Summary
Этот протокол описывает ковалентной иммобилизации белков с heterobifunctional силана муфта агент поверхности оксида кремния, предназначенные для атомно-силовой микроскопии основанные одной молекулы силой спектроскопии который подтверждается взаимодействие RrgA (pilus-1 Cовeт принимает из S. pneumoniae) с фибронектин.
Abstract
В последние годы атомно-силовой микроскопии (АСМ) на основе одной молекулы силой спектроскопии (SMF) расширить наше понимание молекулярных свойств и функций. Это дало нам возможность исследовать разносторонность биофизических механизмов, например, как бактериальные адгезины привязку к поверхности рецепторы принимающей более подробно. Среди прочих факторов успех экспериментов SMF-функции зависит от функциональных и родной иммобилизации биомолекул интерес на твердых поверхностях и AFM советы. Здесь мы опишем простой протокол для ковалентной сцепления белков на поверхности кремния с помощью силана PEG-carboxyls и устоявшихся химии N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/ГСЗ) в порядке изучение взаимодействия pilus-1 принимает RrgA от грамположительные бактерии Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) с фибронектин белков внеклеточного матрикса (Fn). Наши результаты показывают, что Функционализация поверхности приводит к равномерное распределение Fn на поверхности стекла и соответствующей концентрации RrgA на кончике консольные AFM, очевидно, от целевого значения до 20% событий взаимодействия во время SMF-функций измерения и показал, что RrgA связывается с Fn средней численностью 52 pN. Протокол можно подобрать пару через сайт конкретных бесплатно тиоловых групп. Это приводит в предопределенных белка или молекулы ориентации и подходит для других биофизических приложений помимо SMF-функции.
Introduction
Рядом с оптические и Магнитные пинцеты атомно-силового микроскопа (AFM)1,2 стала полезным инструментом для анализа и манипулировать молекул и зондировать их свойства и функции, включая их реакции на внешние силы3 ,4. В отличие от методов как assay энзим связанный иммуносорбента (ELISA), поверхности плазмон резонанс (СРП) или кварцевый микровзвешивания (QCM) установок, АСМ позволяет измерить взаимодействия на уровне одной молекулы (SMF)5 и одну ячейку (заявок)6 . Эти технологии принесли ценную информацию в механизмы привязки как поймать облигации, найденных для взаимодействия E. coli pilus белка FimH с7маннозы или тандем β-молния повторяет формируется Fn связывания белков из S. aureus после привязки к Fn8. Недавно мы смогли показать, что принимает pilus-1 RrgA,9,10 из грамположительные бактерии Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 возможность привязки к фибронектин12 с двух терминалов доменов. Это показал новый механизм привязки двух домен, который отличается от тандем β-молния и может позволить piliated пневмококков формировать и поддерживать переходные контактные фибронектин содержащих хост поверхностей13.
Успех SMF-функций экспериментов критически зависит от функциональных и родной иммобилизации биомолекул на твердых поверхностях и AFM советы. Как высокий силы могут произойти во время измерений SMF-функций, белки должны предпочтительно ковалентно сочетаться на поверхности. Существует большое количество методов различных муфта для иммобилизации белков и других биомолекул, а также всей клетки (неорганические) твердых поверхностей, нано частиц и другие устройства, описанные в литературе14,15 ,16,,1718,19,20,21,,2223,24, 25,,2627. Эти протоколы часто делают использование опасных веществ, трудно выполнять и/или требуют специального оборудования (например, чистого плазмы). Простой способ для молекул пара стекла является придавать более толстым слоем полимера heterobifunctional сшиватели с силана реактивной группы на одной стороне и Амин Реактивная группа на их стороне. В зависимости от приложения, агенты сцепления может состоять из гибких гидро углеродной цепи переменной длины, например., полиэтиленгликоля (PEG). Они подавляют неспецифичные взаимодействия изменение поверхностей (например, гидрофобный, электростатического и ван дер Ваальса взаимодействий) и может предоставлять спаренных молекулы вращательных свободы.
Здесь мы описываем общий протокол для ковалентной сцепления белков, содержащих один или более свободные амино группы (-NH2) для стеклянных поверхностей и нитрид кремния AFM советы через heterobifunctional ethoxy силана PEG-карбоксильной (-COOH). Этот протокол может использоваться в SMF-функции экспериментов, которые проявляется на основе взаимодействия RrgA и белков внеклеточного матрикса Fn (см. Рисунок 1 обзор).
Первым шагом является silanization поверхности28,,2930,31. Это включает в себя гидролиз ethoxy групп сцепления агента для того, чтобы сформировать Высокореактивная SiOH групп. Они могут реагировать с SiOH группами на подложке. В первичной конденсации шаг, эти silanols формы водородных связей и распространение на подложке. В реакции конденсации вторичных (который обычно требует тепла или пылесос для удаления воды) образуются силоксановых облигации. Это приводит в слое ковалентно прилагаемый органо силана.
Вторым шагом является муфта белков для функционального (-COOH) групп, которые простираются от полимера32. Во-первых, кислота преобразуется в реактивной эфира N-hydroxysuccinimid (NHS) промежуточные, который достигается через устоявшихся Трансплантология/EDC (1-этил - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid химии33 и подвергается нуклеофильного замещения окончательно сформировать амидных связей с первичных аминов на белки.
Таким образом RrgA был соединен кремния нитрид AFM советы и человека Fn для стеклянных субстратов в случайные ориентации и их взаимодействия сил были проанализированы на уровне одной молекулы. Наши результаты показывают, что описанные химии поверхности приводит к равномерное распределение Fn на поверхности стекла и соответствующей концентрации RrgA на кончике, очевидно, от целевого значения до 20% событий взаимодействия во время измерений SMF-функции. Эта химия уменьшает фон неспецифичные взаимодействия, подлежит мало изменения во время сбора данных и поэтому отлично подходит для точных SMF-функций экспериментов.
Protocol
1. иммобилизации белков через функциональные силана муфта агентов
Примечание: На рисунке 1 дает обзор над химии поверхности, применяемые в настоящем Протоколе.
Предупреждение: В следующий протокол, используются различных химических веществ с кожи раздражающие свойства и агрессивных. Носите надлежащей (кислотоупорные) перчатки, защитные очки и лаборатории пальто и работать под зонта при подготовке решений для того, чтобы избегать вдыхания паров.
- Функционализация стеклянных поверхностей и консольные нитрида кремния с силана муфты агентов
- Удаление грубой пыли и загрязнений от стекла слайды с изопропанол и точностью, безворсовой салфетки и сократить слайды в желаемый размер (необязательно).
Примечание: Помимо стекла, твердой поверхности может быть кремнезем, кварц и оксидов алюминия, меди, олова, титана, железа, хрома, циркония, никеля и цинка.
Предупреждение: Резка стекла слайды может вызвать острые края. - Место стеклышки в окрашивание банку заполнены с соляной кислотой (33% HCl) разбавляют вдвойне дистиллированной воды (ddH2O) до 3-5% (v/v), закройте банку с соответствующим крышкой и поместить его в ультразвуковой ванне 90 мин при комнатной температуре.
Примечание: Используемые jar имеет диаметр 6 см и приблизительный размер 65-70 мл. Соответствующий объем разреженных HCl для jar-50 мл, содержащие 5 мл 33% HCl и 45 мл ddH2O. HCl эффективно удаляет обязательной ионов металлов, особенно натрия, калия и кальция и уменьшает кремния для того чтобы произвести гидроксила насыщенных стеклянной поверхности.
Предупреждение: HCl является коррозионные и раздражает кожу. Носите надлежащей кислотостойкие перчатки, защитные очки и лаборатории пальто и работать под зонта при подготовке решения для того, чтобы предотвратить вдыхание паров. - Место нитрида кремния AFM консольные зонды на слайде чистого стекла с наконечником вверх и облучать с ультрафиолетового излучения от выше, по крайней мере 90 мин.
Примечание: Для одной молекулы силой спектроскопии, подходят кантилеверов с константой номинального весной 0.01 до 0,1 N м-1 . Облучение поверхности консольные с ультрафиолетовым светом удаления органических загрязнителей, главным образом жировых веществ и сделать гидрофильные на одной стороне. Если другая сторона сильно загрязненных - который не должно быть дела, или если консольные зонды используются свежие из коробки поставщиков - это может повлиять на измерение SMF-функции. Тщательная очистка всей консольные чип с помощью Пиранья решения, который был использован в многих исследований34, может помочь.
Предупреждение: Ультрафиолет вреден для глаз; Таким образом облучение консольные зондов должны осуществляться в УФ света герметичной камере. Пиранья решение высокой реакционной способностью и может сжечь кожу, бумаги и других органических материалов. Не использовать пластиковые контейнеры. Если в блюда или банки даже с небольшим количеством органических загрязнений поверхности (например, от предыдущего использования), он может реагировать быстро. - Замена соляной кислоты в окрашивание банку с ddH2O не давая стеклянной поверхности сухой и поместите банку в ультразвуковой ванне еще 10 мин заменить воду два раза за 10 мин соответственно, чтобы должным образом смыть соляной кислоты.
- В то же время, растворяют ethoxy (или метокси) силана полиэтиленгликоль кислоты (Si (OC2H5)3-PEG-COOH) в смеси этанола и ddH2O (v/v 95% / 5%, рН 4,6 скорректирована с уксусной кислотой) до конечной концентрации 0,1 мг мл -1. Хранят раствор, герметично во избежание испарения этанола.
Примечание: Агенты сцепления силана чувствительны к влажности и температуры. Таким образом они должны храниться в атмосфере инертного газа (N2), при низкой температуре (-20 ° C) и сухих условиях. Перед тем как открыть колбу, убедитесь, что силанов достигли комнатной температуры для сведения к минимуму гидратации и тем самым пассивации реактивной групп. Heterobifunctional PEG муфта агенты доступны с множеством различных функциональных групп и прокладку различных длин. Для случайных иммобилизации белков через их свободные амино группы (NH2), как описано в настоящем Протоколе, в дополнение к ethoxy/метокси силана функциональной группы должен быть Эстер NHS. Помимо покупки силана агента с Эстер NHS, простой способ получить такие Эстер NHS является активация Карбоксильная группа (-COOH) с 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) и стоматология (см. раздел 1.2.1. и 1.2.2.).
Предупреждение: Этанол является легковоспламеняющихся и раздражает кожу. Уксусная кислота, легковоспламеняющихся и коррозионных. Заботиться, чтобы не получить реактивной силанов на кожу или в глаза. Носите надлежащего перчатки, защитные очки и лаборатории пальто и работать под зонт для того, чтобы предотвратить вдыхание паров. - Залейте раствор силана в двух отдельных Петри, подготовленный консольные зонды и стеклянных скольжениях в одной чашке Петри соответственно, запечатать герметически (например, парафина), чтобы избежать испарения этанола и инкубировать стационарных 90 мин в комнатной температуре.
Примечание: Оптимальный размер Петри зависит количество зондов консольные и размер стекла слайды, которые должны быть функционализированных. Диаметр размер для хорошей обработки и низкой реагент объем составляет 50-60 мм. Чтобы избежать нежелательных изгиба кантилевера при проникающие через радиоинтерфейс воды консольные должны проводиться на воздух вода интерфейс под углом 90°. При инкубации слайды стекла (но не консольных датчиков) при необходимости может осуществляться на орбитальный шейкер. - Промывайте стекла и консольные слайды в трех последовательных стаканах, содержащих чистый этанол полностью смыть несвязанных силана соединений.
Примечание: Чтобы избежать нежелательных изгиба кантилевера при проникающие через радиоинтерфейс воды, консольные должны проводиться под углом в 90°. - Место функционализированных стекла слайды в окрашивание jar и консольные на чистой стеклянное скольжение и лечения при 110 ° C за 30 мин.
Примечание: Лечить теплом индуцирует образования ковалентной силоксановых связей и удаления воды. Как стекло слайды были только функционализированных на одной стороне, убедитесь, что правильно указывают на мелованной стороне. - Хранение образцов стекла silanized и консольные зондов в вакуум-сушильный шкаф до одной недели.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
- Удаление грубой пыли и загрязнений от стекла слайды с изопропанол и точностью, безворсовой салфетки и сократить слайды в желаемый размер (необязательно).
- Случайные иммобилизации белков на silanized стекла и кремния нитрид консольные
Примечание: Чтобы избежать нежелательных изгиба кантилевера, консольные зонд должны проводиться под углом в 90° во время проникновения любых интерфейсов воздух вода.- Подготовьте раствор содержащего 42 мг мл-1 о EDC и 20 мг мл-1 ГСЗ в стандартных фосфатный буфер (PBS; 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na2HPO4, 1.8 мм х2PO4, рН 7,4).
Предупреждение: EDC коррозионные и раздражает кожу и может вызвать повреждения серьезные глаз. Носите надлежащего перчатки, защитные очки и лаборатории пальто. - Обложка силана покрытием стекла слайды с решением и положить silanized консольные зонды в каплю раствора EDC/Трансплантология и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
Примечание: Для инкубации консольные зондов, подходит в оригинальную коробку консольные. Пара белков через их свободные амино группы для carboxyls (-COOH) агентов силана PEG heterobifunctional, Группа - COOH активируется с широко используемым EDC/NHS химии. EDC пары ГСЗ в карбоновые кислоты, образуя «стабильный» Эстер NHS, который позволяет эффективно сопряжения для первичных аминов при физиологическом рН в следующий шаг. - Промывайте стекла и консольные слайды тщательно с PBS в трех последовательных стаканах для того, чтобы полностью смыть чрезмерное EDC/ГСЗ.
Примечание: Этот шаг Стиральная критичными, как и остальные белки crosslink может EDC/Трансплантология и тем самым изменить их функциональность. - Инкубируйте слайды активированного стекла и консольные зонды в капли раствора желаемого белка в влажной камере при комнатной температуре. Белка концентрацию и инкубации время должно быть адаптированы для удовлетворения требований эксперимента. В общем концентрация между 0,5 – 1 мг мл-1 и инкубации раз от 30 мин до 2 ч подходят для большинства белков. В случае фибронектина (на стеклянное скольжение) и белка RrgA pilus-1 Cовeт (на консольные) Молярная концентрация 1,5 мкм и 3 мкм, соответственно и время инкубации 2 h достаточно.
- Мойте стекло слайды и консольные зондов тщательно PBS в трех последовательных стаканах для того, чтобы смыть unbound протеины.
- Пропитайте оставшиеся Эстер NHS трис (гидроксиметил)-aminomethan, поместив зондов в трис буфер солевой раствор (TBS; 50 мм трис, 150 мм NaCl, рН 7,6) для 20 мин при комнатной температуре.
Примечание: Этот шаг уменьшает нежелательные ковалентных муфты белков между поверхностью функционализированных AFM кончика и стекла, потому что аминогруппами трис можно привязать к оставшихся групп активированные COOH на поверхности консольные и субстрата. - Мойте стекло слайды и консольные зонды тщательно с PBS и хранить их в отдельный Петри охваченных PBS до использования.
Примечание: Образцы должен быть подготовлен свежезаваренным и использовать тот же день.
- Подготовьте раствор содержащего 42 мг мл-1 о EDC и 20 мг мл-1 ГСЗ в стандартных фосфатный буфер (PBS; 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na2HPO4, 1.8 мм х2PO4, рН 7,4).
2. атомно-силовой микроскопии на основе одной молекулы силой спектроскопия
Примечание: В этой работе, был использован в атомно-силовой микроскоп от JPK инструментов и набор ИБП для получения силы расстояние кривых был определен с RampDesigner силой.
- Калибровка консольные с методом теплового шума35
Примечание: Для калибровки консольные, выполните шаг в руководстве завода-изготовителя. Большинство консольные поставщиков государства константу приблизительное Весна, которая обычно рассчитывается от номинального консольные формы (длина, ширина, толщина) и поэтому не очень надежны. Как правильно весной константа имеет решающее значение, рекомендуется выполнять консольные калибровки, описанных ниже, в трех экземплярах и использовать средние значения чувствительности оптической рычаг и весной постоянно. Это может быть полезным для записи консольные прогиб в вольт (V) во время эксперимента и конвертировать его силы (pN) после этого, используя чувствительность оптических рычаг и весной постоянные значения. Чувствительность постоянной и оптических рычаг весной может быть определено до или после эксперимента, как лазер позиция не изменилась на консольные (положение отражено лазер может быть подрегулировано на фотодиод).- Fix на чистый, свежий стеклянное скольжение на держателя образца AFM и покрыть ее с PBS буфера.
Примечание: Калибровка должна осуществляться на твердой поверхности (например, стекла) и в тот же буфер как реальных экспериментов. - Исправить подготовленные консольные зонд на консольные держатель, поместите его в головку AFM и тщательно мокрой консольные с капелькой PBS буфера.
Примечание: Смачивания кантилевера снижает поверхностное натяжение, появляющиеся во время проникновения в буфере PBS на стеклянное скольжение калибровки и тем самым нежелательным изгиба кантилевера. - Медленно перемещайте консольные к поверхности калибровки до тех пор, пока консольные полностью погружен в буфере PBS, но все еще далеко от поверхности калибровки.
- Используйте оптический микроскоп вид сверху АСМ или (если доступно) инвертированным микроскопом под AFM позиционировать лазер AFM на задней стороне кантилевера. Место лазерного пятна в конце кантилевера близко к где находится кончик.
Примечание: Лазер спот должны быть расположены ближе к концу кантилевера, но она все еще должна быть полностью на консольные. Если не оптический микроскоп, использовать кусок бумаги на видимые лазерные диоды или лазерный детектор карты для инфракрасные лазерные диоды, положил его под головку AFM и перемещения лазерной пятно на краю консольно чип, где расположены стороне кантилеверов , пока не увидите пятно на карте бумаги или детектор. Затем переместите лазер параллельно к краю. Когда пятно исчезает, это на руку консольные. Для линейных кантилеверов переместите пятно в конце рычага до тех пор, пока он появляется на карте бумага/детектор и переместить его обратно до тех пор, пока он снова на рычаг (исчезает с карты бумага). Для треугольной, место пятно в середине между двумя ветвями консольные и переместить его в конце кантилевера, до тех пор, пока она исчезает из бумаги/карты. Проверьте, что вы находитесь в середине кантилевера, перемещая пятно перпендикулярно длинной оси кантилевера. - Отрегулируйте положение фотодиод детектор четыре квадранта АСМ таким образом, что отраженного лазерного луча располагается в центре фотодиод.
Примечание: Действуйте следующим: Используйте винты микрометра вблизи диодный детектор для перемещения диод в горизонтальном и в вертикальном направлении, до тех пор, пока сумма сигнала от всех четырех квадрантах развернуто. Затем переместите диод в вертикальном направлении, до тех пор, пока сигнал вертикальное отклонение равно нулю и переместить диод в горизонтальном направлении, до тех пор, пока сигнал боковое отклонение равно нулю. Кремниево-нитридные кантилеверы обычно имеют золотое покрытие и поэтому биметалла с двумя различными коэффициентами теплового расширения. Это приводит к тепловой дрейф (явно в вертикальное отклонение сигнала) особенно в растворе. Чтобы уменьшить этот дрейф во время измерений, пусть сбалансировать на несколько минут перед началом калибровки системы в целом. - Откройте диспетчер калибровки в программе АСМ и откалибровать чувствительность консольные и весной константа кантилевера с методом теплового шума следующим.
- Тщательно подходить к поверхности субстрата и записывать кривой силы расстояние.
- Определите чувствительность оптических рычаг в Нм/V, Фитинг прямой линии до крутой части кривой силы втягивания, где кончик находится в контакте с поверхности субстрата. Чувствительности позволяет преобразовать константа весной консольные pN/Нм.
Примечание: Наклон кривой Ретракция-пьезо путешествия расстояние против. изменение напряжения фотодиод (измеряется в Нм/V). - Запись нескольких спектров тепловой шум консольные с консольно примерно 100 мкм или более от поверхности для того, чтобы исключить любой поверхности демпфирования.
- Определите Весна постоянной консольные в pN/V, приблизив гармонического осциллятора, предоставляемый AFM программное обеспечение теплового шума спектров.
- Медленно втягивать консольные и вывести его из раствора.
- Замену поверхности стекла используется для калибровки консольные с поверхности образца, содержащих иммобилизованные белков. Убедитесь, что консольные и поверхности образца (и таким образом протеины) не сушите при изменении стеклянных скольжениях.
- Fix на чистый, свежий стеклянное скольжение на держателя образца AFM и покрыть ее с PBS буфера.
- Взаимодействие силы эксперименты на уровне одного белка
- Медленно перемещайте влажные консольные к поверхности образца до тех пор, пока консольные полностью покрыта PBS буфера, но все еще далеко от поверхности субстрата.
Примечание: Чтобы уменьшить тепловой дрейф в ходе эксперимента, пусть вся система установить за несколько минут перед началом измерения силы спектроскопии. - Подходить к поверхности и записать несколько кривых силы расстояние (≥ 500) в разных местах поверхности образца, с контактное усилие 250 pN, время контакта 1 s, втягивание длиной 2 мкм и втягивание скорость 1 мкм s-1.
Примечание: Для корректировки общей силы спектроскопии, следуйте руководство изготовителя. Вариации: Скорость втягивания может изменяться от 0,1 до 5 мкм s-1 для вычисления кинетических данных в зависимости от увеличения нагрузки силы. Время взаимодействия может быть изменено для анализа времени зависимых Бонд укрепления. Вместо того чтобы держать скорость втягивания постоянной, один может держать константу сил (силы зажима режим).
- Медленно перемещайте влажные консольные к поверхности образца до тех пор, пока консольные полностью покрыта PBS буфера, но все еще далеко от поверхности субстрата.
- Анализ данных
Примечание: Анализ данных был проведен с использованием программного обеспечения для обработки данных. В зависимости от подвижности белков, время контакта или скорость втягивания, ли след был включен или нет и других переменных параметров сил расстояние кривых содержат несколько различную информацию. Анализа и интерпретации данных может сильно варьироваться между различными СЛУЖБАМИ эксперименты и поэтому не могут быть описаны подробно здесь. Что касается взаимодействия RrgA и Fn следующий протокол может быть первым шагом для анализа данных SMF-функции.- Открыть файлы кривой измерения силы, выбрав значок Открытого пакета из силы сканирования и обрабатывать кривых силы расстояние следующим:
- Преобразуйте отклонения кантилевера (V) прямо пропорционально силе (F), выбрав значок (Re) калибровать V-поворотной регулировки чувствительности и постоянной весной .
Примечание: Если до эксперимента была проведена калибровка консольные, значения сохраняются в силу проверять файлы и автоматически используются во время калибровки V-прогиб. Если после эксперимента была проведена калибровка, программа использует значения по умолчанию, которые могут быть изменены на измеренных значений. - Вычитание базовой Ретракция канала в регионе кривой силы далеко от поверхности, чтобы задать нулевой уровень силы, выбрав значок Вычитание.
Примечание: В некоторых случаях, отзыв не может иметь то же значение постоянной силой и кривая может отображать линейной наклона, который можно удалить, выбрав смещение + тент. - Определите точку, где кончик получает контакт с образца, выбрав значок Связаться точки определения .
- Преобразуйте сигнал высота разделения образца tip, выбрав значок Образца Tip разделения . Помимо вычитания контактной точки позицию, эта процедура вычитает консольные изгиб для расчета расстояния между поверхностью субстрата и AFM-наконечник.
Примечание: Для установки полимер упругой модели, как расширяемая модель червь как цепи и определение длин взаимодействия, разделения образца tip, который корректируется для изгиба кантилевера, необходима. Чтобы определить силу, скорость загрузки наклон кривой силы и скорости z пьезо, следует использовать кривые нескорректированной силы. - Экран следы сил расстояние для силы пиков, происходящих на разрыв длины выше 70 Нм (длина растянутой распорку PEG)36 разобраться неспецифического взаимодействия и применить расширяемой модели червь как цепи на выбранной вершины, выбрав Fit модель цепочки полимера значок и выбрал расширяемые червь как модель цепочки. Пиков на кривой силы втягивания будет устанавливаться с этой моделью и получаются разрыв силы и длины, вместе с упругой параметры полимера.
- Данные выводятся в виде гистограммы, показаны распределения силы и длина. Используйте по крайней мере 100 отмену привязки события для гистограммы.
Representative Results
Протокол описано здесь результаты в ковалентной иммобилизации белков через их доступных первичных аминов с случайные ориентации (рис. 1). Рисунок 2 показывает AFM изображение поверхности стекла silanized с (слева) и без (справа) Fn прикол, записанный после обезвоживания проб под нежный поток азота. Полимерный слой силана показывает только небольшой поверхности гофрами высотой приблизительно 2-5 Нм (рис. 2, право), а на поверхности функционализированных с Fn, приблизительно 10 Нм высокой Fn молекулы являются очевидными (рис. 2, слева). В приближении может быть признано димерной структура Fn. Fn молекулы, как представляется, быть компактным с высоты 4-5 Нм выше PEG покрытия и длиной ~ 120 Нм (см. вставки).
Для изучения взаимодействия сил RrgA с Fn, который был недавно подробно описал в нашей группе13, RrgA был связан наконечник AFM нитрида кремния и человека Fn на стеклянной подложке (рис. 3a). Рисунок 3 показывает представительный Совет пример разделения кривые взаимодействия RrgA с Fn, записанная на потянув скорость 1 мкм s-1. Используемые химии поверхности, привело к более низких фоновых взаимодействия и стройные взаимодействия единого (или двухместный) события (Рисунок 3А), которые были установлены с помощью расширяемой червь как модель цепочки (eWLC) (красные кривые). Построение эпюр результатов fit (разрыв силы и - длина, см. Рисунок 4) показывает, что после преодоления неспецифической поверхности взаимодействия между AFM наконечник и субстрат и растяжения линкеры ПЭГ (> 70 нм), вплоть до ~ 19% силы кривых показан разрыв события с означает разрыв силу для RrgA - Fn взаимодействия ~ 52 pN на расстояниях образца tip около 100 Нм. В отличие от неприменимым химии поверхности (здесь, опущен закалки с трис буфер солевой Рисунок 3b) будет препятствовать четкую оценку событий взаимодействия одного из-за неопределенного взаимодействия, несколько белков, привязки (след 2 и 3) и/или Ковалентный муфта белков между поверхностью образца и кончик консольные AFM. Это приводит к высокой разрыв сил (след 1) возможно в сопровождении разворачивается из доменов протеина (Fn) (след 4 и 5).
Рисунок 1: обзор за химии поверхности. Гидролиз ethoxy силана PEG-карбоксильной следуют его конденсации на поверхности увлажненной стекла и формирование силоксановых сшивки. Реакция EDC с карбоксильной группы приводит к реактивной o- acylisourea, Амин реактивного промежуточного с чрезвычайно короткий период полураспада в водном растворе (гидролиз). Промежуточных стабилизируется формирования Эстер NHS, которая подвергается нуклеофильного замещения сформировать наконец амидных связей с первичных аминов на белки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Иммобилизация фибронектин на стеклянной подложке через heterobifunctional ethoxy силана PEG карбоксильной муфта агент. АСМ изображения функционализированных стеклянных поверхностей с (слева) и без (справа) Fn. цифры указывают отдельные Fn молекулы, которые равномерно распределены на поверхности субстрата (вставки). Молекулы принять димерной и компактная структура с высотой 4-5 Нм выше КОЛЫШЕК покрытие и длиной > 100 Нм. Это очень напоминает структуру Fn в растворе и согласуется с предыдущей AFM данных на других поверхностях, например, Слюда (шкалы бар вставками = 500 Нм)37. Ниже АСМ изображения являются высота профилей по направлениям, указанным в АСМ изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Иллюстрация функций SMF эксперимент и представитель сил расстояние кривые RrgA - Fn взаимодействия. () RrgA и Fn были ковалентно связанного через heterobifunctional ethoxy силана PEG карбоксильной муфта агент нитрида кремния AFM консольные наконечник и поверхности стекла, соответственно. Представитель SMF-функций силу расстояние приведены кривые, полученные для RrgA - Fn взаимодействия со скоростью Ретракция 1 мкм s-1 с описанной иммобилизации RrgA и Fn. Красные кривые представляют подходит расширяемый червь как цепь, применяется для получения силы разрыв и длины. Рисунок был изменен Becke, et al., ACSnano 201813. (b) представитель SMF-функций силу расстояние кривые, полученные для RrgA - Fn взаимодействия без закалки с трис-буфер солевой. В этом случае отсутствовала Первичные амины трис так что остальные активные NHS эфиры остались ненасыщенных во время эксперимента. Это привело к multi белка привязки (след 2 и 3) и зажима белков между поверхностью и кончик AFM, что привело к высокой разрыв сил сопровождаются (Fn-) домена разворачивалась (трассировки 1, 4 и 5; Обратите внимание различных масштабах). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: силу и длина распределения одного RrgA - Fn взаимодействий. Разрывная сила и соответствующий разрыв длина гистограммы, полученные от RrgA - Fn SMF-функций взаимодействия измерений (n = 1400) со скоростью Ретракция 1 мкм s-1. Гистограммы показывают наиболее вероятным разрыв силы fMP 51.6 pN (Гаусс подходят, черная линия) и накопление разрыв длиной около 100 Нм. Рисунок был изменен с Becke, 2018 et al., ACSnano,13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Поскольку введение AFM на основе функций SMF, она превратилась в широко используемый метод непосредственно зондировать интра- и межмолекулярных сил индивидуальных белков, нуклеиновых кислот и других биомолекул3,4,5. Для успешных экспериментов SMF-функции соответствующей поверхности муфты стратегия является обязательным условием. Зонда внутримолекулярной силы в природных и синтетических полимеров, полимеры могут быть напрямую соединен поверхности субстрата и AFM Совет36,,3839,40,41. Для расследования между молекулярных взаимодействий, например молекулярных связей, однако это рекомендуется использовать гибкие компоновщика молекул, таких как гетеро бифункциональных PEG линкеры или полипептидных цепей, чтобы прикрепить взаимодействия партнеров к кончику AFM и поверхность субстрата, с тем чтобы обеспечить правильную ориентацию партнеров привязки, преодолеть ближней поверхности силы и чтобы избежать денатурации и разворачивается белки21,,2223, 24,-25,-26,-27,-42. Поэтому мы описали простой и прямой вперед протокол для ковалентной иммобилизации белков через их доступных первичных аминов, используя гетеро бифункциональных PEG распорки.
Мы продемонстрировали свою применимость с исследованием взаимодействия сил между принимает RrgA от S. pneumoniae и белков внеклеточного матрикса Fn, как недавно подробно описаны в других13.
Химии поверхности хорошо организованной и проанализированных и аналогичные подходы успешно использовались в нескольких SMF-функций эксперименты19,42,,4344,45. Silylether, используемые для муфты силана полимера к поверхности, подлежит гидролиза. Степень гидролиза зависит количество сформированных силоксановых облигации, которые можно контролировать в процессе silanization. Если высокая взаимодействия сил (≥ 1000 pN) ожидаются во время измерений SMF-функций, silanization должно быть осуществляется через паровой фазы осаждения30 которой приводит к образованию сплошным слоем силоксанов. Что касается многих экспериментов (например, много белок-белковых взаимодействий) силы взаимодействия находятся в диапазоне от нескольких сотен pN, и описанная процедура, в которой силоксановых формирование осуществляется путем осаждения из водной фазы и несвязанных органо силанов тщательно смывается с этанолом (шаг 1.1.7) следуют отверждения с тепла (шаг 1.1.8), является достаточным.
Еще один важный шаг, чтобы вымыть оставшиеся EDC и NHS молекул с поверхности (шаг 1.2.3), как остатки приведет к активации карбоксильных групп белков. Это может либо результат в сшивки белков на одной поверхности, который может изменить их функциональность или ковалентно пара активации белков для других белков на противоположной поверхности. Это может привести к зажимать белков между поверхностью и кончик AFM, что приводит к высокий разрыв сил, возможно в сопровождении разворачивается домена (см. Рисунок 3b, трассировки 1, 4 и 5, разворачивается Fn доменов)46. Такая же проблема может произойти, если активный NHS эфиры ПЭГ распорку остаются ненасыщенных. Таким образом инкубация с трис-буфер солевой раствор рекомендуется (шаг 1.2.6), как первичные амины трис утоляет оставшиеся аминогруппами реактивной.
После поэтапного протокол приводит к равномерное распределение Fn на стекле silanized поверхности (см. Рисунок 2), оставляя димерной формы белка. Это напоминает Fn´s структуры в растворе и согласуется с предыдущей AFM данных на других поверхностях образца37. Кроме того получено соответствующей концентрации RrgA на кончике AFM, который создает целевое значение ~ 20% событий четко взаимодействия во время измерений SMF-функций (рис. 3 и рис. 4). Другой элегантный способ, чтобы контролировать количество молекул, в сочетании с кончик подложки и консольные образца Помимо различной концентрации и/или инкубации раз белка, является сочетание силана агентов с различных вторичных функциональных групп. Изменяя соотношение белка реактивной групп простирается от PEG-полимер, количество подвижности белков может быть контролируемой15,16,17,18.
Протокол, описанные здесь, также может использоваться для иммобилизации других молекул, содержащих2 -NH или скорректировать пара белки на другой поверхности оксида кремния, кроме стекла и кремния нитрид. В зависимости от дизайна белка, Амин реактивной Карбоксильная группа может быть изменен на сульфгидрильных реактивной группу (например, maleimide или орто пиридил дисульфида) пара белков через его бесплатно-SH-группами. Для Fn это приводит в предопределенных ориентации13,17,20.
Таким образом этот протокол может быть скорректирована выполнять различные требования и подходит для других биофизических приложений, помимо одной молекулы силой спектроскопии экспериментов.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
ТБ и HG признаем финансовую поддержку через Европейский исследовательский совет «Cellufuel, дополнительно грант № 294438». HCS признает финансовой поддержке федерального министерства для образования и научных исследований через Innovationsallianz Technofunktionale белки (TeFuProt), SS признает финансовую поддержку от баварского государственного министерства науки и образования через фокус исследования «Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - КАНТЕР». Мы благодарим Конни Hasselberg-Кристоф и Мартина Hörig для технической поддержки
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752 | |
| 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | 03450 | EDC |
| Acetic acid | Carl Roth | 3738 | 100 %; analytical purity |
| Doubly distilled water | |||
| Ethanol | Carl Roth | 9065 | ≥ 99.8 %; analytical purity |
| Ethoxy silane polyethylene glycol acid | Nanocs | PG2-CASL-5k | 5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3 |
| Hydrochloric acid | Carl Roth | X896 | 32 % |
| N-Hydroxysuccinimid | Merck | 804518 | NHS; for synthesis |
| Phosphate Buffered Saline - Dulbecco | Biochrom | L1825 | PBS |
| Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma | Sigma-Aldrich | F1056 | |
| Probe molecule e.g. RrgA | Produced in laboratory | ||
| Sodiumchlorid | Carl Roth | 9265 | NaCl |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Carl Roth | AE15 | ≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Beakers | |||
| Glass cutter | |||
| Glass slides | Carl Roth | 0656 | |
| Inert gas desiccator | Sicco | ||
| Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | ||
| JPK NanoWizard 1 | JPK Instruments | ||
| JPK NanoWizard SPM and DP software | JPK Instruments | ||
| Laboratory oven | Binder | ||
| Magnetic stirrer | IKA | ||
| Micro spatula | |||
| Microcentrifuge tubes | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Parafilm M | Brand | 701606 | |
| Petri dishes | |||
| pH-meter | Knick | ||
| Pipettes | Starlab | 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl | |
| Precision balance | Acculab | ||
| Silicon nitride cantilever - MLCT | Bruker AXS S.A.S | Spring constant ≤ 100 pN/nm | |
| Sonication bath | Bandelin | ||
| Staining jar | |||
| Stereo microscope - Zeiss Stemi | Zeiss | ||
| Stir bar | |||
| Kimtech science precision wipes | Kimberly-Clark | ||
| Twezzers | |||
| UV PenRay | UVP, LLC | 90-0012-01 | Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm |
| Vacuum desiccator | |||
| Vacuum pump | |||
| Vortex mixer | VWR | ||
| Weighing paper | Carl Roth | TP64 |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-Molecule Force Spectroscopy: Optical Tweezers, Magnetic Tweezers and Atomic Force Microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Dufrene, Y. F. Atomic Force Microscopy, a Powerful Tool in Microbiology. Journal of Bacteriology. 184 (19), 5205-5213 (2002).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic Force Microscopy as a Multifunctional Molecular Toolbox in Nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
- Hinterdorfer, P., Dufrene, Y. F. Detection and Localization of Single Molecular Recognition Events Using Atomic Force Microscopy. Nature Methods. 3 (5), 347-355 (2006).
- Dufrene, Y. F. Sticky Microbes: Forces in Microbial Cell Adhesion. Trends in Microbiology. 23 (6), 376-382 (2015).
- Yakovenko, O., et al. FimH Forms Catch Bonds That Are Enhanced by Mechanical Force Due to Allosteric Regulation. The Journal of Biological Chemistry. 283 (17), 11596-11605 (2008).
- Casillas-Ituarte, N. N., et al. Amino Acid Polymorphisms in the Fibronectin-Binding Repeats of Fibronectin-Binding Protein A Affect Bond Strength and Fibronectin Conformation. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8797-8810 (2017).
- Hilleringmann, M., et al. Molecular Architecture of Streptococcus Pneumoniae TIGR4 Pili. The EMBO Journal. 28 (24), 3921-3930 (2009).
- Izore, T., et al. Structural Basis of Host Cell Recognition by the Pilus Adhesin from Streptococcus Pneumoniae. Structure. 18 (1), 106-115 (2010).
- Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), a010215 (2013).
- Henderson, B., Nair, S., Pallas, J., Williams, M. A. Fibronectin: a Multidomain Host Adhesin Targeted by Bacterial Fibronectin-Binding Proteins. FEMS Microbiology Reviews. 35 (1), 147-200 (2011).
- Becke, T. D., et al. Single Molecule Force Spectroscopy Reveals Two-Domain Binding Mode of Pilus-1 Tip Protein RrgA of Streptococcus Pneumoniae to Fibronectin. ACS nano. 12 (1), 549-558 (2018).
- Herman-Bausier, P., Pietrocola, G., Foster, T. J., Speziale, P., Dufrene, Y. F. Fibrinogen Activates the Capture of Human Plasminogen by Staphylococcal Fibronectin-Binding Proteins. mBio. 8 (5), e01067 (2017).
- Vitry, P., Valotteau, C., Feuillie, C., Bernard, S., Alsteens, D., Geoghegan, J. A., Dufrene, Y. F. Force-Induced Strengthening of the Interaction between Staphylococcus aureus Clumping Factor B and Loricrin. mBio. 8 (6), e01748 (2017).
- Milles, L. F., Schulten, K., Gaub, H. E., Bernardi, R. C. Molecular Mechanism of Extreme Mechanostability in a Pathogen Adhesin. Science. 359 (6383), 1527-1533 (2018).
- Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-Ligand Systems of the Cellulosome with AFM-Based Single-Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
- Stetter, F. W., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
- Schmidt, S. W., Christ, T., Glockner, C., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Simple Coupling Chemistry Linking Carboxyl-Containing Organic Molecules to Silicon Oxide Surfaces under Acidic Conditions. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 26 (19), 15333-15338 (2010).
- Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-Based, Site-Specific and Covalent Immobilization of Biomolecules for Single-Molecule Experiments. Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).
- Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-Molecule Force Spectroscopy on Polyproteins and Receptor-Ligand Complexes: The Current Toolbox. Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).
- Ott, W., et al. Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy. ACS nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).
- Ebner, A., et al. A New, Simple Method for Linking of Antibodies to Atomic Force Microscopy Tips. Bioconjugate Chemistry. 18 (4), 1176-1184 (2007).
- Kufer, S. K., et al. Covalent Immobilization of Recombinant Fusion Proteins with hAGT for Single Molecule Force Spectroscopy. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 35 (1), 72-78 (2005).
- Hinterdorfer, P., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schilcher, K., Schindler, H. Detection and Localization of Individual Antibody-Antigen Recognition Events by Atomic Force Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (8), 3477-3481 (1996).
- Hinterdorfer, P., Schilcher, K., Gruber, H. J., Schindler, H. Conjugation of Biomolecules to Tip and Probe Surfaces for Molecular Recognition in Atomic Force Microscopy. European Journal of Cell Biology. 74, 72 (1997).
- Riener, C. K., et al. Heterobifunctional Crosslinkers for Tethering Single Ligand Molecules to Scanning Probes. Analytica Chimica Acta. 497 (1-2), 101-114 (2003).
- Metwalli, E., Haines, D., Becker, O., Conzone, S., Pantano, C. G. Surface Characterizations of Mono-, Di-, and Tri-Aminosilane Treated Glass Substrates. Journal of Colloid and Interface Science. 298 (2), 825-831 (2006).
- Beyer, D., Knoll, W., Ringsdorf, H., Elender, G., Sackmann, E. Covalently Attached Polymer Mono- and Multilayers on Silanized Glass Substrates. Thin Solid Films. 284, 825-828 (1996).
- Hermanson, G. T. Chapter 13 - Silane Coupling Agents. Bioconjugate Techniques. 3, Academic Press. 535-548 (2013).
- Howarter, J. A., Youngblood, J. P. Optimization of Silica Silanization by 3-aminopropyltriethoxysilane. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (26), 11142-11147 (2006).
- Hermanson, G. T. Chapter 6 - Heterobifunctional Crosslinkers. Bioconjugate Techniques. 3, Academic Press. 299-339 (2013).
- Sehgal, D., Vijay, I. K. A Method for the High Efficiency of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Amidation. Analytical Biochemistry. 218 (1), 87-91 (1994).
- Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying Thiol-Gold Interactions Towards the Efficient Strength Control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
- Butt, H. J., Jaschke, M. Calculation of Thermal Noise in Atomic Force Microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
- Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. Single Molecule Force Spectroscopy by AFM Indicates Helical Structure of Poly(ethylene-glycol) in Water. New Journal of Physics. 1 (1), 6 (1999).
- Gugutkov, D., Gonzalez-Garcia, C., Rodriguez Hernandez, J. C., Altankov, G., Salmeron-Sanchez, M. Biological Activity of the Substrate-Induced Fibronectin Network: Insight Into the Third Dimension Through Electrospun Fibers. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 25 (18), 10893-10900 (2009).
- Rief, M., Oesterhelt, F., Heymann, B., Gaub, H. E. Single Molecule Force Spectroscopy on Polysaccharides by Atomic Force Microscopy. Science. 275 (5304), 1295-1297 (1997).
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Marszalek, P. E., Oberhauser, A. F., Pang, Y. P., Fernandez, J. M. Polysaccharide Elasticity Governed by Chair-Boat Transitions of the Glucopyranose Ring. Nature. 396 (6712), 661-664 (1998).
- Clausen-Schaumann, H., Rief, M., Tolksdorf, C., Gaub, H. E. Mechanical Stability of Single DNA Molecules. Biophysical Journal. 78 (4), 1997-2007 (2000).
- Schmidt, S. W., Filippov, P., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Single-Molecule Force-Clamp Experiments Reveal Kinetics of Mechanically Activated Silyl Ester Hydrolysis. ACS nano. 6 (2), 1314-1321 (2012).
- Schmidt, S. W., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Dynamic Strength of the Silicon-Carbon Bond Observed Over Three Decades of Force-Loading Rates. Journal of the American Chemical Society. 130 (11), 3664-3668 (2008).
- Schmidt, S. W., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanically Activated Rupture of Single Covalent Bonds: Evidence of Force Induced Bond Hydrolysis. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (13), 5994-5999 (2011).
- Schmidt, S. W., Pill, M. F., Kersch, A., Clausen-Schaumann, H., Beyer, M. K. Mechanically Induced Silyl Ester Cleavage Under Acidic Conditions Investigated by AFM-Based Single-Molecule Force Spectroscopy in the Force-Ramp Mode. Faraday Discussions. 170, 357-367 (2014).
- Rief, M., Gautel, M., Gaub, H. E. Unfolding Forces of Titin and Fibronectin Domains Directly Measured by AFM. Advances in Experimental Medicine and Biology. 481, 129-136 (2000).
