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Developmental Biology

Ableitung und Differenzierung von Eckzahn Eierstock mesenchymalen Stammzellen

doi: 10.3791/58163 Published: December 16, 2018

Summary

Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung, Erweiterung und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus Eckzahn Ovargewebe.

Abstract

Interesse an mesenchymalen Stammzellen (MSCs) hat im letzten Jahrzehnt aufgrund ihrer einfachen Isolierung, Expansion und Kultur zugenommen. Studien haben vor kurzem die breite Differenzierung Kapazität gezeigt, die diese Zellen besitzen. Der Eierstock stellt einen viel versprechender Kandidat für zellbasierte Therapien, es reich an MSCs ist und, die es ist häufig nach Ovariectomy Operationen als Bioabfall entsorgt. Dieser Artikel beschreibt Verfahren zur Isolierung, Ausbau, und Differenzierung der MSCs abgeleitet aus dem Eckzahn Eierstock, ohne die Notwendigkeit der Zellsortierung Techniken. Dieses Protokoll stellt ein wichtiges Instrument für die regenerative Medizin wegen der breiten Anwendbarkeit dieser höchst differenzierbare Zellen in der klinischen und therapeutischen verwendet.

Introduction

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Die Anzahl der veröffentlichten Studien, die Fokus auf Stammzellen im letzten Jahrzehnt eine Forschungsarbeit, die durch das kollektive Ziel entdecken starke regenerative Medizin Therapien angeheizt hat, erheblich gestiegen ist. Stammzellen haben zwei primäre bestimmende Marker: selbst - Renovierung und Differenzierung. Mesenchymaler Stammzellen sind verantwortlich für regelmäßige Gewebe Umsatz und haben eine eingeschränktere Kapazität der Differenzierung im Vergleich zu embryonalen Stammzellen1. Vor kurzem, zahlreiche Studien belegen eine Vielzahl der Differenzierung der MSCs, und ein Thema in der Diskussion ist, ob Unterschiede zwischen embryonalen und adulten Stammzellen alle2existieren.

Das Ovarium Oberflächenepithel ist ein ohne Commit Schicht von Zellen, relativ weniger differenziert, die beiden epithelialen und mesenchymalen Marker3, behalten die Fähigkeit, sich in verschiedenen Arten von Zellen als Reaktion auf differenzieren ausdrückt Umweltsignale4. Die genaue Lage von Stammzellen im Eierstock ist nicht bekannt; jedoch wurde vorgeschlagen, dass bipotentialen Vorfahren in der Tunica Albuginea zu Keimzellen5führen. Immunologische Untersuchungen haben die Hypothese, dass diese Zellen eine stromale Herkunft6 oder im oder proximalen dem Eierstock Oberfläche7. Da mesenchymaler Stammzellen zahlreiche Rezeptoren zum Ausdruck, die eine wichtige in der Zelle Adhäsion8 bringen Rolle, wurde ein Experiment entwickelt, um die Hypothese zu testen, die Auswahl einer Bevölkerung der Zellen mit schnellen Adhäsion eine Bevölkerung der Zellen deutlich isolieren würde charakterisierbar als mesenchymale in der Natur. Unsere Fraktion berichtete kürzlich, die Ableitung von MSCs von Eierstockgewebe basierend auf ihre Kapazität der Haftung auf die Kunststoffoberfläche der Kulturschale in den ersten 3 h von Kultur, um eine gereinigte Population von Zellen ausstellenden schnelle Haftung9zu erhalten. Hier beschreiben wir die entwickelte Methode für mesenchymale Stammzellen isoliert von der ovariellen Gewebe.

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Protocol

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Dieses Experiment wurde mit den Eierstöcken von vier Mischling Hündinnen nach elektiven Eingriffen an einem Eckzahn Sterilisationsprogramm gespendet durchgeführt. Dieses Experiment wurde von der Ethikkommission für Tierversuche UNESP-FCAV (Protokoll Nr. 026991/13) genehmigt.

(1) experimentelle Vorbereitung

  1. Vorbereiten oder 500 mL sterile Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) ohne Kalzium und Magnesium zu kaufen.
  2. Bereiten Sie ein Kollagenase ich Lager Lösung durch Mischen von 40 µg des Enzyms in 1 mL des DPBS. Mit einem 0,2 µm Spritze Filter filtern Sie und speichern Sie 2 mL Aliquote bei-20 ° C.
  3. Bereiten Sie die Nährmedien aus Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) niedrige Glukose mit fetalen Serum 10 % und 1 % der Antibiotika.
  4. Sterile Materialien sammeln: Scheren und Pinzetten, einer Gewebekultur Kolben, Gerichte, Rohre und 10 mL und 5 mL Pipetten.
  5. Standardzellen-Kultur-Labor-Geräte verwenden: einen biologischen Sicherheitsschrank (BSC), eine Zelle Kultur Inkubator auf 5 % CO2 und 38 ° C und einer Zentrifuge gesetzt.
  6. Reinigen die BSC: mit behandschuhten Händen, Sterilisieren sie mit 70 % EtOH, mit UV-Licht.

2. Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Eierstock

  1. Halten Sie nach der Operation die Eierstöcke mit PBS-Puffer auf dem Eis in einem konischen Rohr, bis zum Eintreffen im Labor.
  2. Füllen Sie zwei 100 mm Petrischalen mit 10 mL PBS.
  3. Entfernen Sie die Eierstöcke aus der Tube und übertragen Sie sie auf der ersten Petrischale mit PBS. Waschen Sie sie mit dem Mischen Bewegungen.
  4. Sanft rufen Sie den Eierstock ab und legen Sie sie in ein anderes Gericht. Mit einer sterilen Pinzette und Schere Hackfleisch das Gewebe in sehr kleine Stücke, etwa 1 mm groß.
  5. Übertragen der ovariellen Gewebes auf eine 35 mm Petrischale und 2 mL der Kollagenbildung. Hacken Sie das Gewebe ein wenig mehr.
  6. Legen Sie die Petrischale im Inkubator bei 38 ° C für 3 h und schütteln Sie die Petrischale mit kreisenden Bewegungen alle 20 Minuten.
  7. Entfernen Sie nach 3 h die Petrischale aus dem Inkubator.
  8. Übertragen Sie den Inhalt der Schale auf eine 15 mL-Tube. 5 mL der Erweiterung Medien hinzufügen.
  9. Invertieren Sie sanft das Rohr vor Zentrifugation. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 2100 X g für 7 min. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Pellet mit 3 mL Erweiterung Medien.
  10. Übertragen Sie das Pellet auf eine T25 Flasche. Stellen Sie die Flasche in den Inkubator mit 5 % CO2 bei 38 ° C für 3 h.
    Hinweis: Der wichtigste Teil des Verfahrens ist es, die Medien nach 3 h Inkubation zu ändern.
  11. Entfernen Sie die Flasche aus dem Inkubator und entfernen Sie das Medium mit dem restlichen Gewebe. Die Flasche 3 mL frische Erweiterung Medien hinzufügen.
  12. Wechseln Sie das Medium alle 48 h und beobachten Sie die Flasche für zelluläre Zusammenfluss.
    Hinweis: Die wichtigsten Schritte des Verfahrens ist in Abbildung 1festzustellen.

3. Ausbau der mesenchymalen Stammzellen aus dem Eierstock

  1. Zelle-passage
    1. Wenn die Zellen Zusammenfluss erreicht haben, entfernen Sie das Medium aus der Flasche.
    2. Waschen Sie die Flasche mit 3 mL PBS. Entfernen Sie die PBS.
    3. Fügen Sie 1,5 mL Trypsin und setzen Sie die Flasche in den Inkubator bei 38 ° C für 3 min. klopfen Sie leicht die Flasche, die Zellen zu lösen helfen.
      Hinweis: Zellen sollten Zusammenfluss ca. 5 - 7 d nach der ersten Beschichtung erreicht.
    4. 3 mL Erweiterung Medien hinzufügen und den Inhalt auf einem konischen Rohr übertragen.
    5. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 2100 X g für 7 min. Entfernen des Überstands und 1 mL Erweiterung Medien.
    6. Der Inhalt des Röhrchens sanft zu homogenisieren.
    7. Nehmen Sie eine Aliquote von 10 µL der Probe durchzuführen Zelle zählen und habe das Rohr mit den Zellen wieder in den Inkubator.
    8. Platz 10 µL der Mischung in die Hemocytometer.
  2. Zählen der Zellen
    1. Verwenden Sie 10 X-Objektiv des Mikroskops und konzentrieren Sie sich auf die Rasterlinien für die Hemocytometer.
    2. Zählen der Zellen in fünf kleine Quadrate (Abbildung 2).
    3. Multiplizieren Sie die gezählte Anzahl von 50.000, die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu schätzen.

4. Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Eierstock

Hinweis: Differenzierung Assays wurden nach den Leitlinien in Hill Et Al. durchgeführt. 9.

  1. 1.0 x 104 Samenzellen pro Bohrloch in dreifacher Ausfertigung, mit einer 4-Well Kulturschale.
  2. Fügen Sie 1 mL der Erweiterung Medien.
  3. Schütteln Sie sanft die Schale mit kreisenden Bewegungen.
  4. Ersetzen Sie nach 24 h die Nährmedien mit den Medien wünschenswert Differenzierung.
  5. Für osteogene, adipogenen und Chondrogenic Differenzierung, Inkubation der Zellen mit der Induktion-Medien für die 30D, mit Ersatz von Medien wurden alle 3 d. spezifische Differenzierung Kits für jede dieser Proben verwendet.
  6. Inkubieren Sie für neurogene Abstammung Differenzierung die Zellen für 10d in den Induktion Medien mit Ersatz von Medien jeder 3-d. Die hier verwendeten Medien enthaltenen DMEM niedrige Glukose, 2 mM Valproinsäure, Hydrocortison-1 µM, 10 µM Forskolin, 5 mM Kaliumchlorid, 5 µg/mL Insulin und 200 µM Butylated Hydroxyanisole.
  7. Für Entoderm Vorstufen 5D im Entoderm Medien gemäß Herstellervorschrift die Reagenz inkubieren.
  8. Inkubieren Sie für primordialen Keimzellen Abstammung Zelldifferenzierung die Zellen in den Induktion Medien für 14 d, mit Ersatz von Medien jeder 3-d. Die hier verwendeten Medien enthaltenen DMEM, 10 % FBS, 1 mM Natrium Pyruvat, 10 ng/mL LIF, unwesentlichen Aminosäuren 1 mM, 2 mM L-Glutamin, 5 µg/mL Insulin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 60 µM Putrescin, 20 µg/mL Transferrin, 10 ng/mL Maus epidermalen Wachstumsfaktor, 1 ng/mL menschlichen grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 40 ng/mL Human glial cell Line-derived Neurotrophic Factor und 15 mg/L Penicillin.

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Representative Results

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Mesenchymale Stammzellen isoliert von Eckzahn Eierstock:

Die Eierstöcke MSC Isolierung Verfahren ist in Abbildung 1zusammengefasst. Nach der Operation, Gewebe zu hacken, Kollagenase Verdauung und ein Medienwechsel 3 h nach dem Beginn der Kultur wurde eine vermeintliche MSC Bevölkerung mit schnellen Kunststoff-Klebstoff Eigenschaften von Eckzahn Ovargewebe erfolgreich isoliert. Die geernteten Zellen rasch die Kunststoffoberfläche der Kulturschale eingehalten und entwickelte sich zu einer morphologisch homogene Monolayer Kultur mit typischen MSC-ähnliche Morphologie (Abbildung 3).

Charakterisierung der Eierstöcke MSC In Vitro

Das Ziel des MSC Charakterisierung soll sicherstellen, dass isolierte Zellen standard MSC-Kriterien entsprechen. Dazu gehören die Einhaltung von Kunststoff, ein positiver Nachweis von mesenchymalen Oberflächenmarker, sowie die Abwesenheit von hämatopoetischen Oberflächenmarker und die Kapazität mesodermalen Differenzierung zu unterziehen.

Wie in Abbildung 3dargestellt, Eierstock-abgeleitete Zellen waren Anhänger der Kunststoff und ausgestellten eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie, Erfüllung des ersten Kriteriums, die MSCs definiert. Darüber hinaus zeigten die isolierten Zellen die Expression von Abschriften für die Hunde MSC Marker CD44, CD90 und CD105. Darüber hinaus wurden MSC-spezifische Zelle Oberfläche Antigene CD90 und CD44 durch frühe Passage FACS Analyse und Immunocytochemistry erkannt. Das Fehlen der Marker CD45 und CD34, die blutbildenden-spezifische Zelle Oberfläche Antigene sind, bestätigte auch die gleichen Techniken (Abbildung 4). Dies bestätigt weiter, dass der Eierstock mit dem Ausdruck einer MSC-spezifischen Phänotyp9Zellen enthält. Die Antikörper, die in diesem Experiment für Hunde MSC Charakterisierung verwendet wurden finden Sie in der Tabelle Materialien.

Der nächste Schritt in der Charakterisierung der MSCs ist Beweis für ihre Fähigkeit, in mesodermalen Linien unterscheiden zu erreichen. Nach 30 Tagen der Belichtungs- und Kultur in Geschlecht-spezifische Differenzierung Protokolle Färbung erfolgte um ein Bekenntnis zu verschiedenen Linien (Abb. 5A) zu identifizieren. Eine Verpflichtung zur osteogene Linie wurde bestätigt durch Von Kossa Färbung, die Kalkablagerungen identifiziert. Safranin O Proteoglykan Färbung Chondrogenic Engagement bestätigt und Öl rot O Lipid Färbung adipogenen Engagement bestätigt. Fortsetzung der Untersuchung der Differenzierbarkeit dieser Zellen, sie konnten unterziehen, Differenzierung in der ectodermic Linie, dargestellt durch Immunostaining für zwei Neuroectodermal Stammzell-Marker: β-Tubulin und Nestin, nach Exposition des Eierstock abgeleitet MSCs des neuronalen Abstammung Differenzierung Protokolls für 10 Tage (Abbildung 5). Abschriften für SOX17 sowie CD184 und Zelle Morphologien spezifisch für die endodermische Linie, wurden nach der Exposition gegenüber bestimmten Differenzierung Protokolle für 5 Tage (Abb. 5 b) beobachtet. Schließlich, nach 14 Tagen der Exposition der Eierstock abgeleitet MSCs zu Keim Zelle Induktion Medien, Okt 4 und DDX4 identifiziert wurden (Abbildung 5). Gemeinsam unterstützen diese Ergebnisse eine robuste und vielfältige Kapazität der Differenzierung für MSCs abgeleitet von Eierstockgewebe, wenn bestimmte Differenzierung Protokolle9ausgesetzt.

Figure 1
Abbildung 1 : Main Schritte des Verfahrens Isolierung. (1) nach der Operation übertragen Sie die Eierstöcke auf sterile Röhrchen mit PBS auf Eis. (2) zu die Eierstöcken zu waschen, sollten sie auf eine 100 mm-Platte mit PBS übertragen werden. (3) zerkleinern Sie das Gewebe in kleine Stücke, etwa 1 mm groß. (4) auf die Zellen aus dem Gewebe zu befreien, übertragen Sie die Stücke des Gewebes auf 35-mm-Platten geben Sie und Kollagenase für eine 3 h Verdauung im Inkubator. (5) übertragen Sie der Inhalt der Platte auf einer konischen Röhre für Zentrifugation. (6) Teller das Pellet in einer Flasche T25 und inkubieren 3 h. (7) nach den ersten 3 h der Kultur, der Nährmedien zu ändern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Hemocytometer. Die fünf kleinen Quadrate gezählt werden sind rot markiert.

Figure 3
Abbildung 3 : Zelle Morphologie. Als die Medien 3 h nach dem Beginn der Kultur geändert wurde, führte es zu einer homogenen Bevölkerung von mesenchymalen Zellen, die eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie ausgestellt. Im Gegenteil, nach 48 h nach Abschluss der ersten Medienwechsel können andere Zelltypen neben den Fibroblasten-ähnliche Zellen beobachtet werden. Die Maßstabsleiste = 1.000 µm. Diese Zahl wurde von Hill Et Al. modifiziert 9. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Molekulare Profil der Eierstöcke MSC. (A) der isolierten Zellen eine klassische MSC Marker Profil, positiv für drei MSC Marker durch Echtzeit-PCR (CD90, CD105 und CD44) ausgestellt. (B) durch Protein-Analyse, CD44 war positiv in diesen Zellen, und es fehlte die Expression von hämatopoetischen Markierungen (CD34 und CD45). Die Maßstabsleiste = 70 µm. Diese Zahl wurde von Hill Et Al. modifiziert 9. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Differenzierung der Eierstöcke MSC. Die isolierten Zellen konnten in (A) mesodermalen Abstammungen zu differenzieren (Chondrogenic, osteogene, und adipogenen; die Maßstabsleiste = 70 µm). Darüber hinaus konnten die Zellen, in beiden endodermische Vorstufen (B) zu unterscheiden (die Maßstabsleiste = 70 µm) und (C) neurogene Linien (die Maßstabsleiste = 50 µm). Interessanterweise wurde die Zellen (D) ur Keim Zelldifferenzierung, demonstriert eine große Kapazität von Differenzierung für Eierstockkrebs mesenchymalen Stammzellen. Diese Zahl wurde von Hill Et Al. modifiziert 9. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Hier stellen wir Hinweise darauf, dass MSCs von Eckzahn Eierstockgewebe isoliert werden können die biologische Abfälle nach Ovariectomy gilt. Da viele Zelltypen in den Eierstöcken gefunden werden können, haben wir vorgeschlagen, ein Protokoll, um wählen MSCs basierend auf ihre schnelle Einhaltung der Kunststoff, der Zellen, die wuchs in einem monomolekularen Film mit einer Fibroblasten-ähnliche Morphologie erfolgreich ausgewählt.

Der erste Bericht über die Ableitung von MSCs aus dem Knochenmark stützte sich auf die Kunststoff Adhäsion Kapazität die MSCs während der ersten 48 Std. Kultur11; Allerdings wurde berichtet, dass diese Methode das Potenzial hat, eine heterogene Bevölkerung phänotypisch und funktionell, zumindest für Knochenmark12zu isolieren. Die vorgeschlagenen Kultur-Methode auch markiert Zellen durch Kunststoff Adhäsion Kapazität und isoliert mesenchymale Zellen aus einem Gewebe, die viele Zelltypen, ohne die Notwendigkeit des Sortierens wünschenswert Zellen hat. Die mesenchymaler Stammzellen zahlreiche Rezeptoren zum Ausdruck, die eine wichtige in der Zelle Adhäsion8 bringen Rolle, wurde es vermutet, wenn eine Population von Zellen mit schnellen Adhäsion ausgewählt wurden, würde es eine homogene Bevölkerung führen die ersten Durchgang mit einem zuverlässigen MSC-Profil. Die repräsentativen Ergebnisse belegen, dass ein kürzere Dauer Kunststoff Adhäsion Assay kann verwendet werden, um eine morphologisch homogene Bevölkerung von MSCs an die erste Stelle, ohne die Notwendigkeit des Wartens auf erweiterte Passagen zu isolieren oder Zell-Sortierung.

Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll soll die Medien 3 h nach dem Beginn der Kultur zu ändern. Wie im Abschnitt repräsentative Ergebnisse gezeigt, die Stammzellen aus Eckzahn Eierstöcke erfüllt die drei Kriterien zur Charakterisierung von MSCs: sie stellte eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie, waren positiv auf das Vorhandensein von MSC-Marker, und in solchen mesenchymalen Linien als osteogene, adipogenen und Chondrogenic Linien unterscheiden können. Zellen isoliert in diesem Experiment wurden auch erfolgreich in endodermische Vorstufen, ektodermalen Abstammungen und Keim Urzelle Linien differenziert. Die Zellen sollten Zusammenfluss ca. 5-7 Tage nach der ersten Beschichtung erreichen. Die Zellen von Tieren mit fortgeschrittenem Alter können langsamer als die Jungtiere wachsen, und derjenigen, können der Kunststoff weniger Zellen entsprechen. In diesen Fällen kann die Konzentration der FBS in den Medien auf 15 % erhöht werden.

Die Auswahl für MSCs basierend auf die Zellen mit schneller Einhaltung Kapazität stellt daher eine kostengünstige, schlanke und effektive Verfahren. Aus therapeutischer Sicht ist es sehr wichtig hervorzuheben, dass diese Zellen ein viel versprechendes Instrument für die regenerative Medizin, vor allem wegen ihrer breiten Palette an Differenzierung repräsentieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen die Hunde Sterilisationsprogramm bei UNESP-FCAV für die freundliche Bereitstellung die Eierstöcke. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von FAPESP (Prozess -Nr. 2013/14293-0) und CAPES unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS  Thermo Fisher 14190144
Collagenase I Thermo Fisher 17100017
Tissue flask Corning CLS3056
DMEM low glucose Thermo Fisher 11054020
FBS Thermo Fisher 12484-010
TrypLE express Thermo Fisher 12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit StemCell 5110
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063
CD45 AbD Serotec MCA 2035S
CD34 AbD Serotec MCA 2411GA
CD90 AbD Serotec MCA 1036G
CD44 AbD Serotec MCA 1041
Nestin Milipore MAB353
β-Tubulin  Milipore MAB1637
DDX4 Invitrogen PA5 -23378
IgG- FITC AbD Serotec STAR80F
IgG- FITC AbD Serotec STAR120F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Cite this Article

Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).More

Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).

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