Summary
Vi beskriver en søvn deprivasjon teknikk kjent som forsiktig håndtering der etterforskere forsiktig prod mus helst søvn problemet er observert. Denne metoden er et kraftig verktøy som tillater forskere å studere virkningene kronisk søvn begrensning gjennom utvikling kan ha på fremtidige hjernen fysiologi og atferd.
Abstract
Søvn er avgjørende for riktig utvikling og nevrale plastisitet. Videre er unormalt søvnmønster karakteristisk for mange neurodevelopmental lidelser. Studere hvordan kronisk søvn begrensning under utviklingen kan påvirke virkemåten for voksne kan legge til vår forståelse av fremveksten av atferdsmessige symptomer på neurodevelopmental lidelser. Mens det er mange metoder som kan brukes til å begrense søvn i gnagere inkludert tvungen bevegelse, konstant avbrudd, presentasjon i aversive stimulans eller elektrisk støt, mange av disse metodene er svært stressende og kan ikke brukes i neonatal mus. Her beskriver vi forsiktig håndtering, en søvn deprivasjon teknikk som kan brukes kronisk gjennom utvikling og inn i voksenlivet for å oppnå søvn begrensning. Skånsom innebærer av musene gjennom søvn deprivasjon perioden og krever forskeren å forsiktig prod dyr når de er inaktiv eller vise opptreden forbundet med søvn. Sammen med EEG innspillinger, kan skånsom brukes å selektivt forstyrre en bestemt fremdriftsfase søvn som REM (REM)-søvn. Teknikken for skånsom er et kraftig verktøy for studier av effekten av kronisk søvn begrensning i neonatal mus som omgår mange av mer stressende prosedyrene brukes for søvnmangel.
Introduction
Søvn spiller en avgjørende rolle i neuronal plastisitet og synapse dannelse og eliminering under hjerne utviklingen1,2. Spesielt er REM (REM)-søvn viktig for danner stabile synaptic kretser gjennom begge styrking av bestemte synapser og synaptic beskjæring2. Farmakologiske søvnmangel tidlig i livet fører til mange fysiologiske og behavioral underskudd3,4. I tillegg til farmakologisk søvn deprivasjon, andre former for søvnmangel som konstant skjelvende, tvang bevegelse eller presentasjon av en aversive stimulans er forbundet med depresjon-lignende symptomer voksen, forskjellige nevrale aktivisering mønstre og endringer i sove tid og søvn kontinuitet i en utvinning periode etter deprivasjon5,6,7. Når søvn er kronisk begrenset i mus i over fem uker under utvikling, ble atferdsmessige underskudd observert etter en måned med søvn utvinning8. Sammen tyder disse studiene på at forstyrrelse av søvn i neonatal gnagere kan påvirke senere søvnmønster, hjernefunksjon og virkemåte. Fremheve betydningen av søvn for normal hjerne utviklingen i mennesker, mange pasienter med neurodevelopmental lidelser, inkludert autismespekterforstyrrelser, Tuberous sklerose komplekse, skjøre X syndrom og oppmerksomhet-underskudd/hyperaktivitet Lidelse, rapporten unormalt i søvnmønster i tillegg til en rekke atferdsmessige underskudd1.
Gitt antall neurodevelopmental lidelser forbundet med unormalt søvnmønster, er det viktig å forstå hvordan søvnmangel påvirker hjernefunksjon og atferd. Men til tross for data som støtter viktigheten av søvn under utvikling, de fleste metoder som begrenser eller frata dyr søvn fokus på voksne. Disse teknikkene omfatter en rekke tester som krever tvunget locomotor aktivitet (f.eks konstant tredemølle), konstant avbrudd (f.eks roterende feiemaskin bar eller kontinuerlig romanen objektet presentasjon) eller forstyrre dyret ved utbruddet av REM-søvn (f.eks plattform over vann)9,10. Selv om disse metodene har effektivt vist problemene knyttet til søvnmangel hos voksne, er ingen av disse metodene passende for gnager pups på grunn av begrenset mobilitet, sove stasjon og de negative effektene av stress tidlig i livet. På grunn av viktigheten av søvn under utvikling er det avgjørende å forstå hvordan begrenset søvn i neonatal pups påvirker fremtidig atferd voksen.
En teknikk for å begrense søvn som kan brukes i gnager pups er skånsom. Skånsom innebærer etterforskeren direkte samspill med gnagere noen sove funksjonalitet er observert. Etterforskerne kan bruke hendene, pensel eller presentasjon av romanen objekter til å fysisk avbryte søvn i neonatal gnagere8,10,11,12,13,14 . Søvn kan behaviorally bestemmes av mangel på motorisk aktivitet, myoclonic rykninger, og øye nedleggelse (i eldre gnager pups). EEG validering bekrefter at forstyrre søvnen med mild håndtering basert på disse virkemåtene reduserer totale sove tid med 91% i P12 rotter14. Andre teknikker som har blitt brukt å frata unge mus inkluderer elektrisk støt og presentasjon av ubehagelig stimuli, men disse teknikkene kan ikke brukes for kronisk søvn begrensning og er mer stressende enn skånsom7, 15. kronisk søvn begrensning kan også gjøres gjennom en risting protokoll som kan brukes med eller uten EEG elektrode implantasjon og tilhørende programvare, men dette hindrer ikke alle skulle sovne og er derfor mindre kontrollerte forhold til skånsom4,16. Muligheten til å begrense eller frata mus søvn i mange dager på rad uten spesifikk utstyr, programvare eller elektrode implantasjon er en fordel av skånsom teknikken. Kronisk søvn begrensning via forsiktig håndtering effektivt begrenser søvn i neonatal gnagere og produserer en rekke atferdsendringer etter de søvn deprivasjon periode8,11,12, 17.
Her beskriver vi resultater som påvirker kronisk søvnmangel i tre timer per dag fra postnatal dag 5 (P5) til P42 betydelig omgjengelighet mus etter en 30-dagers restitusjonsperiode som søvn ikke forstyrres. Disse resultatene markere langtidseffekter av kronisk søvn begrensning under utvikling på fremtidig atferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Alle prosedyrer ble godkjent av National Institute for psykisk helse Animal Care og bruk komité og utført i henhold til nasjonale institutter for helse veiledning på omsorg og bruk av dyr.
1. søvn deprivasjon oppsett
- Bruk myke pensler forsiktig rote mus når du sover.
- Kontroller at pensel kan passe gjennom barer av musen bur materen slik at mus har tilgang til mat og vann annonse libitum under søvndeprivasjon.
- Ikke bruk pensler for flere burene for å hindre overføring av dufter mellom burene. Vi foreslår at du merke hver pensel med buret sitt tildelte og begrense bruken til at buret.
- Angi et rom hvor alle søvnmangel vil inntreffe.
2. dyr oppsett
- Tilfeldig tilordne hver bur søvnmangel eller kontrollgruppe.
- Gi mus tilgang til mat og vann annonse libitum under eksperimentet.
- Kontroller at visningen av mus ikke er begrenset av sengetøy, reir materiale eller berikelse objekter i bur.
- Fjerne ekstra sengetøy eller berikelse objekter som kan begrense visningen av musene.
- Hvis mat eller vann begrenser visning av mus, kan du flytte mus til et område på bur der visningen ikke er begrenset.
- Hvis maten blokkerer en stor del av buret, Fjern mat og plasser pellets nederst i buret slik at dyr opprettholde tilgang til mat i søvn deprivasjon perioden.
3. dyr forhold
Merk: Vi valgte å begynne den tre timen søvn deprivasjon periode på 11 AM, når mus er i deres inaktiv fase, men tiden på dagen og varighet av søvnmangel kan velges basert på ønsket eksperimentelle forhold.
- Kontrollgruppe.
- På P5, fjerner sire fra oppdretter buret og la dammen med valpene til avvenning (P21).
- Flytt mus tilordnet kontrollgruppen til søvndeprivasjon rom og forsiktig prod mus med en pensel kontinuerlig i 10 minutter om dagen for varigheten av forsøket (P5 til P42).
- Etter disse 10 minutter, returnere mus til dyret holde rommet og ikke forstyrr dem
- Søvn deprivasjon gruppe.
- På P5, fjerner sire fra oppdretter buret og la dammen med valpene til avvenning (P21).
Merk: Søvnmangel før P5 kan føre cannibalization av valpene. Vi observerer ikke betydelig cannibalization P5 og senere.
Merk: I ung pups, stasjonen å sove er svært høy at nesten konstant strøk. Som mus utvikler, spesielt etter venne, sove trykket er lavere, og de trenger ikke konstant prodding. - Fortsett med søvnmangel fram til P42.
Merk: Søvn deprivasjon protokoller kan variere i lengde og forlenge forbi P42 hvis ønsket. - Flytt mus tilordnet gruppen søvn deprivasjon til søvn deprivasjon rommet daglig under lyset syklus hvor de vil bli overvåket. Den eksakte varigheten av søvnmangel kan justeres basert på bestemte problemet.
Merk: I neonatal mus søvnmangel som varer lenger enn 3 timer er vanskelig på grunn av økningen i hvilemodus trykk15.- Samtidig forsiktig prod mus med pensel det søvn er tydelig. Spesifikk av søvnmangel er forklart i neste avsnitt.
- På P5, fjerner sire fra oppdretter buret og la dammen med valpene til avvenning (P21).
4. søvnmangel
- Forsiktig prod musen med pensel hvis mistenkt for å være sover til et svar er observert. Alternativt, inverteres mus og skyve over på ryggen å forstyrre søvnen.
- Vurdere en mus å få sove hvis noe av følgende oppstår: inaktivitet, rykninger (spesielt med pups), eller hvis øynene er lukket (i mus eldre enn P12).
- Vurdere mus å være våken hvis de bevege seg rundt, prøver å snu på ryggen eller grooming seg.
- Hvis dammen er dekker pups under søvndeprivasjon, forsiktig prod henne fra pups så visningen av valpene er ubegrenset.
5. etter søvnmangel
- Når tre timers søvndeprivasjon er fullført, kan du sette sengetøy og noen mat som kan ha blitt fjernet tilbake og sette lokket tilbake på buret.
- Returnere bur til animalsk holdingselskap rom til den neste dagen av søvnmangel.
6. etterfølgende eksperimenter
- Avhengig av målet av søvn deprivasjon studien, Fortsett med etterfølgende eksperimenter.
- Høste serum fra dyr til å bestemme corticosterone nivåer18.
- Gjør ett av en rekke atferdsmessige tester, inkludert åpne-feltet RotaRod, forhøyet pluss labyrint, sosial atferd testing, marmor begrave, etc.8,19,20 testene opptreden ville likeledes forhindre dyrene fra sove slik at bør være priset når du bestemmer hvor mange dager med kontinuerlig søvndeprivasjon å ansette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Undersøke effektene av kronisk søvn begrensning på atferd, sove vi begrenset mus i tre timer daglig mellom 11:00 AM og 2:00 fra P5 P428. Etter sove begrensningen, mus var igjen uforstyrret i fire uker og lov til å gjenopprette fra søvn begrensningen. Mus ble testet for oppførsel etter fire uker restitusjonsperiode. Testen tre-kammer sosial atferd ble brukt til å vurdere omgjengelighet (preferanse for romanen mus sammenlignet med en roman objektet) og sosiale nyheten (preferanse for romanen mus sammenlignet med en kjent mus). I omgjengelighet testen, sove begrenset kvinner brukte mer tid sniffing fremmed musen enn kontroll kvinner (p < 0,05) (figur 1A) og søvn-begrenset menn hadde en tendens til å bruke mer tid sniffing objektet i forhold til kontrollere menn (p = 0.077) (figur 1A). Den sosiale nyhet fasen av testing, sove-begrenset kvinnelige mus tilbrakte en økt tiden sniffing romanen musen enn kvinnelige kontroller (p < 0,01) (figur 1B).
Figur 1: kronisk søvn begrensning endrer sosial atferd etter en 4 ukers søvn restitusjonsperiode. (A) omgjengelighet test: tidsbruk sniffing avslører at mannlige mus som var søvn begrenset brukte mer tid sniffing romanen objektet i forhold til kontroller menn (p = 0.077). Søvn-begrenset kvinnelige mus brukte mer tid sniffing fremmed musen sammenlignet kontroll kvinner (*p < 0,05). Søvn-begrenset kvinnelige mus også tendens til å bruke mer tid sniffing objektet i forhold til kontrollen kvinner (p = 0.065). (B) sosial nyhet test: tidsbruk sniffing romanen eller kjent musen avslørt at søvn begrenset kvinnelige mus brukte statistisk signifikant mer tid sniffing romanen musen i forhold til kvinnelige mus som ikke var søvn begrenset (**p < 0,01). Stolper representerer betyr ± SEM i 11 kontroll mann, 13 søvn-begrenset mann, 22 kontroll kvinnelige og 17 søvn-begrenset kvinnelige mus. Dataene ble analysert ved post hoct-tester etter en VARIANSANALYSE. Dette tallet er endret med tillatelse fra Sare et al. 20168. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her vi beskriver en metode for søvnmangel, forsiktig håndtering, som kan brukes i både gnager pups og voksne. Mild levere krever forskere å observere mus for varigheten av en søvn deprivasjon periode og forsiktig prod dyr når de er inaktiv eller beveger seg å forebygge sove. Tidligere søvn deprivasjon studier har bekreftet ved hjelp av samtidige EEG (EEG) innspillinger at skånsom hindrer både REM og ikke - REM NREM sove10. Skånsom er en av bare søvn deprivasjon metoder som kan brukes på unge gnager pups, finnes det noen begrensninger på bruken.
Første, forsiktig håndtering avhenger svært mye av eksperimentator kunne både gjenkjenne og umiddelbart svare før hvilemodus atferd. Når frata sove i gnager pups, må valpene nesten konstant prodded eller invertert for å sikre at de er våken i hele sove begrensningen perioden. Anerkjennelse av rykninger i ung pups er avgjørende for riktig hindre søvn21. Andre, det bør bli anerkjent at søvnmangel som oppstår før avvenning, når valpene er fortsatt med sin mor, kan påvirke mors sove som en sekundær virkning; men har omfanget av denne effekten ennå å bli utforsket. For det tredje er det viktig å erkjenne at noen søvn deprivasjon prosessen blir iboende stressende, og det er ikke mulig å skille effekten av søvnmangel fra stress som er forårsaket av prosedyren. Imidlertid beskrevet bruker skånsom protokollen her prøver å minimere stress søvnmangel sammenlignet med andre søvn deprivasjon protokoller. Og til slutt, mens skånsom er en nyttig teknikk for kronisk neonatal søvnmangel, det er en tung prosedyre for forskere som det er tidkrevende og krever konstant oppmerksomhet. Lengre søvn deprivasjon protokoller er også vanskelig å utføre i neonatal mus på grunn av økningen i søvn press over tid15.
Til tross for disse begrensningene er mild overlate et kraftig verktøy for å studere virkningene av kronisk søvn begrensning i utvikling og i voksen og hvordan søvn begrensning kan påvirke både atferd og hjernen fysiologi. Viktigst, denne metoden tillater forskere å undersøke effekten at søvn begrensning i tidlig alder kan ha på utvikling av hjernen både umiddelbart følgende sove begrensning og senere i livet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Intramural forskningsprogrammet av NIMH (ZIA MH00889). RMS ble også støttet av FRAXA doc..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Wildtype mice used |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Cages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice | |
| S&S Bristle Brush Assortment Pack | Staples | Item # 13764, Model AB37100 | Paint brushes are used to gently poke mice |
References
- Picchioni, D., Reith, R. M., Nadel, J. L., Smith, C. B. Sleep, plasticity and the pathophysiology of neurodevelopmental disorders: the potential roles of protein synthesis and other cellular processes. Brain Sci. 4 (1), 150-201 (2014).
- Li, W., Ma, L., Yang, G., Gan, W. B. REM sleep selectively prunes and maintains new synapses in development and learning. Nat Neurosci. 20 (3), 427-437 (2017).
- Peirano, P. D., Algarin, C. R. Sleep in brain development. Biol Res. 40 (4), 471-478 (2007).
- Mirmiran, M., et al. Effects of experimental suppression of active (REM) sleep during early development upon adult brain and behavior in the rat. Brain Res. 283 (2-3), 277-286 (1983).
- Feng, P., Ma, Y. Instrumental REM sleep deprivation in neonates leads to adult depression-like behaviors in rats. Sleep. 26 (8), 990-996 (2003).
- Frank, M. G., Morrissette, R., Heller, H. C. Effects of sleep deprivation in neonatal rats. Am J Physiol. 275 (1 Pt 2), R148-R157 (1998).
- Todd, W. D., Gibson, J. L., Shaw, C. S., Blumberg, M. S. Brainstem and hypothalamic regulation of sleep pressure and rebound in newborn rats. Behav Neurosci. 124 (1), 69-78 (2010).
- Sare, R. M., Levine, M., Hildreth, C., Picchioni, D., Smith, C. B. Chronic sleep restriction during development can lead to long-lasting behavioral effects. Physiol Behav. 155, 208-217 (2016).
- Colavito, V., et al. Experimental sleep deprivation as a tool to test memory deficits in rodents. Front Syst Neurosci. 7, 106 (2013).
- Franken, P., Dijk, D. J., Tobler, I., Borbely, A. A. Sleep deprivation in rats: Effects on EEG power spectra, vigilance states, and cortical temperature. Am J Physiol. 261 (1 Pt 2), R198-R208 (1991).
- Araujo, P., Coelho, C. A., Oliveira, M. G., Tufik, S., Andersen, M. L. Neonatal sleep restriction increases nociceptive sensitivity in adolescent mice. Pain Physician. 21 (2), E137-E148 (2018).
- Araujo, P., Tufik, S., Anderson, M. L. Sleep and pain: A relationship that begins in early life. Pain Physician. 17 (6), E787-E798 (2014).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation effects on growth factor expression in neonatal rats: a potential role for BDNF in the mediation of delta power. J Neurophysiol. 91 (4), 1586-1595 (2004).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation elevates plasma corticosterone levels in neonatal rats. Neurosci Lett. 315 (1-2), 29-32 (2001).
- Blumberg, M. S., Middlemis-Brown, J. E., Johnson, E. D. Sleep homeostasis in infant rats. Behav Neurosci. 118 (6), 1253-1261 (2004).
- Feng, P., Vogel, G. W., Obermeyer, W., Kinney, G. G. An instrumental method for long-term continuous REM sleep deprivation of neonatal rats. Sleep. 23 (2), 175-183 (2000).
- Xu, Z. Q., Gao, C. Y., Fang, C. Q., Zhou, H. D., Jiang, X. J. The mechanism and characterization of learning and memory impairment in sleep-deprived mice. Cell Biochem Biophys. 58 (3), 137-140 (2010).
- Barriga, C., Martin, M. I., Tabla, R., Ortega, E., Rodriguez, A. B. Circadian rhythm of melatonin, corticosterone and phagocytosis: Effect of stress. J Pineal Res. 30 (3), 180-187 (2001).
- Nadler, J. J., et al. Automated apparatus for quantitation of social approach behaviors in mice. Genes Brain Behav. 3 (5), 303-314 (2004).
- Thomas, A., et al. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology (Berl). 204 (2), 361-373 (2009).
- Karlsson, K. A., Blumberg, M. S. The union of the state: Myoclonic twitching is coupled with nuchal muscle atonia in infant rats. Behav Neurosci. 116 (5), 912-917 (2002).
