Summary
Um die hemmende Wirkung von pharmakologische Agenten auf Phospholipase C (PLC) in verschiedenen Regionen des Gehirns Honigbiene zu testen, stellen wir einen biochemischen Assays um PLC-Aktivität in diesen Regionen zu messen. Dieser Test könnte nützlich für den Vergleich von PLC-Aktivität bei Geweben, sowie bei den Bienen, die unterschiedliche Verhalten ausstellen.
Abstract
Die Honigbiene ist ein Modellorganismus für die Bewertung von komplexen Verhaltensweisen und höheren Gehirnfunktion, wie lernen, Gedächtnis und Arbeitsteilung. Der Pilz Körper (MB) ist eine höhere hirnzentrums vorgeschlagen, das neuronale Substrat von komplexen Honigbiene Verhaltensweisen. Obwohl frühere Studien identifizierten Gene und Proteine, die in der MBs und anderen Gehirnregionen differentiell exprimiert werden, sind die Aktivitäten der Proteine in den einzelnen Regionen noch nicht vollständig verstanden. Um die Funktionen dieser Proteine im Gehirn sichtbar zu machen, ist pharmakologische Analyse einen machbaren Ansatz, aber es ist zunächst notwendig zu bestätigen, dass pharmakologische Manipulationen in der Tat die proteinaktivität in diesen Gehirnregionen verändern.
Wir zuvor identifizierten eine höhere Expression von Genen Codierung Phospholipase C (PLC) in der MBs als in anderen Gehirnregionen und pharmakologisch bewertet die Einbeziehung der PLC in Honigbiene Verhalten. In dieser Studie wir biochemisch zwei pharmakologische Wirkstoffe getestet und bestätigt, dass sie PLC-Aktivität in der MBs und anderen Gehirnregionen verringert. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung wie man PLC Aktivität in Honigbiene Gehirn Homogenat erkennen. In diesem Testsystem Homogenates abgeleitet von verschiedenen Gehirnregionen sind mit einem synthetischen Fluorogenic Substrat reagiert und Fluoreszenz aus PLC Aktivität quantifiziert und im Vergleich zwischen Gehirnregionen. Wir beschreiben auch unsere Bewertung der hemmenden Wirkungen bestimmter Medikamente auf PLC-Aktivität mit dem gleichen System. Obwohl dieses System wahrscheinlich von anderen endogenen Fluoreszenz-Verbindungen bzw. die Absorption der Assay-Komponenten und Gewebe betroffen, die Messung von PLC-Aktivität, die mit diesem System ist sicherer und einfacher als, dass mit den traditionellen Assay, die radioaktiven Substrate erfordert. Die einfaches Verfahren und Manipulationen ermöglichen zu prüfen, PLC-Aktivität im Gehirn und anderen Geweben von Honigbienen in verschiedenen sozialen Aufgaben beteiligt.
Introduction
Die Europäische Honigbiene (Apis Mellifera L.) ist eine eusozialen Insekten, und weibliche Bienen zeigen Kaste-abhängige Reproduktion und altersabhängigen Arbeitsteilung. Zum Beispiel ernähren sich in der sterilen Kaste der Bienen als "Arbeitnehmer" bezeichnet, jüngere Personen Bruten während älteren Nektar und Pollen vor dem Bienenstock1Futter. Lernen und Gedächtnis, Fähigkeit von entscheidender Bedeutung im Leben der Honigbiene, weil Sammlerinnen müssen immer wieder hin und her zwischen Nahrungsquellen und ihr Nest gehen und dann die Standorte der gute Nahrungsquellen zu ihrer Nestmates durch den Tanz kommunizieren Kommunikation1. Frühere Studien zeigten, dass die lernen und Gedächtnis-Fähigkeit der Honigbiene2,3,4MB, eine höhere hirnzentrums bei Insekten, beteiligt ist. Differentiell exprimierten Gene und Proteine wurden in verschiedenen Gehirnregionen der Honigbiene5,6,7,8,9,10 ,11, was darauf hindeutet, dass sie die einzigartigen Funktionen von jeder Region des Gehirns verbunden sind. Obwohl die pharmakologische Hemmung oder Aktivierung eines Proteins des Interesses eine gut gebrauchte Ansatz zu zeigen, die Funktion des Proteins in der Honigbiene Verhalten12,13,14ist, ist es unbekannt, ob alle Medikamente haben Sie funktionelle Auswirkungen in verschiedenen Regionen des Gehirns Honigbiene. Die Validierung der Funktionen solcher Drogen stärkt Schlussfolgerungen in Studien des Verhaltens Pharmakologie.
Hier konzentrieren wir uns auf PLC, eines der Enzyme in Maus Kognition15,16,17,18verwickelt. PLC löst Kalzium Signalisierung durch Abbau von Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate (PIP2) in Inositol-1,4,5-Trisphosphate (IP3) und Diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP-3 öffnet IP-3 Rezeptoren auf dem endoplasmatischen Retikulum (ER), führt zur Freisetzung von Calcium-Ionen aus der Notaufnahme. Das freigesetzte Kalzium aktiviert Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) mit Calmodulin und Proteinkinase C (PKC) in Anwesenheit von DAG. Beide Proteinkinasen sind lernen und Gedächtnis22,23, Einklang mit der Beteiligung der PLC an diesem Prozess beteiligt. SPS sind in Subtypen, einschließlich PLCβ, PLCγ und PLCε, basierend auf ihre Strukturen20kategorisiert. Jeder SPS-Subtyp wird in einem anderen Kontext20aktiviert, und Gene Kodierung dieser Subtypen sind differentiell in verschiedenen Geweben exprimiert. Wir zeigten zuvor, dass Honigbienen MBs Gene Kodierung PLCβ und PLCε Subtypen auf höheren Ebenen als die übrigen Gehirn Regionen24express und zwei Pan-PLC-Hemmer (Edelfosine und Neomycin Sulfat [Neomycin]) PLC Aktivität in verringern verschiedene Regionen des Gehirns und in der Tat, die lernen und Gedächtnis-Fähigkeit der Honigbiene24beeinflussen.
Traditionell wurde die enzymatische Aktivität der PLC mit radioaktiven PIP225, die entsprechende Ausbildung, Ausrüstung und Einrichtungen erfordert gemessen. Ein synthetisches Fluorogenic Substrat der PLC neuerdings etablierte26, macht es einfach, PLC-Aktivität in der standardlabor bewerten. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll, PLC-Aktivität in verschiedenen Gehirnregionen der Honigbiene mit dem Fluorogenic Substrat zu erkennen und anschließend testen Sie die hemmende Wirkung von Edelfosine und Neomycin auf PLC in diesen Geweben. Da das Protokoll nur grundlegende Manipulationen erforderlich ist, kann es für Studien der PLC Tätigkeit in anderen Geweben oder Hirnareale bei Bienen, die verschiedene soziale Aufgaben zugeordnet sein.
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Protocol
1. Erfassung der Futtersuche Honigbienen
- Honigbienenvölkern von einem lokalen Händler zu kaufen.
- Mit Insektennetz, fangen Sie Forager Bienen in den Bienenstock mit Pollen Taschen auf ihren Hinterbeinen zurückgeben. Übertragen Sie die Bienen auf ein standard 50 mL konische Kunststoffrohr und Röhrchen Sie (Abbildung 1). Habe das Rohr auf dem Eis um die Bienen zu betäuben.
Hinweis: Tragen Sie die benannten Jacken für die Bienenzucht, Bienenstiche zu vermeiden. Krankenpflege Bienen können auch je nach dem Experiment gesammelt werden. Die ammenbienen fangen, beobachten Sie die Biene Verhalten auf die Wachs-Kamm und fangen Sie ammenbienen, die stecken ihre Köpfe in brutzellen zu füttern die Larven durch den Flügel oder Thorax mit einer Pinzette zu. Legen Sie dann die Bienen in einen 50-mL-Plastikrohr, das Röhrchen und auf Eis gelegt, wie in Schritt 1.2 beschrieben. - 12 Sammlerinnen nach dem Zufallsprinzip zu erfassen.
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet zwei Bienen pro Lot, was sechs lose. Können mehrere Bienen in eine Röhre gefangen werden, und die Zahl der Bienen in einer einzigen Röhre ist nicht wichtig, da Bienen in jeder Menge später kombiniert werden (siehe Punkt 3.1.1). Die Röhre kühl zu halten im Sommer, da die hohe Temperatur im Rohr die Bienen verletzt.
2. Präparation des Gehirns Honigbiene
- Legen Sie im Labor die 50-mL-Tube auf Eis für mindestens 30 min6 um die Bienen zu betäuben.
- Um die Dissektion Bühne vorzubereiten, ein Stück des zahnärztlichen Wachs in der Hälfte falten (die resultierende Größe ist ca. 3,5 x 7,5 cm) und schieben Sie es in einer Plastikschale (60 x 15 mm).
Hinweis: Das gefaltete Wachs hält fest die Insekten Pins. - Unter einem Binokular mit einer Pinzette trennen Sie die Biene Kopf aus seinem Körper zu und auf das dental Wachs durch Einfügen von Insekten Stifte an der Basis der jede Antenne anterior des Kopfes nach oben aufgestellt (Abb. 2A) zu halten.
Anmerkung: Waschen Sie die Pinzette vor Gebrauch mit Ethanol oder sterilisierte Wasser. - Gießen Sie genügend Salzlösung (0,13 Mol/L NaCl, 5 Mmol/L KCl und 1 Mmol/L CaCl2-2 H2O) auf den Kopf zu decken. Stechen Sie den Kopf wieder mit den Stiften, wenn der Kopf in der Lösung schwebt. Verwenden Sie einen eiskalten Salzlösung, wenn nötig.
Hinweis: Allerdings funktioniert dieses Protokoll ohne die kalte Salzlösung. - Entfernen Sie die Antennen mit einer Pinzette (Abbildung 2B).
- Machen Sie einen horizontalen Schnitt in der Nähe der Basen der Antennen und längs an der Grenze zwischen den Facettenaugen, mit einem Skalpell. Nehmen Sie dann einen horizontalen Schnitt an der Spitze des Kopfes. Entfernen Sie die Nagelhaut um ein Fenster zu öffnen, über das Gehirn (Abbildung 2C).
Hinweis: Falls erforderlich, waschen Sie das Skalpell mit Ethanol oder sterilisierte Wasser vor Gebrauch. - Entfernen Sie die Netzhaut von der Ozellen und die Tracheen auf die Vorderfläche des Gehirns, mit einer Pinzette (Abbildung 2D).
- Erweitern Sie den Schnitt an der Grenze zwischen den Facettenaugen, dorsal und ventral, mit dem Skalpell (Abb. 2E). Als Nächstes entfernen Sie das Bindegewebe zwischen der Kutikula der Facettenaugen und Netzhaut durch Einfügen der Pinzette direkt unter dem Auge Häutchen (Abbildung 2F).
- Entsorgen Sie die Nagelhaut den Facettenaugen. Wählen Sie die dorsalen Tipps von der Netzhaut die Facettenaugen mit einer Pinzette und bewegen Sie die Pinzette in die ventralen Richtung auf der Netzhaut (Abbildung 2G) vorsichtig abziehen.
- Entfernen Sie vorsichtig die restlichen Tracheen auf die Vorderfläche des Gehirns, mit einer Pinzette (Abb. 2H).
- Schneiden Sie das Bindegewebe zwischen Gehirn und rund um das Gewebe mit einer Pinzette, und Zerlegen Sie das Gehirn aus der Kopfkapsel (Abb. 2H).
- Die Tracheen auf der hinteren Oberfläche des Gehirns, mit der Pinzette (Abbildung 2ich) abziehen.
- Schneiden Sie ein Skalpell die Verbindung zwischen der MBs und anderen Gehirnregionen neben der vertikalen Lappen, die einen Teil des MBs (Abbildung 2J).
- Ort der seziert MBs und verbleibende Hirngewebe in 1,5 mL Röhrchen und rasch frieren sie mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff (Abbildung 2K). Speichern Sie die gefrorenen Gewebe bei-80 ° C bis zur Verwendung.
Hinweis: Griff flüssiger Stickstoff mit dem ausgewiesenen Handschuhe und Belüftung, kalte brennen und Erstickungsgefahr zu vermeiden. Trockeneis sollten auch vorsichtig mit Handschuhen angefasst werden. Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Dissektion und Speicherung des Gehirns, die Gewebe sollten durchgeführt, eine Biene zu einem Zeitpunkt Proteinabbau zu vermeiden.
3. Vorbereitung des Gehirns Homogenates
- Fügen Sie 10 µL Homogenisierung Puffer bestehend aus 50 Mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 Mmol/L KCl und 1,0 Mmol/L CaCl2 auf dem gefrorenen Gewebe des Gehirns und das Gewebe in der 1,5 mL Tube durch manuell Druck mit einem Kunststoff Stößel zu homogenisieren. Streicheln das Gewebe mindestens 200 X.
Hinweis: Führen Sie die Manipulationen, beschrieben in Abschnitt 3 auf Eis. Verwenden ein Pistill passend direkt in das Rohr, das Gewebe ausreichend zu zerschlagen, die leicht in der Homogenisierung Puffer schweben.- Übertragen Sie die homogenisierte Gewebe-Lösung der nächsten Gewebe auf dem Parkplatz und homogenisieren Sie das Gewebe auf die gleiche Weise zu.
Hinweis: Bei diesem Schritt sind die Honigbienen in jeder Menge kombiniert. Dieses Protokoll verwendet sechs lose.
- Übertragen Sie die homogenisierte Gewebe-Lösung der nächsten Gewebe auf dem Parkplatz und homogenisieren Sie das Gewebe auf die gleiche Weise zu.
- Fügen Sie 30 µL des Puffers Homogenisierung.
- Zentrifugieren der homogenisierten Probe für 10 min bei ca. 900 x g27 und 4 ° C.
- Übertragen Sie den überstand auf eine neue 1,5-mL-Tube und Zentrifugieren Sie es wieder für 20 min bei ca. 9.500 x g27 und 4 ° C.
- Legen Sie den überstand in eine neue 1,5-mL-Tube. Speichern Sie das Homogenat bei-20 ° C bis zur Verwendung.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins mit der Bicinchoninic Säure (BCA) Test.
- Verdünnen Sie 2.5 µL der Homogenat mit 17,5 µL des sterilisierten Wassers (also verdünnen das Homogenat Achtfache) und verwenden Sie die verdünnte Homogenat.
Hinweis: Aufgrund seiner hohen Viskosität muss Sampling Homogenat mit einer Mikropipette sorgfältig durchgeführt werden. - Durchführen Sie die BCA-Assay mit 0, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0 und 2,0 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) in 20 µL als Standards.
Hinweis: Änderung des Ausmaßes der BCA-Assay als notwendig, basierend auf dem Umfang der homogenisierte und Standardproben. Das Protokoll kann hier angehalten werden.
- Verdünnen Sie 2.5 µL der Homogenat mit 17,5 µL des sterilisierten Wassers (also verdünnen das Homogenat Achtfache) und verwenden Sie die verdünnte Homogenat.
4. SPS Reaktion im Gehirn Homogenates
- Bereiten Sie der Stammlösung der Fluorogenic Substrat WH-1526 aufgelöst in sterilisierten Wasser bei 50 µmol/L vor und bei-80 ° c Lagern
Hinweis: Decken Sie die Lösungen mit dem Substrat mit Folie, Ausbleichen zu verhindern. - Bereiten Sie die Reaktion entscheiden in der erforderlichen Menge, die folgende Zusammensetzung in 10 µL des Reaktionsgemisches zu erreichen: 50 Mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 Mmol/L KCl, 1,0 Mmol/L CaCl2, 2.0 Mmol/L Dithiothreitol, 50 mg/L BSA und 12,5 µmol/L WH-15.
- Verdünnen Sie das Homogenat mit Homogenisierung Puffer, bei Bedarf.
- Mischen Sie die Reaktion entscheiden und Homogenat mit 1,3 µg von Proteinen in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Röhre zu einem Endvolumen von 10 µL des Reaktionsgemisches zu erreichen.
- Bereiten Sie zwei Arten von Kontrolle-Mischungen für die statistische Auswertung: setzen Sie die Homogenat aber nicht WH-15 in Mischung (Kontrolle Mischung 1) und umgekehrt (Kontrolle Mischung 2).
Hinweis: Bereiten Sie den reaktionsgemischen und Kontrolle Mischungen auf Eis, Proteinabbau und Reaktion der PLC zu verhindern. Kontrolle-Mischungen 1 und 2 werden verwendet, um Fluoreszenz aus dem Homogenat und kostenlose Substrat, bzw. zu erkennen.
- Bereiten Sie zwei Arten von Kontrolle-Mischungen für die statistische Auswertung: setzen Sie die Homogenat aber nicht WH-15 in Mischung (Kontrolle Mischung 1) und umgekehrt (Kontrolle Mischung 2).
- Spülen Sie das Rohr und inkubieren Sie es in einem Thermocycler für 30 min bei 25 ° C.
- Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 2 µL 25 Mmol/L Ethylenglykol BIZ (β-Aminoethylether)-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure.
Hinweis: Geeignete Protein-Mengen und Reaktionszeiten variieren zwischen Experimente. So kann zur Optimierung der Reaktion Zustand es notwendig sein, wiederholen die nachfolgend beschriebenen Schritte 4.1 5.3 in den Vorversuchen durch Änderung der Protein-Menge und Inkubation Zeit bis die Fluoreszenz linear erhöht. Als Referenz Wenn das Homogenat abgeleitet von den anderen Hirnregionen verwendet wird, die Reaktion funktioniert in der Regel linear mit 1,3 µg oder weniger Proteine innerhalb 30 min, aber die Linearität sinkt mit mindestens 2,7 µg von Proteinen oder mit einer Inkubationszeit von 90 min oder lo erhitzt.
5. Erkennung der Fluoreszenz PLC Aktivität infolge
- Zentrifugieren Sie der Reaktionsmischung und Kontrolle Mischungen für 5 min bei ca. 310 x g28 und übertragen Sie 10 µL des Überstands zu verschiedenen Brunnen auf einem 384-Well Mikrotestplatte für Fluoreszenz-Detektion zu.
Hinweis: Zur Vermeidung von ausbleichen und eine Kontamination mit Staub decken Sie die Platte mit Folie ab. - Spülen Sie die Mikrotestplatte mit einer Zentrifuge für die Mikrotestplatte.
- Ein Mikrotestplatte Leser die Platte eingelassen und Fluoreszenz mit einem technischen dreifacher zu erkennen.
Hinweis: Die Anregung und Emission Wellenlängen sind 344 nm und 530 nm, beziehungsweise. Ggf. (je nach der Mikrotestplatte Leser) Mischen der Probe-Mischungen für 5 s vor jeder Entdeckung. Das Protokoll kann hier eingestellt werden.
6. Test der hemmenden Wirkung von pharmakologische Agenten
- Stammlösungen von Edelfosine und Neomycin in den entsprechenden Konzentrationen vorzubereiten und bis zur Verwendung aufbewahren: Edelfosine bei 5,0 Mmol/L und-20 ° C; Neomycin bei 550 Mmol/L und 4 ° C.
- Bei der Vorbereitung der Reaktion entscheiden, wie beschrieben in Schritt 4.2., entscheiden die Erreichung der entsprechenden Endkonzentrationen Inhibitoren hinzufügen: Edelfosine, 1,0 Mmol/L; Neomycin, 0,55 Mmol/L.
- Premixture und entsprechende Kontrolle reaktionsgemischen wie in Schritt 4.4 Das Homogenat hinzufügen.
- Drei Arten von Kontrolle Mischungen vorbereiten: Kontrolle Mischung 1; die homogenisierte und Inhibitor, aber nicht das Substrat umgesetzt Fügen Sie das Substrat und Inhibitor aber nicht das Homogenat in Kontrolle Mischung 2; und Kontrolle Mischung 3 den Inhibitor, aber nicht die Homogenat oder das Substrat umgesetzt.
- Führen Sie die PLC Reaktion und Detektion der Fluoreszenz wie 4,5-5.3 beschrieben.
7. statistische Analyse
- Berechnen Sie für die Erkennung von PLC-Aktivität unter Verwendung der in Abschnitt 4 beschriebenen Mischungen die Fluoreszenz die Reaktion zwischen PLC und das Substrat durch Subtraktion der Fluoreszenz emittiert von Homogenat oder kostenlose Substrat wie folgt abgeleitet.
FL (PLC-Aktivität) = Fl (Reaktion Mix) - {Fl (STRG 1) + Fl (Ctrl 2)}
Hinweis: Fl (PLC-Aktivität), Fl (Reaktion Mischung), Fl (STRG 1) und Fl (Ctrl 2) kennzeichnen Bona Fide Fluoreszenz PLC Aktivität abgeleitet, Fluoreszenz erkannt in der Reaktionsmischung und Kontrolle Mischungen 1 und 2, beziehungsweise.- Berechnen Sie nach der Messung der Fluoreszenz in den Mischungen wie 4.1-5.3 beschrieben Fl (PLC-Aktivität) nach der Gleichung im Schritt 7.1, und dann der Mittelwert der technischen dreifacher Ausfertigung für jede Homogenat Fl (PLC-Aktivität).
- Mit der mittleren Fl (PLC-Aktivität) von der technischen dreifacher in Schritt 7.1.1 erhaltenen, wieder berechnen Sie die mittlere Fl (PLC-Aktivität) von biologischen Wiederholungen von MBs und anderen Gehirnregionen zu und vergleichen Sie die Werte zwischen dem Hirngewebe.
- Berechnen Sie für die Prüfung der PLC-Aktivität in Anwesenheit von Inhibitoren der Mischungen in Abschnitt 6 beschrieben die Fluoreszenz die Reaktion unter den homogenisierte Substrat und Inhibitor wie folgt abgeleitet.
FL (PLC-Aktivität mit Inhibitor) = Fl (Reaktion Mix) - {Fl (STRG 1) + Fl (Ctrl 2)} + Fl (STRG-Taste 3)
Hinweis: Hier ist Fl (PLC-Aktivität mit Inhibitor) Bona Fide Fluoreszenz aus PLC Aktivität in Anwesenheit des Inhibitors. FL (Reaktion Mischung), Fl (STRG 1), Fl (Ctrl 2) und Fl (STRG-Taste 3) sind Fluoreszenz Signale erkannt im Reaktionsgemisch, Kontrolle Mischung 1, Mischung 2 und Kontrolle Mischung 3, bzw. zu kontrollieren.- Berechnen Sie nach der Messung der Fluoreszenz in den Mischungen wie in 6.1-6.4 beschrieben Fl (PLC-Aktivität mit Inhibitor) gemäß der Gleichung im Schritt 7.2. Dann erhalten Sie die mittlere Fl (PLC-Aktivität mit Inhibitor) von der technischen dreifacher Ausfertigung für jede Homogenat.
- Verwenden den in Schritt 7.2.1 berechneten Mittelwert, berechnen Sie die mittlere Fl (PLC-Aktivität mit Inhibitor) von biologischen Wiederholungen jeder Hirngewebe abgeleitet. Vergleichen Sie die Fl (PLC-Aktivität mit Inhibitor) und Fl (PLC-Aktivität) in Schritt 7.1.2 in jedem Gehirngewebe erhaltenen.
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Representative Results
Proteinkonzentrationen im Gehirn Homogenates:
Wir vorbereitet Homogenates mit Forager Bienen. Die berechneten proteinkonzentrationen in der ursprünglichen Homogenates sind in Abbildung 3dargestellt. Die ungefähre proteinkonzentrationen in der ursprünglichen Homogenat waren wie folgt: 1,5 mg/mL in der MBs und 2,3 mg/mL in anderen Hirnregionen. Wir haben zwei Bienen pro Lot und sechs lose wurden analysiert.
Nachweis der PLC-Aktivität im Gehirn Homogenates:
In den Pilotversuch erkannt wir höhere Fluoreszenz in anderen Hirnregionen als in der MBs. Daher haben wir wiederholt die Vorversuchen mit Homogenat der anderen Hirnregionen und bestimmt die Reaktionszeit (d.h., 30 min) und Protein-Menge (d.h. 1,3 µg). Das Ergebnis der Reaktion unter diesen Bedingungen zeigt Abbildung 4A. Die Reaktionsmischungen, die Gewebe-Homogenat und Fluorogenic Substrat ausgestellt > 4.2-fold höheren Fluoreszenz als die Kontrolle-Mischungen, die die Gewebe-Homogenat oder Fluorogenic Substrat, was darauf hindeutet, dass PLC Tätigkeit war in den reaktionsgemischen erkannt. Relative Fluoreszenz lag etwa 3.4-fold in anderen Hirnregionen als in der MBs (Abbildung 4B).
Analyse der hemmenden Effekte pharmakologischer Wirkstoffe auf PLC-Aktivität:
Um die Auswirkungen der Pan-PLC-Inhibitoren Edelfosine und Neomycin auf PLC-Aktivität zu untersuchen, führten wir die Reaktion bei Anwesenheit von 1,0 Mmol/L Edelfosine oder 0,55 Mmol/L Neomycin, unter Verwendung der gleichen Homogenat wie oben analysiert. In Anwesenheit von Edelfosine verringerte sich die Fluoreszenz-Ebene auf ca. 6,0 % und 5,4 % in der MBs und anderen Gehirnregionen bzw. im Vergleich zu Kontrollen ohne Edelfosine (Abb. 4C). Neomycin-Behandlung reduziert die Fluoreszenz-Ebene auf 44 % und 20 % der unbehandelten bzw. in der MBs und anderen Gehirnregionen steuert (Abbildung 4D).
Abbildung 1 : Erfassung einer Forager Honigbiene. Eine Rückkehr zu ihrem Bienenstock Forager war Insektennetz erfasst und sie war in ein 50 mL konische Plastikrohr beschränkt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Schematische Darstellung des Verfahrens Dissektion. (A) Achsen der Honigbiene Gehirn im Protokoll erwähnt werden angezeigt. Die Biene aus dem Kopf zu dem vorderen Thorax wird von der lateralen Seite betrachtet. (B - K) Fotos und Illustrationen der Dissektion Verfahren werden angezeigt. Sehen Sie den Haupttext für Details. Nur der Kopf der Honigbiene wird vorgestellt. Veranschaulichung der Tracheen entfällt. MBs = Pilzkörper. Der Maßstabsbalken entspricht bis 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Protein-Konzentrationen im Gehirn Gewebe Homogenates. Proteinkonzentrationen in der ursprünglichen Homogenates wurden durch BCA Assay gemessen und berechnet. Die mittlere Konzentrationen mit Standardabweichungen werden angezeigt. Zwei Sammler Bienen dienten für jedes Los, und sechs lose wurden analysiert. MBs = Pilzkörper. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Fluoreszenz in Reaktionen erkannt. (A) dieses Panel zeigt Fluoreszenz in jedem Gewebe mit oder ohne die Fluorogenic Substrat. Die Reaktion war für 30 min mit 1,3 µg Protein durchgeführt. Fluoreszenz wurde vom Mikrotestplatte Leser gemessen. Die Werte der Stichprobe Brunnen wurden durch leeren Brunnen korrigiert und in beliebige Einheiten (AUs) angezeigt. (B) dieses Panel zeigt einen Vergleich der Fluoreszenz zwischen Hirngewebe. Die Daten in der Gruppe A wurden korrigiert für Gemische, die Kontrolle durch Subtraktion und normalisiert durch die berechnete Fluoreszenz in der MBs. * P < 0,005, Mann-Whitney U-Test. Tafeln, C und D zeigen relative Fluoreszenz im Beisein von 1,0 Mmol/L Edelfosine (C) und (D) 0,55 Mmol/L Neomycin. Die gleichen Homogenates in Platten A und B verwendet wurden analysiert. Die Fluoreszenz-Werte wurden durch die Ergebnisse des Experiments Kontrolle ohne medikamentöse Behandlung für jedes Gewebe normalisiert. Die Daten der Kontrollreaktionen im Bedienfeld " C " sind die gleichen wie in Feld B. Im Bedienfeld " D" wurden alle Homogenates wieder in einem anderen Experiment analysiert. Die mittlere Fluoreszenz-Werte mit Standardabweichungen werden angezeigt. Zwei Bienen dienten für jedes Los, und sechs lose wurden analysiert. P < 0,05, Wilcoxon unterzeichnet-Reihen-Test. Keine Hg = Kontrolle Gemisch nicht mit Homogenat; MBs = Pilzkörper. Platten B - D wurden von Suenami Et Al. modifiziert. 24 mit freundlicher Genehmigung des Herausgebers. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die biochemische Untersuchung der proteinaktivität ist grundlegend wichtig für das Verständnis der molekularen Signale im Gehirn, weil die Aktivität eines Enzyms durch verschiedene Moleküle, wie Substrate und Inhibitoren, beeinflusst wird und kann somit zusammen mit das Verhalten der Tiere (z.B., lernen und Gedächtnis)5. In Honigbiene Studien sind Enzyme z. B. zyklische AMP-abhängige Proteinkinase A zyklisches GMP-abhängige Proteinkinase, PKC, phosphorylierten CaMKII und Adenylat-Cyclase berichtet in verschiedenen Gehirnregionen anhand differentiell ausgedrückt werden Immunohistochemistry5,10,29,30,31. Unterschiede in der enzymatischen Aktivität unter Hirnregionen, sind jedoch nur teilweise gemeldeten6. Hier haben wir ein detailliertes Protokoll für die PLC Aktivität Erkennung und Bewertung der hemmenden Wirkung pharmakologische Wirkstoffe in der MBs und anderen Gehirnregionen beschrieben.
Es gibt einige möglichen Faktoren stören Fluoreszenz-Detektion. Erstens ist es wichtig, das Protein vor Abbau zu schützen, wenn biochemische Tests durchführen. In dem hier beschriebenen Protokoll sind eine schnelle Dissektion und Einfrieren des Gehirns erforderlich. Es wird empfohlen, dass Gewebeproben werden eingefroren und bald nach jedem Zyklus der Dissektion gespeichert. Eine Minimierung der Tauwetter/gefrierzyklus von der Homogenat ist auch entscheidend für die Verschlechterung des Proteins zu verhindern.
Neben der Proteinabbau beeinträchtigen Hintergrundfluoreszenz und Absorption in das Reaktionsgemisch die Ergebnisse in diesem Testsystem weil PLC-Aktivität mit einem Fluoreszenzsignal erkannt wird. Zum Beispiel hat Neomycin in Wasser aufgelöst eine gelbe Farbe, die Fluoreszenz-Detektion betrifft. Obwohl wir 0,55 Mmol/L Neomycin, eine 1000-fold Verdünnung der Stammlösung verwendet möglicherweise eine weitere Optimierung der Konzentration erforderlich. Verunreinigung durch andere Gewebe kann darüber hinaus auch das Ergebnis beeinflussen. Die Netzhaut, die visuelle Reize erkennt und Pigmente enthält, besteht aus einem Gewebetyp, die potenziell mit dem Assay stört.
Mit dem vorliegenden Protokoll erkannt wir höheren PLC Aktivität in anderen Hirnregionen als in der MBs-24. Dies war mit dem Ergebnis der quantitative Reverse Transkription PCR-Analysen, die ergab, dass die MBs höhere Niveaus von PLC-Gene als anderen Gehirn Gewebe24express inkonsistent. Dieser Widerspruch könnte durch WH-15, die ist eine freischwebende Substrat26und die Tatsache, dass wir nicht die Membran und cytosolischen Bruchteile von Gehirn Homogenates unterscheiden. Da PLCβ und PLCε membranassoziierten Enzyme32 sind und mit dem endogenen PIP2 Substrat interagieren können, beeinflusst die Höhe des Membran-Fraktion in der Homogenat wahrscheinlich die Reaktion zwischen PLC und WH-15. Eine weitere mögliche Erklärung ist, dass die PLC-Konzentration in den anderen Hirnregionen als in der MBs aufgrund von Unterschieden in Protein-Produktion und/oder Abbau-Preise höher sein könnte. Bona Fide PLC-Aktivität im Gehirn muss daher geklärt werden weiter durch weitere Experimente wie die Membran33durch ein kürzlich berichtet neues Substrat mit eingegliedert, analysieren die Tätigkeit des membranassoziierten und cytosolischen SPS separat, oder den Inhalt der SPS oder PIP Quantifizierung2 in jedem Gehirngewebe.
Unter Berücksichtigung der oben genannten Punkte hier beschriebenen SPS-Assay-System erweiterbar um PLC-Aktivität in verschiedenen Geweben nicht bewertet hier, wie der Verdauungstrakt, die Muskeln und die Fortpflanzungsorgane zu messen. Es ist auch möglich, vergleichen Sie PLC Aktivität zwischen den Gehirnen von Sammler und ammenbienen, die Einbeziehung der PLC-Aktivität in verschiedenen sozialen Rollen zu bewerten.
Insgesamt ist das hier vorgestellte Testsystem eine praktikable Lösung für die Erkennung von PLC-Aktivität im Gewebe Homogenates, weil es mit standard Laborgeräten durchgeführt werden kann, während ein traditioneller Ansatz mit radioaktiven PIP2 erfordert spezialisierte Einrichtungen, Ausbildung und Ausrüstung für Radioisotope. Unter Ausnutzung des Systems mit weiteren Änderungen vertiefen unser Verständnis der molekularen Mechanismen der Honigbiene komplexes Verhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Abbildung 4 b - 4D wurde von Suenami Et Al. modifiziert. 24 mit Genehmigung der Biologie geöffnet. Die Autoren sind dankbar an den Verlag für die Erlaubnis. Diese Arbeit wurde von der Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) Shota Suenami und Ryo Miyazaki unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
References
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