Summary
Nós descrevemos uma técnica de privação de sono conhecida como manipulação suave, onde os investigadores suavemente prod ratos qualquer momento sono comportamento é observado. Este método é uma ferramenta poderosa que permite aos pesquisadores estudar os efeitos que a restrição de sono crônica durante todo o desenvolvimento pode ter no comportamento e fisiologia do cérebro futuras.
Abstract
O sono é fundamental para o bom desenvolvimento e plasticidade neural. Além disso, padrões de sono anormais são características de muitos transtornos do desenvolvimento neurológico. Restrição de sono estudando como crônica durante o desenvolvimento pode afetar o comportamento adulto pode aumentar a nossa compreensão do surgimento dos sintomas comportamentais de transtornos do desenvolvimento neurológico. Embora existam muitos métodos que podem ser usados para restringir o sono em roedores, incluindo locomoção forçada, perturbação constante, apresentação de um estímulo contrário ou choque elétrico, muitos destes métodos são muito estressantes e não podem ser usados em camundongos neonatais. Aqui, descrevemos manipulação suave, uma técnica de privação de sono que pode ser usada cronicamente durante todo o desenvolvimento e na idade adulta para alcançar a restrição de sono. Manipulação suave envolve estreita observação dos ratos durante todo o período de privação de sono e requer o pesquisador prod suavemente os animais quando eles estão inativos ou exibir comportamentos associados com o sono. Juntamente com as gravações de EEG, manipulação suave poderia ser usada para interromper seletivamente uma fase específica do sono, como sono de movimento rápido dos olhos (REM). A técnica de manipulação suave é uma poderosa ferramenta para o estudo dos efeitos da restrição de sono crônica mesmo em ratos neonatais que contorna a muitos dos procedimentos utilizados para a privação do sono mais estressantes.
Introduction
Sono desempenha um papel fundamental na formação de sinapse e plasticidade neuronal e eliminação durante o desenvolvimento de cérebro1,2. Especificamente, o sono de movimento rápido dos olhos (REM) é essencial para a formação de circuitos sinápticos estáveis através de ambos fortalecimento das sinapses específicas e poda sináptica2. Privação de sono farmacológicos no início da vida leva a muitos déficits fisiológicos e comportamentais3,4. Além de farmacológico sono privação, outras formas de privação do sono, tais como vibração constante, forçado a locomoção, ou apresentação de um estímulo contrário têm sido associados com sintomas de depressão durante a vida adulta, diferente neural padrões de ativação e mudanças na continuidade de tempo e sono sono durante um período de recuperação após privação5,6,7. Quando o sono é cronicamente restrito em camundongos há mais de cinco semanas, durante o desenvolvimento, os défices comportamentais foram observados após um mês de sono recuperação8. Tomados em conjunto, estes estudos sugerem que a perturbação do sono no roedor neonatal pode afetar posteriores padrões de sono, a função cerebral e comportamento. Destacando a importância do sono para o desenvolvimento normal do cérebro em humanos, muitos pacientes com transtornos do desenvolvimento neurológico, incluindo transtornos do espectro do autismo, complexo de esclerose tuberosa, síndrome de X frágil e atenção-déficit Desordem, anormalidades do relatório nos padrões de sono, além de uma variedade de défices comportamentais1.
Dado o número de transtornos do desenvolvimento neurológico que estão associados com padrões de sono anormais, é importante entender como falta de sono afeta o comportamento e a função cerebral. No entanto, apesar dos dados que suportam a importância do sono durante o desenvolvimento, a maioria das metodologias que restringem ou privam os animais de foco do sono em adultos. Estas técnicas incluem uma variedade de testes que exigem forçado a atividade locomotora (por exemplo, constante da esteira), perturbação constante (por exemplo, rotação bar vassoura ou apresentação contínua objeto romance) ou perturbar o animal no início da 9,de sono REM (por exemplo, a plataforma sobre a água)10. Embora esses métodos demonstraram efetivamente os problemas associados com a privação do sono em adultos, nenhum desses métodos são apropriados para filhotes de roedores devido sua mobilidade limitada, unidade de sono alta e os efeitos adversos do stress no início da vida. Devido à importância do sono durante o desenvolvimento, é fundamental para entender o sono como restrito no comportamento futuro do afeta neonatal filhotes durante a vida adulta.
Uma técnica para restringir o sono que pode ser usado em filhotes de roedores é manipulação suave. Manipulação suave envolve o investigador interagindo diretamente com os roedores que qualquer hora sono comportamento é observado. Os investigadores podem usar suas mãos, um pincel ou apresentação de novos objetos fisicamente perturbar o sono em roedores neonatal8,10,11,12,13,14 . Sono pode ser determinado de forma comportamental por falta de atividade motora, espasmos Mioclônicas e fechamento do olho (em filhotes de roedores mais velhos). Validação de EEG confirma que interromper o sono com a manipulação suave baseada esses comportamentos reduz o tempo total de sono em 91% no P12 ratos14. Outras técnicas que foram usadas para privar os ratos jovens incluem choque elétrico e apresentação de estímulos desagradáveis, mas essas técnicas não podem ser usadas para restrição de sono crônica e são mais estressantes do que manipulação suave7, 15. restrição de sono crônica pode também ser realizada através de um protocolo de agitação que pode ser usado com ou sem implante de eletrodos de EEG e software de computador associado, mas este protocolo não impede o sono de todos e, portanto, é menos controlada em comparação com manipulação suave4,16. A capacidade de restringir ou privar ratos de sono por muitos dias seguidos sem equipamentos específicos, software de computador ou implantação do eletrodo é um benefício a técnica de manipulação suave. Restrição de sono crônica através de manipulação suave efetivamente limita o sono em roedores Neonatais e produz uma variedade de mudanças de comportamento após o sono privação período8,11,12, 17.
Aqui, descrevemos os resultados em que privação de sono crônica por três horas por dia pós-Natal dia 5 (P5)-P42 afeta significativamente sociabilidade de ratos após um período de recuperação de 30 dias em que o sono não seja perturbado. Esses resultados destacam os efeitos a longo prazo de restrição de sono crônica durante o desenvolvimento no comportamento futuro.
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Protocol
Nota: Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de uso e National Institute de Mental Saúde Cuidado Animal e efectuados de acordo com os institutos nacionais de saúde orientações sobre os cuidados e uso de animais.
1. instalação de privação de sono
- Use pincéis macios para picar delicadamente os ratos quando dormindo.
- Certifique-se que o pincel pode caber através das grades do alimentador gaiola do rato para garantir que os ratos têm acesso à comida e água ad libitum durante a privação do sono.
- Não usam pincéis para gaiolas múltiplas para evitar a transferência de aromas entre as gaiolas. Sugerimos que você rotule cada escova com sua gaiola atribuída e restringir seu uso para a gaiola.
- Designe um quarto onde ocorrerá toda privação do sono.
2. animal Setup
- Aleatoriamente, atribua cada gaiola a privação do sono ou grupo de controle.
- Dar ratos acesso à comida e água ad libitum durante o experimento.
- Certifique-se de vista de ratos não é restringida por cama, material de ninho ou objetos de enriquecimento na gaiola.
- Remova a roupa de cama extra ou objetos de enriquecimento que poderiam restringir a exibição dos ratos.
- Se a comida ou água restringe a exibição de ratos, vão ratos para uma área da gaiola onde a vista não é restrita.
- Se o alimento bloqueia grande parte da gaiola, retire um pouco de comida e lugar pellets no fundo da gaiola, para que os animais mantenham o acesso à comida durante o período de privação de sono.
3. animais condições
Nota: Nós escolhemos começar a três horas, período de privação de sono às 11:00, quando os ratos estão no meio de sua fase inativa, mas a hora do dia e a duração da privação do sono podem ser escolhidos com base em condições experimentais desejadas.
- Grupo de controle.
- Em P5, remover a Majestade da gaiola do reprodutor e abandonar o ninho com os filhotes até o desmame (P21).
- Mover-se ratos atribuídos ao grupo de controle para a privação do sono de quarto e suavemente prod os ratos com um pincel de pintura continuamente por 10 minutos por dia para a duração do experimento (P5 para P42).
- Após esses 10 minutos, retornar os ratos para o animal a sala e não perturbá-los
- Grupo de privação de sono.
- Em P5, remover a Majestade da gaiola do reprodutor e abandonar o ninho com os filhotes até o desmame (P21).
Nota: A privação de sono antes da P5 pode resultar em canibalização dos filhotes. Nós não observaram significativa canibalização em P5 e mais tarde.
Nota: Em filhotes, a unidade de dormir é muito alta, exigindo quase constante acariciando. Como os ratos se desenvolvem, especialmente após o desmame, a pressão de sono é mais baixa e eles não precisam de estímulo constante. - Continue com a privação de sono todos os dias até P42.
Nota: Protocolos de privação de sono podem variar em comprimento e estender após P42, se desejado. - Mova os ratos atribuídos ao grupo de privação de sono para o quarto de privação de sono diariamente durante o ciclo de luz onde eles serão monitorados. A duração exata de privação do sono pode ser ajustada baseado sobre a questão de pesquisa específicos.
Nota: Em ratos neonatais que dura mais de 3 horas de sono é difícil devido ao aumento de pressão de sono15.- Durante este tempo, suavemente prod os ratos com o pincel sempre que dormir é evidente. Especificidades de privação do sono são explicadas na próxima seção.
- Em P5, remover a Majestade da gaiola do reprodutor e abandonar o ninho com os filhotes até o desmame (P21).
4. a privação de sono
- Delicadamente prod rato com pincel se suspeitas de estarem dormindo, até que uma resposta é observada. Alternativamente, inverter os ratos e empurrão em suas partes traseiras para perturbar o sono.
- Considere um mouse para estar a dormir, se ocorrer qualquer um dos seguintes: inatividade, espasmos (especialmente com filhotes), ou se seus olhos estão fechados (em ratos mais velhos que P12).
- Considere os ratos para ser acordado se eles estão em movimento ao redor, tentando virar depois sendo em suas costas, o aliciamento ou se.
- Se represa está cobrindo os filhotes durante a privação do sono, delicadamente prod ela longe de filhotes para a exibição dos filhotes é irrestrita.
5. após a privação de sono
- Quando terminar o período de três horas de privação de sono, coloque a roupa de cama e qualquer alimento que pode ter sido removido volta e coloque a tampa de volta na gaiola.
- Retorno gaiolas para sala de espera do animal até o próximo dia de privação do sono.
6. subsequentes experimentos
- Dependendo o objetivo do estudo de privação de sono, prosseguir com as experiências subsequentes.
- Colher o soro de animais para determinar os níveis de corticosterona18.
- Fazer qualquer um de uma série de testes comportamentais, incluindo o campo aberto, RotaRod, labirinto, mais elevado, comportamento Social, testes, enterrando de mármore, etc.8,19,20 destes testes de comportamento também impedirá que os animais de dormindo para que devem ser fatorados determinar quantos dias de privação de sono contínuo a empregar.
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Representative Results
Para investigar os efeitos da restrição de sono crônica sobre comportamento, dormimos ratos restritos por três horas diariamente entre as 11:00 e 14:00 de P5 P428. Após a restrição de sono, ratos foram deixados inalterados durante quatro semanas e permitiu recuperar da restrição de sono. Os ratos foram testados pelo comportamento após o período de quatro semanas de recuperação. Foi utilizado o teste de comportamento social três-câmara para avaliar a sociabilidade (preferência para um romance mouse comparado a um objeto romance) e novidade social (preferência para um romance mouse em comparação com um rato familiar). No teste de sociabilidade, dormir restritas fêmeas passadas mais tempo cheirando o mouse mais estranho do que fêmeas de controle (p < 0,05) (figura 1A) e machos de sono restrito tinham uma tendência a passar mais tempo cheirando o objeto em relação ao controlar os machos (p = 0.077) (figura 1A). Na fase de testes novidade social, restrição de sono em ratos fêmeas passaram um aumento a quantidade de tempo cheirando o mouse romance do que controles femininos (p < 0,01) (figura 1B).
Figura 1: restrição de sono crônica altera o comportamento social após um período de recuperação de 4 semanas de sono. (A) teste de sociabilidade: tempo gasto farejador revela que ratos masculinos que foram dormir restrito passou mais tempo cheirando o objeto romance em comparação com os machos de controles (p = 0.077). Restrição de sono em ratos fêmeas passaram mais tempo cheirando o mouse mais estranho em comparação com fêmeas de controle (*p < 0,05). Restrição de sono em ratos fêmeas também tendem a passar mais tempo cheirando o objeto comparado às fêmeas de controle (p = 0.065). (B) teste de novidade Social: tempo gasto cheirando o romance ou rato familiar revelou esse sono restritos ratos fêmeas passaram estatisticamente significativo mais tempo cheirando o romance mouse em comparação com ratos fêmeas que não foram sono restringido (* *p < 0,01). Barras representam os meios ± SEM em 11 controle macho, macho de sono restrito 13, 22 controle feminino e 17 ratos fêmeas sono restrito. Os dados foram analisados por meio de post hoct-testes seguindo uma ANOVA. Esta figura foi modificada com a permissão de Sare et al . 20168. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui nós descrevemos um método para a privação de sono, suave manipulação, que pode ser usada em ambos os filhotes de roedores e em adultos. Entrega de suave requer os pesquisadores a observar os ratos para a duração de um período de privação de sono e suavemente prod os animais quando eles estão inativos ou contrair para impedir o sono. Estudos de privação de sono prévio verificou-se por meio de gravações simultâneas de eletroencefalograma (EEG), que suave manipulação impede que ambos REM e NREM não - REM dormir10. Enquanto manipulação suave é um dos únicos métodos de privação de sono que podem ser usados em filhotes de roedores, existem algumas limitações para seu uso.
Em primeiro lugar, suave manipulação depende muito o experimentador para poderes tanto reconhecer e responder prontamente para pre-dormir comportamentos. Quando privar de sono em filhotes de roedores, os filhotes devem ser picados ou invertidos para garantir que estiverem acordados para o período de restrição de sono inteira quase constantemente. Reconhecimento de espasmos em filhotes é fundamental para prevenir adequadamente sono21. Em segundo lugar, há que reconhecer que privação de sono que ocorre até a desmama, quando os filhotes ainda estão com sua mãe, poderia afetar o sono da mãe como um efeito secundário; no entanto, a extensão deste efeito tem ainda a ser explorado. Em terceiro lugar, é importante reconhecer que qualquer processo de privação de sono será inerentemente estressante, e não é possível separar os efeitos da privação de sono do stress que é causada pelo procedimento. No entanto, usando o protocolo de manuseio suave descrito aqui tenta minimizar o estresse da privação do sono em comparação com outros protocolos de privação de sono. E finalmente, Considerando que a manipulação suave é uma técnica útil para privação de sono neonatal crônica, é um procedimento oneroso para os investigadores como é demorado e requer atenção constante. Mais protocolos de privação do sono também são difíceis de realizar em camundongos neonatais devido os aumentos na pressão de sono ao longo do tempo,15.
Apesar dessas limitações, entregando suave é uma poderosa ferramenta para estudar os efeitos da restrição de sono crônica durante todo o desenvolvimento e para a vida adulta e como restrição de sono pode afetar a fisiologia do comportamento e o cérebro. O mais importante, esse método permite que os pesquisadores para continuar a explorar os efeitos sono que restrição em idade precoce pode ter sobre o desenvolvimento do cérebro ambos imediatamente seguinte restrição de dormir e mais tarde na vida.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo programa de pesquisa Intramural do NIMH (ZIA MH00889). RMS também foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado FRAXA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Wildtype mice used |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Cages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice | |
| S&S Bristle Brush Assortment Pack | Staples | Item # 13764, Model AB37100 | Paint brushes are used to gently poke mice |
References
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