Summary
Bu iletişim kuralı için ticari ışık mikroskobu tarama kullanarak floresans dalgalanma spektroskopisi üzerinde temel protein homo-Oligomerizasyonda vitro miktarının kalibrasyon-Alerjik bir yaklaşım açıklar. Doğru satın alma ayarları ve analiz yöntemleri gösterilir.
Abstract
Numarası ve parlaklık protein homo-Oligomerizasyonda algılamak için bir kalibrasyon-Alerjik floresans dalgalanma spektroskopisi (FFS) tekniğidir. Bu geleneksel bir confocal mikroskop dijital yangın dedektörleri ile donatılmış kullanarak istihdam edilebilir. Vitro tekniği kullanımı için bir iletişim kuralı aracılığıyla nerede numarası ve parlaklık doğru önce ve sonra dimerizing uyuşturucu AP20187 ilavesi mVenus etiketli FKBP12F36V oligomeric durumunu ölçmek için görülebilir bir kullanım örneği gösterilir. Doğru mikroskop edinme parametreleri ve doğru veri ön işleme ve analiz yöntemleri kullanmanın önemini ele alınmıştır. Özellikle, photobleaching düzeltme tercih önemi vurgulanmıştır. Bu ucuz Yöntem protein-protein etkileşimler birçok biyolojik bağlamlarda eğitim için istihdam edilebilir.
Introduction
Protein-protein etkileşimleri ben n in Vitro
Geleneksel olarak, kristalografisi ve cryo-elektron mikroskobu (cryoEM) ile birlikte nükleer manyetik rezonans deneyler doğru proteinlerin üç boyutlu mimari tanımlamak için ve işlevlerine göre anlaması için seçilmiş teknolojiler vardır onların yüksek çözünürlüklü yapısal detayları scrutinizing. Proteinler, ancak, statik yapılar değildir ve konformasyon değişiklikleri ve titreşim çeşitli zaman ve mekan içinde tabi olabilir. Bu yapısal yüzden bilgi crystallographic veya CryoEM veri (Örneğin, moleküler dinamiği simülasyonları ve tek molekül teknikleri) diğer teknikleri ile tamamlanabilir: işlev bir proteinin konformasyon için ilişkilidir değişiklikleri ve etkileşimleri ve bu bilgileri bir statik yapısı içinde mevcut değil. İntra moleküler dynamics için yoklama için çok etkili1Forster rezonans enerji transferi (smFRET) tek molekül dayalı teknikler vardır. Bu yaklaşımlardan farklı altgrupları karmaşık medya olarak değerlendirmek edebiliyoruz. Bu değişikliklerin hızlı ve veri (Örneğin, ikinci aralığı için nanosecond) edinimi sırasında oluşan çok önemlidir.
İki ana yaklaşım yaygın olarak algılamak ve bu değişiklikleri ölçmek için istihdam edilmektedir: proteinler çözüm ve yüzey-immobilizasyon. Arası moleküler etkileşimleri ve özellikle, ligandlar tarafından indüklenen dimerization süreci algılama için smFRET her zaman en iyi araç değildir. Gerçekten de, sadece mesafe (≈10 nm) ama aynı zamanda iki dipoller (donör ve alıcısı, χ2) yönünü FRET bağlıdır ve donör emisyon alıcısı'nın emilimi spectra2, ama belki de bu son durum ile çakışma azdır koşuluyla deneyci olabilir önemli değil FRET çift açmadı. SmFRET homo-dimerization problama için belirli bir dezavantaj faiz protein etiketleme üzerinden gelir: hetero smFRET için dimerization sadece olabilir % 50 tespit (Yani, hetero-perde sadece donör-alıcısı algılamak mümkün olacak ve alıcısı-donör homo-dimer ama değil donör verici veya alıcısı-alıcısı, dimer diğer % 50). Floresans korelasyon spektroskopisi (FCS) ve türevleri (protein difüzyon sabitler ve bağlama sabitler vitro tespit etmek için FCCS, vb3) başka bir alternatif kullanmaktır. Bu yaklaşımların tamamen homo-dimerization de ölçmek mümkün değildir, FCS bir önlemler konsantrasyon ve difüzyon ve RADIUS ve difüzyon katsayısı bir akışkanın parçacık olduğu gibi çok kötü moleküler ağırlık bağlıdır; Örneğin molekül ağırlığı 10 kat artış sadece 2,15 kat değişim difüzyon katsayısı4ima. İki renkli FCS veya FCCS, homo-dimer sadece % 50'si aynı sebepten dolayı yukarıdaki gibi görülecektir. Homo-dimerization vitro ve in vivo algılamak için en pratik ve kantitatif yaklaşımlar homo-perde5 ve numarası ve parlaklık (Y & B)6vardır. Aslında verildi ki homo-perde gerektirir belirli araçları kurtarma anizotropi değeri (Yani, optik elemanları/paralel ve dikey polarizasyon kurtarmak için analiz sistemleri), N & B sunulan burada olumlu bir teknik olarak protein homo-dimerization ve toplama algılar. O-ebilmek var olmak vitro ve in vivo ticari bir kurulum ile istihdam.
Numarası ve parlaklık
N & B son zamanlarda gözden geçirilmiş7oldu. O eleştiriyi canlı hücreleri tekniğinde uygulanması üzerinde duruldu. İçin faydalıdır bu denklemler olarak matematiksel biçimcilik verilere uygulanacak yeniden toplanan içinde vitro. İlk olarak, bazı terimleri ve matematiksel miktarları tanımlamak gereklidir:
- Birbirimize bağlıyız molekülleri bir dizi bir varlıktır.
- Bir varlığın parlaklık ε birim birim zamanda (kare) başına yayar fotonlar sayısıdır.
- n varlıklar mevcut sayısıdır.
- Bir görüntü serisi boyunca belirli bir piksel için < ı > onun ortalama yoğunluğu ve σ2 şiddeti varyans olmasıdır.
O zaman, foton sayma dedektörleri ve varsayarak hareket eden varlıklar ve hiçbir arka plan ile
N B ve belirgin numarası olan belirgin parlaklıkolduğunu. Bu sonuçlar
Gamze vd. 8 gösterdi analog ekipman ile bir üç düzeltme dönem gerekir: S faktörü, arka plan ofsetve okuma gürültü σ02. O zaman, tekrar hareket eden varlıklar varsayarsak,
veren
Yukarıdaki Denklem için farklı olduğuna dikkat edin gamze ve ark. içinde verilen 8 ve sonraki bir daha gözden geçirme. 7 içinde gamze vd. S payda içinde bir yazım hatası nedeniyle ihmal ve bu hata İnceleme çoğaltılamaz. Yukarıdaki denklem doğru olandır. Talimatları Sölçmek için uzaklık ve σ02 - anlamlarını - açıklaması ile birlikte verilen tarafından gamze vd. 8
Parlaklık ε akışkanın varlıkların oligomeric durumuna orantılıdır: ε iki kez ve benzeri trimers için olduğu gibi monomerleri, iki kez hexamers için büyük için olduğu gibi monomerleri, trimers için üç kez büyük için olduğu gibi dimer için büyük olacak. Böylece parlaklık ε, ölçme, bir multimerization her türlü ölçmek.
Varsa mevcut, sayı oligomeric Birleşik bir karışımı ve parlaklığı bireysel oligomeric Birleşik mevcut kurtarma yeteneğine sahip değildir. Bu tekniğin bir kısıtlamadır.
Algoritma ve nandb yazılım detrend
Have be photobleaching düzeltme önemini daha önce9vurguladı. Photobleaching kaçınılmaz olarak hızlandırılmış modunda ışık mikroskobu deneyler sırasında oluşur; hem canlı hücreleri ve içinde vitro. Pek çok yaklaşım7beyazlatma için düzeltmek için literatürde tarif edilmistir. Üstel filtreleme detrending parametre T otomatik seçeneği ile mevcut en iyi tekniktir. Ücretsiz, açık kaynak yazılım nandb9içine entegre edilmiştir. Gerçekten de, bu parametre seçim büyük olasılıkla keyfi ve yanlış olacaktır çünkü onların detrending parametre el ile seçmek Kullanıcı yazılımlar hatalı sonuçlara yol açabilir. Otomatik algoritması verileri inceler ve uygun parametresi, Kullanıcı müdahalesi9için gerek kalmadan belirler. Hatta en iyi seçim düzeltme parametresi ile detrending kendi sınırlamaları vardır ve iyi sadece photobleaching yüzde %25 düşük simülasyonlar9ile gösterildiği gibi çalışır. Öyle ki bir parlaklığı düşük değerlerle çalışabilirsiniz ilginçtir, otomatik detrending rutin, onun doğruluğunu kullanıldığında (hatta B < 1,01) ve bu nedenle düşük yoğunluklarda ve hala homo-dimerization ölçmek için kesin olarak.
Photobleaching da başka bir sorun neden olur: photobleached fluorophores içinde karmaşık bir multimer varlığı. Bu bir trimer görünür bir dimer gibi trimer olarak üç birimi olmayan flüoresan olduğunda Örneğin, yapar. Hur ve Mueller10 için bu sorunu gidermek nasıl gösterdi ve bu düzeltme da bir sonraki İnceleme7' vurguladı. Bu düzeltme9nandb yazılımlardır.
FKBP12 F36V sistem
FKBP12F36V hangi değil doğal olarak oligomerize ama AP20187 ilaç (halk dilinde ligand dimerizing BB da bilinir)11,12eklenmesi dimerize için bilinen bir proteindir. Bu sayı ve parlaklık için ideal bir test çalışması yapar: etiketli FKBP12F36V ile oligomeric durumunu iki katına BB eklenmesi dikkat edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. FKBP12 F36V - mVenus arıtma
- Monomerized insan FKBP12F36V12 ve N-terminal His6 ve mVenus Etiketler (vektör istek üzerine temin edilebilir) içeren pET22b vektör ile (DE3) pLysS hücreleri dönüşümü. Plaka hücreleri üzerine LB agar 50 µg/mL ampisilin ve 34 µg/mL kloramfenikol ile desteklenmiştir.
- Dönüştürülmüş kolonileri 100 mL LB starter kültür aktarmak ve 16-20 saat 37 ° C'de sallayarak ile büyür.
- Yoğun starter kültür seyreltik (OD600 > 1) 1: 100 LB Orta (2 x 500 mL toplu işlemleri) ve OD600 için 2-3 saat boyunca büyümeye = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 devir/dakika).
- Buz üzerinde serin kültürler. 250 µM IPTG ikna etmek ve 16-20 saat 21 ° c, 200 rpm için büyür.
- 20 dakikadır 2.000 x g de Santrifüjü tarafından hücre hasat.
- Pelet 40 ml EDTA ücretsiz proteaz inhibitörleri (hücre Pelet başına 1 tablet) ile (20 mM sodyum fosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 3 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol) takıma IMAC arabelleği resuspend.
- Hücreleri solüsyon içeren temizleyicide (500 watt, 20 kHz, % 40 genlik, 9 s 11 tarihinde kapalı s 15dk için) aralıklarla 20.000 x g de buz ve hasat çözünür malzeme üzerinde.
- Transfer çözünür konik bir şişesi için lysate ve reçine 2 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). 105 rpm döndürme ile 1 saat için kuluçkaya
Not: Nikel sepharose de bu IMAC adım için kullanılabilir. - Reçine hasat ve IMAC arabelleği 500 mL tarafından IMAC arabelleği B (20 mM sodyum fosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 7 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol) takip A 250 mL ile yıkayın.
Not: 50 mM imidazole nikel sepharose reçine kullanıyorsanız artırın. - His6 öğesini protein IMAC tampon C (20 mM sodyum fosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol) kullanarak elute.
- Bir boyut dışlama enjekte sütun 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT equilibrated ( Tablo malzemelerigörmek). FKBP12F36V onun tepe elüsyon 87.71 mL biz kullanılan sütun vardır.
- Saflık SDS-sayfa ve havuzu ile değerlendirmek ve gerektiğinde konsantre.
2. Multiwell plaka dizi hazırlanması
- Saf FKBP12F36V çözülme (veya ilgi protein etiketli) üzerinden-80 ° C.
- 100 çözeltisi hazırlamak nM saf FKBP12F36V (orta, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Solüsyon içeren temizleyicide ve toplamları oluşumunu önlemek için (hızlı spin 13000 RPM) santrifüj kapasitesi.
- 8 iyi gözlem odasına bir cam alt ile 100-200 µL pipette.
- BB dimerizer 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 ve 500 nM12,13son konsantrasyonları ekleyin.
- Bir referans olarak 100 çözeltisi hazırlamak nM yalnız potansiyel toplama ve yağış etkileri değerlendirmek ve monomer için bir parlaklık değeri ile aynı satın alma ayarları kurtarmak için mVenus.
3. Kalibrasyon-Alerjik Confocal edinme
- Confocal sistemi (Şekil 1) başlatın. Dijital dedektörleri ya iyi karakterize analog dedektörleri8mikroskop confocal sistem tarama herhangi bir ışık ile donatılmış ve tutma yeteneğine sahip bir sabit Işınma Zamanı elde her piksel için çalışacak.
- Uyarma ışın yolu ayarla:
- 514 nm lazer ve set 20-100 NW güç amaç çıkış (için FKBP12F36V-mVenus) açın.
- 63X1.4NA amaç veya FCS için tasarlanmış bir yaka düzeltme su daldırma hedefi seçin.
- Bir HyD, APD veya kalibre edilmiş Devresel_ödeme dedektörü açın. Dedektörleri yeteneğine foton sayma tercih, bu davada olduğu gibi hesaplama S, uzaklık ve σ02 gereksizdir.
- 520-560 nm Emisyon pencereyi seçin
- İğne deliği ve sondaj 1 havadar ünitesinde karşılık gelen emisyon ~ 545 nm için ayarlayın.
- 16 x 16 piksel satın alma modunu ayarlamak
- Bu tçerçeve karşılayan gibi piksel Işınma Zamanı tdurmak ayarlamak >> TD >> D nerede ikamet süresi akışkanın protein ve t tdurmak, kare hızı çerçevedir . Bu bekleme süresi ~ 13 µs için ayarlama denk.
Not: Ticari bazı üreticiler Işınma Zamanı piksel başına sabit tutan değil tarayıcılar vardı. Bu süreklilik yöntemin işe yaraması için çok önemlidir. - ~ 120 piksel boyutunu belirlemek nm.
- Xyt satın alma modunu seçin ve satın alma ve iyi (örneğin 5000) elde edilebilir için kare sayısını seçin.
- Sistem yüksek üretilen iş moduyla varsa, her şey ve iyi ücret satın alma sayısını otomatikleştirmek belgili tanımlık oluşum koordinatlarını tanıtmak.
Not: Eğer bir daldırma amacı istimal için su dağıtıcısı varlığını sağlamak dikkat et. - Eğer sistem ile donatılmış bir perfüzyon sistemi BB çözüm yükleyin ve perfüzyon sağ sonra başlatmak için Örneğin, 10.000 görüntüleri alma sırasında dimerization kinetik değerlendirmek için 5000inci çerçeve programı.
- Bir damla yağı yağı daldırma amaç eklemek / FCS için tasarlanmış bir yaka düzeltme su daldırma objektif kullanmak Eğer su.
- 8 iyi gözlem odası sahne içine monte.
- Doğru şey seçin ve çözüm üzerinde odaklanmak.
Not: Önemli: yansıma ve saçılma önlemek için yakın alt cam odaklanarak kaçının. Çözüm içine daha derin netleme yaparken otomatik odaklama seçeneği bağlantısını kesin. - Satın başlatmak ve görüntüleri elde edilen yığını TIFF formatında kaydedin.
4. detrend ve parlaklık R paket nandb kullanarak çözümleme
- Önişleme kalite kontrolü, ImageJ14 resimler bir göz atın ve yoğunluk profili yeniden elde etmek için Şekil 2biriçinde gösterildiği gibi kullanın. Bu çok fazla photobleaching oluştu olup olmadığını belirlemek yararlıdır. Çok fazla ağartma varsa, verileri daha ayrıntılı bir çözümleme için uygun değildir.
Not: ImageJ da ticari oluşum--dan için TIFF görüntüleri dönüştürmek yararlı olabilir. Aşağıda açıklanan nandb yazılım yalnızca TIFF dosyalarıyla çalışabilirsiniz. - Karşıdan yükleyip R ve RStudio15,16. R yükleyip kurmanız en iyisi ilk, o zaman RStudio.
Not: Aşağıda nandb R paketini kullanmak nasıl bir açıklama olduğunu. Hayatı daha kolay hale getirecek ancak R dil bilgisi nandb, kullanmak için gerekli değildir. - Nandb paketini yükleyin.
- RStudio açın ve install.packages("nandb") yazın konsol ve yükleme işleminin tamamlanmasını bekleyin.
- Nandb tanıyın
- El ile17gözden geçirin.
- Yerleşik RStudio yardım çeşitli işlevler için gözden geçirin. Kullanılacak en olası işlevini-ecek var olmak kullanma-ecek var olmak brightness(). Bu işlev için yardım dosyasına yazarak bakın? Brightness() konsol.
- Parlaklık hesaplamak
- Bir img001.tif ('nandb' sadece TIFF dosyaları ile çalışır Not) olarak adlandırılan Masaüstü üzerinde bir görüntü dosyası varmış. Bir o görüntü parlaklığını hesaplayabilirsiniz:
b <-parlaklık ("~/Desktop/img001.tif", tau "auto" =)- Bu değişken b R., görüntünün parlaklığını atar Tau = "otomatik" sağlar görüntü düzgün parlaklık hesaplama önce değişimleri ki. En yaygın olanı buradan ortalama veya ortalama parlaklığının hesaplamak etmektir. Bir mean(b) veya median(b) yazarak yapabilirsiniz. Bir de okul sırası kullanma için parlaklık görüntünün yazabilirsiniz
ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
- Bu değişken b R., görüntünün parlaklığını atar Tau = "otomatik" sağlar görüntü düzgün parlaklık hesaplama önce değişimleri ki. En yaygın olanı buradan ortalama veya ortalama parlaklığının hesaplamak etmektir. Bir mean(b) veya median(b) yazarak yapabilirsiniz. Bir de okul sırası kullanma için parlaklık görüntünün yazabilirsiniz
- Bir klasör masaüstü görüntüleri images_folder dolu ve bu görüntülerin brightnesses hesaplamak ve parlaklık görüntüleri TIFF dosyaları olarak yazmak ihtiyacı demek. O zaman? brightness_folder(). Bu işlev tüm bir klasör birden işler:
brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau "auto" =)
Bu özellikle iyi olanlar R için tercih ettikleri bir yazılım var, tüm dosyaları tek bir komutta işlenir ve o zaman bir çıkış parlaklık TIFF görüntüleri onların seçilen yazılımı ile çalışmaya gitmek, ImageJ14 olması , Python veya başka bir şey.
- Bir img001.tif ('nandb' sadece TIFF dosyaları ile çalışır Not) olarak adlandırılan Masaüstü üzerinde bir görüntü dosyası varmış. Bir o görüntü parlaklığını hesaplayabilirsiniz:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detrending ve monomeric parlaklık
Veriyi kazanılmış sonra bir çözüm ilgi protein oligomeric durumunu belirlemek için parlaklık hesaplamalar başlayabilirsiniz. Çözümde ağartma etkisi kadar sert olmayabilir olsa bile olarak vivo içindeolabilir, yoğunluğu izleme hala muhtemelen fluorophore,18 ama bu arkasındaki nedenleri ile ilgili photophysical etkileri nedeniyle sabit demek olmayacaktır muhtemelen tam olarak anlaşılır değil. Bu parlaklığı hesaplanırken bir etkisi vardır; monomer-dimer geçişler belirlemeye çalışırken, bu çok önemli bir yönüdür. Şekil 2biriçinde gösterilen veri için algoritma otomatik uygulayarak detrend, yoğunluğu izleme düzgün FKBP12F36V-mVenus parlaklık çözüm için daha doğru bir değer sağlayan düzeltildi. Ayrıca bb, detrending, B olmadan önce ise 1,026, = detrending, B sonra 1.005 (Şekil 2b) =.
FKBP12 belirlenmesi F36V -mVenus monomer-dimer geçişler vitro
20.000 saf FKBP12F36V mVenus - 100 nM çözüm olarak satın alınan görüntülerin dizileri Protokolü bölümünde belirtilen. 10.000 çerçeveleri satın alınan sonra homodimerizer uyuşturucu BB alınıyor ise çözümü eklendi. 5.000 kare ardışık her dizi analiz edildi (Şekil 3). Ortalama parlaklık 5 dakika sonra BB ek B oldu FKBP12F36V dimer gösteren bir logosuna 2 kat artmasıdır 1.010 =. Kinetik işlemin Şekil 3bgösterilir; BB ek olarak FKBP12F36V dimerization tam arasındaki gecikme yaklaşık 2 dakika oldu.
Protein toplamları tanımlaması
Protein toplamları sayısı sınırlı sayıda çerçeveler hem de yoğunluk izleme (Şekil 4) tespit edildi. Bu toplamları doğal proteinler ile çalışırken çözümde meydana ve sonicating ve/veya protein seyreltme artan tarafından elimine edilebilir. Yine de, bazı biyolojik sorunlar, bir monomer ve büyük toplamları arasındaki geçişler algılamak gerekiyor. Şekil 4 bir örnek gösterir nerede dağınık bir FKBP12F36V protein toplama gözlem birim (resim 16 x 16); Bu veriler atılan bizim önceki hesaplamaları için ancak, bir örnek Şekil 4 ' te bu toplamları tespit edilebilir ve aynı ayarları ve yaklaşım kullanarak karakterize göstermek için gösterilir. FKBP12F36V-mVenus BB ile tedavi için 5000 görüntüleri değerlendirirken ilk bakışta, bir ortalama parlaklık kurtarabilirsiniz (B = 1.010). Ham parlaklık görüntü ile ilgilenen, bir açıkça, yine de, bir bölge B ≈ 1.080 yüksek değeri yaklaşık 8 piksel ilgi görebilirsiniz. Yörenin ilgi t birkaç kare ile çakışacak nerede bir FKBP12F36V toplamak yayılmış gözlem çevresi 34-37 s =. Toplam gözlem hacmindeki uzun süre doğru boyutunu belirlemek için yeterli kalır değil.
Resim 1 . N & B protein monomer-dimer geçişler çözümde algılamak için uygulanması. (a) basitleştirilmiş bir lazer kaynağı ile donatılmış mikroskop (LSM) tarama bir Lazer optik yol (514 ayarla nm mVenus durumunda etiketli proteinler) bir daldırma amaç (bizim durumumuzda bir 63X1.4NA yağ) (mavi oklar) yönelik bir 100 nM çözüm aydınlatıcı FKBP12F36V-mVenus çözüm. Emisyon Floresan (yeşil ok) geçer bir dikroik aynadan ve emisyon ışık temizler bir bant filtre doğru yönlendirilir ve tam bir nokta dijital dedektörü önce foton sayma yeteneğine sahip yer alan 1 havadar ünitesinde bir iğne deliği ayarlayın. (b) girin ve floresan yoğunluğu dalgalanmaları bir dizi üreten Gauss şekil confocal ses çıkış tek FKBP12F36V-mVenus moleküller aydınlatıcı 16 x 16 piksel ile aydınlatma confocal hacmi taranır. (c) zaman içinde elde görüntüsü serisi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Otomatik detrending monomerleri çözümde bir nüfusa doğru ölçmek için gereklidir. (a) 5000 16 x 16 piksel görüntü yığınını Protokolü bölümünde açıklandığı gibi satın alınmıştır. İlk kare yoğunluğunu uzun ağartma ve diğer solvent ve/veya photophysic etkileri ile ilgili dönem dalgalanmalar gösterir ortalama yoğunluğu zaman çözüldü profil ile birlikte gösterilir. Ne olursa olsun neden uzun vadeli bu dalgalanmalar için onlar parlaklık hesaplamaları etkileyebilir ve bu nedenle detrending gerektirir. Otomatik detrend, bir alır B ise 1,026, = detrending, B otomatik sonra 1.005 =. Ayrıca, parlaklık olmadan (panelleri yaptı, ikinci satır) ve ile (anda panelleri, ikinci satır) düzgün filtreleme gösterilir. (b) aynı veri sundu (a) değişimleri ve yoğunluğu ve gösterilen parlaklık ait sonuçları. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . In vitro N & B FKBP12F36V monomer ve dimer gerçek zamanlı arasında geçiş çözmeniz mümkün. Dimerizer uyuşturucu BB ek bir iki kat artış gerçek parlaklık (dan 0.005 0.010 içinde gerçek moleküler parlaklık için) 2 dk sonra sonuçlandı. (a) ilk kare yoğunluğunu değişimleri görüntü ortalama yoğunluğu profil ile birlikte gösterilir. Parlaklık olmadan (panelleri yaptı, ikinci satır) ve ile (anda panelleri, ikinci satır) düzgün filtreleme gösterilir. parlaklık çizilir (b) demek (her 5000 kare) doğru moleküler parlaklık ε kullanarak. Dimerization 2 dakika sonra BB ekleme oluşur (t = 1 dk) t 4 dk =. Monte eğrisi dimerization sonra dimerizer ilaç (BB) eklenmesi doğru eğilim strese sigmoidal bir işlevdir. Hata çubukları, her zaman bir noktada parlaklık dağıtım standart hatasını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . İn vitro N & B çözüm protein toplamları boyutunu gidermek için. (a) değişimleri zaman çözüldü yoğunluğu izleme FKBP12F36V-mVenus edinimi için parlaklık görüntüleri ile birlikte gösterilir (ikinci sırada). (b) ile kırmızı noktalı daire vurgulanır yoğunluğu en fazla zaman çözüldü değişimleri yoğunluğu izleme gösterir (üst sol panel). Özellikle bu zamanı için karşılık gelen ilk yoğunluğu kare (t = 34 saniye) gösterilir ve aydınlatma alan girerek bir FKBP12F36V-mVenus toplamak kırmızı bir ok gösterir. Düzgünleştirilmiş parlaklık görüntü içine daha yakından bakmak bir bölgesi yüksek oligomeric içeren ilgi gösterir ve görüntünün geri kalanı monomerler ve dimer ortalama ile B arasında bir karışımı içeren 1.008 =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
N & B ticari ışık confocal mikroskoplar dijital yangın dedektörleri ile donatılmış tarama kullanarak multimerization algılamak için tekniktir. Bu yaklaşım tek noktadan FCS, FCCS ve smFRET çünkü kalibrasyon ücretsiz ve parlaklık hesaplama basit ve konsantrasyon bağımsız6ile karşılaştırıldığında oldukça çekici olduğunu. Bu büyük, ancak, ağartma ve uzun süreli şiddeti dalgalanmalar için parlaklık hesaplamalar9gerçekleştirmeden önce düzeltmek için önemlidir; detrending ihmal veya yanlış gerçekleştirilen beyazlatma nedeniyle parlaklık ve diğer yapıları hafif bir artış oligomeric durum değişikliği olarak ( Şekil 2birgörüldüğü gibi) yanlış yorumlanabilir olabilir. Otomatik kullanımı detrend algoritma doğru parlaklık hesaplamalar için sağlar.
Bu görüntüleri elde etme kurallar takip etmek önemlidir. İlk olarak, ikamet süresi confocal cilt ve bu nedenle onların difüzyon sabiti moleküllerin confocal sistem doğru parametrelerini ayarlamak için bilinmesi gerekir; etiketli molekülleri piksel bulunması gereken ikamet süresi zaman ve kare zaman7yaşamak. Doğru fluorophore seçimi çok önemlidir. Parlak ve istikrarlı fluorophore için iyi sinyal gürültü ve en az photobleaching için gereklidir. Lazer güç ağartma önlemek için nispeten düşük tutulmalıdır. Foton sayıları 1 veya 2 piksel başına yeterlidir. Tutma düşük sayar da dedektörü kazayı önlemek çok önemlidir. Teknik beyazlatma ile copes daha düşük foton bütçeleri ile baş edebiliyor. Bu protokol için mVenus istihdam edilmiştir; hangi nispeten parlak bir fluorophore, eGFP19için karşılaştırılabilir olduğunu. Alternatif seçerek bir floresan protein hedef nanoboosters kullanılır; Bunlar geleneksel fluorophores20çok daha parlak olabilir.
Donanım açısından dijital foton sayma dedektörleri miktar kolaylaştırmak, ama koşuluyla bir bazı satın alma parametreler kurtarıldı N & B analog yangın dedektörleri ile mümkündür. 8
N & B anizotropi homo-dimerization, analizleri, kolaylaştırmak için yeni yazılım advent ile algılayabilir gibi diğer yaklaşımlar olsa bile tek başına algılamak ve protein etkileşimleri ve Oligomerizasyonda, her iki vitro ölçmek için erişilebilir bir yaklaşım olarak duruyor ve canlı hücrelerdeki.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Wellcome Trust tarafından desteklenen 105278/Z/14/2 adında için vermek Wellcome Güven Merkezi insan genetiği için Wellcome güven çekirdek Ödülü 203852/Z/16/2 tarafından finanse edilmektedir. C.S. Grup çalışmalarında kanser Araştırmaları İngiltere (C20724/A14414) ve Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı hibe 647278 altında Avrupa Araştırma Konseyi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosettaTM (DE3) pLysS cells | Novagen | 70956-3 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329824407 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID: 24892250 | |
| LB starter culture | QIAGEN | ||
| LB medium | QIAGEN | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif | |
| IPTG | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329815691 | |
| IMAC buffer | Medicago | 09-1010-10 | |
| EDTA-free protease inhibitors | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
| TALON resin | Clonetech | ||
| Nickel sepharose | GE Healthcare | ||
| S200 16/60 column | GE Healthcare | ||
| Glass bottom 8 well observation dish | Ibidi | 80827 |
References
- Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell. Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).
- Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
- Tramier, M., Coppey-Moisan, M. Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).
- Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness. Methods. , (2017).
- Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).
- Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. , (2017).
- Hur, K. H., et al. Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion. PLoS One. 9, (2014).
- Amara, J. F., et al. A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).
- Rollins, C. T., et al. A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).
- R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Core. , (2017).
- RStudio: Integrated Development Environment for R. R Team. , (2016).
- Nolan, R. nandb R package. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=nandb (2017).
- Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222. Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Butkevich, A. N., et al. Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED. Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).
