터링 될 것 이다. 수 면 부족의 정확한 기간 특정 연구 질문에 따라 조정할 수 있습니다.
참고: 신생아 쥐에 3 시간 이상 수 면 부족은 어려운 수 면 압력15증가 때문에.- 이 시간 동안 부드럽게 제품 쥐는 페인트 브러시와 함께 언제 든 지 수 면은 분명 하다. 수 면 부족의 다음 섹션에서 설명 합니다.
- P5, 개종 케이지에서 폐하를 제거 하 고 강아지에 이유 (P21)까지 하는 댐 두고.
4. 수 면 부족
- 응답은 관찰 될 때까지 자 고 인의 의심 하는 경우 부드럽게 브러시와 마우스 제품. 또는 마우스를 반전 하 고 그들의 뒤에 수 면 방해를 밀어.
- 다음 발생 하면 잠들어 마우스 고려: 비활동, (특히 강아지)와 함께 꿈 틀 또는 그들의 눈은 (쥐 P12 보다 오래 된)에 폐쇄 하는 경우.
- 깨어 있다면, 주위를 움직이고 그들의 뒤에 또는 스스로 정리 후 뒤집어 하려고 되도록 마우스를 고려 하십시오.
- 만약 댐 수 면 부족 동안 새끼를 덮고는, 부드럽게 제품 그녀 새끼에서 그래서 새끼의 보기 제한 되지 않습니다.
5. 후 수 면 부족
- 수 면 부족의 3 시간 동안 완료 되 면 위에 침구와 수 있습니다 삭제 되었습니다 다시 음식 및 뚜껑 다시 감 금 소.
- 수 면 부족의 다음 날까지 동물 들고 방에 감 금 소를 반환 합니다.
6. 다음 실험
- 수 면 박탈 연구의 목표에 따라 후속 실험으로 진행 합니다.
- 확인 corticosterone 레벨18동물에서 혈 청을 수확.
- 행동 테스트, 오픈 필드를 포함 하 여 RotaRod, 높은 플러스 미로, 테스트, 대리석 매장, 등8,,1920 이 동작 테스트 또한에서 동물을 막을 것 이다 사회적 행동의 수 중 하나를 수행합니다 자 연속 수 면 부족을의 얼마나 많은 일을 결정할 때 고려 되어야 한다 그래야.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
행동에 만성 수 면 제한의 효과 조사, 우리는 매일 오전 11 시와 오후 2시 p 5에서 P428사이 3 시간 동안 제한 마우스 수 면. 수 면 제한에 따라 쥐 4 주 동안 그대로 남아 있었고, 수 면 제한에서 복구할 수 있습니다. 마우스 동작 다음 4 주 회복 기간에 대 한 테스트 되었습니다. 3-챔버 사회적 행동 테스트 사교 성 (소설 개체에 비해 소설 마우스에 대 한 기본 설정) 및 사회 참신 (익숙한 마우스에 비해 새로운 마우스에 대 한 기본 설정)을 평가 하기 위해 사용 되었다. 사교 성 테스트에 제어 여성 (p < 0.05) 보다 낯선 마우스를 스니핑 하는 시간을 더 소요 하는 제한 된 여성 수 면 (그림 1A)와 남성 수 면 제한 했다에 비교 될 때 개체를 검색 하는 시간을 더 소요 하는 경향이 남성을 제어 (p = 0.077) (그림 1A). 테스트의 사회 참신 단계에서 수 면 제한 여성 쥐 지출 증가 시간 여성 컨트롤 (p < 0.01) 보다 새로운 마우스를 킁 킁 (그림 1B).
그림 1: 4 주 면 회복 기간에 따라 사회적 행동을 변경 하는 만성 수 면 제한. (A) 사교 성 테스트: 시간 보냈다 킁 킁 밝혀 수 면 제한 컨트롤 남성에 비해 소설 개체를 검색 하는 시간을 더 소요 했다 그 남성 쥐 (p = 0.077). 여성 쥐 수 면 제한 스니핑 낯선 마우스 제어 여성에 비해 더 많은 시간을 보냈다 (*p < 0.05). 여성 쥐 수 면 제한도 스니핑 개체 제어 여성에 비해 더 많은 시간을 보내고 있었습니다 (p = 0.065). (B) 사회 참신 테스트: 소설 냄새를 소요 하는 시간 또는 익숙한 마우스 밝혀 그 수 면 제한 된 여성 쥐 스니핑 소설 마우스 수 면 제한 되지 않은 여성 쥐에 비해 통계적으로 중요 한 더 많은 시간을 보냈다 (* *p < 0.01)입니다. 11 컨트롤 남성, 13 수 면 제한, 22 제어 여성, 남성과 17 수 면 제한 여성 쥐에서 수단 ± SEM을 나타내는 막대입니다. 데이터 게시 hoct에의하여 분석 되었다-테스트는 ANOVA를 다음. 이 그림은 사 레 외. 20168에서 허가로 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기 우리 설명 하는 방법 수 면 부족에 대 한 처리, 모두 쥐 새끼와 성인에서 사용할 수 있는 부드러운. 부드러운 나눠 연구자 수 면 박탈 기간 동안 마우스를 관찰 하 고 그들은 비활성 또는 수 면을 방지 하기 위해 꿈 틀 때마다 동물을 부드럽게 자극을 필요 합니다. 이전 수 면 박탈 연구 확인 동시 뇌 파 (EEG) 기록에 의하여 그 부드러운 처리 방지 두 REM REM NREM 수 면10. 부드러운 처리 젊은 쥐 새끼에 사용할 수 있는 유일한 수 면 박탈 방법 중 하나는, 그것의 사용에 몇 가지 제한이 있습니다.
첫째, 부드러운 처리 모두 인식 하 고 신속 하 게 응답할 수 있습니다 미리 동작을 자 수 실험에 크게 의존 합니다. 쥐 새끼에 수 면을 뺏는 때 새끼 해야 합니다 거의 끊임없이 prodded 또는 확신 그들은 깨어 있는 전체 수 면 제한 기간에 대 한 반전. 젊은 강아지에 꿈 틀의 인정이 제대로 잠21을 방지 하기 위해 중요 합니다. 둘째, 그것은 인정 한다 이유, 새끼는 그들의 어머니와 함께 여전히 때 전에 발생 하는 수 면 부족 어머니의 수 면 보조 효과;로 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나,이 효과의 정도 아직 탐험 있다. 셋째, 그것은 본질적으로 스트레스 것입니다 어떤 수 면 박탈 과정 불가능 프로시저에 의해 발생 하는 스트레스 수 면 부족의 효과 분리 하는 것을 인식 해야 합니다. 그러나, 부드러운 처리 프로토콜을 사용 하 여 다른 수 면 박탈 프로토콜에 비해 수 면 부족의 스트레스를 최소화 하려고 여기 설명 합니다. 그리고 마지막으로, 부드러운 처리는 만성 신생아 수 면 부족에 대 한 유용한 기술, 그것은 연구자에 대 한 부담이 절차 시간이 소요 하 고 지속적인 관심을 요구 한다. 더 이상 수 면 박탈 프로토콜 시간15이상 신생아 쥐 수 면 압력에 있는 증가 때문에 수행 하기 어려운 있습니다.
이러한 제한에도 불구 하 고 부드러운 나눠 개발 내내 그리고 성인 기 및 수 면 제한 동작 및 두뇌 생리학에 영향을 미칠 방법으로 만성 수 면 제한의 효과 공부 하는 강력한 도구입니다. 가장 중요 한 것은,이 방법을 사용 하면 연구 효과 탐험을 계속 하는 수 면 어린 나이에 제한 두 다음 제한 자 즉시 뇌의 그리고 나중에 인생에서에서 개발에 가질 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 NIMH (지아 MH00889)의 교내 연구 프로그램에 의해 투자 되었다. RMS는 FRAXA 박사 친교에 의해 또한 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Wildtype mice used |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Cages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice | |
| S&S Bristle Brush Assortment Pack | Staples | Item # 13764, Model AB37100 | Paint brushes are used to gently poke mice |
References
- Picchioni, D., Reith, R. M., Nadel, J. L., Smith, C. B. Sleep, plasticity and the pathophysiology of neurodevelopmental disorders: the potential roles of protein synthesis and other cellular processes. Brain Sci. 4 (1), 150-201 (2014).
- Li, W., Ma, L., Yang, G., Gan, W. B. REM sleep selectively prunes and maintains new synapses in development and learning. Nat Neurosci. 20 (3), 427-437 (2017).
- Peirano, P. D., Algarin, C. R. Sleep in brain development. Biol Res. 40 (4), 471-478 (2007).
- Mirmiran, M., et al. Effects of experimental suppression of active (REM) sleep during early development upon adult brain and behavior in the rat. Brain Res. 283 (2-3), 277-286 (1983).
- Feng, P., Ma, Y. Instrumental REM sleep deprivation in neonates leads to adult depression-like behaviors in rats. Sleep. 26 (8), 990-996 (2003).
- Frank, M. G., Morrissette, R., Heller, H. C. Effects of sleep deprivation in neonatal rats. Am J Physiol. 275 (1 Pt 2), R148-R157 (1998).
- Todd, W. D., Gibson, J. L., Shaw, C. S., Blumberg, M. S. Brainstem and hypothalamic regulation of sleep pressure and rebound in newborn rats. Behav Neurosci. 124 (1), 69-78 (2010).
- Sare, R. M., Levine, M., Hildreth, C., Picchioni, D., Smith, C. B. Chronic sleep restriction during development can lead to long-lasting behavioral effects. Physiol Behav. 155, 208-217 (2016).
- Colavito, V., et al. Experimental sleep deprivation as a tool to test memory deficits in rodents. Front Syst Neurosci. 7, 106 (2013).
- Franken, P., Dijk, D. J., Tobler, I., Borbely, A. A. Sleep deprivation in rats: Effects on EEG power spectra, vigilance states, and cortical temperature. Am J Physiol. 261 (1 Pt 2), R198-R208 (1991).
- Araujo, P., Coelho, C. A., Oliveira, M. G., Tufik, S., Andersen, M. L. Neonatal sleep restriction increases nociceptive sensitivity in adolescent mice. Pain Physician. 21 (2), E137-E148 (2018).
- Araujo, P., Tufik, S., Anderson, M. L. Sleep and pain: A relationship that begins in early life. Pain Physician. 17 (6), E787-E798 (2014).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation effects on growth factor expression in neonatal rats: a potential role for BDNF in the mediation of delta power. J Neurophysiol. 91 (4), 1586-1595 (2004).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation elevates plasma corticosterone levels in neonatal rats. Neurosci Lett. 315 (1-2), 29-32 (2001).
- Blumberg, M. S., Middlemis-Brown, J. E., Johnson, E. D.
- Feng, P., Vogel, G. W., Obermeyer, W., Kinney, G. G. An instrumental method for long-term continuous REM sleep deprivation of neonatal rats. Sleep. 23 (2), 175-183 (2000).
- Xu, Z. Q., Gao, C. Y., Fang, C. Q., Zhou, H. D., Jiang, X. J. The mechanism and characterization of learning and memory impairment in sleep-deprived mice. Cell Biochem Biophys. 58 (3), 137-140 (2010).
- Barriga, C., Martin, M. I., Tabla, R., Ortega, E., Rodriguez, A. B. Circadian rhythm of melatonin, corticosterone and phagocytosis: Effect of stress. J Pineal Res. 30 (3), 180-187 (2001).
- Nadler, J. J., et al. Automated apparatus for quantitation of social approach behaviors in mice. Genes Brain Behav. 3 (5), 303-314 (2004).
- Thomas, A., et al. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology (Berl). 204 (2), 361-373 (2009).
- Karlsson, K. A., Blumberg, M. S. The union of the state: Myoclonic twitching is coupled with nuchal muscle atonia in infant rats. Behav Neurosci. 116 (5), 912-917 (2002).
