Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Количественная оценка деятельности гипопигментация в пробирке

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58185
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Biotechnology, Graduate School of Life Sciences & Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 2JinWoo Bio Co. Ltd

Summary

Мы опишем три экспериментальные методы для оценки деятельности гипопигментация химических веществ в пробирке: количественная оценка деятельности и 2) меланина содержание 1) сотовых тирозиназы и 3) измерение меланина сотовой меланина окрашивание и изображения анализа.

Abstract

Это исследование представляет лабораторных методов для количественной оценки гипопигментация активность в лабораторных условиях. Меланин, основных пигмента в меланоцитов, синтезируется в ответ на несколько клеточных и экологических факторов. Меланин защищает клетки кожи от ультрафиолетового повреждения, но также биофизических и биохимических функций. Чрезмерное производство или накопление меланина в меланоцитов может вызвать дерматологических проблем, таких как веснушки, темные пятна, меланодермия и родинки. Таким образом у людей с клинической или косметических потребностями важен контроль меланогенеза с гипопигментация агентов. Меланин главным образом синтезируется в меланосомы меланоцитов в сложный биохимический процесс, называемый меланогенеза, которая находится под влиянием внешние и внутренние факторы, такие как гормоны, воспаление, возраст и ультрафиолетовых лучей. Мы опишем три метода для определения активности гипопигментация химических веществ или природных веществ в меланоциты: Измерение 1) сотовых тирозиназы активности и содержание меланина 2) и 3) пятная и количественного определения сотовой меланина с изображением анализ.

В меланогенеза тирозиназы катализирует тариф ограничивая шаг, который преобразует L-тирозин в 3,4-Диоксифенилаланин (л-дофа) и затем в допаквинон. Таким образом ингибирования тирозиназы — это основной гипопигментация механизм. В культивированный меланоцитов активность тирозиназы может быть определена количественно, добавляя l-допы как субстрат и измерения допаквинон производства методом спектрофотометрии. Меланогенеза может также измеряться путем количественной оценки содержание меланина. Меланин содержащих сотовой фракция добывается с NaOH и меланина количественно спектрофотометрически. Наконец может быть определена количественно содержание меланина, путем анализа изображений после фонтана-Masson пятнать меланина. Хотя результаты этих анализов в лабораторных условиях не всегда могут быть воспроизведены в коже человека, эти методы широко используются в меланогенеза исследований, особенно в качестве первого шага для выявления потенциальных гипопигментация активности. Эти методы могут также использоваться для оценки активности меланоцитов, роста и дифференцировки. Согласованные результаты с тремя различными методами обеспечения достоверности эффектов.

Introduction

Melanin играет решающую роль в физиологии, патологии и токсикологии ряда органов, включая кожу, глаза и мозг1. Основные функции меланина, Фото скрининг и биохимические эффекты. Меланин поглощает инфракрасный и видимый свет, а также ультрафиолетового (УФ) излучения, с показателями увеличения поглощения при более коротких длинах волн света; Таким образом меланин защищает ткани от повреждения, вызванные видимого света или ультрафиолетового излучения2. Меланин является антиоксидантом и обладает сродством для металлов и других токсичных химических веществ; Таким образом он может защитить тканей от окислительного и химического стресса3. Однако чрезмерное производство меланина вызывает Дерматологические проблемы.

Количество и качество меланина в коже и радужки являются наиболее важными факторами, определяющими цвет радужной оболочки и кожу. Люди могут иметь разные кожи цветовые предпочтения; Некоторые пользу загорелой кожи, в то время как другие выступают светлее цвета кожи. В зависимости от этих профилей потребителя гипопигментация косметики были разработаны для удовлетворения индивидуальных рынков для благоприятствования кожи цвета4. Соответственно исследования гипопигментация и анти melanogenic деятельности являются важными научно и практически.

Меланогенеза — сложный процесс биосинтеза меланина через ряд ферментных и спонтанное химических реакций в меланоциты. Один меланоцит окружена примерно 36 кератиноцитов и меланоцитов являются заводы синтез меланина, которые распространяют их продукт для соседних кератиноцитов. В коже меланин производятся и хранятся в melanosomal отсеке меланоцитов транспортируется в соседних кератиноцитов эпидермиса через дендритов.

L-тирозин служит первоначальный субстрат для меланогенеза и фермента тирозиназы катализирует два последовательных реакций, которые преобразуют L-тирозин в 3,4-Диоксифенилаланин (ДОПЫ), а затем в допаквинон. Эти реакции являются тариф ограничивая шаг в меланогенеза5,6. Соответственно деятельность гипопигментация сначала может измеряться путем оценки активности клеточных тирозиназы непосредственно. Чтобы сделать это, экстракты меланоцитов, содержащие тирозиназы инкубируют с ДОПЫ и допаквинон производится на образцах может измеряться методом спектрофотометрии на 475 Нм. Значения нормализованы по концентрации белка образцов и веществ с гипопигментация результат деятельности в формировании меньше допаквинон, по сравнению с контролем.

Во-вторых гипопигментация активность может быть определена количественно измеряя меланина в культивированный меланоцитов непосредственно. После обработки клеток с испытательным материалом, меланин добывается в щелочных условиях и содержание меланина количественно методом спектрофотометрии на 400 Нм. Агент гипопигментация приведет к более низким содержанием меланина, чем элементы управления7.

Наконец гипопигментация активность может быть квантифицировано фонтана-Masson меланина окрашивание и последующего анализа. В Fontana-Masson окрашивание, гранулы меланина уменьшить аммиака Серебряный нитрат видимое состояние черный металлик и черные области ячеек в микроскопических изображений представляют количество меланина.

Гипопигментация агент обычно дает результаты, последовательной и сопоставимой с помощью этих трех методов, которая подтверждает, что действие вещества является допустимым. Кроме того это может быть полезно для измерения выражение ключевых генов и белков в меланогенеза в ответ на тест вещество для изучения активности гипопигментация. Помимо тирозиназы важнейших ферментов в меланогенеза8являются Тирозиназа связанных белков (ГТО-1) и dopachrome tautomerase (ГТО-2). Транскрипционный фактор фактор транскрипции микрофтальмия связанные (MITF) является основной регулятор меланогенеза и количественная оценка ее уровни выражения гена/белков или промоутера деятельности пробирного также может использоваться для оценки деятельности гипопигментация.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка среднего, соединений и реагенты

  1. Подготовка полного среднего роста B16F10. Дополнение Дульбекко изменение средних орла (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллина/стрептомицина (ПЕШТ).
    1. Чтобы сделать 500 мл полного среднего, смешайте 445 мл среды Дульбекко изменение орла (DMEM) с 50 мл FBS и 5 мл вредителей в стерилизованные стеклянные бутылки 1 Л. После смешивания аккуратно, фильтр среды через фильтр верхней бутылки 0,2 мкм для новой стерилизованные стеклянные бутылки и затем хранить при 4 ° C.
      Предупреждение: Все методы культуры клетки должны проводиться в микробиологической безопасности кабинета с помощью асептического технику для обеспечения стерильности.
  2. Подготовка буфера lysis: 20 мм трис (гидроксиметил) aminomethane, содержащие 0,1% тритон X-100 (v/v) буфера при pH 7.5 (рН скорректирована с HCl). Этот буфер может использоваться для 3 месяцев при хранении при комнатной температуре (RT). Добавление буфера lysis прямо перед использованием ингибиторов протеазы.
  3. Подготовьте ингибитор тирозиназы аналитического буфера. Подготовка 1 M NaH2PO4 (монокальций) и 1 М Na2HPO4 (двухосновной) акций решения. Смешайте 46.3 мл Na2HPO4 и 53,7 мл NaH2PO4 подготовить окончательный объем буфера фосфат натрия 0,1 М (рН 6,8).
    1. Разбавьте полученную смесь до 1 Л (окончательный объем) с H2O. Adjust pH 6.8 окончательного решения. Этот буфер может быть использован для 1 месяц при температуре 4 ° C.
  4. Подготовка раствора субстрата тирозиназы: 0.1% 3,4-дигидрокси L-фенилаланин (ДОПЫ, w/v) растворяют в буфере пробирного ингибитор тирозиназы (обратитесь к шагу 1.3).
    ВНИМАНИЕ: Держите на льду во время использования.
  5. При необходимости подготовьте 100 ед/мл грибов тирозиназы. Растворите лиофилизированные грибов тирозиназы в буфере пробирного ингибитор тирозиназы. Это решение может быть использован для 2 месяцев при температуре 20 ° с. Гриб тирозиназы деятельность, а также активность тирозиназы сотовой рассчитываются присутствии ячейки материалов.
    Предупреждение: Решение aliquoted до замораживания таким образом повторил, что можно избежать замораживания и оттаивания. Держите решение на льду во время использования.
  6. Готовят раствор 1 N NaOH. Весят 4 г NaOH в объемном колбу и растворяют в дистиллированной воды, чтобы сделать 100 мл.
  7. Готовят раствор фиксации (формалина 10%). Разбавьте 27 мл 37% формальдегида с 73 мл дистиллированной воды. Подготовьте свежий ежедневно.
  8. Подготовьте аммиачный раствор серебра запасов. Подготовьте 5 мл 10% раствора нитрата серебра в объемном колбе. Добавьте раствор гидроксида аммония каплям, до тех пор, пока полностью не растворится осадок. Добавьте 200 мкл раствора нитрата серебра (10%). Решение станет немного облачно.
    Предостережение: Избегайте контакта и ингаляции. Использование вытяжного шкафа.
  9. Подготовьте аммиачный раствор серебра рабочих. Разбавьте 2,5 мл раствора аммиачного серебра запасов с 7,5 мл дистиллированной воды. Использовать один раз и затем отменить.
    Предостережение: Избегайте контакта и ингаляции. Использование вытяжного шкафа.
  10. Подготовьте хлорид 0,1% золота. Подготовка 1 мл 10% золота хлорида и добавить 99 мл дистиллированной воды в объемном колбе. Подготовьте свежий ежедневно.
  11. Подготовьте фосфатный буфер (PBS). Добавьте 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4 и 0,24 г х2PO4 800 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 с HCl. развести получившаяся смесь до 1 Л (окончательный объем) с дистиллированной водой.
  12. Подготовьте 5% (w/v) раствора тиосульфата натрия растворяют в дистиллированной воде.

2. клетки культуры и лечение

  1. Использование коммерчески доступных B16F10 клеток. Сохраняйте B16F10 клетки в полной среды. Хранить настой культуры клеток в увлажненные, 5% CO2 атмосферы инкубатора 37 ° c.
  2. Подготовка испытания соединений, ингибитор положительный контроль и отрицательных контрольных образцов.
    1. Растворите испытаний соединений в соответствующие растворители. Растворите водорастворимых соединений в двойной дистиллированной воды. Растворять нерастворимые соединения воды в соответствующих органических растворителей, например., ДМСО.
    2. Здесь используйте арбутин, растворенных в двойной дистиллированной воды (125 мкг/мл) как позитивный элемент управления для оценки активности гипопигментация, по сравнению с испытаний соединений или отрицательного контроля. Как негативное (контроль транспортного средства лечение), используйте решения или буферов, используемых в испытательный образец, например, двойной дистиллированной воды, ДМСО, этанола.
  3. Заполнение ячеек и лечение
    1. Семя B16F10 клетки на 5 × 104 клетки/также в 24-ну культуры пластины с помощью полного среднего и инкубировать в инкубатор CO2 на 24 часа. После инкубации аспирационная полного среднего.
    2. Инкубируйте клетки с среде DMEM (без FBS и 1% пенициллина/стрептомицина) содержащий тест соединения, ингибитор управления или отрицательный контроль в CO2 инкубатора для 72 ч. Проверка клетки каждые 24 ч под микроскопом. После этого шага чтобы выполните шаги 3-5 для дальнейших экспериментов.
      Предупреждение: Смесь из испытываемого вещества и среде DMEM следует процедить через фильтр 0.2 мкм.

3. измерение активности тирозиназы сотовой

  1. С помощью метода, описанного в шаге 2, удалите СМИ и промойте клетки дважды 300 мкл холодной PBS.
  2. Место пластину культуры клеток на льду. Добавить 300 мкл буфера lysis и инкубировать в течение 5 мин. Затем собрать клетки lysate клетки скребком и передачи lysate клетки пробки microcentrifuge 1,5 мл.
  3. Однородный lysate клетки с ячейки гомогенизатор на 14 500 об/мин на 2 сек, 3 раза на льду для получения внутриклеточных тирозиназы. Используйте оптимальное состояние, специфичных для гомогенизатора.
  4. Центрифуга для 10 мин на 12 000 × g при 4 ° C и передачи супернатанта клетки пробки microcentrifuge 1,5 мл. Держите на льду во время использования.
  5. Передать 70 мкл супернатант 96-луночных ясно полистирола микроплиты.
  6. Добавить 140 мкл раствора, содержащего тирозиназы субстрата (ДОПЫ) до 96-луночных ясно полистирола микроплиты, осторожно встряхнуть и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C.
  7. Дополнительно, добавить 70 мкл грибов тирозиназы раствора 100 ед/мл для каждой скважины и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C.
  8. Измерения активности тирозиназы на длине волны 475 Нм, используя Считыватель микропланшетов.
  9. Нормализует активность тирозиназы концентрацию белка каждого образца. Измерьте концентрацию белка каждого образца assay Брадфорд.

4. Измерение содержание меланина

  1. С помощью метода, описанного в шаге 2, удалите СМИ и промойте клетки дважды 300 мкл холодной PBS.
  2. Место пластину культуры клеток на льду. Добавить 300 мкл буфера lysis и инкубировать в течение 5 мин. Затем собрать клетки lysate клетки скребком и передачи lysate клетки пробки microcentrifuge 1,5 мл.
  3. Центрифуги для 10 мин на 12 000 × g при 4 ° C.
  4. Передать новые концентрации общего белка трубки и меры для нормализации супернатант. Измерьте концентрацию белка каждого образца assay Брадфорд.
  5. Добавить 300 мкл 1 N NaOH в каждом Пелле и Инкубируйте на 60 ° C в течение 1 ч.
  6. Центрифуга для растворенных решение для 10 мин на 12 000 × g при 4 ° C.
  7. Передать 96-луночных микропланшетов 200 мкл супернатант.
  8. Измерить содержание меланина на длине волны 400 Нм.
  9. Нормализуют содержание меланина к концентрации белка.

5. фонтана – Masson пятнать

  1. Fontana-Masson пятнать
    1. Вымойте клетки дважды 300 мкл холодной PBS.
    2. Добавить 200 мкл формалина 10% для каждой скважины и инкубировать 1 час при 4 ° C.
    3. Промойте с дистиллированной водой.
    4. Добавить 200 мкл подогретым аммиачного серебра рабочего раствора и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C или до тех пор, пока клетки становятся желто коричневый цвет.
      Предупреждение: Место свежезаваренным смешанные аммиачный раствор серебра рабочих в водяной бане 58 – 60° C и отвести достаточно времени для температуры сбалансировать.
    5. Удалите рабочий раствор аммиачного серебра и смойте дистиллированной водой.
    6. Удаление дистиллированной воды. Добавить 200 мкл хлорида 0,1% золота и проинкубируйте 2 мин на RT.
    7. Удаление 0,1% раствором хлорида золота и смойте дистиллированной водой.
    8. Удаление дистиллированной воды. Добавить 200 мкл раствора тиосульфата натрия (5%, w/v) и инкубировать в течение 2 мин.
    9. Удалить раствор тиосульфата натрия и смойте дистиллированной водой.
    10. Удаление дистиллированной воды. Добавить 200 мкл ядерной быстро красного и инкубировать в течение 5 мин.
    11. Удаление ядерных быстро красный и промыть водопроводной воды.
    12. Удаление водопроводной воды и наблюдать окрашенных клеток под микроскопом.
  2. Fontana-Masson окрашивание (порог анализ с использованием ImageJ)
    Примечание: Пример процедуры анализа изображений, с помощью программного обеспечения ImageJ показан в дополнительных материалах.
    1. Откройте программу ImageJ.
    2. Выберите файл | Открытый | Микроскоп изображение.
    3. Выберите изображение, | Отрегулируйте | Цветовой порог.
    4. Измерить область, окрашенных с фонтана – Masson, равным нулю, панель параметров яркости и отрегулировать яркость панели, чтобы найти точку, в которую включены все окрашенные клетки (черный или темно-коричневый).
    5. Выберите анализировать | Анализ частиц. Установите флажок итоги в окне анализ частиц и нажмите OK. Получить резюме результатов и вставить в таблицу.
      Примечание: Описание результирующее поле параметров являются следующие:
      Фрагмент: Название каждого изображения
      Количество: Количество окрашенных клеток
      Общая площадь: Общая площадь подсчет клеток
      Средний размер: Общая площадь/Кол
      % Площади: Витражи Площадь/общая площадь × 100%; Общая площадь вычисляется автоматически.
    6. Рассчитать относительную площадь витражи с меланина, с использованием значения общей площади.
      Относительный меланина, окрашенных области (%) = значение сотовой площадь тестирования образца/Средняя общая площадь управления × 100, т.е.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представитель результаты деятельности гипопигментация арбутин, анти melanogenic соединения, в B16F10, меланоцитов приведены ниже. Рисунок 1A показывает, что арбутин значительно подавлена деятельность клеточных тирозиназы, по сравнению с элементом управления, транспортное средство лечение. Аналогичным образом содержание меланина клетки стимулируется с арбутин, значительно сократилось по сравнению с элементами управления (рис. 1B). Микроскопических изображений клеток окрашенных с фонтана-Masson пятно показаны на рисунке 1 c. Арбутин лечения уменьшилась площадь черного пигмента, по сравнению с элементом управления.

Figure 1
Рисунок 1 : Арбутин подавлены меланогенеза в меланоцитах. B16F10 клетки обрабатывали арбутин (125 мкг/мл) за 72 ч. а. Активность клеточных тирозиназы. Б. содержание меланина. C. меланина был визуализирован с фонтана-Masson пятно. Данные являются средства ± SEM (n = 4). Статистические сравнения выполнялись с помощью t критерия Стьюдента (p значений < 0,05 считались статистически значимым). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы представили протоколы для оценки гипопигментация активности тестирования соединений с помощью искусственного меланоцитов. Представитель результаты показали гипопигментация эффект арбутин, ингибитор тирозиназы, который препятствует тирозиназы активности и сотовых содержание меланина. Эти методы широко используются в анти melanogenic исследовательской деятельности. С помощью этих анализов, мы также успешно определили несколько биоактивных соединений, которые имеют меланогенеза тормозящее действие на B16F10 клетки в прошлом десятилетии9,10,11,12, 13 , 14.

Меланин вырабатывается меланосомы в различных пигментных клеток, в том числе меланоцитов в коже. В этом исследовании мы использовали B16F10 клетки меланомы, которые производят меланина, который вызывает культуры среднего стать темно коричневый или черный15. Основная меланоцитов может быть биологически важные инструменты для изучения в естественных условиях эффекты, но из-за их ограниченных возможностей пролиферативных и изменчивость в фенотипов генерируется, культивированный меланоцитов считаются надежными в пробирке модель16. Меланогенеза этой клеточной линии сопоставимы с результатами первичных меланоцитов. Этот метод лучше представляет клеточной среды чем деятельности пробирного грибов тирозиназы, в котором фермента непосредственно инкубировали с подложкой и гипопигментация тест соединения.

Перед выполнением этих экспериментов, может быть необходимо для выполнения анализа 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium бромид (МТТ) или сопоставимые анализов, таких как assay клетки фиолетовый, с compound(s) теста. Если испытываемое вещество влияет на пролиферацию клеток или экспонатов цитотоксичность, затем меланоцит роста могут быть затронуты, и результаты не могут правильно представляют активности клеточных тирозиназы. Химических веществ или природные вещества в высоких концентрациях часто имеют некоторые цитотоксичности и это особенно важно для веществ с мягким действием. Это также не редкость для веществ и натуральных экстрактов для содействия клеточной пролиферации и дифференцировки. Следовательно следует изучить возможности для дополнительных биологическую, вызывая рост клеток, хотя эти воздействия на рост клеток могут быть скорректированы путем нормализации деятельности с концентрацией белка.

Различные механизмы могут привести к гипопигментация, зависит от активности тирозиназы. Меланогенеза является сложным биосинтетических путь, который включает в себя несколько сигнальных путей и транскрипционным фактором деятельности17. Таким образом выражение ключевых генов и белков и melanogenic сигнальных путей может рассматриваться для углубленного изучения гипопигментация. MITF является важным транскрипционным фактором меланогенеза и α-меланоцит стимулирующий гормон (α-МСГ) могут стимулировать melanogenic сигнала трансдукции пути18,19. В зависимости от их известные биологические характеристики можно продолжить изучение соответствующих сигнальных путей.

При измерении содержание меланина, полученные значения следует также нормализовать концентрацию белка, таким образом, чтобы результаты правильно представляют содержание меланина в ячейке или в культуры области20. Кроме того фенол красный свободные среднего рекомендуется на шаге составные лечения во избежание негативного воздействия фенола красного на поглощение.

Для окрашивания меланина, мы использовали фонтана-Masson пятно, которое обнаруживает argentaffin веществ, таких, как меланин и argentaffin клеток,21. Этот метод используется также для парафина или замороженные в разделе образцы после депарафинизации шаг. Реагентов, используемых в этом эксперименте вредны; следует избегать контакта и ингаляции, и реагенты должны использоваться только в Зонта, когда это возможно. После окрашивания, ImageJ используется для вычисления окрашенные области. С фонтана-Masson окрашивание это может быть трудно интерпретировать, слабый пятнать в малонаселенных позитивных клеток; Однако это не может быть проблемой для меланина богатые меланоцитов. Нитрата серебра, аммиачного серебра, Тиосульфат натрия и Гидроксид аммония, используемых в экспериментах должны быть обработаны с осторожностью из-за их токсичности.

Они широко используются методы в области меланогенеза и гипопигментация, потому что они являются быстрый, удобный, экономически эффективных и надежной. Эти методы могут быть полезны для следователей, которые хотят определить Роман соединений или экстрактов с анти melanogenic или про melanogenic деятельности. Они могут также использоваться для оценки роста меланоцит клеток или клеточную активность. Единственным ограничением является воспроизводимость результатов на кожу человека, который является сложный орган, в котором поддерживается гомеостаз в ответ на различных экологических, химических и биологических факторов. Таким образом гипопигментация агентов, подтвердили эти методы в пробирке может не иметь значительное воздействие на кожу человека в естественных условиях.

Таким образом эти протоколы являются важным первым шагом в проверке испытания соединений для их тормозящее действие на меланогенеза. Мы предлагаем, что эти методы можно объяснить не только тормозящее действие на меланогенеза, но также механизм участвующих. После того, как определены биоактивные кандидат соединений, дальнейшее тестирование может привести к исследования биологических механизмов или коммерческих приложений, а затем в естественных условиях использования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют не раскрытия информации для доклада.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Кореи институт планирования и оценки технологии в продовольствия, сельского и лесного хозяйства (IPET) через программу развития технологии Agri-биоиндустрии, финансируемая министерством сельского хозяйства, продовольствия и сельских дел (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) и школа наук о жизни и биотехнологии для BK21 плюс, Университет Кореи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine Sigma D9628
Ammonium hydroxide solution Sigma #320145
Arbutin Fluka #10960
DMEM HyClone SH30243.01
FBS HyClone SH30084.03
Formalin Yakuri Pure Chemicals #16223 37%
Gold chloride American MasterTech AHG0226 0.10%
HCl Samchun chemical H0255
KCl Bio basic Canada Inc. PB0440
KH2PO4 Sigma #60218
Na2HPO4 J.T.Baker #3817-01
NaCl Duksan pure chemicals #81
NaOH Sigma 655104
Nuclear fast red Merck 100121 Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution HyClone SV30010
Silver nitrate Duksan Pure Chemicals #900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) J.T. Baker #3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) Sigma S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate Duksan Pure Chemicals #2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Bio Basic Canada TB0196
Triton X-100 Union Carbide T8787
Tyrosinase from mushroom Sigma T3824 25 KU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
  2. Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
  3. Galvan, I., Solano, F. Melanin chemistry and the ecology of stress. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).
  4. Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
  5. Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
  6. Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
  7. Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
  8. Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
  9. Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
  10. Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
  11. Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
  12. Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
  13. Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
  14. Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
  15. Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER 20, Unit 20.1 (2001).
  16. Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
  17. D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. Signaling pathways in melanogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).
  18. Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
  19. Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
  20. Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
  21. Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).

Tags

Биохимия выпуск 145 гипопигментация меланогенеза активность тирозиназы содержание меланина меланоцитов фонтана-Masson пятно
Количественная оценка деятельности гипопигментация в пробирке
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, Y. J., Kim, M. J., Kweon, D.… More

Kim, Y. J., Kim, M. J., Kweon, D. K., Lim, S. T., Lee, S. J. Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e58185, doi:10.3791/58185 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter