Summary
ويصف هذا البروتوكول نهجاً خالية من المعايرة لتحديد كمية البروتين هومو أوليجوميريزاتيون في المختبر استناداً إلى الأسفار تقلب التحليل الطيفي باستخدام ضوء التجارية الفحص المجهري. يتم عرض الإعدادات الصحيحة اقتناء وأساليب التحليل.
Abstract
عدد والسطوع أسلوب التحليل الطيفي (جبهة القوى الاشتراكية) تقلب الأسفار خالية من المعايرة للكشف عن البروتين هومو-أوليجوميريزيشن. يمكن أن تستخدم استخدام مجهر [كنفوكل] تقليدية مزودة بكاشفات رقمية. ويرد بروتوكول لاستخدام التقنية في المختبر عن طريق حالة استخدام حيث يمكن رؤية عدد والسطوع دقة قياس حالة المسمى مفينوس FKBP12F36V أوليجوميريك قبل وبعد إضافة الدواء ديميريزينج AP20187. وتناقش أهمية استخدام المعلمات اقتناء مجهر الصحيحة وطرق تجهيزها وتحليل البيانات الصحيحة. على وجه الخصوص، يتم التشديد على أهمية اختيار التصحيح فوتوبليتشينج. ويمكن استخدام هذا الأسلوب غير مكلفة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين في العديد من السياقات البيولوجية.
Introduction
البروتين-بروتين تفاعلات أنا المختبر ن
تقليديا، علم البلورات وتجارب الرنين المغناطيسي النووي جنبا إلى جنب مع الميكروسكوب الإلكتروني cryo (كريويم) هي التكنولوجيات التي اختارت أن تصف بدقة بنية ثلاثية الأبعاد للبروتينات ووظيفتها بالاستدلال التدقيق في تفاصيل هيكلية عالية الدقة الخاصة بهم. ومع ذلك، البروتينات، وليست هياكل ثابتة ويمكن أن تخضع لمجموعة متنوعة من التغييرات conformational والاهتزازات في الزمان والمكان. وهذا السبب في هيكلية المعلومات من بلورية أو بيانات كريوم تحتاج إلى أن تستكمل مع تقنيات أخرى (مثلاً، ديناميات الجزيئية المحاكاة وتقنيات جزيء واحد): ترتبط وظيفة البروتين في كونفورماشونال التغييرات والتفاعلات، وهذه المعلومات غير موجودة في بنية ثابتة. من أجل التحقيق للديناميات داخل الجزيئية، تقنيات استناداً إلى جزيء واحد "فورستر الرنين نقل الطاقة" (سمفريت) هي فعالة جداً1. هذه النهج قادرين على تقييم مختلف الفئات السكانية الفرعية من جزيئات معقدة من وسائل الإعلام. هذا أمر مهم جداً، كما أن هذه التغيرات السريعة وتحدث أثناء الحصول على البيانات (أي، النانوسيكند إلى النطاق الثاني).
نهجين رئيسيين تستخدم عادة لكشف وتحديد هذه التغييرات: البروتينات في الحل والسطح-التثبيت. للكشف عن التفاعلات بين الجزيئية وبصفة خاصة، عملية ثنائي الناجمة عن يغاندس، سمفريت ليست دائماً أفضل وسيلة. والواقع أن الحنق يعتمد ليس فقط على المسافة (إيتش وان زيرو شمال البحر الأبيض المتوسط) ولكن أيضا في اتجاه قطبانيه اثنين (المانحين ويقبلون، χ2) والتداخل بين الانبعاثات المانحين مع يقبلون امتصاص الأطياف2، ولكن ربما كان هذا الشرط الأخير أقل المهم شريطة أن يمكن experimentalist اختيار الزوجين الحنق الصحيح. وضع غير مؤات من سمفريت لسبر ثنائي هومو يأتي من العلامات من البروتين للفائدة: يمكن فقط أن تكون ثنائي سمفريت مغاير، الكشف عن نسبة تصل إلى 50% (أي، هترو-الحنق فقط ستكون قادرة على الكشف عن الجهات المانحة-يقبلون و المانحة يقبلون هومو-dimers لكن لا مانح أو يقبلون يقبلون، الذي هو الآخر 50 ٪ dimers). استخدام fluorescence ارتباط مطيافية (FCS) ومشتقاتها (فككس، إلخ3) للتأكد من البروتين نشر الثوابت وربط ثوابت في المختبر بديل آخر. ليست قادرة على كامل تقدير هومو-ثنائي أما هذه النهج، كما هو الحال في معامل التركز ونشرها، ونصف قطرها ونشر تدابير FCS واحد من الجسيمات نشرها هي سيئة للغاية تعتمد على الوزن الجزيئي؛ على سبيل المثال إلى زيادة الوقت في الوزن الجزيئي وسوف فقط ينطوي على تغيير إضعاف 2.15 في معامل نشر4. في حالة FCS اللونين أو فككس، سيتبين 50 في المائة فقط من هومو dimers لنفس السبب أعلاه. هي أكثر النهج العملي والكمية للكشف عن هومو-ثنائي في المختبر و في فيفو الحنق هومو5 وعدد والسطوع (ن وب)6. وبالنظر إلى أن الحنق هومو يتطلب استرداد الأجهزة المحددة من قيمة تباين (أي البصرية عناصر/محلل لاستعادة الاستقطاب متوازية ومتعامدة)، N & ب يرد هنا كتقنية ملائمة ل الكشف عن البروتين هومو-ثنائي والتجميع. يمكن أن يكون العاملين في المختبر و في فيفو مع مجموعة تجارية على حد سواء.
عدد والسطوع
وقد ن & ب تمت مراجعتها مؤخرا7. أن المراجعة ركزت على تطبيق هذه التقنية في الخلايا الحية. أنها جديرة بالاهتمام لإعادة إنتاج الشكلية الرياضية هنا كهذه المعادلات سوف تطبق على البيانات التي تم جمعها في المختبر. أولاً، من الضروري لتعريف بعض المصطلحات والكميات الرياضية:
- كيان هو مجموعة من الجزيئات التي ترتبط معا.
- اليورو سطوع كيان هو عدد الفوتونات تنبعث من كل وحدة زمنية (في الإطار).
- n هو عدد الكيانات الحالية.
- بيكسل معين على مدى سلسلة الصورة، < I > متوسط كثافة و σ2 هو الفرق في شدته.
ثم، مع عد فوتون كاشفات وافتراض كيانات متحركة وأي خلفية،
حيث N هو عدد الظاهر و ب هو السطوع الظاهر. ينتج عن هذا
دلال et al. 8 أظهرت أنه مع المعدات التناظرية، يحتاج المرء ثلاثة شروط التصحيح: عامل Sوالخلفية الإزاحة0σ ضجيج قراءات 2. ثم، مرة أخرى بافتراض كيانات متحركة،
إعطاء
لاحظ أن المعادلة المذكورة أعلاه لمختلفة التي تعطي في دلال et al. 8 واستعراض لاحق. 7 أغفلت "في دلال" et al. S في المقام كان بسبب خطأ مطبعي واستنسخ هذا الخطأ في المراجعة. المعادلة أعلاه هو الصحيح. إرشادات لقياس S، تمنح σ والإزاحة02 -جنبا إلى جنب مع شرح لمعانيها-دلال et al. 8
اليورو السطوع غير متناسب للدولة أوليجوميريك للكيانات التي نشرها: اليورو سيكون مرتين كما كبيرة ل dimers كما بالنسبة مونومرات، ثلاثة إضعاف كبير لأرتب كما بالنسبة مونومرات، مرتين كما كبيرة هيكساميرس كما لأرتب وهلم جرا. وبهذه الطريقة، قياس اليورو السطوع، واحد يمكن أن التحديد الكمي لأي نوع من مولتيميريزيشن.
إذا كان هناك خليط دول oligomeric العدد الحالي، وسطوع غير قادر على استرداد فرادى الدول oligomeric الحالية. هذا وجود قيود على هذا الأسلوب.
ديتريند برمجية خوارزمية وناندب
وأكد أهمية تصحيح فوتوبليتشينج وقد تم سابقا9. فوتوبليتشينج حتما يحدث أثناء تجارب الخفيفة الميكروسكوب في الوقت الفاصل بين الوضع؛ على حد سواء في الخلايا الحية و في المختبر. وقد وصف العديد من النهج في الأدب لتصحيح للتبييض7. تقنية التصفية أسي مع الاختيار التلقائي للمعلمة ديتريندينج تي هو أفضل الحالية. وتتكامل في ناندب9البرمجيات الحرة والمفتوحة المصدر. البرامج التي تتطلب المستخدم من اختيار يدوياً على معلمة ديتريندينج في الواقع، يمكن أن يؤدي إلى نتائج غير صحيحة لأن هذا الاختيار المعلمة سيكون على الأرجح تعسفية وغير صحيحة. الخوارزمية تلقائياً بفحص البيانات وتحدد المعلمة المناسبة لذلك، دون الحاجة إلى تدخل المستخدم9. حتى مع أفضل خيار لتجانس المعلمة، ديتريندينج حدودها وتعمل جيدا فقط مع النسب المئوية فوتوبليتشينج أقل من 25%، كما هو موضح بالمحاكاة9. من المثير للاهتمام، عند استخدام روتين ديتريندينج التلقائي، دقة أن واحدة يمكن أن تعمل مع قيم الإضاءة المنخفضة (حتى ب < 1.01)، ومن ثم انخفاض كثافة ولا تزال تكون دقيقة بما يكفي تحديد مقدار هومو-ثنائي.
فوتوبليتشينج يسبب أيضا مشكلة أخرى: وجود فلوروفوريس فوتوبليتشيد في مولتيمير معقدة. وهذا يجعل مثلاً تريمير تبدو وكأنها ديمر عند واحدة من الوحدات الثلاث في تريمير غير الفلورية. هور ومولر10 أظهر كيفية تصحيح هذا وجرى التشديد أيضا على هذا التصحيح في استعراض لاحق7. ويتضمن البرنامج ناندب هذا التصحيح9.
FKBP12 F36V نظام
FKBP12F36V هو بروتين الذي لا أوليجوميريزي بطبيعة الحال ولكن من المعروف أن ديميريزي عند إضافة ال11،AP20187 المخدرات (المعروفة اختصاراً BB ديميريزينج يجند)12. وهذا يجعل من حالة اختبار مثالية لعدد والسطوع: مع المسمى FKBP12F36V، مضاعفة oligomeric الدولة ينبغي أن تراعي عند إضافة BB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-FKBP12 F36V-مفينوس تنقية
- تحويل الخلايا بليس (DE3) مع ناقل pET22b التي تحتوي على مونوميريزيد البشرية FKBP12F36V12 والطرفي ن His6 ومفينوس العلامات (ناقلات متاحة عند الطلب). لوحة الخلايا على أجار رطل وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين و 34 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول.
- تحويل المستعمرات تحولت إلى ثقافة كاتب مل 100 رطل وتنمو ل 16-20 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز.
- تمييع الثقافة كاتب كثيفة (OD600 > 1) 1: 100 في المتوسط رطل (2 × 500 مل دفعات) وتنمو لمدة 2-3 ساعات ل OD600 = 0.6-0.8 (37 درجة مئوية، 200 لفة في الدقيقة).
- بارد من الثقافات على الجليد. حمل مع 250 ميكرون إيبتج وتنمو لمدة 16-20 ساعة في 21 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة.
- حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 2,000 س ز لمدة 20 دقيقة.
- ريسوسبيند بيليه في 40 مل من المخزن المؤقت ايماك (20 مم فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول مم 3، 1 مم β-ميركابتوثانول) وتستكمل مع مثبطات البروتياز يدتا خالية (1 قرص كل خلية بيليه).
- Sonicate الخلايا (500 واط، 20 كيلوهرتز، 40% السعة، 9 ثانية في 11 s إيقاف لمدة 15 دقيقة) على المواد القابلة للذوبان الجليدي والحصاد بالطرد المركزي في 20,000 x ز.
- نقل القابلة للذوبان قارورة مخروطية الشكل وإضافة 2 مل راتنج (انظر الجدول للمواد). احتضان لمدة ساعة واحدة مع تناوب 105 لفة في الدقيقة
ملاحظة: كما يمكن استخدام النيكل سيفاروسي لهذه الخطوة ايماك. - حصاد الراتنج وتغسل مع 250 مل من المخزن المؤقت ايماك A تليها 500 مل من ايماك المخزن المؤقت ب (20 مم فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول ملم 7، 1 مم β-ميركابتوثانول).
ملاحظة: زيادة على ايميدازول 50 مم في حالة استخدام الراتنج سيفاروسي النيكل. - الوت معلم His6 البروتين باستخدام المخزن المؤقت ايماك ج (20 مم فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 300 ملم، 1 مم β-ميركابتوثانول).
- حقن على استبعاد حجم العمود (انظر الجدول للمواد) اكويليبراتيد في 10 مم هيبيس pH 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم DTT. وقد FKBP12F36V شطف الذروة في مل 87.71 في العمود استخدمنا.
- تقييم نقاوة عبر صفحة الحزب الديمقراطي الصربي وتجمع وتركز كما هو مطلوب.
2-إعداد مصفوفة لوحة مولتيويل
- ذوبان الجليد FKBP12F36V المنقي (أو يسمى بروتين فائدة) من-80 درجة مئوية.
- تعد حلاً 100 نانومتر تنقية FKBP12F36V (10 ملم متوسطة، حبيس pH 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم DTT). Sonicate والطرد المركزي (الدوران السريع 13,000 لفة في الدقيقة) لمنع تشكيل المجاميع.
- "الماصة؛" 100-200 ميليلتر في تشكيل غرفة مراقبة جيدا 8 مع أسفل زجاج.
- إضافة ديميريزير BB النهائي بتركيزات من 10، 20، 40، 80، 100، 150، 300 و 500 نانومتر12،13.
- كمرجع، تعد حلاً 100 نانومتر مفينوس وحدة لتقييم الآثار المحتملة على التجميع وهطول الأمطار واسترداد قيمة سطوع مونومر مع الحصول على نفس الإعدادات.
3. اقتناء المعايرة مجاناً [كنفوكل]
- بدء تشغيل النظام [كنفوكل] (الشكل 1). أي ضوء نظام [كنفوكل] مجهر مسح مزودة بكاشفات الرقمية أو التناظرية تتسم جيدا للكشف عن8، وقادرة على حفظ وقت يسكن مستمر لكل بكسل المكتسبة سوف تعمل.
- تعيين مسار شعاع الإثارة:
- قم بتشغيل 514 nm الليزر ومجموعة في nW 20-100 السلطة على خروج الهدف (بالنسبة FKBP12F36V-مفينوس).
- حدد هدف 63X1.4NA أو ذوي الياقات البيضاء وتصحيح الماء غمر هدف مصممة لسفح المنحدر القاري.
- قم بتشغيل HyD، APD أو معايرة PMT كاشف. كاشفات قادر على عد فوتون الأفضل، كما في هذه الحالة، حساب S، σ والإزاحة02 غير ضرورية.
- حدد الإطار الانبعاثات من 520-560 نانومتر
- تعيين الثقب في وحدة مهواة 1 نانومتر الانبعاثات ~ 545 المقابلة.
- قم بتعيين وضع اقتناء 16 × 16 بكسل
- تعيين بكسل يسكن الوقت tيسكن أن استوفى تيالإطار >> تيد >> تيالإسهاب، حيث D هو الإقامة وقت نشرها البروتين و طن هو الإطار معدل الإطار. وتناظر هذا الإعداد الوقت يسكن بالمايكروثانية ~ 13.
ملاحظة: بعض الشركات المصنعة التجارية قد الماسحات الضوئية التي تم حفظ لم يسكن-الوقت كل بكسل المستمر. هذا الثبات حاسم بالنسبة لأسلوب العمل. - تعيين حجم بكسل في ~ 120 نانومتر.
- حدد وضع اكتساب إكسيت وتحديد عدد الإطارات التي يتعين اكتسابها لاقتناء وكذلك (على سبيل المثال 5,000).
- إذا كان مزودًا النظام وضع الفائق، إدخال إحداثيات كل بئر والعدد من المقتنيات كل بئر لأتمتة هذه العملية.
ملاحظة: كن حذراً لضمان وجود موزع المياه إذا استخدام هدفا غمر. - إذا كان مزودًا النظام نظام التروية، تحميل حل BB وبرنامج التروية لبدء الحق بعد الإطارال 5000 لتقييم حركية ثنائي مع اكتساب مثلاً 10000 صور.
- إضافة قطره نفط إلى هدف الغمر النفط/المياه إذا كانت الاستفادة من ذوي الياقات البيضاء وتصحيح الماء غمر هدف مصممة لسفح المنحدر القاري.
- جبل الدائرة 8 المراقبة جيدا في المرحلة.
- حدد البئر الصحيح والتركيز على الحل.
ملاحظة: هامة: تجنب التركيز قريبة من الزجاج السفلي لتفادي انعكاس وتشتت. عند التركيز على أعمق في الحل، قم بفصل خيار التركيز الآلي. - البدء في اقتناء وحفظ المكدس الناتج من الصور في تنسيق TIFF.
4-ديتريند و "سطوع التحليل" استخدام ناندب حزمة R
- كما تحقق جودة تجهيزها، استخدم إيماجيج14 إلقاء نظرة على الصور واسترداد التشكيل الجانبي لكثافة، كما هو مبين في الشكل 2. وهذا مفيد لتحديد ما إذا كان أو لم يكن قد حدث الكثير فوتوبليتشينج. إذا كان هناك الكثير من تبييض، البيانات ليست مناسبة لإجراء مزيد من التحليل.
ملاحظة: يمكن أيضا أن إيماجيج مفيد لتحويل الصور إلى TIFF من الأشكال التجارية. ناندب البرنامج الموصوف أدناه يمكن أن تعمل فقط مع ملفات TIFF. - تنزيل وتثبيت15،رستوديو والتطوير16. فمن الأفضل لتنزيل وتثبيت R أولاً، ثم رستوديو.
ملاحظة: ما يلي وصف لكيفية استخدام حزمة ناندب R. معرفة اللغة R غير مطلوب لاستخدام ناندب، إلا أنه جعل الحياة أسهل. - قم بتثبيت حزمة ناندب.
- فتح رستوديو وفي وحدة التحكم، اكتب install.packages("nandb") والانتظار للتثبيت.
- للتعرف على ناندب
- استعراض دليل17.
- قم بمراجعة التعليمات RStudio المدمج للوظائف المختلفة. تكون الدالة الأكثر احتمالاً لاستخدامها سيكون باستخدام brightness(). عرض ملف التعليمات لهذه الوظيفة عن طريق كتابة؟ brightness() في وحدة التحكم.
- حساب السطوع
- ويقول أحد يحتوي على ملف صورة على سطح المكتب تسمى img001.tif (لاحظ أن 'ناندب' يعمل فقط مع ملفات TIFF). يمكن حساب واحد سطوع الصورة:
ب <--السطوع ("~/Desktop/img001.tif"، تاو = "تلقائي")- هذا يعين سطوع الصورة إلى ب متغير في ر. تاو = "تلقائي" يضمن أن الصورة هي ديترينديد بشكل صحيح قبل حساب السطوع. الشيء الأكثر شيوعاً من هنا لحساب متوسط أو متوسط سطوع الصورة. واحد يمكن القيام بذلك عن طريق كتابة mean(b) أو median(b). واحدة ويمكنك أيضا كتابة سطوع الصورة إلى سطح المكتب باستخدام
ijtiff::write_tif (ب، "~/Desktop/whatever_img_name")
- هذا يعين سطوع الصورة إلى ب متغير في ر. تاو = "تلقائي" يضمن أن الصورة هي ديترينديد بشكل صحيح قبل حساب السطوع. الشيء الأكثر شيوعاً من هنا لحساب متوسط أو متوسط سطوع الصورة. واحد يمكن القيام بذلك عن طريق كتابة mean(b) أو median(b). واحدة ويمكنك أيضا كتابة سطوع الصورة إلى سطح المكتب باستخدام
- ويقول أحد لديه مجلد كامل من الصور images_folder على سطح المكتب، ويحتاج المرء لحساب برايتنيسيس من هذه الصور والكتابة سطوع الصور كملفات TIFF. ثم انظر؟ brightness_folder(). هذه الدالة عمليات مجلد بأكمله في كل مرة:
brightness_folder ("~/Desktop/images_folder"، تاو = "تلقائي")
هذا أمر جيد لا سيما لأولئك الذين لديهم برمجيات أنهم يفضلون للبحث والتطوير، لأنه تتم معالجة كافة الملفات في أمر واحد واحد، ومن ثم واحدة يمكن مواصلة العمل مع الصور TIFF سطوع الإخراج في البرنامج الذي تم اختياره، سواء كان إيماجيج14 ، بيثون أو أي شيء آخر.
- ويقول أحد يحتوي على ملف صورة على سطح المكتب تسمى img001.tif (لاحظ أن 'ناندب' يعمل فقط مع ملفات TIFF). يمكن حساب واحد سطوع الصورة:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سطوع ديتريندينج وأحادي
متى تم اكتساب البيانات، واحد يمكن بدء سطوع العمليات الحسابية لتحديد حالة أوليجوميريك من بروتين الفائدة في الحل. حتى ولو قد لا يكون تأثير تبييض في حل جذري كما أنها يمكن أن تكون في فيفو، تتبع كثافة سوف لا تزال لديها ربما لا يعني ثابتة، ربما بسبب تأثيرات فوتوفيسيكال تتصل فلوروفوري،18 لكن الأسباب الكامنة وراء هذا ليست مفهومة تماما. وهذا له تأثير عند حساب السطوع؛ عند محاولة تحديد الانتقالات مونومر-ديمر، هذا الجانب الحاسم. عن طريق تطبيق التلقائي ديتريند خوارزمية للبيانات المبينة في الشكل 2، التتبع كثافة يتم تصحيح بشكل صحيح، لتوفير قيمة أكثر دقة سطوع FKBP12F36V-مفينوس في الحل. قبل إضافة BB، دون ديتريندينج، ب = 1.026، بينما بعد ديتريندينج، ب = 1.005 (الشكل 2ب).
تحديد FKBP12 F36V انتقالات مونومر-ديمر-مفينوس في المختبر
تسلسلات الصور 20,000 لتنقية FKBP12F36V-مفينوس في 100 نانومتر الحل تم الحصول عليها المحدد في المقطع بروتوكول. بعد أن تم اقتناء إطارات 10,000، تمت إضافة المخدرات هوموديميريزير BB للحل أثناء الحصول. وقد تم تحليل كل سلسلة متتالية من إطارات 5,000 (الشكل 3). سطوع يعني 5 دقائق بعد إضافة BB ب = 1.010، التي زيادة إضعاف، مما يدل ديمر FKBP12F36V. ويبين الشكل 3ب؛ حركية عملية وكان التأخير بين BB بالإضافة إلى كامل ثنائي FKBP12F36V 2 دقيقة تقريبا.
تحديد المجاميع البروتين
تم الكشف عن عدد من المجاميع البروتين سواء في عدد محدود من الإطارات، وأيضا في تتبع كثافة (الشكل 4). هذه المجاميع يحدث بصورة طبيعية في الحل عند العمل مع البروتينات ويمكن القضاء على سونيكاتينج و/أو زيادة إضعاف البروتين. ومع ذلك، في بعض المشاكل البيولوجية، يحتاج المرء الكشف عن التحولات بين مونومرات ومجاميع كبيرة. ويبين الشكل 4 على سبيل مثال حيث تنتشر FKBP12F36V بروتين الكلي من خلال حجم المراقبة (الصور 16 × 16)؛ لحساباتنا السابقة تم تجاهل هذه البيانات، ومع ذلك، يظهر المثال واحدة في الشكل 4 لإظهار أن هذه المجاميع يمكن الكشف عنها، وتتميز باستخدام نفس الإعدادات والنهج. في الوهلة الأولى، عند تقييم الصور 5000، واحد يمكن استرداد سطوع متوسط لمعاملة FKBP12F36V-مفينوس مع BB (ب = 1.010). عرض صورة raw السطوع، واحدة أن نرى بوضوح، على الرغم من منطقة الاهتمام بحوالي 8 بكسل ذات قيمة عالية من ≈ ب 1.080. هذه المنطقة من اهتمام وتتزامن مع إطارات قليلة في t = s 34-37 حيث تنتشر إجمالي FKBP12F36V حول منطقة المراقبة. المجموع لم يبق في وحدة المراقبة لفترة طويلة كافية لتحديد حجمها بدقة.
الشكل 1 . تطبيق N & ب للكشف عن البروتين مونومر-ديمر التحولات في الحل. (أ) المبسطة المسار البصرية لليزر المسح مجهر (LSM) مجهزة بمصدر ليزر (تعيين في 514 شمال البحر الأبيض المتوسط وفي حالة مفينوس المسمى البروتينات) توجه (الأسهم الزرقاء) نحو هدف غمر (في حالتنا زيت 63X1.4NA) ينير حل nM 100 من الحل FKBP12F36V-مفينوس. الأسفار الانبعاثات (الأسهم الخضراء) يمر عبر مرآة مزدوج اللون وموجه نحو ممر الموجه مرشح أن ينظف انبعاث الضوء، وتعيين ثقب في 1 وحدة مهواة يقع الحق قبل كاشف نقطة رقمية قادر على عد فوتون. (ب) يتم تفحص وحدة تخزين [كنفوكل] للإضاءة من خلال إلقاء الضوء على واحد من الجزيئات FKBP12F36V-مفينوس أن الدخول والخروج من الشكل الضبابي [كنفوكل] حجم إنتاج مجموعة من الأسفار شدة تقلبات 16 × 16 بكسل. (ج) صورة سلسلة المكتسبة على مر الزمن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . ديتريندينج التلقائي ضروري لقياس عدد أن مونومرات في الحل بدقة. (أ) تم اقتناؤها كومة من 5000 16 × 16 بكسل الصور كما هو موضح في قسم البروتوكول. ويبين كثافة الإطار الأول جنبا إلى جنب مع التشكيل الجانبي لمتوسط كثافة الوقت وتصميما، الذي يبين طويلة الأجل تقلبات قد تكون ذات صلة بآثار فوتوفيسيك و/أو المذيبات التبييض وغيرها. أيا كان السبب لهذه التقلبات طويلة الأجل، أثر العمليات الحسابية السطوع ومن ثم تتطلب ديتريندينج. دون التلقائي ديتريند، أحد يحصل ب = 1.026، بينما بعد التلقائي ديتريندينج، ب = 1.005. أيضا، السطوع دون (ترك لوحات، الصف الثاني) ومع (الحق الألواح، والصف الثاني) تصفية السلس ويرد. (ب) تقديم البيانات نفسها في (أ) كان ديترينديد والنتائج فيما يتعلق بكثافة وسطوع سيظهر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . N في المختبر وب غير قادرة على حل الانتقال بين مونومرات FKBP12F36V و dimers في الوقت الحقيقي. الإضافة للمخدرات ديميريزير BB أسفرت عن زيادة شقين في السطوع الحقيقي الحق بعد 2 دقيقة (من 0.005 إلى 0.010 في سطوع الجزيئي الحقيقي). (أ) شدة الإطار الأول تظهر جنبا إلى جنب مع التشكيل الجانبي متوسط كثافة الصورة ديترينديد. السطوع دون (ترك لوحات، الصف الثاني) ومع (الحق الألواح، والصف الثاني) تصفية السلس ويرد. (ب) يعني المرسومة السطوع (الإطارات كل 5000) استخدام اليورو سطوع الجزيئي الحقيقي. يحدث ثنائي 2 دقيقة بعد إضافة BB (t = 1 دقيقة) عند t = 4 دقيقة. منحنى المجهزة دالة سيجمويدال التأكيد على الاتجاه نحو ثنائي بعد إضافة للمخدرات ديميريزير (بب). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي لتوزيع الإضاءة في كل نقطة في الوقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . في المختبر ن & ب لحل حجم المجاميع البروتين في الحل. (أ) تتبع حل وقت الشدة ديترينديد للحصول على FKBP12F36V-مفينوس تظهر جنبا إلى جنب مع سطوع الصور (الصف الثاني). (ب) تتبع حل وقت الشدة ديترينديد يظهر كحد أقصى في كثافة المميز مع دائرة أحمر منقط (اللوحة اليسرى العلوية). الإطار كثافة الأول الذي يتوافق مع هذا الوقت بالذات (t = 34 ثانية) يظهر ويظهر سهم أحمر المجمعة FKBP12F36V-مفينوس دخول منطقة الإضاءة. إلقاء نظرة فاحصة إلى متجانسة سطوع الصورة يظهر منطقة الاهتمام الذي يحتوي على الدول أوليجوميريك عالية وبقية الصورة تحتوي على مزيج بين مونومرات و dimers بمتوسط ب = 1.008. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ن & ب أسلوب للكشف عن استخدام الضوء التجارية المسح مجاهر [كنفوكل] مزودة بأجهزة رقمية للكشف عن مولتيميريزيشن. وهذا النهج جذابة للغاية مقارنة بنقطة واحدة FCS وفككس وسمفريت لأنها المجانية المعايرة وحساب سطوع واضح ومباشر وتركيز مستقلة6. بيد أنه من أهمية كبرى، لتصحيح لتقلبات كثافة تبيض وطويلة الأجل قبل تنفيذ العمليات الحسابية سطوع9؛ زيادة طفيفة من سطوع سبب ابيضاض وغيرها من الأعمال الفنية يمكن أن يساء تفسيرها كتغيير في الدولة oligomeric (كما يتضح في الشكل 2) إذا كان ديتريندينج هو إهمال أو يقوم بشكل غير صحيح. ديتريند استخدام التلقائي يسمح الخوارزمية لحسابات دقيقة السطوع.
من المهم، اتباع عدد من القواعد عند الحصول على الصور. أولاً، ينبغي أن تكون معروفة وقت الإقامة من الجزيئات في الحجم [كنفوكل]، ومن ثم على نشر ثابت من أجل تعيين المعلمات الصحيحة للنظام [كنفوكل]؛ وقت الإقامة احتياجات الجزيئات المسماة بالإقامة بين بكسل يسكن في الوقت، و الوقت الإطار7. اختيار فلوروفوري المناسب أمر بالغ الأهمية. Fluorophore مشرق ومستقرة ضروري لإشارة جيدة للضوضاء والحد الأدنى فوتوبليتشينج. ينبغي أن تظل قوة الليزر منخفضة نسبيا لتفادي تبييض. فوتون تهم 1 أو 2 كل بكسل بشكل كاف. حفظ التهم منخفضة أيضا أمر حاسم لتجنب الكشف عن تصادم بين. التقنية تتواءم مع ميزانيات منخفضة فوتون أفضل من أنها تتواءم مع تبيض. وقد استخدمت مفينوس في هذا البروتوكول؛ وهو فلوروفوري مشرقة نسبيا، قابلة لمقارنة إلى اجفب19. وبديل هو استخدام نانوبوستيرس التي تستهدف بشكل انتقائي بروتين فلوري؛ وهذه يمكن أن تكون أكثر إشراقا بكثير من فلوروفوريس التقليدية20.
من حيث المعدات، كاشفات فوتون العد الرقمي يسهل القياس الكمي، ولكن ن & ب من الممكن مع كاشفات التناظرية، شريطة أن أحد قد استعادت بعض المعلمات اقتناء. 8
على الرغم من أن النهج الأخرى مثل تباين يمكن الكشف عن هومو-ثنائي، مع ظهور برامج جديدة لتبسيط التحليل، ن & ب تقف وحدها كنهج الوصول كشف وتحديد تفاعلات البروتين وأوليجوميريزيشن، على حد سواء في المختبر وفي الخلايا الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال مؤسسة ويلكوم ترست منح 105278/Z/14/2 المعنية ويمول "المركز ويلكوم ترست" "علم الوراثة البشرية" قبل ويلكوم ترست الأساسية جائزة 203852/Z/16/2. العمل في المجموعة شخص معتمد من قبل المملكة المتحدة "لأبحاث السرطان" (C20724/A14414)، ومجلس البحوث الأوروبية ضمن الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 البحث والابتكار البرنامج منحة 647278.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosettaTM (DE3) pLysS cells | Novagen | 70956-3 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329824407 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID: 24892250 | |
| LB starter culture | QIAGEN | ||
| LB medium | QIAGEN | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif | |
| IPTG | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329815691 | |
| IMAC buffer | Medicago | 09-1010-10 | |
| EDTA-free protease inhibitors | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
| TALON resin | Clonetech | ||
| Nickel sepharose | GE Healthcare | ||
| S200 16/60 column | GE Healthcare | ||
| Glass bottom 8 well observation dish | Ibidi | 80827 |
References
- Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell. Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).
- Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
- Tramier, M., Coppey-Moisan, M. Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).
- Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness. Methods. , (2017).
- Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).
- Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. , (2017).
- Hur, K. H., et al. Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion. PLoS One. 9, (2014).
- Amara, J. F., et al. A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).
- Rollins, C. T., et al. A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).
- R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Core. , (2017).
- RStudio: Integrated Development Environment for R. R Team. , (2016).
- Nolan, R. nandb R package. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=nandb (2017).
- Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222. Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Butkevich, A. N., et al. Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED. Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).
