Summary
여기, 우리 두뇌 매트릭스를 모방 하도록 설계 하는 기가 가변 생체 내의 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한 프로토콜을 제시. 이 접근 한 생체 외에서세포종 세포 vivo에서 일반적으로 문화에서 길을 잃 었의 많은 특성을 유지 하는 실험 플랫폼을 제공 합니다.
Abstract
세포종 (GBM)은 가장 일반적인, 그러나 가장 치명적인, 중추 신 경계 암 이다. 최근 몇 년 동안, 많은 연구는 어떻게는 세포 외 기질 (ECM) 히 알루 론 산 (HA) 등 독특한 두뇌 환경의 용이 GBM 진행 및 내 습에 집중 했다. 그러나, 대부분의 생체 외에서 문화 모델 GBM 세포는 ECM의 컨텍스트 외부 포함. GBM 셀 murine xenografts 또한 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, vivo에서 모델 어렵게 종양 동작으로 복잡 한 종양 microenvironment의 개별 특징의 기여를 분리. 여기, 우리는 하 하이드로 겔-기반, 3 차원 (3D) 문화 플랫폼 연구원 하 농도 및 강성 독립적으로 변경할 수 있도록 설명 합니다. 높은 분자량 HA 및 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)는 마이클 형 추가 라이브 세포의 존재를 통해 가교 된 hydrogels를 구성 됩니다. 3D 하이드로 겔 문화 환자 파생 GBM 세포 전시 생존 및 확산의 속도 만큼 좋은, 또는 때 교양으로 표준 gliomaspheres 보다 더 있습니다. 하이드로 겔 시스템은 또한 특정 세포-ECM 상호 작용의 효과 분리 하는 ECM 모방 펩 티 드의 수 있습니다. Hydrogels 광학 투명는 라이브 셀 3D 문화에 몇 군데 있습니다. 마지막으로, 하 히드로 문화 분자 및 세포 분석, PCR, 등 서 부 럽 cryosectioning 뒤에 면역 형광 염색 법에 대 한 표준 기술로 호환 됩니다.
Introduction
3 차원 (3D) 문화 시스템 기본 조직 그들의 2 차원 (2D) 대응1,2보다 더 나은에서 셀과 그들의 주변 세포 외 기질 (ECM) 간의 상호 작용을 정리. 조직 공학의 발전은 새로운 매트릭스 microenvironment 영향 셀 동작 및 2)의 효능의 1) 어떻게 화학 및 물리적 구성 요소에 대 한 제어 조사를 가능 하 게 하는 정교한, 3D 문화 플랫폼 굴복 했다 치료 질병, 암2등의 숫자에 대 한 전략. 생체 외에서 모델 조직 요인, 내 분 비 및 면역 신호, 등에 대 한 계정이 없습니다 따라서 완전히 vivo에서 모델을 대체할 수 없습니다 하는 동안 그들은 재현성, 실험 제어를 포함 하 여 몇 가지 장점을 제공합니다 경제성 그리고 속도입니다. 여기, 우리 두뇌 모방 hydrogels는 3d에서 환자 파생 뇌 종양 세포의 문화 종양 생리학, 특히, 치료 저항3취득의 역학의 여러 측면을 캡처를 사용 하 여를 설명 합니다. 체 외에 다른 방법에 비해, 이러한 문화는 더 나은 종양 모델 vivo에서 및 임상 관찰3을 나타냅니다.
세포종 (GBM)은 1-2 년4,5의 메디아 생존으로 뇌에서 가장 빈번 하 고 치명적인 암 이다. 최근 몇 년 동안, 많은 연구는 GBM6,,78종양 매트릭스 환경의 영향에 집중 했다. 독특한 두뇌 ECM GBM 셀 이동, 확산, 그리고 치료 저항6,7,8,9,,1011 에 영향을 미칠 것으로 보고 되었습니다. , 12. 히 알루 론 산 (HA) 두뇌, 그것은 다른 개 그와 상호 작용 및 하이드로 겔 같은 한 형태로 proteoglycans 메쉬13에 풍부한 glycosaminoglycan (개 그)입니다. HA overexpression에 GBM 종양 및 암 진행8,9,13,,1415,16에 후속 효과 많은 연구 보고 ,17. 다른 ECM 구성 요소 GBM 종양 성장과 침공6,7,,1518에 영향을 줍니다. 예를 들어 fibronectin 및 vitronectin, GBM에 overexpressed 일반적으로, "RGD" 시퀀스에 대 한 바인딩을 통해 세포 표면 integrin 수용 체의 heterodimerization를 유발 하 고 종양 생존19 홍보 하는 복잡 한 신호 폭포를 시작 ,,2021. 생 화 학적 영향 외에 조직 매트릭스의 물리적 특성 GBM 진행22,23에 영향을 줍니다.
치료에 저항을의 지속적인 수집 GBM 치4의 주요 드라이버 중 하나입니다. 2D 또는 gliomasphere 모델에서 유망한 결과 보여주는 마약 이후 동물 연구와 임상 사례3, microenvironmental 요인의 효과 GBM 종양 응답1에 크게 기여 했다는 것을 나타내는 데 실패 했습니다. 동물 모델 3D를 제공할 수 있는, 순수 microenvironment xenografted 환자 세포에 적절 한 고 임상 관련 결과24,25, 두뇌 microenvironment에는 vivo에서 의 복잡성을 생성 기능, 세포-매트릭스 상호 작용을 포함 하 여 특정 핵심 생물 학적 결과 확인 하기 위해 도전 하기가. 새로운 치료 대상의 단순화 된 문화 플랫폼 생화학 및 생물 속성 정의 사용 하 여에서 도움이 됩니다.
GBM 종양 microenvironment26,27 의 이전에 보고 된 소재 모델과 달리는 달성 하지 않았습니다 진정한 직교 제어할 ECM, 소재 플랫폼의 개별 생 화 학적 및 물리적 특징 보고 여기 수 있습니다 여러 개의 독립적인 기능 GBM 세포 표현 형을 기여의 분리 하 고 여기, 선물이 환자 파생 GBM 셀의 3 차원 문화에 대 한 HA 기반, 기가 가변 하이드로 겔 시스템. Hydrogels 두 폴리머 구성 요소에서 형성 된다: 1) 생물학적으로 활성 하 고 2) 생물학으로 비활성 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG). 못은 낮은 단백질 흡착과 최소한의 immunogenicity28널리 생체 및 친수성 소재. 여기, 하 체인에 glucuronic 산 moieties의 약 5%는 기능성 가교를 상업적으로 사용할 수 있는 4-팔-못 maleimides 마이클 형 추가 통해 종료를 수 있도록 thiol 그룹. 가장 일반적인 형태로 본문에, 하 고 분자량 (HMW) 체인에 존재합니다. 여기, 낮은 정도의 HMW 하의 (500-750 kDa) 수정 하 고 CD4429를 포함 하 여 그것의 세포 수용 체의 기본 상호 작용을 유지 하기 위해 도움이 됩니다. Maleimides에 총 thiols의 일정 한 어 금 니 비율을 유지 하면서 하 thiol 위한 페그 thiol를 대체 하 여 하 농도 결과 hydrogels의 기계적 성질에서 분리 될 수 있습니다. 또한, 화학 량 론 컨트롤 시스테인 종료 펩 티 드의 maleimide로 끝나는 각 4-팔-말뚝에 정의 된 평균 수 켤레를 사용할 수 있습니다. ECM 파생, 접착제 펩 티 드의 integrins는 생화학 및 화학 신호는 불리고1경작된 한 세포에와 상호 작용 수 있습니다. Maleimide-thiol 추가 셀 캡슐화 및 환자에서 파생 된 세포의 생존을 극대화 하는 데 필요한 시간을 최소화 하는 생리 적 조건 하에서 매우 빠르게 발생 합니다. 또한, 히드로 문화 일반적인 조직 표본 처럼 취급 될 수 있으며 표준 특성화 기법 등 서 부 럽, cytometry, 면역 형광 염색 법와 호환. 다음 프로토콜 환자 파생 GBM 셀 및 생 화 확 적인 분석에 대 한 기술 3D 문화 수립 hydrogels 날조를 위한 절차를 설명 합니다.
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Protocol
모든 인간의 조직 컬렉션 단계 제도 승인된 프로토콜에서 실행 되었다.
1입니다. 히 알루 론 산의 Thiolation
참고: 어 금 니 비율 진술 된다 카복실산 그룹의 총 수와 관련 하 여 별도로 지정 하지 않는 한.
- 에 이온을 제거 된 증류수 (DiH2O) 압력솥 살 균, 250 mL 삼각 플라스 크에에서 10 mg/mL에서 나트륨 hyaluronate (HA, 500-750 kDa)의 500 mg을 디졸브. 완전히 분해 하 게 2 시간 동안 실내 온도에 솔루션 (~ 200 rpm)를 저 어. Thiolation 절차 동안 교 반 반응 계속 저 어 바와 자기 저 어 접시를 사용 합니다.
- 0.1 m M를 사용 하 여 염 산 (HCl), 5.5 HA 솔루션의 pH를 조정 합니다. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)의 69.6 mg (어 금 니 비율 x 0.25)에 밖으로 나가는 거 야.
참고: 소화 EDC HA 솔루션에 직접 추가할 수 있습니다, 비록 그것은 일반적으로 쉽게 DiH2O의 1 mL에 먼저 EDC를 해산 하 고 다음 신속 하 게 추가할 EDC 솔루션 HA 솔루션을. 전 해산 DiH의 1 mL에2O 또한 할 수 있습니다 N-hydroxysuccinimide (NHS)와 cystamine dihydrocholoride 1.3 및 1.4 단계에서 반응에 추가 하기 전에. - 반응에 NHS의 17.9 mg (어 금 니 비율 x 0.125)를 추가 합니다. 5.5 0.1 M HCl을 사용 하 여 반응 용액의 pH를 조정 하 고 45 분 동안 실내 온도에 반응을 품 어.
- Cystamine dihydrochloride 70.0 mg (어 금 니 비율 x 0.25) 반응 솔루션에 추가 합니다. 0.1 M 수산화 나트륨 (NaOH)를 사용 하 여 6.25에 pH를 조정. 교 반 하면서 하룻밤 실 온에서 반응을 품 어.
- 다음 날에 1 M NaOH 사용 하 여 약 8 반응 해결책의 pH를 조정. 반응에 dithiothreitol (DTT)의 192 mg (어 금 니 비율 x 4)을 추가 합니다. DTT의 추가 후 다시 8로 pH를 조정 하 고 실 온에서 1-2 시간 동안 교를 떠나.
- 1 M HCl을 사용 하 여 4로 pH를 조정. 미리 젖된 투 석 막 (주위 13 kDa 분자량 컷오프)로 전체 반응 혼합물을 전송 하 고 DiH에 대 한 dialyze2O pH 4에 사전 조정.
참고: DiH2O 투 석의 40 배 이상 반작용된 HA 솔루션 (예를 들어, 50 mL 샘플 DiH2O, pH 4의 2 L에)의 볼륨 이어야 합니다. - 대체 투 솔루션 (DiH2O, pH 4) 두번 매일 실 온에서 3 일 동안.
- Dialyzed 솔루션 0.22 μ m의 막, 진공 기반 필터를 통해 필터링. 플래시는 액체 질소에 thiolated HA 솔루션을 동결. lyophilizer를 사용 하 여 동결 건조 샘플 2 일 동안. Thiolated 하 건조 형태로 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 밀폐 desiccator에 6 개월 이상.
- Thiolation의 정도 확인, 덮어의 테스트 및 양성자 NMR 분광학30,31을 사용 합니다.
2입니다. 가교 자료의 준비
- 주위 빛에 노출을 최소화 하기 위해 호박 유리병에서 HEPES 버퍼링 식 염 수 (20 mM HEPES 행 크의 균형된 소금 염 (HBSS) 버퍼, pH 8-9의 내 조정)에 (이 예제에서는 13.3 mg/mL)에서 원하는 농도에서 thiolated HA를 분해. 끊임없이 약동 하는 솔루션을 유지.
참고: thiols HA에 활용 된 사이 이황화 결합의 대형 pH는 8 위, 솔루션 농도 너무 높은, 또는 솔루션은 겔 화 하기 전에 너무 오래 대 한 교 반 남아 경우 발생할 수 있습니다. 이 문제를 방지 하려면 15 mg/mL thiolated HA의 아래 사용 하 고 thiolated HA hydrogels 형성의 2 시간 안에 해산. - 4-팔-말뚝-maleimide (말뚝-말, 20 kDa) 및 4-팔-말뚝-thiol (페그 thiol, 20 kDa) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.4, 50 mg/mL 못 말 및 못 thiol 재고 솔루션을 준비 하에 분해.
참고: 그것은 완전히 해산 못 시 약 1 시간 이상 걸립니다. - ECM 파생 된 펩 티 드를 추가 하는 경우 재고 솔루션을 준비 하는 PBS에 시스테인-포함 펩 티 드를 분해.
참고: 2-4 m m의 재고 농도 사용 합니다. - 담가 실리콘 고무 주조한 다 깨끗 한 그들을 20 분 이상 그리고 압력솥에 대 한 에탄올에 그들 살 균에 대 한.
3. 하이드로 겔 가교 및 세포 캡슐화
참고: 예를 들어 서 여기, 4 개인, 80 µ L hydrogels 0.5% (w/v) 하 고 1 kPa의 압축 계수의 캡슐화는 설명된3. 다양 한 속성 hydrogels 항복 예 조리법에 대 한 표 1을 참조 하십시오: 두 hydrogels integrin 바인딩 펩 티 드 RGD 통합 및 두 hydrogels 시스테인 모자 펩 티 드 활동에 대 한 부정적인 컨트롤로 통합. 환자 파생 GBM 세포의 농도 시드 500000 셀/mL입니다.
- 12.5 mg/mL을 못 말 재고 솔루션 (단계 2.2에서에서 50 mg/mL) 120 µ L PBS에 재고 솔루션의 40 µ L을 추가 하 여 희석. 각 튜브는 80 µ L 희석된 솔루션 두 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 분할.
- 16 µ L 재고 RGD 솔루션 (2.8 m m, 단계 2.3에서에서) 1 개의 관을 및 재고 시스테인 솔루션 (2.8 m m, 단계 2.3에서에서) 두 번째 관의 16 µ L를 추가 합니다. 소용돌이를 섞어입니다. 단계 3.9에서에서 사용까지 얼음에 말뚝-말-RGD 또는 말뚝-말-CYS 솔루션을 놓습니다.
참고: 수익률 hydrogels 펩 티 드의 ~ 140 µ M와 함께 여기에 설명 된 대로 절차. 이것은 펩 티 드로 점유 되 고 모든 8 사용할 수 못 팔에서 약 1입니다. 이 시스테인 종료 사용할 수 maleimide 그룹에 펩 티 드의 어 금 니 비율을 변경 하 여 다양 한 될 수 있습니다. 일반적으로, 여전히 히드로 가교에 대 한 사용할 수 있는 maleimide 그룹의 충분 한 숫자를 떠나 있는 동안 펩 티 드의 280 μ M의 최대 농도 얻을 수 있습니다. - PBS의 36 µ L 재고 솔루션 4 µ L 50 mg/mL의 혼합 하 여 말뚝 thiol 재고 솔루션 (단계 2.2에서에서 50 mg/mL) 5 mg/ml를 희석. 2.1 단계에서 혼합물을 녹아, thiolated HA의 120 µ L를 추가 합니다.
참고: HMW 하의 솔루션은 아주 점성. 따라서, 넓은 구멍 micropipette 팁을 사용 하 여 솔루션을 전송 하는 것이 좋습니다. 피 펫 천천히 micropipette 팁의 벽에 집착 하는 솔루션을 방지 하 고 측정 정확도 향상 - (준비 단계 2.4에서에서) 깨끗 하 고 마른 형 조직 문화 치료 12-잘 접시의 각 음에 놓습니다. 피 펫 팁의 깨끗 하 고 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여, 젤 형과 금형과 잘 접시의 바닥 사이 더블 씰링을 누릅니다.
참고: 누설을 방지 하기 위해 캡슐화 하기 바로 전에 다시 인감을 확인 하십시오. - 교양된 GBM 셀을 통과 하 고 단일 셀에 해리 셀 농도 앞에서 설명한3결정 합니다.
참고: 일부 GBM 라인은 단일 셀에 해리 했다 수 수 없습니다. 이 경우에, 전체 gliomaspheres 캡슐화 될 수 있습니다. 그러나, 재현성을 개선 하기 위해 정확한 셀 계산 후 해리 단일 셀을 준비 합니다. Gliomasphere 뿌리고 위한 프로토콜 다른 실험실 사이에서 변화 하 고 이러한 많은 가능성이 호환 히드로 캡슐화.- (권장) 5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기 gliomaspheres 제거는 상쾌한 고 셀 펠 릿을 셀 분리 효소의 1 mL를 추가 합니다. 그런 다음, 부드럽게 도청 선동 튜브 5 분 동안 품 어.
- 셀에 완전 한 문화 매체 (50 ng/mL EGF, DMEM/f 12에 20 ng/mL FGF-2, 25 µ g/mL 헤 파 린, G21 보충 및 1% 페니실린/스)의 4 개 mL를 추가 합니다.
- 다시 5 분 동안 500 x g에서 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 마지막으로, 완전 한 매체의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend 고 70 µ m 셀 여과기 정지 세포를 통과. (권장된) 세척 세포의 수를 최대화 하려면 전체 매체의 추가 4 mL와 여과기를 복구.
- 서 스 펜 션은 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 농도 추정 합니다. 2 원심 분리기 튜브 각 튜브 ~ 80000 셀을 포함 하는 곳에 세포 현 탁 액을 분할. 5 분;에 대 한 500 x g에서 원심 일반적으로, 80000 셀 2 80 µ L hydrogels를 만들 것입니다.
- 제거는 상쾌한 고 못 말 RGD 솔루션의 80 µ L에서 한 펠 릿과 (3.1 단계에서 준비 하는) 말뚝-말-CYS 솔루션의 80 µ L에 두 번째 펠 릿 resuspend.
- 각 고무 실리콘 금형 (으로 단계 3.4에서 준비)에 (위 단계 3.3)에서 HA 솔루션의 40 µ L를 분배 using 200 µ L, 넓은 구멍 micropipette 팁.
- 200 µ L, 넓은 구멍 micropipette 팁 using, 페그-말-CYS 또는 금형에 HA 솔루션을 페그-말-RGD 셀 솔루션의 40 µ L 믹스. 플라스틱 아래로 신속 하 게 10 개 이상 시간. 준비 중인 각 젤 문화에 대 한 반복 합니다.
참고:이 단계는 연습, 신속 하 게 발생 하는 초기 겔 화 이후 (30 s). 팁도 혼합 되도록 금형에서 다른 위치로 이동 하는 동안 아래로 플라스틱. 항상 기포의 형성을 피하기 위해 액체 수준 아래 팁을 유지. 솔루션 젤은 micropipette 내부 형성 얻을 수 있습니다으로 너무 많은 시간 팁 혼합 하지 마십시오. 말뚝 말 CYS 및 말뚝-말-RGD 원하는 RGD 펩타이드 농도 달성 하기 위해 다양 한 비율에서 결합할 수 있습니다. - 반응의 완료를 보장 하기 위해 5-10 분 동안 37 ° C 세포 문화 인큐베이터로 젤 캡슐 셀을 포함 하는 잘 판 놓습니다.
- 각 잘 구성 된 젤을 문화 매체의 2-2.5 mL를 추가 합니다. 부드럽게 금형과 젤을 분리 하는 살 균, 2 µ L 피 펫 팁 또는 마이크로-주걱을 사용 합니다. 미리 소독된 집게를 사용 하 여 잘 플레이트에서 금형을 제거. 문화와 미래 실험 위한 셀 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 다시 잘 접시를 놓습니다.
참고: 젤 문화를 해치지 않으려면 형 수직으로 위쪽으로 당겨. 일반적으로 3-4 일 마다 젤 문화에서 매체에 대체 되어야 한다. 알아서 하지 매체를 제거할 때 hydrogels 발음. 이 문제는, 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여 것이 좋습니다. 휴대폰 번호를 추적 하기 위해 이미징 생물 발광을 계획 하는 경우 GBM 셀 lentivirus luciferase 식을 캡슐화, 전에 앞에서 설명한3로 인코딩을 constitutively로 불리고 해야 합니다. 생물 발광 영상, 문화 매체 발광 영상 전에 1 h D-소의 1 mM를 추가 합니다.
4. lysate 준비 부 럽
- 얼음 (젤 샘플 당 1)에 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 진정. 4 ° c.에 멋진 원심 분리기
- 잘 플레이트에서 매체를 제거 합니다. Prechilled microcentrifuge 튜브 젤을 전송 합니다.
- 1 x 효소/인산 가수분해 효소 억제제와 RIPA 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다.
- 20 번 이상 바늘을 통해 전체 혼합물을 추진 하 여 젤을 헤어 20 G 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여.
- 플래시 스핀 벤치 가기 microcentrifuge 및 샘플 다시 얼음에 장소를 사용 하 여 샘플.
- 소용돌이 간단히 모든 5 분 총 20 분의 샘플링.
- 4 ° c.에 15 분 동안 14000 x g에서 원심 분리기 샘플
- 상쾌한 새, 미리 냉장 microcentrifuge 관에 전송 하 고 (단기)-20 ° C에서 저장 또는 (장기)-80 ° c. 젤 전기 이동 법 앞에서 설명한3표준 절차를 사용 하 여 수행 합니다.
5. 하이드로 겔 문화에서 단일 셀을 추출 Cytometry에 대 한
- Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 매체 및 전송 젤 문화 (단계 3.11)를 제거 합니다.
- 때때로 교 반 튜브를 flicking 5 분 동안 37 ° C에서 (예를 들어, TrypLE 익스프레스) 셀 분리 효소의 500 µ L 젤 품 어.
- 완전 한 매체의 5 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 혼합물을 전송 합니다. 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 10 mL 주사기에 20 G 바늘을 연결 합니다. 부드럽게 당겨 셀 서 스 펜 션 아래로 바늘을 통해 8 번.
- 새로운 50 mL 원심 분리기 관으로 혼합물 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 흐름. 나머지 셀을 수집에 스 트레이너를 통해 완전 한 매체의 추가적인 5 mL를 적용 합니다.
- 5 분에 대 한 제거는 상쾌한 cytometry (를 사용 하 여 표준 프로토콜3)에 대 한 원하는 버퍼에 펠 릿을 resuspend 400 x g에서 샘플을 원심.
6입니다. cryopreservation Hydrogels 단면에 대 한의
- (3.11 단계)에서 젤 문화에서 매체를 제거 합니다.
- 밤새 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde (PFA)의 2 개 mL 젤 문화를 품 어.
주의: PFA 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다. - 다음 날, PFA 제거 합니다. PBS에서 젤 5% 자당의 2 개 mL를 추가 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.
- PBS에서 20% 자당의 2 mL와 5% 자당 해결책을 대체 하 고 30 분 동안 품 어.
- 자당 솔루션 2 mL PBS에서 신선한 20% 자당의 교체와 추가 30 분 동안 품 어.
- 세 번째 시간에 대 한 자당 솔루션을 2 mL PBS에서 신선한 20% 자당의 바꿉니다. 4 ° C에서 밤새 품 어.
- 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물에 20% 자당을 준비 합니다.
참고: 10 월의 점성 때문에 자당의 해산 걸릴 수 있습니다 일부 시간 (하룻밤)까지. 동요를 유지 하기 위해 해체 동안 통에 혼합물을 저장 하는 것이 좋습니다. - 다음 날, 20% 자당 해결책을 제거 하 고 부드럽게 붓는 20% 자당 10 월 솔루션에서 젤. 전체 젤을 커버 있는지 확인 합니다. 3 h 4 ° C에서 품 어.
- 젤 큰, 편평한 주걱;를 사용 하 여 포함 형의 센터에 전송 이 젤의 손상을 방지 하려면 신중 하 게 수행 되어야 합니다.
- 드라이 아이스의 초과 cryochamber 안에 멋진 2-methylbutane.
- 순수한 oct (자당) 포함 형을 채우십시오. 바로 형의 위쪽 가장자리 아래에 채우십시오.
- 냉각된 2-methylbutane에 침수에 의해 하이드로 겔 샘플을 동결 하 고 단면 진행.
- 섹션 cryostat;를 사용 하 여 샘플 10-18 µ m의 섹션 두께 및 단면 약-26 ° C의 온도 것이 좋습니다.
- 앞에서 설명한3으로 sectioned 젤 문화에 표준 immunostaining 절차를 수행 합니다.
참고: PFA 자극 및 발암 물질 알려져 있습니다. 처리 하 고 PFA 로컬로 적용 가능한 표준 및 규정에 따라 처분 하십시오.
7. 총 RNA 추출 하이드로 겔 샘플에서
참고: 여기, 우리는 광고를 사용 하 여 프로토콜 설명 (재료의 표 참조) 히드로 배양 세포에서 총 RNA 추출 키트. 버퍼 및 모든 자료 사용 키트에서 사용할 수 있습니다.
- 문화 매체를 제거 합니다. 넓은 구멍 팁 P1000 전송 피 펫을 사용 하 여 1.5 mL microcentrifuge 관으로 히드로 문화를 전송.
- 하이드로 겔 문화를 버퍼 실내의 350 µ L를 추가 합니다.
- 20 번 이상 바늘을 통해 전체 혼합물을 추진 하 여 젤을 분쇄기 1 mL 주사기에 부착 된 20 G 바늘을 사용 하 여.
- 2 mL 컬렉션 튜브에 균질 화기 열에 전체 혼합물을 전송 합니다. 2 분 13000 x g에서 원심.
- Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 합니다. 수 맨 젤 침전을 방해 하지 않도록 주의 하십시오.
- 100% 에탄올의 350 µ L lysate 샘플 혼합. 2 mL 컬렉션 튜브에 스핀 (kit)에서 열 위치로 모든 샘플을 전송 합니다. 13000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기입니다.
- PCR 위한 RNA 정화에 대 한 이후 단계에 대 한 키트 제조 업체에서 제공 하는 일반적인 프로토콜을 따릅니다.
참고: RNA 추출 되 면 PCR 위한 표준 프로토콜 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
Thiolated 하의 각 배치에 대 한 thiolation 정도 H1-NMR 또는 덮어의 테스트를 사용 하 여 확인 한다. 하 수정 여기 일관 되 게 설명 하는 절차를 사용 하 여 생성 (정의 하과 thiols의 어 금 니 비율) ~ 5 %thiolation (그림 1).
이 새로운 문화 플랫폼 설정 대규모 실험을 구현 하기 전에 좋은 문화 생존을 보장 하기 위해 엄격한 테스트를 수행할 각 연구실을 요구할 것 이다. 우리의 80 µ L hydrogels는 시드 밀도 500000 셀/mL (40, 000 셀/젤)와 지속적으로 확산 속도 비교, 또는 gliomasphere 문화 (그림 2A-2 C)보다 더 나은 결과. HA/말뚝 hydrogels는 광학 투명 셀 동작 관찰할 수 있습니다 라이브, 3D 문화 단계 대비 또는 형광 현미경을 사용 하 여에서 직접. 그림 3A 보여줍니다, 캡슐화, 후 4 일 RGD 포함 hydrogels GBM 셀 전시는 침략 적 표현 형, 셀 하이드로 겔에서 경작 하는 동안 못 말 CYS을 사용 하 여 컨트롤 구형 형태.
연구원 일 개월 이식된 종양 진보적인 성장24,32에 도달할 때까지 대기 해야 하는 종이 식 모델에서 일반적으로 환자 파생 된 세포는 또한 새로운 문화 환경에 적응 하려면 시간이 걸릴. 따라서, 대부분의 세포 지 수 성장 단계 입력 되도록 약물 치료 같은 실험을 시작 하기 전에 4-8 일 경작 하는 것이 좋습니다. 약물 치료, 넘어 경쟁력 hydrogels에 RGD와의 세포 상호 작용 방해, 수용 성 쿠-RGD, 같은 시 약 배양 (그림 3A)에 추가할 수 있습니다.
우리의 하이드로 겔 시스템 glioma 세포 생물학 조사에 대 한 많은 일반적인 방법와 호환 됩니다. 일반적으로 설치류이 종이 식 종양을 모니터링 하는 데 사용 되는 생물 발광 영상를 사용 하 여 실행 가능한 세포의 상대적인 숫자 관찰할 수 있습니다 히드로 문화에서 치료의 과정. 그림 3B GBM 셀 하이드로 겔 경작에 erlotinib 치료의 효과 6 일 동안을 평가 했다,이 방법의 예를 제공 합니다. 서쪽 오 점 또는 PCR lysates를 준비할 때 일반적으로, 히드로 문화 조직 샘플으로 처리할 수 있습니다. 쪼개진된 폴 리 ADP 중 합 효소의 서쪽 오 점 분석 치료 CD44 최저의 세포에 있는 apoptosis의 상대적 정도 wildtype GBM 셀 0.5%에서 경작 하 hydrogels (그림 3C)보다 높은 임을 나타냅니다. 마찬가지로, cytometry 그대로 조직 (그림 2)에서 단일 셀을 해방에 대 한 표준 프로토콜을 사용 하 여 통해 분석에 대 한 단일 셀 정지 히드로 문화에서 준비 될 수 있습니다. 세포 기능, 히드로 기반, 3D 문화 cryosections ECM 배양된 세포에서 보존 한다. 예를 들어 증 착 패턴 유형 IV 콜라겐 변화의 erlotinib 치료 하이드로 겔 문화 (그림 3D)의 시.
그림 1 : 대표 H 1 Thiolated 히 알루 론 산의-NMR 스펙트럼. 통합된 봉우리 HA glucuronic 산 그룹의 대략 5%는 thiol로 수정 된 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 히드로 캡슐화 된 세포의 증식. 12-잘 접시에 조작된 80 µ L 젤의 A) 예제 이미지. 가교, 후 hydrogels 세포 배양 매체에 부 어 했다. 확산 속도의 B) 대표 결과 cytometry 사용 하 여 측정. GBM 셀 (HK301)은 1 µ M와 알을 품을 캡슐화 하거나 뿌리고 후 4 일째에 2.5 h에 대 한 듀 (5-ethynyl-2-deoxyuridine). 클릭 반응 켤레 아오 외 에 설명된대로 법인된 듀 형광 염료를 사용 했다 2017.3 부정적인 컨트롤, 어디 아무 듀 문화에 추가 되었습니다, 포함 했다. C) 대표 confocal 현미경 이미지의 라이브 (녹색) 그리고 죽은 (레드) 세포 24 시간 후에 GBM 셀 (HK157)의 하이드로 겔 문화 설립 되었다. 스케일 바 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 특성화. 0.5% (w/v) HA 히드로 배양 세포 캡슐화 후 8 일에 대 한 다양 한 조건에서의 A) 대표 위상 대비 이미지. 화살표는 침략 적 형태와 셀을 나타냅니다. 생물 발광 신호 B) 대표 이미지 1 µ M erlotinib와 차량 (DMSO) 치료의 15 일 후 측정. 1mm D 소 세포 배양 매체 영상 이전 1 시간에 추가 되었습니다. 셀은 lentivirus 캡슐화 이전 반딧불 luciferase 제정 표현을 위한 인코딩으로 불리고 있었다. C) 대표 면역-오 점 이미지 분석 죽 hydrogels 0.5% (w/v) 하 고 1 kPa 압축 계수에서 경작 하 GBM 셀 (HK301)에 많은 ADP 중 합 효소 (cl-PARP) 식 습. 모든 자른 이미지 표시 같은 오에서 했다. D) 대표 얼룩 콜라겐 IV (녹색) 및 Hoechst 33342 (블루) HK301 셀 하이드로 겔 교양 12 일에에서 1 µ m erlotinib와 차량 (DMSO) 치료 후. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 젤 타입 | 일부는 (40 µ L 각) | 파트 B (40 µ L 각) | ||||
| 4Arm-말뚝-말 (50 mg/mL) | 시스테인 또는 RGD (2.81 m m) | PBS (pH 7.4) | 4Arm-말뚝-thiol (50 mg/mL) | PBS (pH 7.4) | 하-S (13.3 mg/mL) | |
| 0.5% (w/v) HA 1kPa | 10 Μ L | 4.00 Μ L | 26 Μ L | 1.00 Μ L | 9.00 Μ L | 30.0 Μ L |
| 0.5% (w/v) HA 2kPa | 20.0 Μ L | 4.00 Μ L | 16.0 Μ L | 8.00 Μ L | 2.00 Μ L | 30.0 Μ L |
| 0.1% (w/v) HA 1kPa | 10 Μ L | 4.00 Μ L | 26 Μ L | 8.00 Μ L | 26.0 Μ L | 6.00 Μ L |
표 1입니다. 하이드로 겔 제형 저조한 하 농도 및 기계적 특성의 독립 제어.
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Discussion
이 3D 문화 시스템을 사용 하 여 재현할 수 데이터의 생성이 필요 합니다: 1) 일관 된 배치-배치 thiolation HA, 효율적인 히드로 선구자의 혼합 및 히드로의 처리를 달성 하기 위해 연습 2)의 손상을 방지 하기 위해 문화 및 3) 최적화 된 시드 각 셀 라인 사용에 대 한 밀도입니다.
특정 무게 비율 하는 하이드로 겔에서 원할 때 하의 thiolation의 정도 crosslink 밀도를 결정 합니다. 각 thiolation 반응에 대 한 HA의 일관 된 금액을 사용 하 여 일괄 배치 변화를 최소화 하기 위해 하는 것이 좋습니다. 하의는 적어도 300 mg이 좋습니다 thiolated HA의 동일한 배치 여러 실험 반복에 사용할 수 있도록 각 thiolation 반응에 대 한 사용 될. 4 팔 못에 maleimide 그룹 thiols의 어 금 니 비율 항상 최대 가교 효율 1.1:1 될 해야 합니다. 따라서, thiolation의 정도, 변화 하는 경우 다음 못 말 추가 금액 해야 합니다 조정할 수 따라. 펩 티 드 maleimides 젤 형성 이전에 활용은 때 못 팔 닿는 펩 티 드의 추정된 번호가이 계산에 대 한 사용 가능한 maleimides의 총 수에서 공제 해야 합니다. 또한, HA thiolation 해산 하 고 일관 된 겔 화 방지 합니다 이황화 결합 형성을 피하기 위해 10-15% 정도 유지 하는 것이 좋습니다.
Thiol 및 maleimide 그룹 사이 마이클 형 추가 반응 하면 그 겔 분 아래에서 발생. 캡슐화 프로세스와 모든 pipetting 달성 하는 단계를 혼합 경험을 필요로이 빨리 겔 화 셀 하이드로 겔 선구자에 그들의 생존을 손상 될 수 있는 완전 한 매체 없이 시간을 최소화 한다 재현 가능한 결과입니다. 일반적으로, 우리는 새로운 연수생 "진짜" 캡슐화 실험을 수행 하기 전에 셀 없이 겔의 여러 라운드를 연습.
두 가지 요소는 겔 화 속도 조절 하 변화 될 수 있습니다: 반응 온도 전조 pH. 혼합 하는 동안 얼음에 잘 접시를 두어서 반응 온도 낮추면 반응 속도가 느려집니다 하 고 전조 솔루션 혼합 큰 시간에 대 한 제공 합니다. 그러나,이 적절 한 무 균 기술을 사용 하 여 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다. 마찬가지로, 전조 솔루션의 pH 증가 또는 더 높은 또는 낮은 산도 각각 사용 하 여 반응 시간을 감소 변경할 수 있습니다. Thiolated 하는 이황화 결합 형성을 방지 하기 위해 산 성 수에 대 한 dialyzed는, 이후 재구성된 thiolated 하 그렇지 않으면 예상 있을 보다 낮은 pH를 얻을 것입니다. 일반적으로, 20 mM HEPES HBSS 버퍼, pH 9, 조정에서 재구성 7 때 근처 산도 얻을 것입니다 thiolated HA의 15 mg/mL (~ 5 %thiolated) 해산. 사용 좋습니다 pH 6.8-7 thiolated HA 솔루션을 셀 건강을 극대화 하면서도 젤 솔루션의 혼합 수 있도록.
캡슐화 동안 밀도 뿌리기 하는 것은 세포 생존 능력 및 실험의 재현성에 대 한 중요 합니다. 100, 000에서 2000000 셀/mL의 범위에서 뿌리기 것이 좋습니다. 우리는 적어도 3 주간의 실험 기간 내 이상 confluency를 방지 하면서이 범위는 대부분 종류의 세포 생존 능력에 대 한 최적의 나타났습니다. 초기 시드 밀도 생존 능력을 최적화 하는 각 셀 형식 사용에 대 한 실험적으로 결정 되어야 합니다.
익 스 트림 한다 주의 셀 매체를 변경할 때 손상 히드로 문화를 피하기 위해. 특히, 주의 하지 피펫으로에 히드로 발음. 따라서, 하지 진공 포부를 사용 하 고 대신 살 균 전송 피 펫을 사용 하 여 수동으로 발음. 또한 한 번에 잘 문화에서 절반만 매체를 변경 도움이 됩니다.
일반적으로,이 기술은 필요한 수동 손 재주와 일관성을 달성 하는 연습을 해야 합니다. 실험실 전용 프로토콜 설정 되 면 3D 문화 시스템 세포 배양 및 explanted 조직에 대 한 일반적으로 많은 특성화 메서드를 사용 하는 연구원을 수 있습니다. 여기, 우리는 분석, 면역 형광 검사, cytometry, 부 럽, 및 생물 발광 영상, 3D 문화 (그림 2-3)의 포함 하 여에 대 한 몇 가지 기법을 설명 했습니다. 특성화 방법의 자세한 프로토콜, 샤 오 외. 20173를 참조 하십시오. 마지막으로, HA/못 hydrogels 광학 투명으로, confocal 영상를 포함 하 여 표준 가벼운 현미경 검사 법 기술, 라이브, 3D 문화 모니터링 하 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (R21NS093199)와 UCLA 아크 3R의 수상에서 자금을 지원 했다. 우리의 충심으로 감사 합니다는 HK301 및 HK157 셀 라인의 제공에 대 한 닥터 할리 로드의 실험실으로 이동합니다. 우리 또한 감사 UCLA 조직 병리학 코어 연구소 (TPCL) cryosectioning, 고급 조명 현미경/분광학 핵심 시설 (연금)에서 캘리포니아 Nanosystems 연구소 (CNSI) ucla confocal 현미경, UCLA Crump 연구소의 사용에 대 한 IVIS 이미징 시스템, UCLA 분자 계측 센터 (MIC) 흐름에 대 한 계측을 제공 하기 위한 자기 공명 분광학, 및 교류 Cytometry 코어에 Jonsson 종합 암 센터 (JCCC) UCLA에서 제공를 사용 하 여에 대 한 분자 영상 cytometry입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
References
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