Summary
化学物質の in vitro の色素脱失活性を評価するための 3 つの実験的方法を述べる: 1) 細胞のチロシナーゼ活性および 2) メラニン コンテンツ、および 3) メラニン細胞のメラニン色素染色と画像解析による測定の定量化。
Abstract
本研究では、色素脱失活性の in vitro の定量化のための実験方法を示します。メラニンは、メラノサイトの主要な色素は、複数の細胞および環境要因への応答で合成されます。メラニンは紫外線のダメージから皮膚細胞を保護、生物物理学的および生化学的な機能を持っています。過剰生産やメラノサイトでメラニンの蓄積は、そばかすやシミ、肝斑、ほくろなどの皮膚の問題を引き起こす可能性が。したがって、メラニン色素脱失エージェントのコントロールは重要な臨床的または化粧品ニーズを持つ個人です。メラニンは、メラノサイト メラニンに強く影響を外因性と呼ばれる複雑な生化学的過程とホルモン、炎症、年齢、紫外線暴露などの内的因子のメラノソームで主に合成されています。我々 は化学物質やメラノサイトの天然物質の色素脱失アクティビティを決定する 3 つの方法を記述する: 1) 細胞のチロシナーゼ活性・ 2) メラニン コンテンツ イメージ 3) 染色および定量化の細胞メラニンの測定解析。
メラニン形成、チロシナーゼは 3, 4-ジヒドロキシフェニルアラニン (L-DOPA) にし、dopaquinone に L-チロシンに変換する律速段階を触媒します。したがって、チロシナーゼの阻害、主色素脱失メカニズムです。培養メラノサイトでチロシナーゼ活性は基板として L-DOPA を追加し、dopaquinone の生産を吸光光度法による測定で定量化できます。メラニンは、メラニン コンテンツを定量化することで測定できます。NaOH でメラニン含有細胞分画を抽出し、メラニンが光光度法による定量化されます。最後に、次のメラニンのフォンタナ ・ マッソン染色画像解析によるメラニン コンテンツを定量化することができます。これらの試験管内アッセイの結果が常に人間の皮膚で再現することができません、これらのメソッドは、潜在的な色素脱失の活動を識別する最初のステップとして特に広くメラニン形成研究で使用します。これらのメソッドは、メラニン細胞の活性・成長・分化を評価するためにも使用できます。3 つの異なる方法で一貫した結果では、効果の有効性を確認します。
Introduction
メラニンは、生理学、病理学、皮膚、目、脳1などいくつかの臓器の毒物学で重要な役割を果たしています。メラニンの主要な機能は、写真審査と生化学的な効果です。メラニンは uv (紫外線) 放射、光の短波長の光で増加した吸収率と同様、近赤外、可視光を吸収します。したがって、メラニンは、可視光や紫外線放射2によるダメージから組織を保護します。メラニンの酸化防止剤、金属および他の有毒化学物質に親和性を持ってしたがって、それは、化学的酸化ストレス3から組織を保護できます。ただし、メラニンの過剰生産は、皮膚の問題を引き起こします。
肌や虹彩のメラニンの質と量は、アイリスと肌の色の最も重要な要因です。個人があります異なる肌の色の設定;明るい皮膚色を好む他、日焼けした肌、賛成します。これらの消費者プロファイルに応じて化粧品色素脱失を支持された肌の色4の個々 の市場を満たすために開発されています。したがって、科学的に、実質的に、色素脱失、抗メラニン活性研究が重要です。
メラニンは、メラノサイトでの酵素および自発の化学反応の一連のメラニン生合成の複雑なプロセスです。1 つの色素は約 36 ケラチノ サイトに囲まれ、メラノサイトは、メラニン合成工場隣接のケラチノ サイトへの彼らの製品を配布します。皮膚、近隣の樹状突起を介して表皮ケラチノ サイトにメラニン色素の生産し、メラニン細胞の melanosomal のコンパートメントに格納されているで運ばれています。
L-チロシンをメラニン形成と酵素チロシナーゼの初期基板は 3, 4-ジヒドロキシフェニルアラニン (DOPA) にし、dopaquinone に L-チロシンに変換 2 つの連続した反応を触媒する提供しています。これらの反応メラニン形成5,6の率制限ステップであります。したがって、色素脱失活動は、まず直接細胞のチロシナーゼ活性を評価することによって測定できます。ドーパと孵化させるメラニン細胞エキスのチロシナーゼが含まれているようにとサンプルで生産 dopaquinone 475 に吸光光度法によって測定できる nm。値は、サンプル、およびコントロールと比較して少ない dopaquinone 形成における色素脱失活動結果と物質のタンパク質の濃度によって正規化されます。
第二に、培養メラノサイトでメラニンを直接測定することにより色素脱失活動を定量化することができます。試験材料とセルを扱う後、メラニンがアルカリ条件下で抽出され、メラニン コンテンツを 400 で吸光光度法で定量 nm。色素脱失エージェントはコントロール7より低いメラニン コンテンツになります。
最後に、フォンタナ ・ マッソン メラニン染色とそれに続く画像解析による色素脱失活動を定量化することができます。フォンタナ ・ マッソン染色にメラニン顆粒が見える黒い金属状態にアンモニア硝酸銀を減らすし、細胞顕微鏡画像の黒の領域は、メラニンの量を表します。
色素脱失のエージェントは、通常物質の活動が有効であることを確認これらの 3 つの方法の一貫性と同等の結果を与えます。また、メラニン色素脱失活性を調べるテスト物質に応答のキー遺伝子そして蛋白質の発現を測定する有用な場合があります。チロシナーゼ、に加えてチロシナーゼ関連タンパク質 (TRP-1) と dopachrome tautomerase (TRP 2) がメラニン形成8の重要な酵素です。メラニン形成とその遺伝子・ タンパク質発現レベルの定量化のマスター調節因子である転写因子小眼球関連転写因子 (MITF) またはプロモーターの活性測定法は色素脱失活性を評価するためにも使用できます。
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Protocol
1. 媒体、化合物、および試薬の調製
- B16F10 成長完全培地を準備します。サプリメント ダルベッコ イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (害虫) に変更。
- 500 mL の完全培地を作るため、FBS と 1 L 滅菌ガラス瓶の中の害虫 5 mL 50 ml ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 445 mL を混ぜます。軽く混合後、新しい滅菌ガラス瓶と 4 ° C で、ストアに 0.2 μ m ボトル上部フィルターを通して媒体をフィルターします。
注意: すべての細胞培養の技術は、微生物学的安全キャビネットの無菌性を確保するための無菌技術を使用して行わなければなりません。
- 500 mL の完全培地を作るため、FBS と 1 L 滅菌ガラス瓶の中の害虫 5 mL 50 ml ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 445 mL を混ぜます。軽く混合後、新しい滅菌ガラス瓶と 4 ° C で、ストアに 0.2 μ m ボトル上部フィルターを通して媒体をフィルターします。
- 換散バッファーの準備: 20 mM トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン 0.1% トリトン X-100 (v/v) バッファー ph 7.5 (pH は HCl で調整) を含みます。このバッファーは、3 ヶ月間使用できる室温 (RT) で格納されている場合。プロテアーゼ阻害剤を使用する前に、右の換散バッファーに追加します。
- チロシナーゼ阻害アッセイ バッファーを準備します。1 M NaH2PO4 (塩基性) と 1 M Na2HPO4 (塩基) 在庫ソリューションを準備します。46.3 mL Na2HPO4と 0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液 (6.8) の最終巻を準備する NaH2PO4 53.7 mL を混ぜます。
- 6.8 に最終的な解決の pH の H2o. 調整 1 L (最終巻) に得られた混合物を薄くしなさい。このバッファーは 1 ヶ月間使用できます 4 ° C で保存する場合
- チロシナーゼ基板ソリューションを準備: 0.1 %3, 4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン (DOPA、w/v) チロシナーゼ阻害アッセイ バッファーに溶解 (手順 1.3 を参照してください)。
注意: は、使用中に氷の上にしてください。 - また、100 U/mL チロシナーゼを準備します。チロシナーゼ阻害剤アッセイバッファーで凍結乾燥チロシナーゼを分解します。このソリューションは、2 ヶ月間使える-20 ° C で保存する場合チロシナーゼの活動だけでなく、細胞のチロシナーゼ活性は細胞材料の存在下で計算されます。
注意: 従って凍結凍結融解を避けることが繰り返される前に、ソリューションは避けようです。使用中に氷の上のソリューションを保持します。 - 1 N の NaOH 溶液を準備します。容積測定フラスコに NaOH の 4 g の重量を量るし、蒸留水を 100 mL に溶かします。
- 固定の解決 (10% ホルマリン) を準備します。73 mL の蒸留水と 37% ホルムアルデヒドの 27 mL を希釈します。新鮮な毎日を準備します。
- アンモニア銀ストック溶液を準備します。容積測定フラスコに 10% 硝酸銀溶液の 5 mL を準備します。沈殿が完全に溶解するまで滴下し、アンモニア水を追加します。硝酸銀溶液 (10%) 200 μ L を追加します。ソリューションは、曇りがちになります。
注意: は、接触・吸入を避けます。ヒューム フードを使用します。 - アンモニア銀作業ソリューションを準備します。7.5 mL の蒸留水とアンモニア銀ストック溶液 2.5 mL を希釈します。一度使用し、破棄します。
注意: は、接触・吸入を避けます。ヒューム フードを使用します。 - 0.1% の金塩化物を準備します。10% 金の塩化物の 1 mL を準備し、メスフラスコに 99 mL の蒸留水を追加します。新鮮な毎日を準備します。
- リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) を準備します。NaCl、KCl、1.44 g Na2HPO4と 800 mL の蒸留水で KH2PO4 0.24 g 0.2 g 8 g を追加します。塩酸 Dilute 蒸留水 1 L (最終巻) に得られた混合物を 7.4 に pH を調整します。
- 蒸留水に溶解した 5% (w/v) チオ硫酸ナトリウム溶液を準備します。
2. 細胞の培養と治療
- 市販の B16F10 細胞を使用します。完全培地で B16F10 細胞を維持します。細胞培養用フラスコを保つために加湿、37 ° C で 5% CO2雰囲気インキュベーター
- テスト化合物、インヒビター陽性対照および陰性対照サンプルを準備します。
- 適切な溶媒で試験化合物を溶解します。二重蒸留水で水溶性の化合物を溶解します。例えば、適切な有機溶媒に水不溶性化合物を溶解します。、DMSO。
- ここでは、テスト混合物または陰性対照と比較して色素脱失活性を評価するために肯定的な制御として二重蒸留水 (125 μ g/mL) に溶解しアルブチンを使用します。否定的なコントロール (コントロールの車両扱い) としてソリューションや、テスト サンプルなど、ダブル蒸留水、DMSO で使用されるバッファーを使用して、エタノール。
- 細胞の播種と治療
- 5 × 10 の4シード B16F10 細胞完全培地を使用して 24 ウェル培養皿の細胞/ウェルと 24 h のための CO2インキュベーターで孵化させなさい。インキュベーション後、完全培地を吸引します。
- テスト混合物、抑制制御、または 72 h チェック細胞顕微鏡下でのすべての 24 h のための CO2インキュベーターでネガティブ コントロールを含む (FBS と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン) なし DMEM 培地で細胞を孵化させなさい。この手順の後、さらに実験の手順 3-5 に移動します。
注意: 被験物質と DMEM 培地の混合物は、0.2 μ m フィルターでろ過する必要があります。
3. 細胞のチロシナーゼ活性を測定
- ステップ 2 で説明した方法を使用して、メディアを取り出し、冷たい PBS の 300 μ L で 2 回細胞をすすいでください。
- 氷の上には、細胞培養プレートを配置します。換散バッファーの 300 μ L を追加し、5 分間インキュベートします。細胞ライセート細胞スクレーパーを使用してを収集し、1.5 mL 遠心チューブに細胞ライセートを転送します。
- 2 14,500 rpm でセル ホモジナイザーを用いた細胞ライセートを均質化 3 回細胞内チロシナーゼを取得する氷の上の s。ホモジナイザー、最適条件に従います。
- 4 ° C、12,000 × gで 10 分間遠心し、細胞培養上清を 1.5 mL 遠心チューブに転送します。使用中に氷の上を保ちます。
- 96 ウェル明らかポリスチレン製マイクロ プレート上澄みの 70 μ に転送します。
- チロシナーゼ基板 (DOPA) 96 ウェル明らかポリスチレン製マイクロ プレートを含むソリューションの 140 μ L を追加、静かに振るし、37 ° C で 2 時間インキュベート
- オプションで、各ウェルに 100 U/mL のチロシナーゼ溶液の 70 μ L を追加し、37 ° C で 2 時間インキュベート
- 475 の波長でチロシナーゼ活性を測定マイクロ プレート リーダーを使用して nm。
- 各サンプルのタンパク質濃度にチロシナーゼの活性を正常化します。ブラッドフォードの試金によって各サンプルのタンパク質濃度を測定します。
4. メラニン量を測定
- ステップ 2 で説明した方法を使用して、メディアを取り出し、冷たい PBS の 300 μ L で 2 回細胞をすすいでください。
- 氷の上には、細胞培養プレートを配置します。換散バッファーの 300 μ L を追加し、5 分間インキュベートします。細胞ライセート細胞スクレーパーを使用してを収集し、1.5 mL 遠心チューブに細胞ライセートを転送します。
- 4 ° C で 12,000 × gで 10 分間遠心
- 正規化の新しいチューブとメジャー総蛋白濃度に上澄みを転送します。ブラッドフォードの試金によって各サンプルのタンパク質濃度を測定します。
- ペレットを 1 N NaOH の 300 μ L を追加し、60 ° C で 1 時間インキュベートします。
- 遠心分離機の 4 ° C で 12,000 × gで 10 分の溶存のソリューション
- 96 ウェル マイクロ プレートに培養上清 200 μ L を転送します。
- 測定波長 400 でメラニン内容 nm。
- 蛋白質の集中するメラニンの内容を正規化します。
5. フォンタナ-マッソン染色
- -フォンタナ ・ マッソン染色
- 冷 PBS の 300 μ L で 2 回細胞を洗浄します。
- 各ウェルに 10% ホルマリンの 200 μ L を追加し、4 ° C で 1 時間インキュベート
- 水ですすいでください。
- 作業ソリューションに予め温めておいたアンモニア銀の 200 μ L を追加し、またはセル色で黄色/茶色になるまで、37 ° C で 1 時間インキュベートします。
注意: 58-60 ° C の水浴で練り混ぜたアンモニア銀実用的なソリューションを配置、平衡温度に十分な時間を許可します。 - アンモニア銀作業ソリューションを削除し、蒸留水で洗浄します。
- 蒸留水を削除します。0.1% の金の塩化物の 200 μ L を追加し、室温の 2 分間インキュベート
- 0.1% 塩化金水溶液を削除し、水ですすいでください。
- 蒸留水を削除します。5% (w/v) チオ硫酸ナトリウム溶液 200 μ L を追加し、2 分間インキュベートします。
- チオ硫酸ナトリウム溶液を外し、水ですすいでください。
- 蒸留水を削除します。核高速赤の 200 μ L を追加し、5 分間インキュベートします。
- 核高速赤を取り外し、水道水ですすいでください。
- 水道水を削除し、染色の細胞を顕微鏡で観察します。
- -フォンタナ ・ マッソン染色 (しきい値解析を用いた ImageJ)
注: 補足資料に ImageJ ソフトウェアを使用して画像解析手順の例を示します。- ImageJ のプログラムを開きます。
- ファイルを選択 |オープン |顕微鏡像。
- イメージを選択 |調整 |しきい値の色します。
- -フォンタナ ・ マッソン染色領域を測定、輝度パラメーターのバーを 0 に設定、明るさのバーでは、すべて染色細胞 (黒または暗いブラウン) が含まれているポイントを見つけることを調整します。
- 選択分析 |粒子の分析。分析粒子ウィンドウの要約ボックスをオンし、 OKを押します。集計結果を取得し、スプレッドシートに貼り付けます。
注: 結果ボックスのパラメーターの説明は次のとおりです。
各画像のスライス: 名
陽性細胞の数
総面積: カウントの細胞の総面積
平均サイズ: 総数/エリア
% 領域: 染色領域/総面積 × 100%;総面積は自動的に計算されます。 - 相対的な計算領域総面積の値を使用してメラニン色素で染色します。
すすけるエリア (%) 相対的なメラニン コントロール × 100、すなわち、テスト サンプル/期中平均総面積の総細胞領域の値を =
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Representative Results
アルブチン、抗メラニンの色素脱失活動の代表の結果は、B16F10 メラノサイトは以下の化合物します。図 1 aは、そのアルブチンが車両処理制御に比べ細胞のチロシナーゼ活性を有意に抑制を示しています。同様に、刺激アルブチンのメラニン コンテンツ コントロール (図 1 b) と比較して著しく減った。フォンタナ ・ マッソン染色した細胞の顕微鏡の画像は図 1のとおりです。アルブチン治療には、コントロールに比べると黒の色素の面積が減少しました。
図 1: アルブチンは、メラノサイトにメラニンを抑制します。B16F10 細胞を施した 72 h. A.のアルブチン (125 μ g/mL)細胞のチロシナーゼ活性。B. メラニン コンテンツ。C. メラニンに描出フォンタナ ・ マッソン染色です。データは、平均 ± SEM (n = 4)。スチューデントの t 検定を使用して統計上の比較を行った (p値 < 0.05 が統計的に重要であると考えられていた)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
培養メラノサイトを用いた試験化合物の色素脱失活性を評価するためのプロトコルを提案します。代表的な結果は、アルブチン、チロシナーゼの活性と細胞のメラニン コンテンツを抑制するチロシナーゼ阻害剤の色素脱失の効果を示した。これらのメソッドは抗メラニン活性研究で広く使用されます。これらの試金を使用して、我々 はまた、正常に B16F10 細胞のメラニン合成阻害効果が過去にあるいくつかの生理活性化合物を識別した十年9,10、11,12,13,14。
様々 な顔料の細胞、皮膚のメラノサイトを含むメラノソームでメラニンが生成されます。本研究では、暗い茶色や黒の15になる培養液を引き起こすメラニン B16F10 メラノーマ細胞を使用しました。プライマリ メラノサイト体内の影響を研究する生物学的に重要なツールが信頼性の高い in vitro モデル16が培養メラノサイト限定増殖能力と生成の表現型の可変性のためと見なされます。この細胞のメラニン合成はプライマリ メラノサイトに匹敵するレベルです。このメソッドは、チロシナーゼ活性は、基板、色素脱失のテスト混合物と酵素は直接に培養したよりもより良い携帯電話環境を表します。
これらの実験を実行する前に 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium ブロマイド (MTT) 試金テスト化合とバイオレット細胞アッセイなどの対等なアッセイを実行する必要がある場合があります。被験物質が細胞の増殖に影響を与える、細胞毒性を展示し、メラニン細胞の成長が影響を受ける可能性と結果かもしれない細胞のチロシナーゼ活性を正しく表現していません。高濃度でいくつかの細胞毒性がしばしば持ち化学物質または天然物質、これは穏やかな活性物質について特に重要です。珍しくもない物質と天然抽出物を促進する細胞増殖と分化。その結果、蛋白質の集中した活動を正規化することで細胞増殖に対するこれらの効果を調整できるが、細胞増殖を引き起こすその他の生物活性のため可能性を調査する必要があります。
さまざまなメカニズムは、色素脱失チロシナーゼ活性の独立で起因できます。メラニンは、複数のシグナル伝達と転写因子の活動17を含む複雑な生合成経路です。したがって、色素脱失の綿密な研究の重要な遺伝子とタンパク質とメラニン シグナル伝達経路の表現を検査できます。メラニン合成に重要な転写因子 MITF であり α-メラニン細胞刺激ホルモン (α MSH) メラニン信号伝達経路18,19を刺激することができます。その既知の生物学的特性によって関連のシグナル伝達経路をさらに検討する可能性が。
メラニン コンテンツを測定する場合は結果は正しくメラニン コンテンツ セル単位または文化エリア20単位を表すので、得られた値も蛋白質の集中によって正規化する必要があります。さらに、フェノール レッド自由な媒体は、フェノールレッドの吸光度に負の影響を避けるために化合物の治療ステップにオススメです。
メラニン色素の染色、親和物質を検出などのメラニン色素と親和細胞21フォンタナ ・ マッソン染色を使用しました。この手法は、パラフィンまたは凍結切片試料 deparaffinization ステップを次のも使用されます。この実験で使用する試薬が有害である;接触や吸入を避けるべきと試薬を可能な限りヒューム フードでのみ使用する必要があります。染色、ImageJ が染色領域の計算に使用されます。フォンタナ ・ マッソン染色、まばら肯定的な細胞のかすかな染色を解釈することは困難にすることができます。しかし、これは、メラニンの豊富なメラノサイトの問題をできない場合があります。銀製硝酸塩、アンモニア銀、チオ硫酸ナトリウム、実験で使用される水酸化アンモニウムは毒性が注意して処理する必要があります。
これらは広く、迅速、低コスト、便利な信頼性の高い、メラニン形成と色素脱失のフィールドにメソッドを追加を使用します。これらのメソッドは、抗メラニンやメラニン プロ活動と新規化合物または抽出物を識別したい研究者の役に立つかもしれません。彼らは、メラノサイト細胞の成長や細胞の活動を評価するために使用可能性があります。1 つの制限は、様々 な環境・化学・生物学的要因への応答で、恒常性を維持する複雑な器官は、人間の皮膚に結果の再現性です。したがって、これらのメソッドの in vitro で確認した色素脱失エージェントは生体内で人間の皮膚に重大な影響を持たないかもしれない。
要約すると、これらのプロトコルは、メラニン形成抑制効果試験化合物をスクリーニングで重要な最初のステップです。これらのメソッドがメラニン形成抑制効果だけでなく、関与のメカニズムを説明できることを提案します。生理活性候補化合物が特定された後は生物学的メカニズムや商用アプリケーション、続く研究につながる可能性がありますさらにテスト生体内で使用。
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Disclosures
著者があるレポートへの開示。
Acknowledgments
この作品は、韓国研究所の計画と評価における食品・農業・林業 (IPET) 農水省・食品・農村情勢 (マフラによって資金を供給、農業バイオ技術開発プログラムを通じて技術によって支えられました。) (116159-02-2-WT011) 生命科学部と bk 21 プラス、韓国大学バイオ テクノロジー。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
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