Summary
Burada, yalıtım, genişleme ve köpek yumurtalık dokusundan mezenkimal kök hücre farklılaşma için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Mezenkimal kök hücre (MSCs) ilgi yalıtım, genişleme ve kültür kolaylığı nedeniyle son on yıl içinde artmıştır. Son zamanlarda, çalışmalar bu hücreler sahip geniş farklılaşma kapasite göstermiştir. Yumurtalık hücre tabanlı terapiler için umut verici bir aday MSCs içinde zengin ve sık sık biyolojik atık olarak ovariectomy ameliyat sonra atılan nedeniyle gerçeğini temsil eder. Bu makalede, yalıtım, genişleme, için yordamlar açıklanır ve MSCs farklılaşma hücre sıralama gerekliliği olmadan köpek yumurtalık türetilmiştir teknikleri. Bu iletişim kuralı rejeneratif tıp için önemli bir araç nedeniyle klinik çalışmalar son derece türevlenebilir bu hücrelerde geniş uygulanabilirliği temsil eder ve terapötik kullanır.
Introduction
Kök hücreler üzerinde odak önemli ölçüde güçlü rejeneratif tıp terapiler keşfetmek toplu amacı tarafından yakıt oldu bir araştırma çaba son on yıl içinde artmıştır yayımlanmış çalışmaları sayısı. Kök hücreler var iki birincil tanımlama işaretleri: öz - yenileme ve farklılaşma. Mezenkimal kök hücre normal doku ciro için sorumlu ve embriyonik kök hücre1' e göre farklılaşma daha sınırlı bir kapasiteye sahip. Son zamanlarda, birçok çalışma geniş bir MSCs farklılaşma göstermiştir ve olup farklar embriyonik ve yetişkin kök hücreleri arasındaki tüm2adlı bir konudur tartışma altında.
Ovarium yüzey epitel hücreleri yanıt olarak farklı türdeki ayırt etmek için kapasite istinat hem epitelyal ve mezenkimal işaretçileri3, ifade farklılaşmış, bir kaydedilmemiş katman hücre, nispeten daha az olduğunu çevre sinyalleri4. Yumurtalık kök hücre tam konumunu iyi bilinen değildir; Ancak, tunica albuginea bipotential ataları germ hücreleri5' e çıkmasına önerilmiştir. İmmünolojik araştırmalar bu hücreler stromal kökenli6 veya içinde bulunduğu veya proksimal Over yüzey7onaylanmadığına karar. Mezenkimal kök hücre hücre adezyon8' önemli bir rol oynamaktadır çok sayıda reseptörleri hızlı beri bir deney bir nüfus hızlı adezyon içeren hücrelerin seçerek hücreleri nüfusu açıkça ayırmak hipotezi test etmek için tasarlanmıştır doğada mezenkimal olarak characterizable. Son zamanlarda, bizim grup MSCs türetmeye yumurtalık dokusu hücreleri hızlı yapışma9sergilenmesi arıtılmış nüfusu elde etmek için onların ilk 3 h kültür, kültür tabakta plastik yüzeyine yapışma üzerine kurulu kapasiteli bildirdi. Burada, yumurtalık dokusu mezenkimal kök hücre izolasyon için geliştirilen yöntem açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu deney dört melez kadın köpek bir köpek sterilizasyon programı seçmeli ameliyat sonrası hibe yumurtalık ile gerçekleştirildi. Bu deney UNESP-FCAV (protokol No 026991/13) hayvanların kullanımı Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. deneysel hazırlık
- Hazırlamak veya 500 mL steril Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) kalsiyum ve magnezyum olmadan satın alın.
- Bir collagenase hazırlamak enzim DPBS 1 ml 40 µg karıştırılarak çözüm stok. 0.2 µm şırınga filtre kullanarak filtre uygulama ve 2 mL aliquots-20 ° C'de depolayın
- Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) düşük glikoz % 10 fetal serum ve antibiyotiklerin % 1 ile kültür ortamından hazırlayın.
- Steril malzeme toplamak: makas ve forseps, doku kültürü flask, yemekler, tüpler ve 10 mL ve 5 mL pipetler.
- Standart hücre kültür Labaratuar donanımları kullanın: bir biyolojik emanet dolabı (BSC), % 5 CO2 ve 38 ° C ve bir santrifüj ayarlamak bir hücre kültür kuluçka makinesi.
- BSC temiz: eldivenli elleriyle % 70 ile sterilize alkol, UV ışığı kullanarak.
2. izolasyon yumurtalık mezenkimal kök hücre
- Ameliyattan sonra onların varış laboratuarındaki kadar PBS bir konik tüp buzda yumurtalık unutmayın.
- 100 mm Petri tabağı PBS 10 mL ile doldurulması.
- Yumurtalık tüpü çıkarması ve PBS ile ilk Petri kabına aktarın. Onları hareketleri karıştırma ile yıkayın.
- Yavaşça yumurtalık almak ve başka bir çanak içine yerleştirin. Steril cımbız ve makas ile çok küçük parçalara, yaklaşık 1 mm boyutunda doku kıyma.
- Yumurtalık dokusu bir 35 mm Petri kabına aktarın ve collagenase 2 mL ekleyin. Doku biraz daha kıyma.
- 38 ° c kuluçka 3 h için Petri kabına yerleştirin ve yavaşça dairesel hareketler her 20 min ile Petri kabına sallamak.
- 3 saat sonra Petri kabına kuluçka makinesi kaldırın.
- Yemeğin içeriğini 15 mL tüp aktarmak. Genişletme ortam 5 mL ekleyin.
- Santrifüjü önce tüpü yavaşça tersine çevirin. 2100 x g 7 dk. kaldır at tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet genişleme medya 3 mL ile resuspend.
- Pelet T25 biberondan aktarın. Kuluçka % 5 ile şişe koyun 3 h için 38 ° C'de CO2 .
Not: Prosedürün en önemli kısmı kuluçka 3 h sonra medya değiştirmektir. - Şişe kuluçka makinesi kaldırın ve medya kalan doku ile kaldırın. Taze genişleme medya 3 mL şişe ekleyin.
- Medya her 48 h değiştirmek ve hücresel izdiham için şişe gözlemlemek.
Not: Yordamı ana adımları Şekil 1' de görülebilir.
3. yumurtalık mezenkimal kök hücre genişlemesi
-
Hücre geçiş
- Hücreleri izdiham ulaştığınızda, medyayı şişeden çıkarın.
- PBS ile 3 mL şişe yıkama. PBS kaldırın.
- Tripsin ve şişe 38 ° C'de kuluçka 3 dakika süreyle hafifçe dokunun ayırmak için hücreleri yardımcı şişe yerine 1,5 mL ekleyin.
Not: Hücreleri izdiham yaklaşık 5 - 7 sonra ilk kaplama d ulaştırılması gerekmektedir. - Genişletme ortam 3 mL ekleyin ve içeriği bir konik tüp aktarın.
- 2100 x g 7 dk. kaldır at tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve 1 mL genişleme medya ekleyin.
- Yavaşça tüp içeriğini lunaparkçı.
- 10 µL sayma ve hücreleri ile tüp da kuluçka makinesine koy hücre gerçekleştirmek için örnek bir aliquot al.
- Karışımı içine hemasitometre yer 10 µL.
-
Hücreleri sayma
- Hemasitometre kılavuz çizgileri üzerinde odaklanmak ve mikroskop'ın 10 X objektif kullanın.
- Beş küçük kareler (Şekil 2) içinde hücreleri saymak.
- Sayılan sayısı mililitre başına hücre sayısı tahmin etmek için 50.000 tarafından çarpın.
4. yumurtalık mezenkimal kök hücre farklılaşma
Not: Hill ve ark. içinde kurulan esaslarına göre farklılaşma deneyleri gerçekleştirilmiştir 9.
- Kuyuda nüsha, 4-şey kültür tabak başına tohum 1.0 x 104 hücre.
- Genişletme ortam 1 mL ekleyin.
- Yavaşça dairesel hareketler ile çanak kışkırtmak.
- 24 saat sonra arzu edilen farklılaşma medya ile kültür ortamı değiştirin.
- İçin osteojenik, Adipojenik ve chondrogenic farklılaşma, kuluçkaya indüksiyon medya 30 d için hücrelerle, Medya değiştirme ile her 3 ö. belirli farklılaşma kitleri her bu deneyleri için kullanıldı.
- Nörojenik lineage farklılaşma için indüksiyon medya, medya değiştirilmesi her 3 d ile 10 d için hücreleri kuluçkaya. Burada kullanılan ortamı DMEM düşük glikoz, 2 mM valproik asit, 1 µM hidrokortizon, 10 µM forskolin, 5 mM potasyum klorür, 5 µg/mL insülin ve 200 µM butylated hydroxyanisole yer.
- Endoderm medya reaktif üreticinin yönergelerine göre 5 d için endoderm öncüleri, kuluçkaya.
- Primordial germ hücreli lineage farklılaşma için indüksiyon medya medya değiştirilmesi her 3 d ile 14 d için hücrelerde kuluçkaya. Burada kullanılan medya bulunan DMEM, %10 FBS, 1 mM sodyum pyruvate, 10 ng/mL LIF, 1 mM gerekli olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, 5 µg/mL insülin, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 60 µM putrescine, 20 µg/mL transferrin, 10 ng/mL fare epidermal büyüme faktörü, 1 ng/mL insan temel fibroblast büyüme faktörü, 40 ng/mL insan gliyal hücre satırı kaynaklı nörotrofik faktör ve 15 mg/L penisilin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Köpek yumurtalık mezenkimal kök hücre izolasyon:
Yumurtalık MSC yalıtım yordamı Şekil 1' de özetlenmiştir. Cerrahi, doku kıyma, collagenase sindirim ve medya Değiştir 3 h başında kültür sonra sonra hızlı plastik yapışkanlı özellikleri sözde MSC nüfusuyla başarıyla köpek yumurtalık dokusundan izole edildi. Hasat hücreleri hızla kültür çanak plastik yüzeye yapıştırılır ve tipik MSC benzeri morfoloji (Şekil 3) ile morfolojik homojen monolayer kültür içine büyüdü.
Yumurtalık MSC karakterizasyonu Vitro
MSC karakterizasyonu izole hücreler standart MSC kriterlere uygun emin olmak için hedeftir. Bu plastik, olumlu bir algılama mezenkimal yüzey işaretlerinin ve hematopoetik yüzey işaretlerinin bir devamsızlığın yanı sıra Mezodermal farklılaşma geçmesi kapasite bağlılığı içerir.
Şekil 3' te gösterildiği gibi yumurtalık kaynaklı hücreler plastik yapışık ve sergilenen MSCs tanımlar önce birinci ölçüte uygun bir fibroblast benzeri morfolojisi. Ayrıca, izole hücreler transkript köpek MSC işaretleri CD44, CD90 ve CD105 ifadesi gösterdi. Buna ek olarak, MSC özel hücre yüzey antijenleri CD90 ve CD44 erken geçiş FACS Analizi ve immunocytochemistry tarafından tespit edildi. CD45 ve CD34, özel hematopoietik hücre yüzey antijenleri olan işaretleri yokluğu da aynı teknikleri (Şekil 4) tarafından doğrulandı. Bu daha da yumurtalık MSC özgü fenotip9ifade hücreleri içeren doğruladı. Bu deneyde köpek MSC karakterizasyonu için kullanılan antikor listelenen Tablo reçetesi.
MSCs karakterizasyonu sonraki adımda yeteneklerini Mezodermal soy ayırt etmek için kanıtı elde etmektir. Pozlama ve kültür silsilesi özgü farklılaşma protokolleri 30 gün sonra boyama farklı soy (Şekil 5A) için bir taahhüt tanımlamak için gerçekleştirildi. Osteojenik lineage için bir taahhüt Von boyama, kalsiyum mevduat tanımlanan Kossa teyit edildi. Safranin O proteoglikan boyama chondrogenic taahhüt doğruladı ve lipid yağ kırmızı O boyama Adipojenik taahhüt doğruladı. Bu hücreler differentiability soruşturma devam, onlar iki nöroektodermal kök hücre işaretçileri için immunostaining tarafından gösterildiği gibi farklılaşma ectodermic lineage içine geçmesi başardık: β-tübülin ve maruz kalma takip Nestin, Yumurtalık kaynaklı MSCs nöronal lineage farklılaşma protokolüne 10 gün (Şekil 5C). Transkript için SOX17 ve CD184 gibi hücre türleri morfoloji endodermal soy belirli süre belirli farklılaşma protokolleri maruz 5 gün (Şekil 5B) tespit edildi. Son olarak, türetilmiş yumurtalık teshir edilmesi 14 gün sonra mikrop için MSCs indüksiyon medya, Ekim 4 hücre ve DDX4 tespit edildi (Şekil 5 d). Birlikte, bu sonuçlar belirli farklılaşma protokolleri9' a gösterdiğiniz zaman yumurtalık dokusundan elde edilen MSCs farklılaşma sağlam ve çeşitli kapasite desteği.
Resim 1 : Ana adımları yalıtım yordamının. (1) cerrahisi, PBS, buz ile steril tüpleri yumurtalıklar aktarın. (2) yumurtalık yıkamak için onlar için PBS ile 100 mm plaka aktarılmalıdır. (3) küçük parçalara, yaklaşık 1 mm boyutunda doku kıyma. (4) doku hücrelerinden kurtarmak için 35 mm plakalar için doku parçalarını aktarmak ve collagenase 3 h sindirim için kuluçka makinesine ekleyin. (5) konik tüp Santrifüjü için plaka içeriğini aktarmak. (6) plaka Pelet T25 şişede ve 3 h. (7) kültür ilk 3 h sonra kuluçkaya, kültür ortamı değiştirin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Hemasitometre. Sayılacak beş küçük kareler kırmızı olarak işaretlenir.
Şekil 3 : Hücre morfolojisi. Medya kültürü başlangıç sonra 3 h değiştirince fibroblast benzeri morfoloji sergilenen mezenkimal hücreler homojen bir nüfus içinde sonuçlandı. Aksine, 48 saat sonra ilk medya değişiklik yapıldığında diğer hücre tipleri fibroblast benzeri hücreler yanı sıra görülebilmektedir. Ölçek çubuğu 1000 µm =. Bu rakam Hill ve ark. değiştirildi 9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Moleküler profil yumurtalık MSC. (A) izole hücreler tarafından gerçek zamanlı PCR (CD90, CD105 ve CD44) üç MSC işaretleri için olumlu olan klasik bir MSC marker profil sergiledi. (B) protein analiz, CD44 bu hücrelere olumlu ve onlar iki hematopoetik işaretleri (CD34 ve CD45) ifadesi yoktu. Ölçek çubuğu 70 µm =. Bu rakam Hill ve ark. değiştirildi 9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Yumurtalık MSC farklılaşma. İzole hücreler(a)Mezodermal soy ayırt etmek başardık (chondrogenic, osteojenik ve Adipojenik; ölçek çubuğu 70 µm =). Ayrıca, hücreleri her iki (B) endodermal öncüleri ayırt etmek başardık (ölçek çubuğu 70 µm =) ve (C) nörojenik soy (ölçek çubuğu 50 µm =). İlginçtir, hücreleri (D) primordial germ hücre farklılaşması, farklılaşma yumurtalık mezenkimal kök hücre için geniş kapasiteli gösteren uygulandı. Bu rakam Hill ve ark. değiştirildi 9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada kanıt MSCs ovariectomy sonra biyolojik atık olarak kabul edilir köpek yumurtalık dokusu yalıtılmış olmasını sağlamak. Birçok hücre tipleri-ebilmek bulunmak içinde Yumurtalık nedeniyle gerçeğini, başarılı bir şekilde büyüdü hücreleri bir monolayer fibroblast benzeri görünümdeki seçili plastik hızlı onların bağlılığı dayalı MSCs seçmek için bir protokol evlenme teklif etti.
MSCs türetmeye kemik iliği ilk rapor MSCs plastik yapışma kapasitesini kültür11ilk 48 saat dayanıyordu; Ancak, bu yöntem türdeş olmayan bir nüfus phenotypically ve işlevsel olarak, en az yalıtmak için kemik iliği12potansiyeline sahiptir bildirilmiştir. Önerilen kültür yöntemi Ayrıca plastik yapışma kapasitesi ile hücreleri seçer ve mezenkimal hücreler arzu edilen hücreleri sıralama gerekliliği olmadan birçok hücre tipleri vardır bir dokusundan izole ediyor. Mezenkimal kök hücre hücre adezyon8' önemli bir rol oynamaktadır çok sayıda reseptörleri hızlı nedeniyle gerçeğini, bir nüfus hızlı adezyon içeren hücrelerin seçtiyseniz daha homojen bir popülasyondaki neden olur ki bu onaylanmadığına karar yapıldı. güvenilir bir MSC profil ile ilk geçiş. Temsil edici sonuçlar daha kısa bir süre plastik yapışma tahlil MSCs morfolojik homojen bir popülasyon için daha gelişmiş pasajlar bekleyen gerekliliği olmadan ilk geçiş, ayırmak için kullanılan veya sıralama hücresini kanıt sağlar.
Bu iletişim kuralı kritik bir adımda kültür başlangıçta sonra medya 3 h değiştirmektir. Temsilcisi sonuçları bölümünde gösterildiği gibi köpek yumurtalık elde edilen kök hücre MSCs karakterizasyonu için kurulan üç kriterlerini karşıladı: fibroblast benzeri morfoloji sergilenen, MSC işaretleri varlığı için olumlu ve giriyordu osteojenik, Adipojenik ve chondrogenic soy olarak böyle mezenkimal soy içine ayırt etmek mümkün. Bu deneyde izole hücreler de başarıyla endodermal öncüleri, ektodermal soy ve primordial germ hücreli soy ayırt. Hücreleri izdiham yaklaşık 5-7 gün sonra ilk kaplama ulaştırılması gerekmektedir. Bir ileri yaş hayvanlarla hücrelerden daha yavaş bu genç hayvanların daha uzayabilir ve o, daha az sayıda hücre Plastik için uygun. Bu gibi durumlarda, FBS konsantrasyonu medya için % 15 daha çalışır.
Bu nedenle, seçimi ile daha hızlı bağlılık kapasitesi hücreleri temel alan MSCs için ucuz, akıcı ve etkili bir yordamı temsil eder. Terapötik bir bakış açısından, bu hücreler rejeneratif tıp için umut verici bir araç özellikle onların geniş farklılaşma nedeniyle temsil vurgulamak çok önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar köpek sterilizasyon program UNESP-FCAV, lütfen yumurtalık sağlamak için kabul etmiş oluyorsunuz. Bu eser FAPESP (işlem No 2013/14293-0) ve burunları gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Collagenase I | Thermo Fisher | 17100017 | |
| Tissue flask | Corning | CLS3056 | |
| DMEM low glucose | Thermo Fisher | 11054020 | |
| FBS | Thermo Fisher | 12484-010 | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604021 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007201 | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Kit | StemCell | 5110 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | |
| CD45 | AbD Serotec | MCA 2035S | |
| CD34 | AbD Serotec | MCA 2411GA | |
| CD90 | AbD Serotec | MCA 1036G | |
| CD44 | AbD Serotec | MCA 1041 | |
| Nestin | Milipore | MAB353 | |
| β-Tubulin | Milipore | MAB1637 | |
| DDX4 | Invitrogen | PA5 -23378 | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR80F | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR120F |
References
- Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). Atala, A., Lanza, R. , Academic Press. 513-527 (2013).
- Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
- Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
- Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).
- Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
- Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145 (2004).
- Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
- Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).
- Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
- Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
- Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).
