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संयंत्र घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री को बढ़ाता है, एक अनुकरणीय के रूप में मकई (Zea mays) का उपयोग

Published: August 6, 2018 doi: 10.3791/58164
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 2, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Entomology, University of Minnesota, 3Department of Entomology, University of Kentucky

Summary

यहां वर्णित प्रोटोकॉल घुलनशील प्रोटीन और पच (गैर संरचनात्मक) संयंत्र के ऊतकों में कार्बोहाइड्रेट सामग्री को मापने के लिए एक स्पष्ट और दृष्टिकोण पद्धति प्रदान करते हैं । इन दो संयंत्र macronutrients यों की क्षमता संयंत्र फिजियोलॉजी, पोषण पारिस्थितिकी, संयंत्र-शाकाहारी बातचीत और खाद्य-वेब पारिस्थितिकी के क्षेत्रों को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है ।

Abstract

तात्विक डेटा सामांयतः शाकाहारी करने के लिए एक संसाधन के रूप में संयंत्र की गुणवत्ता अनुमान करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, सर्वव्यापकता में कार्बन के अणुओं, नाइट्रोजन युक्त संयंत्र रक्षात्मक यौगिकों की उपस्थिति, और प्रजातियों में भिन्नता-नाइट्रोजन और संयंत्र प्रोटीन सामग्री के बीच विशिष्ट सहसंबंध इन अनुमान की सटीकता की सीमा । इसके अतिरिक्त, अनुसंधान संयंत्र और/या शाकाहारी फिजियोलॉजी पर केंद्रित सटीकता का एक स्तर है कि सामान्यीकृत सहसंबंध का उपयोग कर प्राप्त नहीं है की आवश्यकता होती है । तरीकों यहां प्रस्तुत की पेशकश शोधकर्ताओं ने सीधे संयंत्र घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट को मापने के लिए एक स्पष्ट और तेजी से प्रोटोकॉल, दो संयंत्र macronutrients सबसे निकट पशु शारीरिक प्रदर्शन से बंधा । प्रोटोकॉल अच्छी तरह से अनुकूलित संयंत्र विशिष्ट पाचन कदम सटीक और reproducible परिणाम प्रदान करने के साथ वर्णमिति परख चरित्रों गठबंधन । विभिंन मीठी मकई के ऊतकों के हमारे विश्लेषण बताते है कि इन परख के लिए कई स्थानिक तराजू भर में संयंत्र में घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री में भिंनता का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता है । इन के बीच क्षेत्र और संयंत्र प्रजातियों या किस्मों, साथ ही भीतर ऊतक प्रकार और भी एक ही ऊतक के भीतर स्थिति अंतर में संयंत्र मतभेद बढ़ भर में अंतर संयंत्र शामिल हैं । तात्विक डेटा के साथ घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री के संयोजन भी संयंत्र शारीरिक प्रक्रियाओं के साथ संयंत्र खनिज पोषण कनेक्ट करने के लिए संयंत्र जीवविज्ञान में नए अवसर प्रदान करने की क्षमता है । ये विश्लेषण भी मदद घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट के लिए पोषण पारिस्थितिकी, संयंत्र शाकाहारी बातचीत और खाद्य-वेब गतिशीलता है, जो बारी में वृद्धि फिजियोलॉजी और पारिस्थितिकी अनुसंधान का अध्ययन करने की जरूरत डेटा उत्पंन करते हैं ।

Introduction

संयंत्र बायोमास वस्तुतः सभी स्थलीय खाद्य-जाले की नींव रूपों । पौधों को अपनी जड़ों प्रणालियों के माध्यम से मिट्टी से पोषक तत्वों का अधिग्रहण और उनके पत्तियों ऊतकों में सूर्य के रोशनी का उपयोग करने के लिए विश्लेषित अणुओं । विशेष रूप से, कार्बन और नाइट्रोजन कार्बोहाइड्रेट बनाने के लिए उपयोग किया जाता है, प्रोटीन (अमीनो एसिड के शामिल), और लिपिड है कि संयंत्र बायोमास बनाने की जरूरत है (यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संयंत्र फिजियोलॉजी में शब्द "macronutrient" अक्सर मिट्टी के तत्वों को संदर्भित करता है, जैसे N, पी, कश्मीर, और एस, तथापि, इस पत्र के दौरान इस शब्द प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, और लिपिड के रूप में, ऐसे अणुओं का उल्लेख होगा) । जब शाकाहारी संयंत्र सामग्री का उपभोग, संयंत्र के ऊतकों में निहित macronutrients नीचे उनके घटक भागों में टूट रहे हैं और फिर उपभोक्ता की शारीरिक प्रक्रियाओं ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया. इस तरह, संयंत्र macronutrients उच्च क्रम पारिस्थितिकी बातचीत और खाद्य वेब गतिशीलता के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ के साथ उपभोक्ता शरीर क्रिया विज्ञान पर एक मजबूत प्रभाव है ।

पशु किंगडम, घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट के पार macronutrients सबसे निकट अस्तित्व, प्रजनन, और प्रदर्शन1से बंधे हैं । इसके अलावा, पशुओं के बहुमत सक्रिय रूप से इन दो macronutrients के अपने सेवन को विनियमित करने के लिए उनकी शारीरिक मांगों को पूरा1,2। यह कीट शाकाहारी कि शर्करा और संयंत्र के ऊतकों, जो बारी में व्यवहार खिला निर्देशन में अमीनो एसिड की सांद्रता का पता लगाने के लिए विशेष रूप से सच है । नतीजतन, संयंत्र घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री संयंत्र-कीट बातचीत के विकास में एक मजबूत भूमिका निभाई है ।

जबकि संयंत्र घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री पर डेटा अपेक्षाकृत दुर्लभ है (लेकिन6,7,8,9,10,11देखें), वहां की एक विचार है संयंत्र मौलिक सामग्री (कार्बन, नाइट्रोजन, और फास्फोरस) पर उपलब्ध डेटा । मोटे तौर पर यह है क्योंकि तत्वों संयंत्र खनिज पोषण3,4,5में एक प्राथमिक भूमिका निभाते हैं । जहां तत्वों मापा जाता है, सहसंबंध घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट की मात्रा एक्सट्रपलेशन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन सटीक गणना अक्सर प्राप्त करने के लिए मुश्किल हैं । उदाहरण के लिए, यह संयंत्र पच कार्बोहाइड्रेट सामग्री के एक संकेतक के रूप में कार्बन का उपयोग करना असंभव है क्योंकि कार्बन सभी कार्बनिक यौगिकों में मौजूद बैरे है । एक मजबूत संबंध मौलिक नाइट्रोजन और संयंत्र घुलनशील प्रोटीन सामग्री के बीच मौजूद है, और सामान्यीकृत नाइट्रोजन से प्रोटीन रूपांतरण कारकों अक्सर उपयोग किया जाता है । हालांकि, वहां मजबूत सबूत है कि नाइट्रोजन के लिए प्रोटीन रूपांतरण उच्च प्रजातियों-विशिष्ट12,13,14,15, सामान्यीकृत रूपांतरण की संभावना का उपयोग कर रहे है गलत. इस वजह से, नाइट्रोजन से प्रोटीन रूपांतरण कारकों अक्सर परिशुद्धता कमी, विशेष रूप से हद तक है कि शाकाहारी पर पोषण के अध्ययन के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, N-युक्त संयंत्र allelochemicals की उपस्थिति, जैसे उपक्षारों और ग्लूकोसाइनोलेट्स कि अक्सर शाकाहारी के लिए विषाक्त कर रहे हैं, इन रूपांतरणों को मिल सकता है ।

यहां, हम घुलनशील प्रोटीन और संयंत्र के ऊतकों में सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट की एकाग्रता को मापने के लिए दो रासायनिक परख प्रदान करते हैं । इन परख अलग से प्रस्तुत कर रहे हैं, लेकिन यह सुझाव दिया है कि वे समवर्ती एक ही संयंत्र के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए संयंत्र macronutrients का एक अधिक व्यापक विश्लेषण प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । दोनों समान तरीके से काम, एक निष्कर्षण कदम से मिलकर, अवशोषक के माध्यम से ठहराव द्वारा पीछा किया । संयंत्र नमूना प्रस्तुत करने की तैयारी भी दोनों प्रोटोकॉल के लिए समान है, यह आसान बनाने में दोनों विश्लेषण चलाने के लिए । इन परख की उपयोगिता उनकी नवीनता से स्टेम नहीं है, के रूप में वे पुराने पर भरोसा करते हैं, (ब्रैडफोर्ड, जोंस, Dubois) अच्छी तरह से वर्णमिति परख16,17,18की स्थापना की, लेकिन यहां हम एक स्पष्ट और आसान का आयोजन किया है का पालन करें प्रोटोकॉल है कि अधिक अस्पष्ट संयंत्र विशिष्ट निष्कर्षण तकनीक17,19 के साथ इन तरीकों को जोड़ती है ताकि इन परख के आवेदन और संयंत्र में उन लोगों के लिए सुलभ बनाने के लिए प्रासंगिक क्षेत्रों ।

दोनों परख के लिए, संयंत्र macronutrients पहले ठंड से शारीरिक रूप से निकाले जाते हैं, lyophilizing, और संयंत्र सामग्री पीसने । घुलनशील प्रोटीन परख के लिए, आगे रासायनिक निष्कर्षण17,19 NaOH समाधान में भंवर और हीटिंग नमूनों के कई दौर के माध्यम से किया जाता है । अच्छी तरह से ज्ञात ब्रैडफोर्ड परख, Coomassie शानदार नीले जी-२५० का उपयोग, तो है घुलनशील प्रोटीन और 3000 के बीच polypeptides-5000 Daltons16,17। इस परख 1-20 µ g कुल प्रोटीन के बीच एक पहचान सीमा है microplate अच्छी तरह से या < 25 µ g/एमएल, लेकिन उपाय नहीं मुक्त अमीनो एसिड होता है । पच कार्बोहाइड्रेट परख के निष्कर्षण कदम स्मिथ एट अल के एसिड विधि पतला पर आधारित है । 20 और घुलनशील शर्करा, स्टार्च, और fructosan के अलगाव के लिए अनुमति देता है-लेकिन नहीं संरचनात्मक कार्बोहाइड्रेट । एक phenol-सल्फर एसिड ठहराव विधि Dubois एट अल से लिया जाता है । 18 और सभी मोनो उपाय, oligo-, और polysaccharides (साथ ही मिथाइल डेरिवेटिव). इस परख के लिए विशिष्ट शर्करा यों तो कर रहा है, लेकिन हम इसे कुल पच कार्बोहाइड्रेट सामग्री के एक संकेतक के रूप में उपयोग करें (स्मिथ एट अल देखें । 20 अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए) । साथ में, इन परख दो macronutrients कि दृढ़ता से संयंत्र पर्यावरण फिजियोलॉजी और शाकाहारी प्रदर्शन बंधे हैं, स्थलीय खाद्य-जाले के आधार पर संसाधन गुणवत्ता पर महत्वपूर्ण डेटा उपलब्ध कराने के उपाय । पेश है इन प्रोटोकॉल संयंत्र macronutrient डेटासेट की पीढ़ी को बढ़ावा देने के क्रम में संयंत्र फिजियोलॉजी, शाकाहारी पोषण पारिस्थितिकी, और संयंत्र-शाकाहारी बातचीत की एक और अधिक गहन समझ प्राप्त करने के लिए ।

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Protocol

1. संयंत्र संग्रह और प्रसंस्करण

  1. इकट्ठा और प्रक्रिया संयंत्र के नमूने
    1. संयंत्र के नमूनों का संग्रह करने के बाद, फ्लैश-संदंश के साथ तरल नाइट्रोजन में संयंत्र सामग्री सूई और-८० ° c पर स्टोर द्वारा फ्रीज नमूने । यदि संयंत्र के नमूने एकत्र भी फ्लैश के लिए बड़े हैं, फ्रीज, जल्दी से सूखी बर्फ और स्थानांतरण का उपयोग कर एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के रूप में जितनी जल्दी हो सके नमूनों शांत । संयंत्र सामग्री के macronutrient सामग्री के ऊतकों को संयंत्र से अलग कर रहे है के बाद बदल सकते हैं, तो यह संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके संयंत्र नमूने फ्रीज करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
      सावधानी: तरल नाइट्रोजन गंभीर शीतदंश जब त्वचा के साथ संपर्क में पैदा कर सकता है । कृपया सुनिश्चित करने के लिए अनुमोदित कंटेनरों में तरल नाइट्रोजन परिवहन और क्रायो-दस्ताने, आंख गूगल, चेहरा ढाल, एप्रन, और एक प्रयोगशाला कोट सहित अपनी हैंडलिंग के दौरान उचित पीपीई पहनते हैं ।
    2. Lyophilize संयंत्र सामग्री एक फ्रीज-ड्रायर का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि ऊतकों चयापचय निष्क्रिय कर रहे है जबकि पानी हटाया जा रहा है । जब तक सूखे के नमूने के द्रव्यमान सुनिश्चित करने के लिए स्थिर सभी पानी हटा दिया गया है ।
    3. एक बार नमूने सूख रहे हैं, एक चक्की या मिल का उपयोग कर एक ठीक पाउडर में पीसने । विश्लेषण तक एक desiccating कैबिनेट में नमूनों की दुकान ।

2. घुलनशील प्रोटीन परख

  1. नमूना तैयारी
    1. बाहर वजन प्रत्येक ऊतक के नमूने दोहराने, लगभग 20 मिलीग्राम प्रत्येक, १.५ मिलीलीटर polystyrene microcentrifuge ट्यूबों और लेबल ट्यूबों में । इन नमूनों को बाद में अज्ञात नमूनों के रूप में संदर्भित किया जाएगा । प्रत्येक नमूने के सटीक द्रव्यमान रिकॉर्ड, के रूप में इस जानकारी के लिए प्रत्येक अज्ञात नमूने में% घुलनशील प्रोटीन की गणना करने के लिए आवश्यक हो जाएगा । ढक्कन लॉकिंग के साथ microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग करें, के रूप में गैर लॉकिंग ढक्कन बाद हीटिंग कदम के दौरान खुला हो सकता है, नमूना समाधान की हानि में जिसके परिणामस्वरूप ।
  2. Solubilize और अलग अज्ञात नमूना प्रोटीन
    1. एक माइक्रो pipettor का उपयोग कर, प्रत्येक ट्यूब के लिए ०.१ मीटर NaOH के ५०० µ एल जोड़ें । ढक्कनों को कसकर बंद करें और 30 मिनट के लिए sonicate । एक गर्म पानी स्नान ९० ° c कचौरी ।
      सावधानी: सोडियम हीड्राकसीड एक मजबूत आधार है और जब त्वचा के साथ संपर्क में जलता पैदा कर सकता है । हालांकि ०.१ मीटर NaOH कम एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है, त्वचा की जलन से बचने के लिए सुरक्षात्मक दस्ताने पहनते हैं ।
    2. 15 मिनट के लिए गर्म पानी में स्नान में एक रैक में जगह ट्यूबों ।
    3. १५,००० x जी पर 10 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक । पिपेट नए लेबल microcentrifuge ट्यूबों में supernatant तरल, प्रत्येक नमूने के लिए एक नया पिपेट टिप का उपयोग कर । जोड़ें ३०० µ ०.१ एम NaOH की गोली युक्त ट्यूब करने के लिए और फिर से 10 मिनट के लिए १५,००० x जी पर केंद्रापसारक । फिर, supernatant तरल इकट्ठा और एक ही नमूना से अन्य supernatant द्रव के साथ गठबंधन. यह एक संभावित रोक बिंदु है, और नमूनों 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है अगर जरूरत भर में ।
  3. हाला संयंत्र प्रोटीन
    1. ५.८ एम एचसीएल के 11 µ l को जोड़कर supernatant सॉल्यूशन का पीएच बेअसर । प्रत्येक नमूना समाधान में लिटमस पेपर सूई द्वारा ~ 7 के एक पीएच की पुष्टि करें ।
      सावधानी: हाइड्रोक्लोरिक एसिड एक मजबूत संक्षारक एसिड है कि जलता है जब त्वचा (त्वचा आवेदन या साँस लेना) के साथ संपर्क में पैदा कर सकता है । कृपया त्वचा की जलन को रोकने के लिए दस्ताने पहनते हैं, जबकि एचसीएल हैंडलिंग ।
    2. 30 मिनट के लिए १००% trichloroacetic एसिड (टीसीए) के प्रत्येक ट्यूब और बर्फ पर मशीन ट्यूबों के ९० µ एल जोड़ें । प्रोटीन की वर्षा स्पष्ट से अपारदर्शी करने के लिए समाधान बंद हो जाएगा । यदि यह 30 मिनट के बाद नहीं होती है, तो 1 घंटे के लिए ट्यूबों प्रशीतित । यह एक संभावित रोक बिंदु है, और नमूनों 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है अगर जरूरत भर में ।
      सावधानी: Trichloroacetic एसिड राक है । कृपया दस्ताने पहनते है जब त्वचा के साथ संपर्क को रोकने और सांस लेना से बचने के हैंडलिंग ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १३,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक । एक वैक्यूम लाइन का उपयोग कर एक महीन ग्लास micropipette टिप (एक ही टिप के नमूनों में इस्तेमाल किया जा सकता है) के साथ इसे बाहर चूषण करके टीसीए supernatant को सावधानीपूर्वक निकालें । भारी चूषण से परहेज और पिपेट टिप और गोली के बीच एक उचित दूरी रखने के द्वारा प्रोटीन गोली परेशान मत करो ।
    4. -20 ° c एसीटोन के १०० µ एल के साथ जल्दी गोली धो लें । इस चरण में गोली, जो बाद में ब्रैडफोर्ड परख के साथ हस्तक्षेप कर सकते है से किसी भी शेष टीसीए निकालता है; हालांकि, एसीटोन प्रोटीन गोली भंग अगर संपर्क में बहुत लंबा छोड़ दिया है, तो एसीटोन जोड़ा जाना चाहिए तो जल्दी से 5 सेकंड के भीतर गोली से निकाले जाने शुरू कर देंगे ।
    5. एसीटोन की अनुमति दें एक धुएं हुड या रेफ्रिजरेटर में ट्यूबों रखकर लुप्त हो जाना । फिर, प्रत्येक ट्यूब के लिए ०.१ मीटर NaOH की 1 मिलीलीटर जोड़कर प्रोटीन गोली भंग । पूरी तरह से गोली भंग एक गर्म पानी के स्नान में हीटिंग के कई दौर की आवश्यकता हो सकती है, भंवर, और sonicating ।
      नोट: अब ट्यूबों धुएं डाकू या रेफ्रिजरेटर में बैठते है और सुखाने छर्रों मिलता है, और अधिक मुश्किल वे फिर से solubilize होगा । यह 30 मिनट के लिए गोली सूखी सुझाव दिया है, और फिर एसीटोन की उपस्थिति के लिए जांच हर 10-15 मिनट तक यह स्पष्ट है कि एसीटोन (कोई एसीटोन धुएं का पता लगाने वाले है) काफूर हो गया है ।
  4. मिश्रण मानक समाधान, अज्ञात नमूना समाधान पतला, और ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर अज्ञात नमूनों की कुल प्रोटीन सामग्री मात्रा ।
    1. तैयार गोजातीय immunoglobulin जी (आईजीजी) मानक समाधान तालिका 1 में सूचीबद्ध सांद्रता के अनुसार (lyophilized या आईजीजी स्टॉक समाधान एक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जल के साथ मिश्रित किया जा सकता है) । 4 डिग्री सेल्सियस पर मानकों की दुकान । एक ९६-well प्लेट में, तपसिल में प्रत्येक आईजीजी मानक समाधान के १६० µ एल जोड़ने के लिए अच्छी तरह से प्लेट के a1 स्थिति (0 µ g/µ l में a1, A2, A3 स्थिति, ०.०१२५ µ g/µ l में B1, B2, B3 स्थिति, आदि) ।
    2. आसुत जल के ०.१ M NaOH ९५० µ l के ५० µ l को जोड़कर एक पतला NaOH समाधान तैयार करें । एक खाली नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, तपसिल में अच्छी तरह से थाली के लिए इस समाधान के ६० µ एल जोड़ें (G1, G2, G3 के पदों) ।
    3. एक नया १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में आसुत जल के ९५० µ एल के लिए प्रत्येक नमूना समाधान के ५० µ एल जोड़कर अज्ञात नमूनों की कमजोर पड़ने की तैयारी करें । फिर, तपसिल में अच्छी तरह से थाली के लिए एक पतला नमूना के ६० µ एल जोड़ें, H1 स्थिति से शुरू । एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट 6 मानकों के विश्लेषण के लिए अनुमति चाहिए, 1 रिक्त, और 25 अज्ञात नमूने जब तपसिल में पढ़ें. एक अच्छी तरह से प्लेट विश्लेषण अपने स्वयं के आईजीजी मानक और खाली नमूने शामिल होना चाहिए ।
    4. सभी रिक्त और अज्ञात नमूनों कुओं के लिए आसुत जल के १०० µ एल जोड़ें । अब एक अच्छी तरह से १६० µ की कुल शामिल होना चाहिए l एक मल्टी चैनल पिपेट (8 चैनल) का उपयोग कर, Coomassie शानदार नीले जी के ४० µ एल जोड़ने-२५० प्रोटीन डाई अच्छी तरह से थाली के पहले कॉलम में हर अच्छी तरह से । कई बार डूबनेवाला करके नमूनों के साथ डाई मिलाएं । अन्य सभी स्तंभों के लिए दोहराएँ, संदूषण से बचने के लिए पिपेट युक्तियों की जगह.
      सावधानी: Coomassie शानदार नीले जी-२५० एक अड़चन है और त्वचा, आंखों, या फेफड़ों के साथ संपर्क से बचा जाना चाहिए है । कृपया त्वचा के साथ संपर्क को रोकने के दस्ताने पहनते हैं । यदि त्वचा के साथ संपर्क होता है, इस उत्पाद दाग होगा ।
    5. वे microplate spectrophotometer पढ़ने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में, कुओं में मौजूद किसी भी बुलबुले पॉप करने के लिए एक सुई का प्रयोग करें । कुओं के बीच संदूषण से बचने के लिए सुई को साफ करें । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर microplate मशीन चलो ।
    6. एक microplate spectrophotometer का उपयोग करना, ५९५ एनएम पर एक अच्छी तरह के लिए अवशोषक मूल्यों रिकॉर्ड ।
    7. तीन रिक्त कुओं के लिए औसत अवशोषक रिकॉर्ड और प्रत्येक मानक और अज्ञात नमूना रीडिंग से इस मूल्य घटाना । उसके बाद, प्रत्येक मानक और अज्ञात नमूने के लिए औसत अवशोषक रिकॉर्ड करें ।
      नोट: मानक वक्र का उपयोग करते हुए प्रत्येक अज्ञात नमूने में मौजूद प्रोटीन की मात्रा की गणना करने के लिए, प्रत्येक मानक में मौजूद माइक्रोग्राम प्रोटीन के विरुद्ध प्रत्येक मानक के औसत अवशोषण को निकासी करना सबसे आसान है, लेकिन एक प्रोटीन एकाग्रता को प्लॉट कर सकता है (µ प्रत्येक मानक के g/µ l) यदि वांछनीय हो । निम्नलिखित गणना, तथापि, एक मानक वक्र माइक्रोग्राम पर आधारित करने के लिए देखें, सांद्रता नहीं (µ g/µ l).
    8. प्रत्येक मानक अच्छी तरह से (तालिका 1) में मौजूद प्रोटीन की कुल मात्रा के खिलाफ प्रत्येक स्तर के औसत अवशोषण प्लाट । इन डेटा के लिए एक रैखिक प्रतीपगमन रेखा फ़िट करें और प्रत्येक अज्ञात नमूना अच्छी तरह से औसत अवशोषक (आंकड़ा 1a) के आधार पर में प्रोटीन की मात्रा (µ g) की गणना करने के लिए समीकरण का उपयोग ।
      नोट: इस पंक्ति का सहसंबंध गुणांक (r मान) से अधिक ०.९८ और नियमित रूप से ०.९९ के पास होना चाहिए । मानक प्रतिगमन प्रत्येक थाली के लिए विशिष्ट हो जाएगा, इसलिए प्रत्येक थाली में अज्ञात नमूना कुओं अलग से विश्लेषण किया जाना चाहिए ।
    9. एक बार प्रोटीन की औसत मात्रा प्रत्येक अज्ञात नमूना के लिए अच्छी तरह से गणना की है, प्रत्येक मूल नमूने में प्रोटीन की कुल मात्रा (µ g) की गणना करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
      Mp = (((Wp/६०) x 1000)/50) * 1000
      एमपी = मूल नमूना में प्रोटीन की µ जी
      डब्ल्यूपी = अज्ञात नमूना में प्रोटीन के µ जी अच्छी तरह से
      1. फिर, प्रत्येक नमूने में प्रोटीन का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
        पी पी = ((एमपी1000//M)* १००
        पीपी = नमूना में% प्रोटीन
        एमआइ = प्रारंभिक मास का नमूना (mg)
        नोट: कुछ मामलों में, नमूना ऊपरी अवशोषक थ्रेशोल्ड को पार कर सकता है । यदि ऐसा है, तो नमूना समाधान चरण 2.4.3 पर आगे कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है ।
        इसके बाद की गणना में अतिरिक्त कमजोर पड़ने के लिए जवाबदेह होना चाहिए । कुछ microplate रीडर ब्रांड भी कंप्यूटर सॉफ्टवेयर है कि स्वचालित रूप से प्रत्येक अज्ञात नमूना मानक वक्र डेटा के आधार पर की औसत प्रोटीन एकाग्रता की गणना करेगा प्रदान करते हैं ।

3. सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट परख

  1. नमूना तैयारी
    1. बाहर वजन प्रत्येक ऊतक के नमूने दोहराने, लगभग 20 मिलीग्राम प्रत्येक, गिलास में 15 रबर के साथ एमएल ट्यूबों-स्क्रू कैप्स (१०० mm लंबाई) । इन सैंपल को बाद में अज्ञात नमूनों के रूप में भेजा जाएगा । एक निविड़ अंधकार मार्कर के साथ या ढक्कन पर लेबलिंग टेप के साथ Label ट्यूबों और प्रत्येक नमूने के सटीक द्रव्यमान रिकॉर्ड, के रूप में इस जानकारी के प्रत्येक अज्ञात नमूने में% कार्बोहाइड्रेट की गणना करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.
  2. प्रत्येक अज्ञात नमूने से सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट निकालें.
    1. ०.१ एम एच2तो4 प्रत्येक ट्यूब और पेंच टोपियां पर कसकर ट्यूब के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ें । 1 घंटे के लिए एक उबलते पानी स्नान में जगह है ।
      सावधानी: सल्फर एसिड बहुत संक्षारक है । कृपया दस्ताने, आंख गूगल पहनते हैं, और एक एप्रन जब एच2हैंडलिंग तो4 और एक धुएं डाकू में इस कदम प्रदर्शन करते हैं ।
    2. एक गुनगुना पानी स्नान में बंद ट्यूबों कूल । १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों लेबल में ट्यूब सामग्री डालो (अगर कुछ संयंत्र सामग्री कांच ट्यूबों में रहता है चिंतित नहीं है) ।
    3. १५,००० x जी पर 10 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक । एक माइक्रो pipettor के साथ supernatant तरल निकालें और नए लेबल १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में जगह है । ट्यूबों इस बिंदु पर रात भर प्रशीतित किया जा सकता है । यदि परख के साथ जारी रखने के लिए, कदम 3.3.2 का संदर्भ लें ।
  3. मिश्रण मानक समाधान और अज्ञात नमूनों की कुल पच कार्बोहाइड्रेट सामग्री मात्रा ।
    1. D (+) तालिका 2में सूचीबद्ध सांद्रता के साथ ग्लूकोज मानक समाधान तैयार करें । प्रत्येक मानक समाधान के ४०० µ एल के साथ छह ग्लास टेस्ट ट्यूब तैयार करें ।
    2. पिपेट 15 µ एल प्रत्येक अज्ञात नमूना के अपने स्वयं के परीक्षण ट्यूब में जोड़ने और ३८५ µ l आसुत पानी की एक कुल मात्रा के लिए प्रत्येक में ४०० µ l प्रत्येक परीक्षण ट्यूब. एक धुएं डाकू में, प्रत्येक मानक और अज्ञात नमूना परीक्षण ट्यूब के लिए 5% phenol के ४०० µ एल जोड़ने के लिए, और फिर जल्दी से एक ट्यूब में तो4 केंद्रित एच2के 2 मिलीलीटर पिपेट । पिपेट टिप के साथ परीक्षण ट्यूब सामग्री को छूने मत करो, बस समाधान सतह (एक पुनरावर्तक पिपेट इस के लिए सबसे अच्छा काम करता है) में जोड़ें ।
    3. चलो ट्यूबों 10 मिनट के लिए मशीन, और फिर सावधानी से ट्यूबों मिश्रण सामग्री के भंवर । एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए मशीन ।
      सावधानी: Phenol और सल्फर एसिड संक्षारक अड़चनें हैं । त्वचा, आंखों के लिए जोखिम से बचाने के लिए, और साँस लेना, यह कदम एक रासायनिक धुएं में प्रदर्शन किया जाना चाहिए हूड उचित पीपीई का उपयोग कर, जिसमें शामिल हैं: चेहरा ढाल या आंख चश्मे, रबर के दस्ताने, लैब एप्रन, और जूते. सल्फर एसिड के साथ phenol मिश्रण भी एक अमबर प्रतिक्रिया में परिणाम है, जो ट्यूबों गर्म होता जा रहा में परिणाम होगा ।
    4. पिपेट ८०० प्रत्येक ट्यूब से नमूने के µ एल 3 polystyrene १.५ मिलीलीटर अर्द्ध माइक्रो cuvettes में से प्रत्येक में (3 तकनीकी नकल नमूना) । ४९० एनएम पर पढ़ने के लिए spectrophotometer सेट करें । मानक या अज्ञात नमूनों को पढ़ने से पहले आसुत जल युक्त एक खाली cuvette करने के लिए जांचना, और आवर्तक रूप भर में नमूना रीडिंग. एक spectrophotometer के माध्यम से प्रत्येक cuvette चलाने और अवशोषक रिकॉर्ड । प्रत्येक अज्ञात नमूने के लिए तकनीकी में औसत प्रतिकृति ।
      नोट: कुछ मामलों में, नमूने ऊपरी अवशोषक सीमा पार कर सकते हैं । यदि ऐसा है, नमूने कदम 3.2.3 पर पतला किया जाना चाहिए । कमजोर पड़ने के बाद की गणना में भी के लिए जवाबदेह होना चाहिए ।
    5. प्रत्येक मानक के लिए औसत अवशोषक की गणना ।
      नोट: मानक वक्र का उपयोग करते हुए प्रत्येक अज्ञात नमूने में मौजूद कुल सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट की मात्रा की गणना करने के लिए, प्रत्येक मानक में D (+) ग्लूकोज के प्रत्येक मानक के मुकाबले औसतन निकासी का औसत अवशोषण करना सबसे आसान है, लेकिन एक भी कर सकते हैं प्लॉट D (+) ग्लूकोज एकाग्रता (µ g/µ l) प्रत्येक मानक के वांछनीय है । निम्नलिखित गणना, तथापि, एक मानक वक्र माइक्रोग्राम पर आधारित करने के लिए देखें, सांद्रता नहीं (µ g/µ l).
    6. प्रत्येक मानक समाधान में D (+) ग्लूकोज (µ g) की कुल राशि के खिलाफ औसत अवशोषक साजिश रचने के द्वारा मानक वक्र की गणना । इन डेटा के लिए एक रेखीय प्रतीपगमन रेखा फ़िट करें, और उसके बाद प्रत्येक अज्ञात नमूने में कार्बोहाइड्रेट (µ g) की कुल मात्रा की गणना करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
      एमसी = (((Ax – b)/m)/(15)) * 1000
      एमसी = µ जी के सैंपल में कार्बोहाइड्रेट की
      अज्ञात नमूना का एकx = औसत अवशोषित
      b = y-अवरोधन (मानक प्रतीपगमन रेखा)
      m = ढलान (मानक प्रतिगमन लाइन)
      इस पंक्ति का सहसंबंध गुणांक ०.९८ से अधिक होना चाहिए और ०.९९ के पास नियमित रूप से होना चाहिए । फिर, प्रत्येक नमूने में कार्बोहाइड्रेट का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
      पीसी = ((एमसी/1000)/(एमआई)) * १००
      पीसी =% कार्बोहाइड्रेट
      एमआइ = प्रारंभिक मास का नमूना (mg)

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Representative Results

इन तरीकों की उपयोगिता दिखाने के लिए, हम चार अलग क्षेत्र और sweetcorn ऊतकों कि कीट शाकाहारी के लिए विशिष्ट संभावित पोषण संसाधनों के रूप में सेवा के घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री का विश्लेषण किया । हम तीन संयुक्त राज्य अमेरिका (मिनेसोटा, उत्तरी कैरोलिना, और टेक्सास) में कृषि क्षेत्रों से मकई के कान एकत्र, मीठी मकई के पांच विभिंन किस्मों को शामिल (यानी, पादी) और एक समूह के रूप में क्षेत्र मकई की एक किस्म । तालिका 3 इन मकई के नमूनों का सारांश दिखाता है और वे कहां एकत्र किए गए थे । सभी किस्मों परिपक्वता पर एकत्र किए गए, लेकिन किस्मों के बीच विकासात्मक मतभेदों के कारण, वे एक ही दिन में रोपण के बाद सभी एकत्र नहीं थे । हम तुरंत भूसी को अलग (संशोधित पत्तियों सिल चारों ओर से अलग ऊतकों में कान संसाधित), और रेशम (भूसी और गुठली के बीच चमकदार फाइबर) पर सभी ऊतकों को भंडारण से पहले कान से-८० ° c तरीकों में संकेत के रूप में । प्रत्येक ऊतक तो फ्रीज-सूख गया था । एक बार सूख गया, हम आधार और कान के टिप से गुठली बंद शेविंग ऊपर एक तिहाई से (टिप) और नीचे एक तिहाई (आधार) सिल के नीचे से गुठली अलग कर दिया । अगले, सभी ऊतकों एक ठीक पाउडर में जमीन थे । हम तो भूसी, रेशम, टिप कर्नेल, और बेस कर्नेल ऊतक नमूनों के लिए घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री के लिए ऊपर के तरीकों में उल्लिखित प्रक्रियाओं के अनुसार विश्लेषण किया । उपलब्ध ऊतक की राशि पर बाधाओं को देखते हुए, हम दोनों घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री के लिए २१७ संयंत्र के नमूनों की कुल विश्लेषण किया ।

घुलनशील प्रोटीन
हम कुल में spectrophotometer के माध्यम से नौ नमूना प्लेटें भाग गया, और कुल मिलाकर, मानक curves उच्च सहसंबंध गुणांक (r), 0.985-1.00 के बीच मूल्यों के साथ था । चित्रा 1 उच्चतम (ए) और सबसे कम (ख) आर मूल्यों के साथ प्राप्त की परिवर्तनशीलता हम प्लेटों में मनाया प्रदर्शित करने के लिए मानक वक्र से पता चलता है । हम प्रारंभिक नमूना द्रव्यमान (तालिका 4) का उपयोग कर सभी नमूनों के लिए% घुलनशील प्रोटीन की गणना और फिर क्षेत्रों, किस्मों, और ऊतक प्रकार के बीच घुलनशील प्रोटीन सामग्री में सांख्यिकीय मतभेदों के लिए डेटा का विश्लेषण किया । डेटा रैंक-जब आवश्यक सामान्यीकृत मांयताओं को पूरा करने के लिए बदल रहे थे ।

हम क्षेत्रों के बीच घुलनशील प्रोटीन सामग्री में महत्वपूर्ण अंतर मनाया (वेल्च ANOVA; एफ(2, १३३.५) = ४.३०३, पी = ०.०१५), एक परिणाम के रूप में, प्रत्येक क्षेत्र से डेटा बाद में अलग से विश्लेषण किया गया । मिनेसोटा नमूनों विविधता और घुलनशील प्रोटीन सामग्री पर ऊतक प्रकार के बीच एक महत्वपूर्ण संपर्क (दो तरह ANOVA दिखाया; एफ(3, ६४) = १६.५१, पी < ०.००१) । अधिकांश ऊतकों दोनों किस्मों में समान घुलनशील प्रोटीन सामग्री, आधार गुठली, जहां स्वीट कॉर्न किस्म के लगभग 7 गुना क्षेत्र मकई किस्म की तुलना में राशि समाहित के अलावा था । क्षेत्र मकई किस्म (Syngenta/NK-3122A-ईज़ी) के लिए, भूसी और रेशम समान थे और सभी ऊतकों की सबसे कम घुलनशील प्रोटीन सामग्री थी । कान की नोक से गुठली सबसे अधिक घुलनशील प्रोटीन सामग्री थी, और कान के आधार से गुठली मध्यवर्ती (चित्रा 2a) थे । मीठी मकई किस्म (प्रोविडेंस Bicolor) के लिए, सभी ऊतकों अलग थे, भूसी और सबसे कम घुलनशील प्रोटीन सामग्री युक्त रेशम के साथ, और आधार कर्नेल में निहित ~ २.५ बार टिप गुठली (चित्रा बी) से अधिक ।

उत्तरी कैरोलिना के नमूनों में भी विविधता और ऊतक प्रकार के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत (दो तरह ANOVA दिखाया; एफ(3, ७७) = ३.३३, पी < ०.०२४) । ज्यादातर ऊतकों किस्मों भर में समान घुलनशील प्रोटीन सामग्री, टिप गुठली जो गैर में एक उच्च सामग्री-बीटी किस्म (मीठी G90 संकर) का प्रदर्शन के अलावा दिखाया । बीटी किस्म के लिए (Seedway बीटी १५७६) भूसी सबसे कम घुलनशील प्रोटीन सामग्री के साथ ऊतक थे, रेशम और टिप गुठली है, जो एक समान सामग्री थी द्वारा पीछा किया । आधार गुठली सबसे अधिक घुलनशील प्रोटीन सामग्री थी, लेकिन नहीं थे कि टिप गुठली (चित्रा 2c) से सांख्यिकीय अलग । गैर मेंबीटी किस्म (मीठे G90 संकर), सभी ऊतकों टिप और आधार गुठली जो सांख्यिकीय समान थे के अलावा अलग थे । भूसी सबसे कम घुलनशील प्रोटीन सामग्री, रेशम के बाद था, और टिप और आधार गुठली जो उच्चतम सामग्री (चित्रा 2d) था ।

टेक्सास नमूनों किस्मों के बीच घुलनशील प्रोटीन सामग्री में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया (दो तरह ANOVA; एफ(1, ७६) = १२.९१, पी = ०.००१) और ऊतकों (दो तरह ANOVA; F(3, ७६) = २१.९०, P < ०.००१), लेकिन कोई महत्वपूर्ण सहभागिता (दो-तरफ़ा ANOVA; एफ(3, ७६) = ०.४३६, पी = ०.७२८) । कुल मिलाकर, bicolor किस्म (Sh2 SS2742 NAT III) ने सिल्वर क्वीन वेरायटी (TRTD F1 (सु)) की तुलना में कम औसत घुलनशील प्रोटीन कंटेंट दिखाया । दोनों किस्मों के पार, भूसी सबसे कम प्रोटीन सामग्री थी, रेशम के बाद, और फिर टिप और आधार गुठली, दोनों जिनमें से इसी तरह उच्च सामग्री (चित्रा 2e-एफ) था ।

सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट
क्योंकि सभी नमूनों एक समय में विश्लेषण किया गया, हम केवल एक मानक वक्र भाग गया । चित्रा 1c से पता चलता है कि सहसंबंध गुणांक उच्च था, ०.९९८ पर । हमने सभी नमूनों (तालिका 5) के लिए% सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री की गणना की और फिर क्षेत्रों, किस्मों और ऊतक प्रकारों के बीच सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री में सांख्यिकीय अंतर के लिए डेटा का विश्लेषण किया. डेटा रैंक-बदल रहे थे जब सामांय मांयताओं को पूरा करने के लिए आवश्यक है ।

क्षेत्रों के बीच में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे (ANOVA; एफ(2, २१६) = १.४७, पी = ०.२३१), लेकिन प्रोटीन के साथ निरंतरता के लिए विश्लेषण हम फिर से प्रत्येक क्षेत्र से अलग से डेटा का विश्लेषण किया । मिनेसोटा नमूनों किस्मों के बीच पच कार्बोहाइड्रेट सामग्री में कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाया (दो तरह ANOVA; एफ(1, ६४) = ०.०००१४, पी = ०.९९०) या ऊतक प्रकार (दो तरह ANOVA; एफ(3, ६४) = ०.८१८, पी = ०.४८९) । वहां भी था विविधता और ऊतक के बीच कोई महत्वपूर्ण बातचीत (दो तरह ANOVA; एफ(3, ६४) = २.२६, पी = ०.०९२) । चित्र 2a -बी से पता चलता है कि सभी ऊतकों ३६.५% (± ०.५३) के एक औसत सामग्री का प्रदर्शन किया ।

उत्तरी कैरोलिना के नमूनों पच कार्बोहाइड्रेट सामग्री पर ऊतक प्रकार का एक महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाया (दो तरह ANOVA; एफ(3, ७७) = ३.९९, पी = ०.०११), लेकिन विविधता का कोई प्रभाव नहीं (दो तरह ANOVA; एफ(1, ७७) = १.०६, पी = ०.३०७) या बातचीत (दो तरह ANOVA; एफ(3, ७७) = ०.४६५, पी = ०.७०८) । चित्र 2c -डी से पता चलता है कि रेशमी सबसे कम पच कार्बोहाइड्रेट सामग्री, भूसी, टिप गुठली, और आधार गुठली के बाद किया था । सभी ऊतकों रेशम और आधार गुठली के अलावा सांख्यिकीय समान थे ।

टेक्सास नमूनों में विविधता का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं दिखाया (दो तरह ANOVA; एफ(1, ७६) = ०.८३४, पी = ०.३६४) या ऊतक प्रकार (दो तरह ANOVA; एफ(3, ७६) = १.०३, पी = ०.३८५), लेकिन एक महत्वपूर्ण बातचीत (दो तरह ANOVA दिखा दिया; एफ(3, ७६) = ३.३४, पी = ०.०२४) । यह प्रभाव काफी हद तक था क्योंकि bicolor किस्म में आधार गुठली (Sh2 SS2742 NAT III) चांदी की रानी किस्म (TRTD F1 (सु)) में उन लोगों की तुलना में एक काफी अधिक सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री थी । चित्रा 2e -f से पता चलता है कि चांदी की रानी किस्म (TRTD F1 (सु)) में ऊतक प्रकार के पार पच कार्बोहाइड्रेट सामग्री में कोई सांख्यिकीय मतभेद थे, लेकिन bicolor किस्म के लिए रेशम और बेस कर्नेल के ऊतकों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर था ( Sh2 SS2742 नात III).

Figure 1
चित्र 1. macronutrient परख के लिए मानक घटता । (एक) घुलनशील प्रोटीन परख के लिए मानक वक्र उच्चतम सहसंबंध गुणांक (उत्तम वक्र) के साथ थाली दिखा । (ख) घुलनशील प्रोटीन परख के लिए मानक वक्र सबसे कम सहसंबंध गुणांक के साथ थाली दिखा (सबसे अधिक वक्र) । (ग) पच कार्बोहाइड्रेट परख के लिए मानक वक्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए% घुलनशील प्रोटीन और% पच कार्बोहाइड्रेट सामग्री का मतलब । (A) mn- बीटी Syngenta/NK-3122A-ईज़ी (फील्ड कॉर्न), (B) MN-non-बीटी प्रोविडेंस Bicolor, ( C) नेकां-Seedway बीटी १५७६, (D) नेकां-गैर-बीटी स्वीट G90 हाइब्रिड, (E) TX-Sh2 SS2742 F1 NAT III Bicolor, (च) TX-सिल्वर क्वीन TRTD F1 (सु) । हलकों कच्चे डेटा दिखाने के लिए, जबकि चौकों मतलब मूल्यों को दिखाते हैं । हरा (भूसी), लाल (रेशम), पीला (टिप गुठली), और बैंगनी (आधार गुठली) । प्रत्येक वर्ग के लिए मूल को जोड़ने बिंदीदार लाइनों प्रत्येक ऊतक के लिए P:C अनुपात दिखाने के (अनुपात बिंदीदार रेखा की ढलान है) । पत्र के साथ शीर्ष और कार्बोहाइड्रेट अंतर के साथ प्रोटीन मतभेदों के लिए पोस्ट हॉक परिणाम, विभिंन ऊतकों में महत्वपूर्ण विभिंन मूल्यों का प्रतिनिधित्व पत्र के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

आईजीजी एकाग्रता (यूजी/ मानक नमूनों में प्रोटीन (यूजी)
०.०००० 0
०.०१२५ 2
०.०२५० 4
०.०३७५ 6
०.०५०० 8
०.१००० 16

तालिका 1. घुलनशील प्रोटीन परख के लिए मानक वक्र गणना । प्रत्येक मानक में प्रोटीन की मात्रा प्रत्येक मानक की एकाग्रता लेने और एक अच्छी तरह से (१६० µ एल) में मानक समाधान की मात्रा के द्वारा इसे गुणा करने के द्वारा की गणना की है ।

D (+) ग्लूकोज एकाग्रता (यूजी/ डी (+) मानक नमूनों में ग्लूकोज (यूजी)
०.०००० 0
०.०३७५ 15
०.०७५० 30
०.११२५ ४५
०.१५०० ६०
०.१८७५ ७५

तालिका 2. पच कार्बोहाइड्रेट परख के लिए मानक वक्र गणना । प्रत्येक मानक में ग्लूकोज की मात्रा प्रत्येक मानक की एकाग्रता लेने और प्रत्येक टेस्ट ट्यूब (४०० µ एल) में मानक समाधान की मात्रा के द्वारा इसे गुणा करने के द्वारा की गणना की है ।

क्षेत्र किस्म स्थान एन
मिनेसोटा बीटी Syngenta/NK-3122A-ईज़ी (फील्ड कॉर्न) Rosemount, MN (४४.७०७०,-९३.१०७३) 10
गैर-बीटी प्रोविडेंस Bicolor Rosemount, MN (४४.७०७०,-९३.१०७३) 10
नॉर्थ कैरोलिना गैर-बीटी स्वीट G90 हाइब्रिड रॉकी पर्वत, नेकां (३५.८९१८,-७७.६७८०) 10
Seedway बीटी १५७६ Edenton, नेकां (३६.१७५८,-७६.७०५७) 10
टेक्सास Sh2 SS2742 F1 णत III Bicolor Lubbock, TX (३३.६९३५,-१०१.८२४९) 10
सिल्वर क्वीन TRTD F1 (सु) Lubbock, TX (३३.६९३५,-१०१.८२४९) 10

तालिका 3. मकई नमूना स्थान और किस्मों का सारांश । भूसी, रेशम, टिप गुठली, और आधार गुठली: प्रत्येक क्षेत्र और विविधता संयोजन के लिए, 10 कान और एकत्र किए गए चार ऊतकों का विश्लेषण किया गया ।

क्षेत्र किस्म % घुलनशील प्रोटीन
भूसी रेशमियाँ टिप कर्नेल बेस कर्नेल
मिनेसोटा बीटी Syngenta/NK-3122A-ईज़ी (फील्ड कॉर्न) ३.२९ ± ०.३८ ४.५७ ± १.२७ १४.७४ ± १.५४ ७.०७ ± ०.८४
गैर-बीटी प्रोविडेंस Bicolor ३.३५ ± ०.५८ ६.७१ ± ०.७० १७.८७ ± ३.८५ ४८.४१ ± २.८५
नॉर्थ कैरोलिना गैर-बीटी स्वीट G90 हाइब्रिड २.९० ± ०.६० ६.९७ ± ०.६३ १२.९५ ± ०.८६ १२.२३ ± ०.८३
Seedway बीटी १५७६ ५.४८ ± ०.७३ ९.०८ ± ०.६२ १०.७५ ± ०.९३ १२.७६ ± १.१६
टेक्सास Sh2 SS2742 F1 णत III Bicolor ७.७४ ± १.०३ १२.१५ ± ०.६३ १४.७९ ± ०.६९ १४.८८ ± ०.४८
सिल्वर क्वीन TRTD F1 (सु) ६.०६ ± १.०५ ८.१७ ± ०.७९ १२.९५ ± १.१९ १२.३२ ± १.२३

तालिका 4. प्रत्येक क्षेत्र, विविधता, और ऊतक प्रकार के लिए प्रोटीन मान मतलबहै । मतलब प्रतिशत (शुष्क जन द्वारा) ± 1 एसई दिखाया गया है ।

क्षेत्र किस्म % पच कार्बोहाइड्रेट्स
भूसी रेशमियाँ टिप कर्नेल बेस कर्नेल
मिनेसोटा बीटी Syngenta/NK-3122A-ईज़ी (फील्ड कॉर्न) ३७.५५ ± ०.८८ ३२.३१ ± १.३८ ३६.७९ ± १.६० ३८.६६ ± १.५७
गैर-बीटी प्रोविडेंस Bicolor ३७.३० ± ०.८२ ३७.३१ ± २.३० ३५.८० ± १.७७ ३४.८३ ± १.३७
नॉर्थ कैरोलिना गैर-बीटी स्वीट G90 हाइब्रिड ३५.७९ ± ०.८१ ३५.२८ ± १.१७ ३६.१३ ± ०.९१ ३९.४७ ± १.१८
Seedway बीटी १५७६ ३५.७५ ± ०.५८ ३४.९१ ± ०.७६ ३५.७३ ± १.३५ ३७.२९ ± १.१३
टेक्सास Sh2 SS2742 F1 णत III Bicolor ३५.५५ ± ०.८७ ३३.४० ± १.१० ३४.८५ ± १.०१ ३९.१४ ± १.२२
सिल्वर क्वीन TRTD F1 (सु) ३४.६३ ± १.१३ ३३.४२ ± २.३३ ३५.१६ ± १.१६ ३३.९३ ± १.०३

तालिका 5. प्रत्येक क्षेत्र, विविधता, और ऊतक प्रकार के लिए कार्बोहाइड्रेट मान का मतलब है । मतलब प्रतिशत (शुष्क जन द्वारा) ± 1 एसई दिखाया गया है ।

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Discussion

अच्छी तरह से संयोजन-प्रभावी संयंत्र विशिष्ट निष्कर्षण प्रोटोकॉल के साथ वर्णमिति परख की स्थापना की, परख यहां का प्रदर्शन किया संयंत्र घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री को मापने के लिए एक उचित और सटीक तरीका प्रदान करते हैं । हमारे एक अनुकरणीय के रूप में मकई का उपयोग परिणाम दिखाता है कि कैसे इन प्रोटोकॉल विभिंन जैविक तार्किक-प्रासंगिक स्थानिक तराजू भर में सटीक माप प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हम भौगोलिक क्षेत्रों, किस्मों (या पादी), ऊतक प्रकार, और यहां तक कि स्थानिक अलग ऊतकों के बीच घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री के संयंत्र में अंतर का पता लगाने में सक्षम थे । दोनों परख आम प्रयोगशाला उपकरण और रिएजेंट का उपयोग किया जा सकता है, केवल बुनियादी प्रयोगशाला कौशल की आवश्यकता होती है, और एक छोटी समय सीमा के भीतर नमूनों की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या (50-75) का विश्लेषण कर सकते हैं ।

हालांकि प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, कुछ कदम दूसरों की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण हैं, और अगर गलत तरीके से किया परिणाम की सटीकता को सीमित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, यह आवश्यक है कि संयंत्र सामग्री ठीक से नमूना चरण के दौरान नियंत्रित किया जाता है । यहां तक कि विच्छेदित संयंत्र ऊतक चयापचय सक्रिय रहेगा जब तक एक घातक तापमान उजागर, और इस अवधि के दौरान संयंत्र macronutrient सामग्री बदल सकते हैं । एक परिणाम के रूप में, संयंत्र नमूना और ठंड (या तो तरल एन या फ्रीजर भंडारण द्वारा) के बीच लंबे समय अवधि की संभावना है कि नमूना संयंत्र macronutrient सामग्री नमूना के समय मौजूद था सामग्री को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है बढ़ा सकते हैं ।

कदम 2.3.3- -6 प्रोटीन प्रोटोकॉल में एक सफल परिणाम के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं, इन कदमों के रूप में उपजी प्रोटीन के साथ सौदा । देखभाल प्रोटीन गोली के किसी भी खोने से बचने के लिए जब microcentrifuge ट्यूबों से supernatant टीसीए वैक्यूम कर लिया जाना चाहिए, क्योंकि ऐसा करने से प्रोटीन सामग्री के एक अनुमान में परिणाम होगा । यह भी महत्वपूर्ण है जब एसीटोन के साथ प्रोटीन गोली धोने के लिए ऐसा बहुत जल्दी है । एसीटोन कई सेकंड से अधिक के लिए संपर्क में छोड़ दिया अगर गोली नीचा कर सकते हैं. हम से कम 5 सेकंड के लिए एसीटोन और गोली के बीच संपर्क सीमित सुझाव देते हैं । अंत में, जब गोली सुखाने, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है केवल एसीटोन के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के लिए लुप्त हो जाना । यदि गोली के लिए बहुत लंबे समय के लिए सूखी छोड़ दिया है, यह बहुत NaOH में resuspend मुश्किल हो जाता है । हम 30 मिनट के लिए गोली सुखाने का सुझाव है, और फिर एसीटोन की उपस्थिति के लिए जांच, या तो नेत्रहीन ट्यूब में तरल देख या ध्यान से एसीटोन धुएं की गंध का पता लगाने के द्वारा । हर 10-15 मिनट गोली की जांच जारी रखें जब तक एसीटोन काफूर हो गया है ।

के रूप में ब्रैडफोर्ड १९७६16में उल्लिखित, ठहराव कदम Coomassie शानदार नीले जी २५० डाई का उपयोग कर उच्च संवेदनशीलता के लिए अनुमति देते हैं, केवल 5 µ ग्राम प्रोटीन/एमएल, उच्च प्रोटीन डाई जटिल स्थिरता, और सीमित हस्तक्षेप के एक मानक विचलन के साथ गैर प्रोटीन यौगिकों । यह परख 1-20 µ g कुल प्रोटीन प्रति microplate अच्छी तरह से (कम एकाग्रता परख) या 25 µ g/एमएल की एक अधिकतम के बीच एक पहचान सीमा है; हालांकि, किसी भी एकाग्रता है कि उच्चतम मानक से अधिक है और पतला होना चाहिए फिर से सबसे सटीक परिणाम के लिए विश्लेषण (प्रोटोकॉल के मामले में समाधान की एक अतिरिक्त पैदा करता है इस तरह के कमजोर पड़ने और फिर से विश्लेषण आवश्यक है) । वहां डाई के लिए एक पूर्वाग्रह को तरजीही बुनियादी एमिनो एसिड, जैसे arginine, और सुगंधित एमिनो एसिड अवशेषों को बांध; हालांकि, ब्रैडफोर्ड परख सबसे सटीक और मिश्रित नमूनों में कुल प्रोटीन ठहराव के लिए विधि का उपयोग करने के लिए आसान रहता है ।

पच कार्बोहाइड्रेट परख एक तेजी से, लागत प्रभावी है, और सरल विधि संयंत्र saccharides को बढ़ाता है, जबकि संरचनात्मक कार्बोहाइड्रेट को छोड़कर (जैसे कि फाइबर के रूप में), जो सबसे शाकाहारी द्वारा पच रहे हैं । कार्बोहाइड्रेट परख में सबसे अधिक समस्याग्रस्त कदम कदम 3.2.1 और 3.3.2-3.3.4 हैं । यहां, यह ट्यूब ईमानदार रखने के लिए और screwcaps अच्छी तरह से कस जब उबलते, किसी भी पानी की शुरूआत के नमूनों को पतला और सही ठहराव को प्रभावित करेगा के रूप में महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, देखभाल जब phenol और केंद्रित सल्फर एसिड के साथ काम कर लिया जाना चाहिए, के रूप में दोनों उच्च संक्षारक हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हम ४९० एनएम पर नमूना अवशोषक रिकॉर्डिंग की वकालत, जो hexoses के लिए अधिकतम अवशोषित है, लेकिन नहीं अंय शर्करा, जैसे pentoses और uronic एसिड जो ४८० एनएम20,21पर एक अधिकतम अवशोषित है । संयंत्र के नमूनों में चीनी मिश्रण के लिए, ४९० एनएम समग्र कार्बोहाइड्रेट सामग्री22,23,24को बढ़ाता है के लिए एक उपयुक्त तरंग दैर्ध्य प्रदान करता है, लेकिन विभिंन शर्करा की एक अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए20देखते हैं, 21. शी. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि मासुको एट अल. 23 phenol-सल्फर अम्ल कार्बोहाइड्रेट विश्लेषण के लिए एक सुव्यवस्थित microplate विधि प्रदान करता है ।

संयंत्र पोषक तत्व सामग्री25,26,27 का आकलन करने के लिए एक अंय उल्लेखनीय विधि के पास है अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (NIRS) । NIRS प्रौद्योगिकी व्यापक रूप से कृषि और खाद्य उत्पादन में प्रयोग किया जाता है । इस वैकल्पिक तकनीक आक्रामक, विनाशकारी है, किसी भी गीले रसायन विज्ञान पद्धति में शामिल समय का एक अंश लेता है, और संयंत्र के ऊतकों के एक व्यक्ति के टुकड़े को एक परिदृश्य से अलग तराजू पर लागू किया जा सकता है । इस तकनीक के उपायों को परोक्ष रूप से पोषक तत्वों और अंशांकन के लिए ब्याज की संयंत्र रासायनिक की सटीक गीला रसायन विज्ञान माप पर निर्भर करता है । यहां वर्णित तरीके इसलिए संयंत्र पोषक तत्व विश्लेषण के भविष्य में एक महत्वपूर्ण स्थान होगा, यह सुनिश्चित करना है कि अंशांकन घुलनशील और पच macronutrient ठहराव पर आधारित है और गैर-पोषक मौलिक किराए से पक्षपातपूर्ण नहीं है ।

संयंत्र घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री को मापने के लिए प्रस्तुत तरीकों पर्यावरण और जैविक विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं । संयंत्र के ऊतकों की मौलिक संरचना पर जानकारी का खजाना के बावजूद, संयंत्र macronutrient सामग्री पर जानकारी बुरी तरह से कमी है । सीमाओं कि macronutrient सामग्री के साथ correlating मौलिक उपायों में मौजूद है और संयंत्र पोषक तत्वों की सामग्री और उच्च क्रम पारिस्थितिकी प्रक्रियाओं के बीच मजबूत संबंध मानने को देखते हुए, इस तरह के डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है संयंत्र फिजियोलॉजी, पोषण पारिस्थितिकी, संयंत्र-शाकाहारी बातचीत, खाद्य-वेब गतिशीलता11,28,29,30के क्षेत्रों को आगे बढ़ाने । यह हमारी आशा है कि संयंत्र घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री को मापने के लिए एक स्पष्ट और पंहुचा पद्धति प्रदान करने के लिए शोधकर्ताओं ने भविष्य के अनुसंधान में इस तरह के डेटा इकट्ठा करने और शामिल करने के लिए प्रोत्साहित करेंगे ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हमारे सहयोगियों, जो मीठे मकई क्षेत्र संग्रह के साथ उत्तरी कैरोलिना राज्य विश्वविद्यालय में डोमिनिक Reisig और दान Mott सहित, और पैट पोर्टर Lubbock, TX में टेक्सास में एक और एम विश्वविद्यालय में सहायता प्रदान की है के सभी के लिए धंयवाद । प्रोटोकॉल का अनुकूलन और इस पांडुलिपि को संपादन प्रदान करने के लिए मदद करने के लिए Fiona Clissold के लिए धंयवाद । इस काम के हिस्से में टेक्सास ए एंड एम सी Everette Salyer फैलोशिप (Entomology विभाग) और जैव प्रौद्योगिकी जोखिम मूल्यांकन अनुदान कार्यक्रम के भाग में समर्थित किया गया था अमेरिका के कृषि विभाग से प्रतिस्पर्धी अनुदान no. 2015-33522-24099 (गैस के लिए संमानित किया और STB) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
microplate reader (spectrophotometer) Bio-Rad Model 680 XR
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate Bio-Rad #5000006 450mL

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक १३८ Macronutrients पोषण herbivory कृषि ज्यामितीय ढांचा कीट फिजियोलॉजी
संयंत्र घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री को बढ़ाता है, एक अनुकरणीय के रूप में मकई (<em>Zea mays</em>) का उपयोग
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Deans, C. A., Sword, G. A., Lenhart, … More

Deans, C. A., Sword, G. A., Lenhart, P. A., Burkness, E., Hutchison, W. D., Behmer, S. T. Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar. J. Vis. Exp. (138), e58164, doi:10.3791/58164 (2018).

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