Summary
이 프로토콜 단백질 호모-oligomerization에서 체 외에 상업 조명 현미경 검사를 사용 하 여 형광 변동 분광학에 따라 측정을 위한 보정 없는 접근을 설명 합니다. 올바른 인수 설정 및 분석 방법을 표시 됩니다.
Abstract
수와 밝기 감지 단백질 호모-oligomerization에 대 한 교정 무료 형광 변동 분광학 (FFS) 기술입니다. 그것은 전통적인 confocal 현미경 디지털 감지기 장비를 사용 하 여 사용할 수 있습니다. 생체 외에서 기술 사용에 대 한 프로토콜 번호와 밝기를 dimerizing 약 AP20187의 추가 전후 mVenus 표시 FKBP12F36V의 oligomeric 상태를 정확 하 게 계량을 볼 수 있는 사용 사례에 의해 표시 됩니다. 정확한 현미경 수집 매개 변수를 사용 하 여 올바른 데이터 전처리 및 분석 방법의 중요성을 설명 합니다. 특히, photobleaching의 선택의 중요성은 강조 했다. 이 저렴 한 방법은 많은 생물학 문맥에서 단백질 단백질 상호 작용 연구에 사용할 수 있습니다.
Introduction
단백질-단백질 상호 작용 나 n 체 외
전통적으로, 결정학 및 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryoEM)와 결합 하는 핵 자기 공명 실험은 정확 하 게 단백질의 3 차원 구조를 설명 하 고 그들의 기능을 추정 하는 것을 선택 하는 기술 그들의 높은 해상도 구조 세부 사항을 면밀히 그러나 단백질,, 정적 구조 하 시간과 공간에 다양 한 구조적 변화와 진동 받을 수 있습니다. 이 때문에 구조 결정학에서 정보 또는 CryoEM 데이터 (예: 분자 동역학 시뮬레이션 기술과 단일 분자) 다른 기술로 보완 될 필요가: 그 구조적 관련 단백질의 기능 변경 및 상호 작용, 그리고이 정보는 정적 구조에 존재. 내부 분자 역학 조사, 순서 기술 포스터 공명 에너지 전송 (smFRET) 단일 분자에 따라 매우 효과적인1있습니다. 이러한 방식을 복잡 한 매체에 있는 분자의 다른 부분 모집단을 평가할 수 있습니다. 이것은 매우 중요 하 고, 이러한 변경 신속 하 고 (즉, 두 번째 범위에 나노초) 데이터 수집 중에 발생.
두 가지 주요 방법을 감지 하 고 이러한 변화를 정량화 일반적으로 채택 된다: 솔루션 및 표면 immobilization 단백질. 감지 간의 분자 상호 작용의와 특히, 이합체 화, ligands에 의해 유도 된 과정에 대 한 smFRET은 항상는 최고의 도구가 아니다. 사실, 무서 워 거리 (≈10 nm)에 뿐만 아니라 두 개의 쌍 극 자 (기증자 및 수락자, χ2)의 방향에 따라 그리고 수락자의 흡수 스펙트럼2, 하지만 아마도이 마지막 조건 기증자 방출의 오버랩은 중요 한 하는 experimentalist 수 오른쪽 무서 워 몇 선택. 호모-이합체 화를 프로 빙에 대 한 smFRET의 특정 단점 관심사의 단백질의 라벨에서 온다: hetero smFRET, 이합체 화만 될 수 있습니다 감지 최대 50% (즉, hetero 무서 워만 기증자 수락자를 감지할 수 있을 것입니다 및 기증자 수락자 호모-이합체 하지 기증자 기증자 또는 수락자-수락자, 다른 50%는 이합체의). 형광 상관 분광학 (FCS) 및 파생 상품 (FCCS, 등3) 확인 단백질 보급 상수 및 바인딩 상수에서 생체 외에서 의 사용은 또 다른 대안 이다. 이러한 방식을 완전히 중 호모-이합체 화를 계량 수, 확산 입자의 FCS 한 측정 농도 확산, 반지름 및 확산 계수가 매우 저조한; 분자량에 의존 예를 들어 10 증가 분자량에만 확산 계수4에서 2.15 배 변화를 나타내며. 2 컬러 FCS 또는 FCCS, 호모 이합체의 50%만 위와 같은 이유로 볼 것입니다. 호모-이합체 화에서 생체 외에서 그리고 vivo에서 감지 하는 가장 실용적이 고 양적 접근은 호모 무서 워5 와 수와 명도 (N & B)6. 그 사실을 감안할 때 호모 무서 워 필요 이방성 값 (즉, 광학 요소/분석기 병렬 및 수직 분극 복구)의 특정 계측 복구, N & B 제공 됩니다 여기에 유리한 기술로 단백질 호모-이합체 화 및 집계 검색 합니다. 그것은 될 수 있다 생체 외에서 그리고 vivo에서 상업 설정 고용.
수와 밝기
N & B 최근 검토7되었습니다. 그 리뷰는 라이브 셀에서 기술의 응용 프로그램에 집중 했다. 그것은 가치가 재현이이 방정식으로 수학적 주의 여기 데이터에 적용 될 것입니다 수집 에 체 외. 첫째, 그것은 몇 가지 용어 및 수학 수량을 정의 하는 데 필요한:
- 엔터티가 바인딩되는 함께 분자의 집합입니다.
- 엔터티 밝기 ε (프레임) 당 단위 시간 당 방출 하는 광자의 수입니다.
- n 은 현재 엔터티 수입니다.
- 이미지 시리즈의 과정을 통해 주어진된 픽셀, < 나 > 의 의미와 σ2 은 그것의 강도에 대 한 분산입니다.
다음,와 광자 계산 탐지기 모바일 엔터티 및 아무 배경 가정
여기서 N 은 명백한 수 와 B 명백한 밝기입니다. 이 인해
Dalal 외. 8 아날로그 장비와 함께 하나의 3 개의 교정 기간 요구 했다: S 요소, 배경 오프셋및 판독 잡음 σ02. 다음, 다시 모바일 엔터티, 가정
주는
위의 방정식은 다른 Dalal 외 에 주어진 8 그리고 후속 검토입니다. 7 에 Dalal 외. S 분모에 오타 때문에 생략 되었다 그리고이 오류는 검토에서 재현 됐다. 위의 방정식 올바른 것 이다입니다. 지침 S측정, 오프셋 및 σ02 -그들의 의미-에 대 한 설명 Dalal 외 에 의해 주어진 다 8
밝기 ε 이다 oligomeric 확산 엔터티 상태에 비례: ε 그것은 단위체, 세 번 큰 trimers를 위한 trimers 등은 단위체, hexamers에 대 한 큰 두 번은 이합체에 대 한 큰 두 번 있을 것입니다. 이 방법에서는, 밝기 ε를 측정 하나 multimerization의 모든 종류를 계량 수 있습니다.
만약 oligomeric 국가의 혼합물, 수 있으며 밝기는 현재 개별 oligomeric 상태 복구의 수 있습니다. 이 기술의 한계입니다.
알고리즘 및 nandb 소프트웨어 detrend
Photobleaching는을 위한 교정의 중요성은 이전9를강조 했다. Photobleaching은 필연적으로 시간 경과 모드;에 가벼운 현미경 실험 중 발생 둘 다 라이브 세포에 생체 외에서. 많은 접근7표백에 대 한 올바른 문학에서 설명 했습니다. 트렌딩 매개 변수 T 의 자동 선택과 지 수 필터링 기술은 현재 최고입니다. 그것은 무료, 오픈 소스 소프트웨어 nandb9에 통합 된다. 실제로, 그들의 detrending 매개 변수를 수동으로 선택 하는 사용자를 필요로 하는 소프트웨어 임의적이 고 잘못 된 매개 변수 선택이 될 가능성이 있기 때문에 잘못 된 결과가 발생할 수 있습니다. 자동 알고리즘 데이터를 검사 하 고 사용자 개입9에 대 한 필요 없이, 그것에 대 한 적절 한 매개 변수를 결정 합니다. 부드럽게 매개 변수의 최선의 선택으로도 트렌딩는 한계가 하며 잘만 photobleaching 비율 25% 보다 낮은 시뮬레이션9와 같이 작동 합니다. 흥미롭게도, 자동 detrending 루틴을 사용 하 여, 그것의 정확도 하나 낮은 밝기 값을 사용할 수 있습니다 (심지어 B < 1.01), 따라서 낮은 농도, 그리고 아직 충분히 정확 하 게 계량 호모-이합체 화.
Photobleaching는 또한 또 다른 문제를 일으키는: multimer 복잡 한에 photobleached fluorophores의 존재. 이것은 예를 들어, 경우는 삼합체에 3 단위 중 하나 비 형광은 삼합체는 이합체 처럼 나타납니다. 허 고 뮬러10 이 해결 하는 방법 그리고이 수정 또한 후속 검토7에서 강조 되었다. Nandb 소프트웨어는이 보정9포함 되어 있습니다.
FKBP12 F36V 시스템
FKBP12F36V는 자연스럽 게 oligomerize 하지 않습니다 하지만 AP20187 약물 (구어체로 dimerizing ligand BB 라고도 함)11,12의 추가 따라 dimerize 알려져 있는 단백질 이다. 이것은 번호와 밝기에 대 한 이상적인 테스트 케이스: 이라는 FKBP12F36V와 oligomeric 상태의 두 배로 관찰 해야 BB의 추가에.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. FKBP12 F36V-mVenus 정화
- Monomerized 인간 FKBP12F36V12 및 N 맨끝 His6 태그와 mVenus 태그 (요청에 사용할 수 있는 벡터)를 포함 하는 pET22b 벡터와 (DE3) pLysS 셀을 변환 합니다. 파운드 천 50 µ g/mL 암 피 실린과 34 µ g/mL 페니와 보완에 플레이트 세포.
- 100 mL 파운드 스타터 문화로 변환 된 식민지를 전송 하 고 떨고와 37 ℃에서 16 ~ 20 시간에 대 한 성장.
- 고밀도 스타터 문화를 희석 (OD600 > 1) 1: 100 파운드 매체 (2 x 500 mL 배치)에 OD600를 2-3 시간 동안 성장 = 0.6-0.8 (37 ° C, 200 rpm).
- 얼음에 멋진 문화입니다. 250 µ M IPTG 유발 하 고 21 ° C, 200 rpm에서 16-20 시간에 대 한 성장.
- 20 분 동안 2000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수확.
- 아이맥 버퍼 (20 m m 인산 나트륨 pH 7.5, 500 m m NaCl, 이미 3 m m, 1mm β-mercaptoethanol) 보충 EDTA 무료 protease 억제제 (1 태블릿 셀 펠 릿 당) 40 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 셀 sonicate (500w, 20 kHz, 40% 진폭, 9 초, 11 15 분 떨어져 s) 20000 x g에서 원심 분리 하 여 수확과 얼음 녹는 물자에.
- 전송 성 lysate 원뿔 플라스 크를 고 수 지의 2 개 mL를 추가 ( 재료의 표참조). 105 rpm 회전 1 시간 동안 품 어
참고: 니켈 sepharose 또한이 아이맥 단계에 사용할 수 있습니다. - 수 지를 수확 하 고 아이맥 버퍼는 (20 m m 인산 나트륨 pH 7.5, 500 mM NaCl, 7mm 이미, 1 m m β-mercaptoethanol) 아이맥 버퍼 B의 500 mL의 250 mL로 씻어.
참고: 50mm 이미 경우 니켈 sepharose 수 지를 사용 하 여 늘립니다. - 아이맥 버퍼 C (20 m m 인산 나트륨 pH 7.5, 500 mM NaCl, 이미 300 m m, 1mm β-mercaptoethanol)를 사용 하 여 His6 태그가 단백질 elute
- 크기 배제에 주사 열 10 mM HEPES pH 7.5, 150 m m NaCl, 1 mM DTT에에서 equilibrated ( 재료의 표참조). FKBP12F36V의 피크 차입을 87.71 mL 우리가 사용 하는 열에 있다.
- SDS 페이지 및 수영장을 통해 순도 평가 하 고 필요에 따라 집중.
2입니다. Multiwell 격판덮개 배열 준비
- 순화 FKBP12F36V를 녹여 (또는 관심사의 단백질 표시)-80 ° c.에서
- 100의 솔루션을 준비 nM 정화 FKBP12F36V (중간, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 m m NaCl, 1 mM DTT). Sonicate 고 집계의 형성을 방지 (13000 rpm의 빠른 회전)을 원심.
- 100-200 µ L 유리 바닥 8 잘 관찰 챔버로 플라스틱.
- 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300, 및 500 nM12,13의 최종 농도에 BB dimerizer를 추가 합니다.
- 참고로, 100의 솔루션 준비 혼자 잠재적인 집계 및 강 수 효과 평가 하 고 동일한 수집 설정으로는 단량체에 대 한 밝기 값을 복구 하는 mVenus의 nM.
3. 교정 무료 Confocal 수집
- 공초점 레이저 시스템 (그림 1)를 시작 합니다. 어떤 가벼운 현미경 confocal 시스템 스캔 디지털 감지기 또는 잘 특징이 아날로그 감지기8있고 유지의 지속적인 유지 시간 획득 하는 모든 픽셀을 작동 합니다.
- 여기 빔 경로 설정:
- 514 nm 레이저 및 세트 그것 20-100 베스트 팔 렌 (FKBP12F36V-mVenus)에 대 한 목표의 출구에 전원을 켭니다.
- 63X1.4NA 목표 또는 FCS를 위한 칼라 보정 물 침수 목표를 선택 합니다.
- 한 유압, APD 또는 보정된 PMT 검출기를 켭니다. 검출기의 광자를 세는 바람직 하 고,이 경우, 계산의 S, 오프셋 및 σ02 는 필요 하지 않습니다.
- 520-560 nm에서 방출 창 선택
- 1 공기 단위 해당 방출 ~ 545 nm에서 pinhole을 설정 합니다.
- 16 x 16 픽셀에 수집 모드를 설정
- 설정 된 픽셀 면만 시간 t연연 같은 t프레임 만족 >> TD >> t연연, 여기서 D 는 확산 단백질과 t의 체류 시간 프레임 은 프레임 속도. 이 ~ 13 µs 유지 시간 설정에 대응 했다.
참고: 일부 상용 제조업체 스캐너 픽셀 당 유지 시간 상수 유지 하지 했다 했다. 이 불변성은 작동 방법에 대 한 중요 합니다. - ~ 120에서 픽셀 크기를 설정 nm.
- Xyt 수집 모드를 선택 하 고 수집 및 잘 (예: 5000) 당 획득 프레임 수를 선택 합니다.
- 경우 시스템은 높은 처리량 모드, 프로세스를 자동화 하 각 잘하고 잘 당 인수 수의 좌표를 소개 합니다.
참고: 집중 목표를 사용 하는 경우는 물 디스펜서의 존재를 보장 하기 위해 주의 해야 합니다. - 시스템 설치 되어 있는 경우 관류 시스템 BB 솔루션을 로드 하 고 프로그램 오른쪽 후 시작을 관류의 예를 들어, 10000 이미지를 획득 하는 동안 이합체 화 활동 평가를 5000번째 프레임.
- 기름 침수 목표에 오일 한 방울을 추가/물 FCS를 위한 칼라 보정 물 침수 목표를 활용 하는 경우.
- 단계에 8 잘 관찰 챔버를 탑재 합니다.
- 정확한 음을 선택 하 고 솔루션에 초점.
참고: 중요 한: 반사와 분산을 피하기 위해 하단 유리 가까이 초점을 방지. 솔루션으로 깊은 초점, 자동된 포커스 옵션을 분리 합니다. - 인수를 시작 하 고 이미지의 결과 스택 TIFF 형식으로 저장.
4. detrend 및 R 패키지 nandb를 사용 하 여 밝기 분석
- 그림 2는에서 같이 전처리 품질 검사로 서 이미지를 보고 고 강도 프로필 복구 ImageJ14 를 사용 합니다. 너무 많은 photobleaching 발생 여부 확인에 유용 합니다. 너무 많이 표백 경우 데이터 추가 분석을 위해 부적 하다.
참고: ImageJ 상업 형식에서 tiff 이미지를 변환 하는 데 유용 수도 있습니다. 아래 설명 하는 nandb 소프트웨어 TIFF 파일에만 사용할 수 있습니다. - 다운로드 및 설치 R 및 RStudio15,16. 그것은 다운로드 하 고 설치 R 최고의 첫 번째, 다음 RStudio.
참고: 다음은 nandb R 패키지를 사용 하는 방법의 설명입니다. 그러나 R 언어의 기술 그것은 인생을 쉽게 만들 것입니다 nandb를 사용 하 여 필요 하지 않습니다. - Nandb 패키지를 설치 합니다.
- RStudio 및 콘솔에서 install.packages("nandb")를 입력 열고 설치를 기다립니다.
- Nandb를 알게
- 수동17검토 합니다.
- 다양 한 기능에 대 한 내장 된 RStudio 도움말을 검토 합니다. 가장 가능성이 기능을 사용할 수 있을 것입니다 사용 하 여 brightness() 될 것입니다. 입력 하 여이 기능에 대 한 도움말 파일을 보려면? 콘솔에서 brightness()입니다.
- 밝기를 계산
- 하나는 img001.tif (참고만 TIFF 파일 작동 하는 그 'nandb') 라는 바탕 화면에 있는 이미지 파일을 말한다. 하나는 그 이미지의 밝기를 계산할 수 있습니다.
b <-밝기 ("~/Desktop/img001.tif", 타우 = "자동")- 이 r에서 변수 b에는 이미지의 밝기를 할당 타우 = "자동" 보장 이미지 밝기 계산 하기 전에 detrended 올바르게. 여기에서 할 수 있는 가장 일반적인 일 평균 또는 이미지의 평균 명도 계산 하는 것입니다. 하나는 mean(b) 또는 median(b)를 입력 하 여 이것을 할 수 있다. 또한 바탕 화면 사용 하 여 밝기 이미지를 작성할 수 있습니다.
ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
- 이 r에서 변수 b에는 이미지의 밝기를 할당 타우 = "자동" 보장 이미지 밝기 계산 하기 전에 detrended 올바르게. 여기에서 할 수 있는 가장 일반적인 일 평균 또는 이미지의 평균 명도 계산 하는 것입니다. 하나는 mean(b) 또는 median(b)를 입력 하 여 이것을 할 수 있다. 또한 바탕 화면 사용 하 여 밝기 이미지를 작성할 수 있습니다.
- 하나는 바탕 화면에 이미지 images_folder의 전체 폴더 하나 이러한 이미지의 brightnesses를 계산 하 고 밝기 이미지를 TIFF 파일로 쓸 필요가 말한다. 다음 참조? brightness_folder(). 이 함수는 한 번에 전체 폴더 처리:
brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", 타우 = "자동")
이것은 특히 좋은 소프트웨어를 연구 하는 것을 선호 하는 사람들을 위해, 모든 파일 하나 하나의 명령, 처리 되 고 하나 갈 일 수 그들의 선택한 소프트웨어에 출력 밝기 TIFF 이미지, 때문에 그것 ImageJ14 Python 또는 뭔가 다른.
- 하나는 img001.tif (참고만 TIFF 파일 작동 하는 그 'nandb') 라는 바탕 화면에 있는 이미지 파일을 말한다. 하나는 그 이미지의 밝기를 계산할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
트렌딩 및 단위체 밝기
데이터 획득 되 면 하나의 솔루션에 관심사의 단백질의 oligomeric 상태를 확인 하려면 밝기 계산을 시작할 수 있습니다. 솔루션에서 표백의 효과 과감 한 되지 않을 수도 있습니다 경우에 그것으로 비보에있을 수 있습니다, 그리고 강도 추적 여전히 아마 없을 것 photophysical 효과 fluorophore,18 하지만이 뒤에 이유를 관련으로 인해 고정 된 의미 완전히 이해 되지 않는다. 이 영향; 밝기를 계산할 때 모노 머-이합체 전환 결정 하려고,이 측면은 중요 합니다. 자동 적용 하 여 알고리즘에 그림 2표시 된 데이터를 detrend, 강도 추적 제대로 해결 솔루션에서 FKBP12F36V mVenus의 밝기에 대 한 더 정확한 값을 제공 합니다. 트렌딩, B 없이 BB의 추가 하기 전에 반면 1.026, = 후 트렌딩, B = 1.005 (그림 2b).
FKBP12의 결정 F36V mVenus-모노-이합체 전환 생체 외에서
MVenus-100 nM 솔루션에서으로 인수 했다 순화 FKBP12F36V의 20000 이미지의 시퀀스는 프로토콜 섹션에서 지정 합니다. 10000 프레임을 확보 했다 homodimerizer 마약 BB 취득 하는 동안 솔루션에 추가 되었습니다. 각 연속 된 일련의 5000 프레임 분석 되었다 (그림 3). 평균 밝기 5 분 후 BB 추가 B = 1.010, FKBP12F36V 이합체를 나타내는 2-fold 증가. 과정의 활동 그림 3b; 표시 FKBP12F36V 이합체 화 전체에 BB 추가 사이의 지연 약 2 분 이었다.
단백질의 식별
단백질의 수는 제한 된 수의 프레임에서와 또한 강도 추적 (그림 4)에 감지 했다. 단백질을 작업할 때 이러한 집계 솔루션에서 자연스럽 게 발생 sonicating 또는 단백질 희석을 증가 의해 삭제 될 수 있다 고. 그럼에도 불구 하 고, 어떤 생물 학적 문제에 하나 단위체 및 큰 집계 간의 전환 감지 해야 합니다. 그림 4 집계 FKBP12F36V 단백질 관찰 볼륨 (16 x 16 이미지);를 통해 확산 예를 보여 줍니다. 그러나 이러한 데이터 삭제 된 우리의 이전 계산,, 한 예로 표시 됩니다 그림 4 에서 이러한 집계 검출 될 수 있다과 동일한 설정 및 접근을 사용 하 여 특징을 보여주는. 첫눈에 5000 이미지를 평가할 때, 하나를 복구할 수 있습니다 평균 밝기 FKBP12F36V mVenus BB와 치료에 대 한 (B = 1.010). 원시 밝기 이미지 보기, 하나 명확 하 게 볼 수 있지만, B ≈ 1.080의 높은 가치와 약 8 픽셀의 관심 영역. 관심의이 지역 t에서 몇 프레임 일치 = 34-37의 FKBP12F36V 집계 관찰 주변 확산. 집계 남아 있지 않았다 관찰 볼륨에 오랫동안 정확 하 게 그것의 크기를 결정 하는 이젠 그만.
그림 1 . N & B 단백질 단위체-이합체 전환 솔루션에서 검색 응용 프로그램입니다. (a) 레이저 스캔 현미경 (LSM) 레이저 소스를 갖춘의 간체 광학 경로 (514에서 설정 mVenus 경우 nm 단백질 분류) (우리의 경우에는 63X1.4NA 기름) 침수 목표 방향 (파란색 화살표) 감독의 100 nM 솔루션 조명 FKBP12F36V-mVenus 솔루션입니다. 방출 형광 (녹색 화살표) dichroic 거울을 통해 전달 하 고 대역 통과 필터를 청소 방출 빛으로 지시 되 고는 핀 홀 포인트 디지털 검출기 광자 계산의 능력 앞에 위치한 1 공기 단위에 설정 합니다. (b) 16 x 16 픽셀 입력 하 고 생산 하는 다양 한 형광 강도 변동 가우스 모양 confocal 볼륨을 종료 하는 단일 FKBP12F36V mVenus 분자 계몽을 통해 조명의 confocal 볼륨을 검색 합니다. (c) 이미지 시리즈 시간이 지남에 인수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 자동 트렌딩 솔루션에서 단위체의 인구를 정확 하 게 측정에 필요 하다. (a) 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 5000 16 x 16 픽셀 이미지의 스택 인수 되었다. 첫 번째 프레임의 강도 표백 및 다른 용 매 그리고/또한 photophysic 효과 관련이 있을 수 있는 긴 기간 변동 보여주는 평균 시간 해결 강도 프로필 함께 표시 됩니다. 원인이 무엇이 든이 장기 변동에 대 한 그들은 밝기 계산에 영향을 하 고 따라서 트렌딩 필요. 자동 없이 detrend, B 얻는 반면 1.026, = 후 자동 트렌딩, B = 1.005. 하지 않고 또한, 밝기 (행 두 번째 패널, 왼쪽)와 (오른쪽 패널, 두 번째 행) 표시는 부드러운 필터링. (b) 에 같은 데이터 표시 (a) detrended 고 강도 및 밝기 표시 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 체 외에서 N & B FKBP12F36V 단위체와 이합체 실시간으로의 전환 해결 할 수 있다. Dimerizer 마약 BB의 추가 (0.005 0.010 진정한 분자 밝기를)에서 2 분 후 바로 진정한 밝기 2 배 증가에 결과. (a) 첫 번째 프레임의 강도 표시 됩니다 detrended 이미지의 평균 강도 프로필 함께. 없이 밝기 (행 두 번째 패널, 왼쪽)과 함께 (오른쪽 패널, 두 번째 행) 표시 됩니다 부드러운 필터링. (b) 밝기 플롯 의미 (모든 5000 프레임) 진정한 분자 밝기 ε를 사용 하 여. 이합체 화 발생 BB 추가 후 2 분 (t = 1 분) t = 4 분. 맞춤된 곡선 dimerizer 마약 (BB)의 추가 후 이합체 화 경향을 강조 하는 자형 기능 이다. 오차 막대는 각 시간 지점에서 밝기 분포의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 생체 외에서 N & B 솔루션에서 단백질의 크기를 해결 하기 위해. (a) FKBP12F36V mVenus의 인수에 대 한 시간 해결 강도 detrended 추적 밝기 이미지와 함께 표시 됩니다 (두 번째 행). (b) 시간 해결 detrended 강도 추적에서는 최대 빨간색 점선 동그라미로 강조 강도 (위 왼쪽된 패널). 이 특정 시간에 해당 하는 첫 번째 강도 프레임 (t = 34 초) 표시 되 고 빨간색 화살표 표시 조명 영역을 입력 FKBP12F36V mVenus 집계. 부드럽게 밝기 이미지에 가까이 보고 높은 oligomeric 포함 된 관심 영역을 표시 하 고 이미지의 나머지 단위체와 이합체 B 평균 사이 혼합 되어 1.008 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
N & B multimerization 상업적인 빛 디지털 검출기를 장착 하는 confocal 현미경 검사를 사용 하 여 감지 하는 기술입니다. 이 방법은 단일 지점 FCS, FCCS, 및 smFRET 교정 무료 이며 밝기 계산 하기 때문에 간단 하 고 농도 독립6에 비해 매우 매력적 이다. 그러나 그것은 중요 한 중요성의, 밝기 계산9;를 수행 하기 전에 표백 및 장기 강도 변동에 대 한 수정 표백에 따른 휘도 및 기타 아티팩트에의 약간의 증가 수 수 잘못 해석 oligomeric 상태에서 변화 (같이 그림 2는) 무시 트렌딩 또는 잘못 수행 하는 경우. 자동 사용 detrend 알고리즘 정확한 밝기 계산에 대 한 수 있습니다.
그것은, 이미지를 수집 하는 때 규칙의 수를 따르는 것이 중요입니다. 첫째, confocal 볼륨에 따라서 그들의 확산 상수 분자의 체류 시간 confocal 시스템; 오른쪽 매개 변수를 설정 하기 위하여 알려져야 한다 픽셀 사이 거주 하는 레이블이 분자의 체류 시간 시간 및 프레임 시간7연연. 오른쪽 fluorophore를 선택 하는 것은 중요 합니다. 밝고 안정적인 fluorophore는 좋은 신호 잡음을 최소 photobleaching 필요 합니다. 레이저 파워 표백 피하기 위해 상대적으로 낮은 유지 되어야 한다. 1 또는 2 픽셀 당 광자 수는 충분 하다. 유지 낮은 계산 탐지기 산더미를 피하기 위해 중요 한 또한 이다. 기술은 대처 낮은 광자 예산 표백 대처 하는 그것 보다 더 나은. 이 프로토콜에서 mVenus 고용 되었다; 상대적으로 밝은 fluorophore eGFP19비교입니다. 대신은 nanoboosters; 형광 단백질을 대상으로 선택적으로 사용 하는 이들은 전통적인 fluorophores20보다 훨씬 밝은 수 있습니다.
하드웨어 측면에서 디지털 광자 계산 탐지기 쉽게 정량화, 하지만 N & B가 아날로그 탐지기로 가능 하나 일부 수집 매개 변수를 회복 했다. 8
N & B를 감지 하 여 체 외에서 단백질 상호 작용 및 oligomerization, 두 계량 접근 방식으로 혼자 서는 비록 다른 이방성 호모-이합체 화, 분석을 단순화 하기 위해 새로운 소프트웨어의 출현으로 검색할 수 있습니다 처럼 접근 고 라이브 셀에.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 Wellcome 신망에 의해 지원 되었습니다 105278/Z/14/2 치료에 부여 Wellcome 신뢰 센터 인간 유전학에 의해 Wellcome 신뢰 코어 수상 203852/Z/16/2 자금입니다. 작업 씨에 스 그룹에 암 연구 영국 (C20724/A14414), 그리고 유럽 연합의 지평선 2020 연구 및 혁신 프로그램 그랜트 647278 유럽 연구 위원회에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosettaTM (DE3) pLysS cells | Novagen | 70956-3 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329824407 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID: 24892250 | |
| LB starter culture | QIAGEN | ||
| LB medium | QIAGEN | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif | |
| IPTG | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329815691 | |
| IMAC buffer | Medicago | 09-1010-10 | |
| EDTA-free protease inhibitors | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
| TALON resin | Clonetech | ||
| Nickel sepharose | GE Healthcare | ||
| S200 16/60 column | GE Healthcare | ||
| Glass bottom 8 well observation dish | Ibidi | 80827 |
References
- Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell. Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).
- Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
- Tramier, M., Coppey-Moisan, M. Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).
- Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness. Methods. , (2017).
- Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).
- Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. , (2017).
- Hur, K. H., et al. Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion. PLoS One. 9, (2014).
- Amara, J. F., et al. A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).
- Rollins, C. T., et al. A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).
- R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Core. , (2017).
- RStudio: Integrated Development Environment for R. R Team. , (2016).
- Nolan, R. nandb R package. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=nandb (2017).
- Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222. Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Butkevich, A. N., et al. Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED. Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).
