Summary
체 외 화학 물질의 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위한 세 가지 실험 방법 설명: 1) 셀룰러 tyrosinase 활동과 2) 멜 라 닌 콘텐츠, 및 3) 멜 라 닌 세포의 멜 라 닌 얼룩 및 이미지 분석에 의해 측정의 정량화.
Abstract
이 연구는 생체 외에서 hypopigmentation 활동의 정량화에 대 한 실험실 방법을 선물 한다. Melanocytes에 주요 안료 멜 라 닌은 여러 세포와 환경 요인에 대 한 응답에서 합성 됩니다. 멜 라 닌 자외선 손상 으로부터 피부 세포를 보호 하지만, 또한 생물 및 생 화 확 적인 기능을가지고. 과도 한 생산 또는 축적 melanocytes에 멜 라 닌의 주 근 깨, 검 버섯, melasma, 사마귀 등 피부 문제를 일으킬 수 있습니다. 따라서, hypopigmentation 에이전트 melanogenesis 제어 임상 또는 화장품 요구와 개인에서 중요 하다. 멜 라 닌은 주로 외부 영향 melanogenesis 라는 복잡 한 생 화 확 적인 과정에 내재 성 요인, 호르몬, 염증, 나이, 등 자외선 빛 노출 melanocytes melanosomes에 합성 됩니다. 우리는 화학 물질 또는 melanocytes에 자연 물질의 hypopigmentation 활동을 결정 하는 세 가지 방법을 설명: 1) 셀룰러 tyrosinase 활동 및 2) 멜 라 닌 콘텐츠 및 이미지 3) 얼룩과 측량 셀룰러 멜 라 닌의 측정 분석입니다.
Melanogenesis에서 tyrosinase L-티로신 그리고 dopaquinone로 3, 4-dihydroxyphenylalanine (l 아미노산의 일종)으로 변환 하는 속도 제한 단계 catalyzes. 따라서 tyrosinase의 저해는 기본 hypopigmentation 메커니즘입니다. 교양된 melanocytes에 tyrosinase 활동 기판으로 아미노산의 일종을 추가 하 고 dopaquinone 생산 분 광 광도 법으로 측정 하 여 측정할 수 있습니다. Melanogenesis 또한 멜 라 닌 콘텐츠를 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 포함 하는 멜 라 닌 세포 일부는 NaOH와 함께 추출 되 고 멜 라 닌 spectrophotometrically 계량. 마지막으로, 멜 라 닌 콘텐츠 폰 타나-마 송 멜 라 닌의 얼룩이 다음 이미지 분석에 의해 측정할 수 있습니다. 이러한 생체 외 분석 실험의 결과 항상 복제 될 수 없다 인간의 피부에, 비록 이러한 메서드는 널리 특히 잠재적인 hypopigmentation 활동을 식별 하는 초기 단계로 melanogenesis 연구에 사용. 이 방법 또한 melanocyte 활동, 성장과 분화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 세 가지 다른 방법으로 일관 된 결과 효과의 유효성을 확인합니다.
Introduction
멜 라 닌은 생리학, 병리학, 피부, 눈, 뇌1등 여러 장기의 독성에 중요 한 역할을 한다. 멜 라 닌의 주요 기능 사진 심사 및 생 화 확 적인 효과가 있습니다. 멜 라 닌 근처-적외선과 보이는 빛으로 자외선 (UV) 방사선, 짧은 파장의 빛;에서 증가 흡수 속도와 흡수 따라서, 멜 라 닌 가시광선 이나 자외선 방사선2로 인 한 손상 으로부터 조직을 보호 합니다. 멜 라 닌은 항 산화 및 금속과 다른 독성 화학 물질;에 대 한 선호도 따라서, 그것은 산화 화학 스트레스3에서 조직을 보호할 수 있습니다. 그러나, 멜 라 닌의 과도 한 생산 피부 문제를 발생합니다.
피부와 홍 채에 있는 melanin의 품질과 수량은 아이리스와 피부 색깔의 가장 중요 한 결정 요인. 개인은 다른 피부 색깔 기본 설정; 있을 수 있습니다. 다른 더 가벼운 피부 색깔을 선호 하는 동안 일부 검게 그을린된 피부를 선호 합니다. 이러한 소비자 프로 파일에 따라 hypopigmentation 화장품 선호 피부 색상4에 대 한 개별 시장을 만족 시키기 위해 개발 되었습니다. 따라서, hypopigmentation 및 안티 melanogenic 활동의 연구 모두 과학적으로 그리고 실제적으로 중요 하다.
Melanogenesis는 멜 라 닌 생 합성 효소 및 자발적인 화학 반응을 melanocytes에 일련의 복잡 한 프로세스입니다. 한 melanocyte 약 36 keratinocytes 둘러싸여 있으며 melanocytes 이웃 keratinocytes 그들의 제품을 배포 하는 멜 라 닌 합성 공장. 피부에 멜 라 닌을 생산 하 고 melanocytes의 melanosomal 구획에 저장 dendrites 통해 표 피에에서 인접 keratinocytes에 수송 된다.
L-티로신 melanogenesis 및 효소 tyrosinase 초기 기판 catalyzes L-티로신 그리고 dopaquinone로 3, 4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)으로 변환 하는 두 개의 연속 반응을 제공 합니다. 이러한 반응 속도 제한 단계 melanogenesis5,6에 있습니다. 따라서, hypopigmentation 활동 세포 tyrosinase 활동을 직접 평가 하 여 먼저 측정할 수 있습니다. 이렇게 하려면 melanocyte 추출 tyrosinase를 포함 하는 인 큐베이 팅 DOPA와 및 dopaquinone 샘플에서 475에 분 광 광도 법으로 측정 될 수 있다 nm. 값은 샘플, 및 컨트롤에 비해 적은 dopaquinone 형성에 hypopigmentation 활동 결과와 물질의 단백질 농도 의해 정규화 됩니다.
둘째, hypopigmentation 활동 교양된 melanocytes에 멜 라 닌을 직접 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 시험 체와 세포 치료, 후 멜 라 닌 알칼리 조건 하에서 추출 되 고 멜 라 닌 콘텐츠 400 분 광 광도 법으로 정량 nm. Hypopigmentation 에이전트 컨트롤7보다 더 낮은 melanin 내용을 발생 합니다.
마지막으로, hypopigmentation 활동 폰 타나-마 송 melanin 얼룩 및 후속 이미지 분석 하 여 측정할 수 있습니다. 폰 타나-마 송 얼룩에 멜 라 닌과 립을 보이는 검은 금속 상태로 암모니아-실버 질산염을 줄일 하 고 미세한 이미지 셀의 검정 영역은 멜 라 닌의 양을 나타내며.
Hypopigmentation 에이전트 보통 제공 일관 되 고 비교 결과이 세 가지 방법으로는 물질의 활동 올바른지 확인 합니다. 또는, 그것은 주요 유전자와 단백질 melanogenesis hypopigmentation 활동을 조사 하는 시험 물질에 대 한 응답에서에 식을 측정 하기 유용할 수 있습니다. Tyrosinase, 뿐만 아니라 tyrosinase 관련 (TRP-1) 단백질과 dopachrome tautomerase (TRP-2) melanogenesis8에 중요 한 효소는. 녹음 방송 요인 microphthalmia 관련 된 전사 요소 (MITF) melanogenesis는 유전자/단백질 식 레벨의 정량화에 마스터 레 귤 레이 터 또는 발기인 활동 분석 결과 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 매체, 화합물, 및 시 약의 준비
- B16F10 성장 전체 매체를 준비 합니다. 보충 Dulbecco의 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 (해충)이 글의 중간 (DMEM) 수정.
- 완전 한 매체의 500 mL을 FBS와 1 패 멸 균된 유리병에 해충의 5 mL 50 mL와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)의 445 mL를 혼합 한다. 부드럽게 혼합 후 새로운 소독된 유리 병을 4 ° c.에 다음 저장소 0.2 µ m 병 상위 필터를 통해 매체 필터링
주의: 모든 셀 문화 기술은 미생물 안전 무 균을 보장 하기 위해 무 균 기술을 사용 하 여 캐비닛에 이루어져야 한다.
- 완전 한 매체의 500 mL을 FBS와 1 패 멸 균된 유리병에 해충의 5 mL 50 mL와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)의 445 mL를 혼합 한다. 부드럽게 혼합 후 새로운 소독된 유리 병을 4 ° c.에 다음 저장소 0.2 µ m 병 상위 필터를 통해 매체 필터링
- 세포의 용 해 버퍼 준비: 0.1% 트라이 톤 X-100 (v/v) 버퍼 pH 7.5 (pH 조정 HCl)를 포함 하는 20 m m Tris (hydroxymethyl) aminomethane. 3 개월 동안이 버퍼를 사용할 수 있습니다 (RT) 실내 온도에 저장 될 때. Protease 억제제 사용 하기 바로 전에 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.
- Tyrosinase 억제 물 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 1 M NaH2포4 (이수소) 및 1 M 나2HPO4 (염기) 재고 솔루션을 준비 합니다. 나2HPO4 의 0.1 M 나트륨 인산 염 버퍼 (pH 6.8)의 최종 볼륨을 준비가 NaH2포4 의 53.7 mL 46.3 mL를 혼합.
- 6.8에 마지막 해결책의 pH H2o. 조정 1 l (최종 볼륨) 결과 혼합물을 희석. 이 버퍼는 1 달 동안 사용할 수 있습니다 4 ° c.에 저장 될 때
- Tyrosinase 기판 솔루션 준비: tyrosinase 억제 물 분석 결과 버퍼에 녹아 있는 0.1 %3, 4-dihydroxy-L-페닐알라닌 (DOPA, w/v) (1.3 단계 참조).
주의: 사용 하는 동안 얼음에 계속. - 100 U/mL 버섯 tyrosinase를 준비. Tyrosinase 억제 물 분석 결과 버퍼에서 동결 건조 된 버섯 tyrosinase 해산. 2 개월 동안이 솔루션을 사용할 수 있습니다 – 20 ° c.에 저장 될 때 버섯 tyrosinase 활동 뿐만 아니라 세포 tyrosinase 활동 셀 재료의 계산 됩니다.
주의:이 솔루션은 피할 수 있습니다 동결 및 해 동을 반복 따라서 동결 전에 aliquoted. 계속 사용 하는 동안 얼음에 솔루션. - 1 N NaOH 솔루션을 준비 합니다. 그리고 무게 부피 플라스 크에 NaOH의 4 g을 100 mL의 증류수에 용 해.
- 고정 솔루션 (10% 포 르 말린)를 준비 합니다. 희석 증류수의 73 mL와 함께 37% 포름알데히드의 27 mL. 신선한 매일을 준비 합니다.
- 암모니아 실버 재고 솔루션을 준비 합니다. 5 mL 부피 플라스 크에 10% 실버 질산염 솔루션의 준비. 침전은 완전히 용 해 될 때까지 dropwise, 수산화 암모늄 솔루션을 추가 합니다. 200 μ의 실버 질산염 용액 (10%)를 추가 합니다. 솔루션은 약간 흐린 될 것입니다.
주의: 접촉 및 흡입을 피하십시오. 사용 하 여 증기 두건. - 암모니아 실버 작업 솔루션을 준비 합니다. 7.5 mL 증류수와 암모니아 실버 재고 솔루션의 2.5 mL를 희석. 한 번 사용 하 고 삭제.
주의: 접촉 및 흡입을 피하십시오. 사용 하 여 증기 두건. - 금 0.1% 염화를 준비 합니다. 골드 10% 염화 물의 1 mL를 준비 하 고 부피 플라스 크에 증류수의 99 mL를 추가 합니다. 신선한 매일을 준비 합니다.
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 준비 합니다. 8 g의 NaCl, KCl, 0.2 g 1.44 g Na2HPO4 의 KH2포4 증류수 800 ml에서의 0.24 g을 추가 합니다. HCl. Dilute 증류수 1 l (최종 볼륨) 결과 혼합물과 7.4에 pH를 조정 합니다.
- 증류수에 용 해 하는 5% (w/v) 나트륨 thiosulfate 솔루션을 준비 합니다.
2. 세포 배양 및 치료
- 상업적으로 이용 가능한 B16F10 세포를 사용 합니다. 완전 한 매체에서 B16F10 세포를 유지 합니다. 습도에 셀 문화 플라스 크를 계속 5% CO2 분위기 인큐베이터에서 37 ° c.
- 테스트 화합물, 억제제 긍정적인 통제, 및 부정적인 제어 샘플을 준비 합니다.
- 적절 한 용 매에 있는 시험 화합물을 디졸브. 이중 증 류 물에서 물 녹는 화합물을 디졸브. 적절 한 유기 용 매, 예물 불용 성 화합물을 분해., DMSO.
- 여기, 사용 알 부 틴 테스트 화합물 또는 부정적인 통제와 비교 된 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위해 긍정적인 컨트롤로 이중 증 류 물 (125 μ g/mL)에 녹. 부정적인 통제 (차량 처리 제어) 사용 하 여 솔루션 또는 테스트 샘플, 예를 들어, 이중 증 류 물, DMSO, 사용 버퍼 에탄올.
- 셀 시드 및 치료
- 5 × 104 씨 B16F10 세포 세포/완전 한 매체를 사용 하 여 24-잘 배양 배지에서 잘 하 고 24 h에 대 한 CO2 배양 기에서 품 어. 부 화, 후 완전 한 매체 발음.
- DMEM 매체 (FBS와 1% 페니실린/스) 없이 테스트 화합물, 억제제 컨트롤 또는 72 h. 검사 세포는 현미경 아래 모든 24 h에 대 한 CO2 배양 기에서 부정적인 컨트롤을 포함 하는 셀을 품 어. 이 단계 후 추가 실험을 위한 단계 3-5로 이동 합니다.
주의: 시험 물질과 DMEM 매체의 혼합 0.2 μ m 필터를 통해 필터링 해야 합니다.
3. 세포 Tyrosinase 활동 측정
- 2 단계에서에서 설명 하는 방법을 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 차가운 PBS의 300 μ로 두 번 셀 린스.
- 얼음에 셀 문화 접시를 놓습니다. 300 μ의 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 5 분 동안 품 어. 다음 세포 lysate 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 수집 하 고 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 lysate를 전송할.
- 14500 rpm 2 셀 균질 화기와 세포 lysate를 균질 s, 세포내 tyrosinase를 얼음에 3 번. 균질 화기에 대 한 최적의 상태로 관련을 사용 합니다.
- 4 ° C에서 12000 × g 에서 10 분 동안 centrifuge 고 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 표면에 뜨는 전송. 사용 하는 동안 얼음에 계속.
- 96-잘 분명 폴리스 티 렌 microplate에는 상쾌한의 70 μ를 전송.
- Tyrosinase 기판 (DOPA) 96-잘 분명 폴리스 티 렌 microplate에를 포함 하는 솔루션의 140 μ를 추가 하 고, 부드럽게, 동요 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어
- 옵션, 추가 100 U/mL 버섯 tyrosinase 솔루션의 70 μ 각 잘 하 고 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어
- 475의 파장에서 tyrosinase 활동 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.
- 각 샘플의 단백질 농도를 tyrosinase 활동 정상화. Bradford 분석 실험에 의해 각 샘플의 단백질 농도 측정 합니다.
4. 멜 라 닌 함량을 측정
- 2 단계에에서 설명 된 메서드를 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 차가운 PBS의 300 μ로 두 번 셀 린스.
- 얼음에 셀 문화 접시를 놓습니다. 300 μ의 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 5 분 동안 품 어. 다음 세포 lysate 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 수집 하 고 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 lysate를 전송할.
- 4 ° c.에 12000 × g 에서 10 분 원심 분리기
- 새로운 튜브 정규화에 대 한 측정 총 단백질 농도 상쾌한 전송. Bradford 분석 실험에 의해 각 샘플의 단백질 농도 측정 합니다.
- 각 펠 릿에 300 μ 1 N NaOH의 추가 하 고 1 시간에 60 ° C에서 품 어.
- 녹은 솔루션 4 ° c.에 12000 × g 에서 10 분 원심
- 96-잘 microplate에는 상쾌한의 200 μ를 전송.
- 400의 파장에서 멜 라 닌 내용을 측정 nm.
- 멜 라 닌 콘텐츠 단백질 농도를 정상화.
5. 폰 타나-마 송 얼룩
- 폰 타나-마 송 얼룩
- 셀 차가운 PBS의 300 μ로 두 번 씻는 다.
- 각 잘을 10% 포 르 말린의 200 μ를 추가 하 고 1 시간 4 ° c.에 대 한 품 어
- 증류수로 씻어.
- 200 μ의 미리 데워 진 암모니아 솔루션 작업을 추가 하 고 37 ° C에 또는 셀 색깔에 황색/갈색 될 때까지 1 시간에 품 어.
주의: 58-60 ° C 물 욕조에 갓 혼합된 암모니아 실버 작업 솔루션 놓고 온도 equilibrate를 위한 충분 한 시간을 허용 합니다. - 암모니아 실버 솔루션 작업을 제거 하 고 증류수로 헹 구 십시오.
- 증류수를 제거 합니다. 금 0.1% 염화의 200 μ를 추가 하 고 실시간에 2 분 동안 품 어
- 0.1% 골드 염화 솔루션을 제거 하 고 증류수로 헹 구 십시오.
- 증류수를 제거 합니다. 나트륨 thiosulfate 솔루션 (5%, w/v)의 200 μ를 추가 하 고 2 분 동안 품 어.
- 나트륨 thiosulfate 솔루션을 제거 하 고 증류수로 헹 구 십시오.
- 증류수를 제거 합니다. 핵 빠른 레드의 200 μ를 추가 하 고 5 분 동안 품 어.
- 핵 빠른 붉은 색을 제거 하 고 수돗물으로 씻어.
- 수돗물을 제거 하 고 관찰 하는 현미경으로 얼룩진된 셀.
- 폰 타나-마 송 (임계값 분석 사용 하 여 ImageJ) 얼룩
참고: ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 분석 절차의 예는 보충 자료에 표시 됩니다.- ImageJ 프로그램을 엽니다.
- 파일을 선택 | 오픈 | 현미경 이미지.
- 이미지 선택 | 조정 | 임계값 색상.
- 폰 타나-마 송 물 면적 측정, 밝기 매개 변수 바는 0으로 설정 하 고는 모든 스테인드 셀 (검정 또는 진한 갈색) 포함 됩니다 지점을 찾기 위해 밝기 막대를 조정 합니다.
- 선택 분석 | 입자 분석. 분석 입자 창에서 요약 상자를 확인 하 고 확인을 누릅니다. 요약 결과 얻을 하 고 스프레드시트에 붙여 넣습니다.
참고 설명 결과 상자 매개 변수는 다음과 같습니다.:
각 이미지의 슬라이스: 이름
카운트: 스테인드 셀 수
계산된 셀의 총 면적: 총 면적
평균 크기: 총 면적/수
% 지역: 스테인드 영역/총 면적 × 100%; 총 면적 자동으로 계산 됩니다. - 상대적 계산 지역 전체 면적의 값을 사용 하 여 멜 라 닌으로 물.
상대 멜 라 닌 스테인드 영역 (%) = 제어 × 100, 즉, 의 테스트 샘플/평균 전체 면적의 총 세포질 영역의 값
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Representative Results
알 부 틴, 안티-melanogenic의 hypopigmentation 활동에 대 한 대표적인 결과 화합물, B16F10 melanocytes 다음과 같습니다. 그림 1A 는 그 알 부 틴은 크게 차량 처리 제어에 비해 세포 tyrosinase 활동 억제를 보여 줍니다. 마찬가지로, 알 부 틴과 자극된 세포의 멜 라 닌 콘텐츠 컨트롤 (그림 1B)에 비해 감소 크게 되었다. 셀 폰 타나-마 송 얼룩과 얼룩의 현미경 이미지 그림 1C에 표시 됩니다. 알 부 틴 치료 컨트롤에 비해 검은 안료의 영역을 감소.
그림 1 : 알 부 틴 억제 melanogenesis melanocytes에. B16F10 세포에 72 h. A. 알 부 틴 (125 μ g/mL)로 치료 했다 세포질 tyrosinase 활동입니다. B. 멜 라 닌 콘텐츠. C. 멜 라 닌을 가시화 했다 Fontana Masson 얼룩과. 데이터는 의미 ± SEM (n = 4). 통계 비교 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 수행 되었다 (p 값 < 0.05 통계적으로 유의 한 것으로 간주 되었다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 교양된 melanocytes을 사용 하 여 테스트의 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위한 프로토콜을 제시. 대표 결과 알 부 틴, 저해 tyrosinase 활동 및 셀룰러 멜 라 닌 콘텐츠 tyrosinase 억제 물의 hypopigmentation 효과를 보여주었다. 이러한 메서드는 안티 melanogenic 활동 연구에 널리 사용 됩니다. 이 분석 실험을 사용 하 여, 또한 성공적으로 확인 했습니다 melanogenesis B16F10 세포에 억제 효과 과거에는 여러 가지 생리 활성 화합물 10 년9,10,,1112, 13 , 14.
멜 라 닌 melanosomes melanocytes을 포함 하 여 피부에 다양 한 색소 세포에 의해 생산 됩니다. 이 연구에서 우리는 B16F10 흑색 종 세포 어두운 갈색 또는 검은색15될 문화 매체를 일으키는 원인이 되는 멜 라 닌을 생성 하는 사용. 기본 melanocytes vivo에서 효과, 공부에 대 한 생물학적으로 중요 한 도구가 될 수 있습니다 하지만 그들의 한정 된 증식 능력 및 고기 생성에 있는 가변성, 교양된 melanocytes 신뢰할 수 있는 체 외 모델16를 간주 됩니다. 이 셀 라인의 Melanogenesis은 그 기본 melanocytes. 이 메서드는 더 나은 버섯 tyrosinase 활동 분석 결과, 있는 효소 직접 incubated 복합 기판 및 hypopigmentation 테스트 보다 세포 환경을 나타냅니다.
이러한 실험을 수행 하기 전에 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 (MTT) 분석 결과 또는 보라색 셀 분석 결과, 테스트 compound(s)와 같은 유사한 분석 실험을 수행 하는 데 필요한 수 있습니다. 시험 물질 세포 증식에 영향을 미치는 또는 세포 독성을 전시, 다음 melanocyte 성장 영향을 받을 수, 고 결과 세포 tyrosinase 활동을 올바르게 나타내지 않을 수 있습니다. 화학 물질 또는 천연 물질 종종 일부 세포 독성 높은 농도에서 있고 이것은 가벼운 활동 물질에 대 한 특히 중요 하다. 그것은 또한 물질에 대 한 흔히 하 고 촉진 하는 천연 추출 물 세포 확산 그리고 감 별 법. 따라서, 세포 성장을 일으키는 추가 bioactivity에 대 한 잠재력 비록 단백질 농도와 활동을 정상화 하 여 세포 성장에 이러한 효과 조정 될 수 있었다에, 시험 되어야 한다.
다양 한 메커니즘 hypopigmentation tyrosinase 활동의 독립 될 수 있습니다. Melanogenesis는 여러 신호 전달 경로 및 녹음 방송 요인 활동17를 포함 하는 복잡 한 생 합성 통로. 따라서, 키 유전자와 단백질 및 melanogenic 신호 변환 통로의 식 hypopigmentation의 심도 있는 연구에 대 한 검사 수 있습니다. MITF melanogenesis에 중요 한 전사 요소 이며 α-melanocyte 자극 호르몬 (α-MSH) melanogenic 신호 변환 통로18,19를 자극 수 있습니다. 그들의 알려진된 생물 학적 특성에 따라 관련된 신호 변환 통로 더 공부 될 수 있습니다.
멜 라 닌 함량을 측정 하는 때 얻은 값 해야 또한 될 정규화 단백질 농도 의해 있도록 결과 제대로 셀 또는 문화 영역20멜 라 닌 콘텐츠를 나타냅니다. 또한, 페 놀 레드 무료 매체 흡 광도에 페 놀 레드의 부정적인 효과 방지 하려면 복합 치료 단계에 좋습니다.
멜 라 닌 얼룩, 폰 타나-마 송 얼룩 argentaffin 물질 감지 같은 멜 라 닌 및 argentaffin 셀21을 사용 했습니다. 이 기술은 또한 파라핀 또는 deparaffinization 단계를 다음 냉동된 섹션 샘플에 사용 됩니다. 이 실험에 사용 된 시 약은 해로운; 접촉과 흡입은 피해 야 한다, 그리고 가능 하면 연기 후드에만 시 약을 사용 해야 합니다. 얼룩, 후 ImageJ는 스테인드 영역을 계산 하는 데 사용 됩니다. 폰 타나-마 송 얼룩, 띄엄띄엄 긍정적인 세포;에 희미 한 얼룩 해석 하기 어려운 수 있습니다. 그러나,이 멜 라 닌이 풍부한 melanocytes 문제가 않을 수 있습니다. 그들의 독성 때문에 주의 실버 질산염, 암모니아, 나트륨 thiosulfate, 실버와 실험에 사용 된 수산화 암모늄을 처리 되어야 합니다.
이들은 널리 사용는 방법 melanogenesis 및 hypopigmentation의 분야에서 급속 한, 편리한, 비용, 그리고 신뢰할 수 있는 때문에. 이러한 메서드는 소설 화합물 또는 추출 안티-melanogenic 또는 프로 melanogenic 활동을 식별 하 고 싶은 수 사관에 대 한 유용할 수 있습니다. 그들은 또한 melanocyte 세포 성장이 나 세포 활동을 평가 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 한 가지 한계는 항상성 유지 하는 다양 한 환경, 화학, 및 생물학적 요인에 대응 하는 복잡 한 기관 이다 인간의 피부에 결과의 재현성은. 따라서, 생체 외에서 이러한 방법으로 확인 하는 hypopigmentation 에이전트 vivo에서 인간 피부에 큰 영향 없을 수도 있습니다.
요약 하자면, 이러한 프로토콜은 시험 화합물 melanogenesis에 그들의 억제 효과 대 한 심사의 중요 한 초기 단계 이다. 이러한 방법은 melanogenesis에 억제 효과 뿐만 아니라 관련 된 메커니즘을 설명할 수 있는 것이 좋습니다. 생리 활성 후보 화합물을 확인 후 연구의 생물 학적 메커니즘 또는 상용 응용 프로그램, 다음으로 이어질 수 있습니다 추가 테스트 vivo에서 사용.
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Disclosures
저자 아무 공개 보고 있다.
Acknowledgments
이 작품은 한국 연구소의 계획과 기술 음식, 농업 및 임업 (IPET) 농업, 음식, 및 농촌 업무 (MAFRA 투자 농업-한국 기술 개발 프로그램을 통해에 대 한 평가 의해 지원 되었다 ) (116159-02-2-WT011) BK21 플러스, 고려 대학교 생명 공학 및 생명 과학의 학교.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F.
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER 20, Unit 20.1 (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E.
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
