Summary
Vi beskriver en sleep deprivation teknik känd som varsam hantering där utredarna försiktigt prod möss som helst sova beteende observeras. Denna metod är ett kraftfullt verktyg som tillåter forskare att studera effekterna som kronisk sömn begränsning i hela utvecklingen kan få på framtida hjärnans fysiologi och beteende.
Abstract
Sömn är avgörande för god utveckling och neural plasticitet. Dessutom är onormal sömnmönster kännetecknar många neurologiska utvecklingsavvikelser. Studera hur kronisk sömn begränsning under utveckling kan påverka vuxna beteende kan lägga till vår förståelse av uppkomsten av beteendemässiga symtom på kind. Medan det finns många metoder som kan användas för att begränsa sömn hos gnagare inklusive påtvingad förflyttning, ständiga avbrott, presentation av ett aversivt stimulus, eller elektriska stötar, många av dessa metoder är mycket stressande och kan inte användas i neonatala möss. Här beskriver vi skonsam hantering, en sleep deprivation teknik som kan användas för kroniskt hela utveckling och i vuxen ålder för att uppnå sömn begränsning. Skonsam hantering innebär noggrann observation av möss under hela sleep deprivation och kräver forskaren som försiktigt prod djuren när de är inaktiva eller Visa beteenden associerade med sömn. Tillsammans med EEG inspelningar, kunde varsam hantering användas selektivt störa en viss fas av sömn såsom rapid eye movement (REM) sömn. Tekniken med varsam hantering är ett kraftfullt verktyg för att studera effekterna av kronisk sömn begränsning även i neonatala möss som kringgår många av de mer stressande förfaranden som används för sömnbrist.
Introduction
Sömnen spelar en avgörande roll i neuronal plasticitet och synaps bildas och eliminering under hjärnans utveckling1,2. Specifikt, är rapid eye movement (REM) sömn viktigt för att bilda stabila synaptic kretsar genom båda stärka specifika synapser och synaptic beskärning2. Farmakologiska sömnbrist tidigt i livet leder till många fysiologiska och beteendemässiga underskott3,4. Förutom farmakologisk sömn deprivation, andra former av sömnbrist som konstant skakningar, tvingade locomotion eller presentation av ett aversivt stimulus har förknippats med depression-liknande symtom under vuxenlivet, olika neurala aktivering mönster och förändringar i sömn tid och sömn kontinuitet under en återhämtningsperiod efter frihetsberövande5,6,7. När sömnen är kroniskt begränsad hos möss i över fem veckor under utveckling, observerades beteendemässiga underskott efter en månad av sömn återvinning8. Sammantaget tyder dessa studier på att störningar av sömn i neonatal gnagare kan påverka senare sömnmönster, hjärnans funktion och beteende. Belysa vikten av sömn för hjärnans normala utveckling hos människor, många patienter med nervsystemets utveckling, inklusive autismspektrumstörningar, tuberös skleros Complex, Fragil X-syndromet och Attention-Deficit/Hyperactivity Sjukdom, rapportera avvikelser i sömnmönster förutom en mängd beteendemässiga underskott1.
Med tanke på antalet kind som är associerade med onormalt sömnmönster, är det viktigt att förstå hur Sömnbrist påverkar hjärnans funktion och beteende. Trots att data som stöder vikten av sömn under utveckling, de flesta metoder som begränsar eller beröva djur av sömn fokuserar på vuxna. Dessa tekniker inkluderar en mängd olika tester som kräver tvingade rörelseaktivitet (t.ex. konstant löpband), konstant störningar (t.ex. roterande sopmaskin bar eller kontinuerlig roman objekt presentation) eller störa djuret vid uppkomsten av REM-sömn (t.ex. plattform över vatten)9,10. Även om dessa metoder har effektivt visat problemen i samband med sömnbrist hos vuxna, är ingen av dessa metoder lämpliga för gnagare valpar på grund av deras begränsade rörlighet, hög sömn drive och de negativa effekterna av stress tidigt i livet. På grund av vikten av sömn under utveckling är det viktigt att förstå hur begränsad sömn i neonatal pups påverkar framtida beteende under vuxenlivet.
En teknik att begränsa sömn som kan användas hos gnagare ungar är varsam hantering. Skonsam hantering innebär att utredaren interagerar direkt med gnagare någon tid sömn beteende observeras. Utredarna kan använda sina händer, en pensel eller presentation av romanen objekt att fysiskt störa sömnen i neonatal gnagare8,10,11,12,13,14 . Sömn kan bestämmas behaviorally av bristande motorisk aktivitet, myokloniska ryckningar och öga stängning (i äldre gnagare pups). EEG validering bekräftar att störa sömnen med varsam hantering baserat på dessa beteenden minskar totala sömntiden med 91% i P12 råttor14. Andra tekniker som har använts för att beröva unga möss inkluderar elstötar och presentation av obehagliga stimuli, men dessa tekniker kan inte användas för kronisk sömn begränsning och är mer stressande än varsam hantering7, 15. kronisk sömn begränsning kan också åstadkommas genom en skakande protokoll som kan användas med eller utan EEG elektrod implantation och tillhörande programvara, men detta protokoll hindrar inte alla sömn och är därför mindre kontrollerade jämfört med varsam hantering4,16. Möjlighet att begränsa eller beröva möss sömn för många dagar i rad utan särskild utrustning, programvara eller elektrod implantation är en fördel av tekniken med varsam hantering. Kronisk sömn begränsning via skonsam hantering effektivt begränsar sömn i neonatal gnagare och producerar en mängd olika beteendeförändringar efter de sleep deprivation periodiska8,11,12, 17.
Här, beskriver vi resultat där kronisk sömnbrist tre timmar per dag från postnatal dag 5 (P5) till P42 avsevärt påverkar sällskaplighet möss efter en 30-dagars återhämtningsperiod där sömn inte störs. Dessa resultat belysa de långsiktiga effekterna av kronisk sömn begränsning under utveckling på framtida beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Alla förfaranden godkändes av det nationella institutet för Mental djur vård och användning kommittén och utförs i enlighet med nationella institut för hälsa riktlinjerna för vård och användning av djur.
1. sleep Deprivation Setup
- Använd mjuka penslar för att försiktigt peta möss när du sover.
- Kontrollera att pensel kan passa genom barerna i mus bur mataren så att möss har tillgång till mat och vatten ad libitum under sömnbrist.
- Använd inte penslar för flera burar för att förhindra överföring av dofter mellan burar. Vi föreslår att du märka varje borste med dess tilldelade bur och begränsa dess användning till denna bur.
- Utse ett rum där alla sömnbrist kommer att inträffa.
2. djurens Setup
- Slumpmässigt tilldela varje bur till antingen sömnbrist eller kontrollgrupp.
- Ge mössen tillgång till mat och vatten ad libitum under experimentet.
- Kontrollera att Visa möss inte begränsas av sängkläder, bomaterial eller anrikning objekt i bur.
- Ta bort extra sängkläder eller anrikning objekt som kan begränsa visningen av möss.
- Om mat eller vatten som begränsar syn på möss, flytta möss till ett område av bur där vyn inte är begränsad.
- Om maten blockerar en stor del av buren, ta bort lite mat och placera pellets på botten av buren så att djuren behålla tillgången till mat i sleep deprivation perioden.
3. djurens villkor
Obs: Vi valde att börja den tre timmars sömn deprivation perioden kl 11.00, när möss är mitt i sin inaktiva fas, men tid på dagen och varaktighet av sömnbrist kan väljas utifrån önskad experimentella förutsättningar.
- Kontrollgrupp.
- På P5, ta bort far från uppfödare buren och lämna dammen med avkomman fram till avvänjning (P21).
- Flytta möss som tilldelats kontrollgruppen till sömnbrist rumsservice och försiktigt prod möss med en pensel kontinuerligt i 10 minuter om dagen för varaktigheten av experimentet (P5 till P42).
- Efter dessa 10 minuter, återvända möss till djuret hålla rummet och stör inte dem
- Sleep Deprivation grupp.
- På P5, ta bort far från uppfödare buren och lämna dammen med avkomman fram till avvänjning (P21).
Obs: Sömnbrist före P5 kan resultera i cannibalization av valparna. Vi inte observerar betydande cannibalization på P5 och senare.
Obs: I unga valpar är enheten att sova mycket hög kräver nästan konstant strök. När möss utvecklar, särskilt efter avvänjning, sömn trycket är lägre och de behöver inte konstant prodding. - Fortsätta med sömnbrist varje dag fram till P42.
Obs: Sleep deprivation protokoll kan variera i längd och förlänga förbi P42 om så önskas. - Flytta möss som tilldelats gruppen sleep deprivation till sleep deprivation rummet dagligen under lätta cykeln där de kommer att övervakas. Den exakta varaktigheten av sömnbrist kan justeras baserat på den specifika frågeställningen.
Obs: Hos neonatala möss sömnbrist som varar längre än 3 timmar är svårt på grund av ökningen av sömn tryck15.- Under den här tiden försiktigt prod möss med paintbrush helst att sömn är uppenbart. Detaljerna i sömnbrist förklaras i nästa avsnitt.
- På P5, ta bort far från uppfödare buren och lämna dammen med avkomman fram till avvänjning (P21).
4. sömnbrist
- Försiktigt prod mus med pensel om misstänks vara sover tills ett svar har observerats. Alternativt, Invertera möss och skjut över på ryggen att störa sömnen.
- Överväga en mus ska somna om något av följande inträffar: inaktivitet, ryckningar (särskilt med PUP), eller om deras ögon är stängda (hos möss äldre än P12).
- Överväga möss att vara vaken om de flyttar runt, försöker vända över efter att på ryggen eller grooming sig.
- Om dammen täcker valpar under sömnbrist, försiktigt prod henne bort från pups så valparna är obegränsad.
5. efter sömnbrist
- När tre timmars perioden av sömnbrist är komplett, sätta sängkläder och någon mat som kan ha tagits bort tillbaka och sätt tillbaka locket på buren.
- Returnera burar till animaliskt innehav rum förrän nästa dag av sömnbrist.
6. efterföljande experiment
- Beroende på syftet med frihetsberövande sömnstudien, Fortsätt med efterföljande experiment.
- Skörda serum från djur att bestämma kortikosteron nivåer18.
- Gör något av ett antal beteendemässiga tester, inklusive öppet fält, RotaRod, förhöjt Plus labyrint, socialt beteende testning, marmor begrava, etc.8,19,20 dessa beteende tester kommer också att förhindra djuren från sover så att bör vägas in vid fastställandet av hur många dagar av kontinuerlig sömnbrist att anställa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att undersöka effekterna av kronisk sömn inskränkning beteende, sover vi begränsad möss i tre timmar dagligen mellan 11:00 och 2:00 PM från P5 till P428. Efter sömn begränsningen, var möss lämnas ostörda i fyra veckor och får återhämta sig från sömn begränsning. Möss testades för beteende efter fyra veckors återhämtningsperiod. Tre-kammare sociala beteende testet användes för att bedöma sällskaplighet (preferens för en roman mus jämfört med en roman objekt) och sociala nyhet (preferens för en roman mus jämfört med en bekant mus). I sällskaplighet test, sova begränsad honor tillbringade mer tid sniffa främling musen än kontroll honor (p < 0,05) (figur 1A) och sömn-begränsad män hade en tendens att spendera mer tid sniffa objektet jämfört styra män (p = 0.077) (figur 1A). I den sociala nyhet fasen av testning, sömn-begränsad honmöss tillbringade ett ökat mängden tid som sniffar roman musen än kvinnliga kontroller (p < 0,01) (figur 1B).
Figur 1: kronisk sömn begränsning förändrar sociala beteende efter en 4-veckors sömn återhämtningsperiod. (A) sällskaplighet test: träningstid snusas avslöjar att hanmöss som var sömn begränsad tillbringade mer tid sniffa objektet roman jämfört kontroller hanarna (p = 0.077). Sömn-begränsad honmöss tillbringade mer tid sniffa främling musen jämfört med kontroll honor (*p < 0,05). Sömn-begränsad honmöss tenderade också att spendera mer tid sniffa objektet jämfört med kontroll honor (p = 0,065). (B) sociala nyhet test: träningstid snusas romanen eller bekant mus visade att sömn begränsad honmöss tillbringade statistiskt signifikant mer tid sniffa roman musen jämfört honmöss som inte var sömn begränsas (**p < 0,01). Staplarna representerar den medel ± SEM i 11 kontroll hane, 13 sömn-begränsad hane, 22 kontroll kvinnliga och 17 sömn-begränsad honmöss. Data analyserades med hjälp av post hoct-testerna som en ANOVA. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Sare et al. 20168. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en metod för sömnbrist, skonsam hantering, som kan användas i både gnagare ungar och vuxna. Mild lämna kräver forskare att iaktta möss för varaktigheten av en sleep deprivation perioden och försiktigt prod djuren när de är inaktiva eller ryckningar att förhindra sömn. Tidigare sömnstudier frihetsberövande har kontrollerat genom samtidig elektroencefalogram (EEG) inspelningar att varsam hantering förhindrar både REM och icke - REM NREM sömn10. Medan varsam hantering är en av de enda sleep deprivation metoder som kan användas på unga gnagare valpar, finns det vissa begränsningar för dess användning.
Första, skonsam hantering är starkt beroende av försöksledaren ska kunna erkänna såväl omedelbart svarar att före sova beteenden. När beröva sömn hos gnagare ungar, måste valparna vara nästan konstant stack eller vändas för att försäkra att de är vaken för perioden hela sömn begränsning. Erkännande av ryckningar i unga valpar är kritisk för att förhindra korrekt sömn21. För det andra bör det erkännas att sömnbrist som uppstår innan avvänjning, när valparna är fortfarande med sin mor, kunde påverka moderns sömn som en sekundär effekt; omfattningen av denna effekt har dock ännu att utforskas. Det tredje är det viktigt att erkänna att någon sömn deprivation process kommer att vara inneboende stressande, och det är inte möjligt att skilja effekterna av sömnbrist från den stress som orsakas av förfarandet. Dock beskrivs med varsam hantering protokollet här försök att minimera stress av sömnbrist jämfört med andra sleep deprivation protokoll. Och slutligen, varsam hantering är en användbar teknik för kronisk neonatal sömnbrist, är det ett betungande förfarande för forskare i det är tidskrävande och kräver ständig uppmärksamhet. Längre sleep deprivation protokoll är också svåra att utföra i neonatala möss på grund av ökningen av sömn trycket över tid15.
Trots dessa begränsningar är mild överlämnande ett kraftfullt verktyg för att studera effekterna av kronisk sömn begränsning hela utveckling och i vuxen ålder och hur sömn begränsning kan påverka både beteende och hjärnans fysiologi. Viktigast av allt, denna metod tillåter forskare att fortsätta att undersöka effekterna att sömn begränsning i tidig ålder kan ha på utvecklingen av hjärnans båda omedelbart följande sova begränsning och senare i livet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats av intramurala forskningsprogrammet av NIMH (ZIA MH00889). RMS stöddes också av en FRAXA postdoktorsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Wildtype mice used |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Cages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice | |
| S&S Bristle Brush Assortment Pack | Staples | Item # 13764, Model AB37100 | Paint brushes are used to gently poke mice |
References
- Picchioni, D., Reith, R. M., Nadel, J. L., Smith, C. B. Sleep, plasticity and the pathophysiology of neurodevelopmental disorders: the potential roles of protein synthesis and other cellular processes. Brain Sci. 4 (1), 150-201 (2014).
- Li, W., Ma, L., Yang, G., Gan, W. B. REM sleep selectively prunes and maintains new synapses in development and learning. Nat Neurosci. 20 (3), 427-437 (2017).
- Peirano, P. D., Algarin, C. R. Sleep in brain development. Biol Res. 40 (4), 471-478 (2007).
- Mirmiran, M., et al. Effects of experimental suppression of active (REM) sleep during early development upon adult brain and behavior in the rat. Brain Res. 283 (2-3), 277-286 (1983).
- Feng, P., Ma, Y. Instrumental REM sleep deprivation in neonates leads to adult depression-like behaviors in rats. Sleep. 26 (8), 990-996 (2003).
- Frank, M. G., Morrissette, R., Heller, H. C. Effects of sleep deprivation in neonatal rats. Am J Physiol. 275 (1 Pt 2), R148-R157 (1998).
- Todd, W. D., Gibson, J. L., Shaw, C. S., Blumberg, M. S. Brainstem and hypothalamic regulation of sleep pressure and rebound in newborn rats. Behav Neurosci. 124 (1), 69-78 (2010).
- Sare, R. M., Levine, M., Hildreth, C., Picchioni, D., Smith, C. B. Chronic sleep restriction during development can lead to long-lasting behavioral effects. Physiol Behav. 155, 208-217 (2016).
- Colavito, V., et al. Experimental sleep deprivation as a tool to test memory deficits in rodents. Front Syst Neurosci. 7, 106 (2013).
- Franken, P., Dijk, D. J., Tobler, I., Borbely, A. A. Sleep deprivation in rats: Effects on EEG power spectra, vigilance states, and cortical temperature. Am J Physiol. 261 (1 Pt 2), R198-R208 (1991).
- Araujo, P., Coelho, C. A., Oliveira, M. G., Tufik, S., Andersen, M. L. Neonatal sleep restriction increases nociceptive sensitivity in adolescent mice. Pain Physician. 21 (2), E137-E148 (2018).
- Araujo, P., Tufik, S., Anderson, M. L. Sleep and pain: A relationship that begins in early life. Pain Physician. 17 (6), E787-E798 (2014).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation effects on growth factor expression in neonatal rats: a potential role for BDNF in the mediation of delta power. J Neurophysiol. 91 (4), 1586-1595 (2004).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation elevates plasma corticosterone levels in neonatal rats. Neurosci Lett. 315 (1-2), 29-32 (2001).
- Blumberg, M. S., Middlemis-Brown, J. E., Johnson, E. D.
- Feng, P., Vogel, G. W., Obermeyer, W., Kinney, G. G. An instrumental method for long-term continuous REM sleep deprivation of neonatal rats. Sleep. 23 (2), 175-183 (2000).
- Xu, Z. Q., Gao, C. Y., Fang, C. Q., Zhou, H. D., Jiang, X. J. The mechanism and characterization of learning and memory impairment in sleep-deprived mice. Cell Biochem Biophys. 58 (3), 137-140 (2010).
- Barriga, C., Martin, M. I., Tabla, R., Ortega, E., Rodriguez, A. B. Circadian rhythm of melatonin, corticosterone and phagocytosis: Effect of stress. J Pineal Res. 30 (3), 180-187 (2001).
- Nadler, J. J., et al. Automated apparatus for quantitation of social approach behaviors in mice. Genes Brain Behav. 3 (5), 303-314 (2004).
- Thomas, A., et al. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology (Berl). 204 (2), 361-373 (2009).
- Karlsson, K. A., Blumberg, M. S. The union of the state: Myoclonic twitching is coupled with nuchal muscle atonia in infant rats. Behav Neurosci. 116 (5), 912-917 (2002).
