Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kvantificering af hypopigmentering aktivitet In Vitro

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58185
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Biotechnology, Graduate School of Life Sciences & Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 2JinWoo Bio Co. Ltd

Summary

Vi beskriver tre eksperimentelle metoder til evaluering af hypopigmentering aktivitet af kemikalier in vitro: kvantificering af 1) cellulære tyrosinase aktivitet og 2) melanin indhold, og 3) måling af melanin af cellulære melanin farvning og billede analyse.

Abstract

Denne undersøgelse præsenterer laboratoriemetoder til kvantificering af hypopigmentering aktivitet in vitro. Melanin, den store pigment i melanocytter, er syntetiseret i svar til flere cellulære og miljømæssige faktorer. Melanin beskytter hudceller fra ultraviolet skader, men også har biofysiske og biokemiske funktioner. Overdreven produktion eller ophobning af melanin i melanocytter kan forårsage dermatologiske problemer, såsom fregner, mørke pletter, melasma og modermærker. Derfor er kontrol af melanogenesis med hypopigmentering agenter vigtigt hos personer med klinisk eller kosmetiske behov. Melanin er primært syntetiseret i melanosomer af melanocytter i en kompleks biokemiske proces, der kaldes melanogenesis, som er påvirket af ydre og iboende faktorer, såsom hormoner, betændelse, alder og ultraviolet lys eksponering. Vi beskriver tre metoder til at bestemme hypopigmentering aktiviteter kemikalieproducenter eller naturlige stoffer i melanocytter: måling af 1) cellulære tyrosinase aktivitet og 2) melanin indhold og 3) farvning og kvantificere cellulære melanin med billede analyse.

I melanogenesis katalyserer tyrosinase trinnet trafikhastighedsbegrænsning, der konverterer L-tyrosin i 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) og derefter ind i dopaquinone. Hæmning af tyrosinase er derfor en primær hypopigmentering mekanisme. I kulturperler melanocytter, kan tyrosinase aktivitet kvantificeres ved at tilføje L-DOPA som substrat og måling af dopaquinone produktion af spektrofotometri. Melanogenesis kan også måles ved kvantificere melanin indhold. Melanin-holdige cellulære brøken ekstraheres med NaOH og melanin er kvantificeret spektrofotometrisk. Endelig, melanin indhold kan kvantificeres ved billedanalyse efter Fontana-Masson farvning af melanin. Selv om resultaterne af disse in vitro-assays ikke kan altid gengives i menneskelige hud, er disse metoder almindeligt anvendt i melanogenesis forskning, især som det første skridt til at identificere potentielle hypopigmentering aktivitet. Disse metoder kan også bruges til at vurdere melanocyte aktivitet, vækst og differentiering. Ensartede resultater med de tre forskellige metoder sikrer gyldigheden af virkningerne.

Introduction

Melanin spiller en afgørende rolle i fysiologi, patologi og toksikologi af flere organer, herunder hud, øjne og hjerne1. Hovedfunktioner af melanin er foto-screening og biokemiske virkninger. Melanin absorberer nær-infrarødt og synligt lys samt ultraviolet (UV) stråling, med øget absorption satser ved kortere bølgelængder af lys; således beskytter melanin væv fra skader forårsaget af synligt lys eller UV stråling2. Melanin er en antioxidant og har en affinitet for metaller og andre giftige kemikalier; Derfor kan det beskytte væv fra oxidative og kemiske stress3. Dog, overdreven produktion af melanin forårsager dermatologiske problemer.

Mængden og kvaliteten af melanin i huden og iris er de vigtigste determinanter for farven på iris og hud. Enkeltpersoner kan have forskellige hud farvepræferencer; nogle fordel garvet hud, mens andre favor lysere hudfarver. Afhængigt af disse forbruger profiler, er hypopigmentering kosmetik blevet udviklet for at opfylde individuelle markeder for begunstiget hud farver4. Derfor er undersøgelser af hypopigmentering og anti-melanogenic aktivitet vigtigt både videnskabeligt og praktisk.

Melanogenesis er en kompleks proces af melanin biosyntesen gennem en serie af enzymatiske og spontane kemiske reaktioner i melanocytter. Én melanocyte er omgivet af ca 36 keratinocytter og melanocytter er melanin syntese fabrikker, som distribuerer deres produkt til tilstødende keratinocytter. I huden transporteres melanin produceret og gemt i melanosomal rum af melanocytter til tilstødende keratinocytter i epidermis via dendritter.

L-tyrosin tjener som den oprindelige substrat for melanogenesis og enzymet tyrosinase katalyserer to på hinanden følgende reaktioner, der konverterer L-tyrosin i 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) og derefter ind i dopaquinone. Disse reaktioner er det hastighedsbegrænsende trin i melanogenesis5,6. Hypopigmentering aktivitet kan derfor først måles ved vurdering af cellulære tyrosinase aktivitet direkte. For at gøre det, melanocyte ekstrakter som indeholder tyrosinase inkuberes med DOPA og dopaquinone produceret i prøverne kan måles ved spektrofotometri på 475 nm. Værdierne er normaliseret af protein koncentrationer af prøver og stoffer med hypopigmentering aktivitet resulterer i mindre dopaquinone dannelse sammenlignet med kontrol.

For det andet, hypopigmentering aktivitet kan kvantificeres ved direkte måling af melanin i kulturperler melanocytter. Efter behandling af celler med teststoffet, melanin er udvundet alkalisk betingelser og melanin indhold er kvantificeret ved spektrofotometri på 400 nm. En hypopigmentering agent vil resultere i en lavere melanin indhold end kontrol7.

Endelig, hypopigmentering aktivitet kan kvantificeres ved Fontana-Masson melanin farvning og efterfølgende billedanalyse. I Fontana-Masson farvning, melanin granulat reducerer ammoniak-sølv nitrat til en synlig sort metallic tilstand og de sorte områder af celler i mikroskopiske billeder repræsenterer mængden af melanin.

En hypopigmentering agent giver normalt sammenhængende og sammenlignelige resultater med disse tre metoder, som bekræfter, at aktiviteten af stoffet er gyldig. Alternativt kan det være nyttigt at måle udtryk for centrale gener og proteiner i melanogenesis svar på en test-kemikaliet at undersøge hypopigmentering aktivitet. Tyrosinase er tyrosinase-relaterede proteiner (TRP-1) og dopachrome tautomerase (TRP-2) kritiske enzymer i melanogenesis8. Transskription faktor microphthalmia-associerede transskription faktor (MITF) er en master regulator i melanogenesis og kvantificering af dens gen/protein udtryk niveauer eller en promotor aktivitet assay kan også bruges til at vurdere hypopigmentering aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af Medium, stoffer og reagenser

  1. Forberede B16F10 komplet vækstmediet. Supplement Dulbecco ændrede Eagle's medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (PEST).
    1. For at gøre 500 mL af komplette mellemstore, mix 445 mL Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 50 mL af FBS og 5 mL af PEST i 1 L steriliseret glasflaske. Efter blandingen forsigtigt, filtreres mediet en 0,2 µm flaske-top filter til en ny steriliseret glasflaske og derefter opbevares ved 4 ° C.
      Advarsel: Alle celle kultur teknikker bør foretages i mikrobiologisk sikkerhed kabinet ved hjælp af aseptisk teknik for at sikre sterilitet.
  2. Forberede lysisbuffer: 20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane der indeholder 0,1% Triton X-100 (v/v) buffer pH-værdi på 7,5 (pH justeret med HCl). Denne buffer kan anvendes i 3 måneder når den opbevares ved stuetemperatur (RT). Tilføje proteasehæmmere til lysisbuffer lige før brug.
  3. Forberede tyrosinase hæmmer analysebuffer. Forberede 1 M NaH2PO4 (monobasic) og 1 M Na2HPO4 (dibasiske) bestand løsninger. Bland 46,3 mL Na2HPO4 og 53.7 mL NaH2PO4 til at forberede en endelige mængden af 0,1 M natrium fosfat buffer (pH 6,8).
    1. Fortynd den resulterende blanding til 1 L (endelige rumfang) med H2O. Juster pH-værdien af den endelige løsning til 6,8. Denne buffer kan anvendes til 1 måned når den opbevares ved 4 ° C.
  4. Forberede tyrosinase substratopløsning: 0,1% 3,4-dihydroxy-L-fenylalanin (DOPA, w/v) opløst i tyrosinase hæmmer analysebuffer (Se trin 1.3).
    Advarsel: Hold på is i brug.
  5. Eventuelt forberede 100 U/mL champignon tyrosinase. Opløse den frysetørrede champignon tyrosinase i tyrosinase hæmmer analysebuffer. Denne løsning kan bruges til 2 måneder når den opbevares ved – 20 ° C. Champignon tyrosinase aktivitet samt cellulære tyrosinase aktivitet beregnes i overværelse af celle materialer.
    Forsigtig: Løsningen er aliquoted før frysning således gentagen nedfrysning og optøning kan undgås. Opløsningen på is i brug.
  6. Forberede 1 N NaOH opløsning. 4 g NaOH i en målekolbe afvejes og opløses det i destilleret vand for at lave 100 mL.
  7. Forberede fiksering løsning (10% formalin). Fortynd 27 mL 37% formaldehyd med 73 mL destilleret vand. Forberede frisk dagligt.
  8. Forberede ammoniakalsk sølv stamopløsning. Forberede 5 mL 10% sølvnitratopløsning i en målekolbe. Tilføje ammoniumhydroxid løsning dråbevis, indtil bundfaldet er opløst. Tilføje 200 μl sølvnitratopløsning (10%). Løsningen bliver lidt uklar.
    Advarsel: Undgå kontakt og indånding. Bruge et stinkskab.
  9. Forberede ammoniakalsk sølv brugsopløsning. Fortynd 2,5 mL af ammoniumkvælstof sølv stamopløsning med 7,5 mL destilleret vand. Bruge én gang og derefter kasseres.
    Advarsel: Undgå kontakt og indånding. Bruge et stinkskab.
  10. Forberede 0,1% guld chlorid. Forberede 1 mL 10% guld chlorid og tilføje 99 mL destilleret vand i en målekolbe. Forberede frisk dagligt.
  11. Forberede fosfat buffer saltvand (PBS). Tilføje 8 g NaCl, 0,2 g af KCl, 1.44 g Na2HPO4 og 0,24 g KH2PO4 i 800 mL destilleret vand. PH indstilles til 7.4 med HCl. Dilute den resulterende blanding til 1 L (endelige rumfang) med destilleret vand.
  12. Forberede 5% (w/v) natrium thiosulfate opløsning opløses i destilleret vand.

2. celle kultur og behandling

  1. Bruge kommercielt tilgængelig B16F10 celler. Opretholde B16F10 cellerne i komplet medium. Holde celle kultur kolbe i en fugtig, 5% CO2 atmosfære inkubator ved 37 ° C.
  2. Forbered test forbindelser, hæmmer positiv kontrol og negative kontrolprøver.
    1. Opløse prøven forbindelser i de passende opløsningsmidler. Opløse vandopløselige forbindelser i dobbeltdestilleret vand. Opløse vand uopløselige forbindelser i passende organisk opløsningsmiddel, fx., DMSO.
    2. Her brug arbutin opløst i dobbeltdestilleret vand (125 μg/mL) som positiv kontrol for at vurdere hypopigmentering aktivitet sammenlignet med test forbindelser eller en negativ kontrol. Som negativ kontrol (køretøj-behandlede kontrol), bruge løsninger eller buffere anvendes i prøven, fx, dobbeltdestilleret vand, DMSO, ethanol.
  3. Celle såning og behandling
    1. Seed B16F10 celler på 5 × 104 celler/brønd i 24-og kultur plader ved hjælp af komplette mellemstore og inkuberes i en CO2 inkubator i 24 timer. Efter inkubationen Opsug den fuldstændige medium.
    2. Inkuber celler med DMEM medium (uden FBS og 1% penicillin/streptomycin) indeholdende test forbindelser, en inhibitor kontrol eller en negativ kontrol i en CO2 inkubator for 72 h. Check celler hver 24 h under mikroskop. Efter dette trin, skal du gå til trin 3-5 for yderligere eksperimenter.
      Advarsel: Blandingen af prøvestof og DMEM medium skal filtreres gennem et filter, 0,2 μm.

3. måling af cellulære Tyrosinase aktivitet

  1. Ved hjælp af metoden beskrevet i trin 2, fjerne medier og skyl celler to gange med 300 μl koldt PBS.
  2. Celle kultur pladen anbringes på is. Tilsæt 300 μL lysisbuffer og Inkuber i 5 min. Derefter indsamle cellen lysate ved hjælp af en celle skraber og overføre cellen lysate til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
  3. Homogeniseres lysate celle med en celle homogeniseringsapparat på 14.500 rpm for 2 s, 3 gange på isen for at opnå intracellulære tyrosinase. Brug den optimale tilstand specifikke for homogeniseringsapparat.
  4. Der centrifugeres i 10 min på 12.000 × g ved 4 ° C og overføre cellen supernatanten til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Holde på is i brug.
  5. 70 μL af supernatanten overføres til en 96-godt klar polystyren mikrotiterplade.
  6. Tilføje 140 μL af en oploesning indeholdende tyrosinase substrat (DOPA) til en 96-godt klar polystyren mikrotiterplade, Ryst forsigtigt, og der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C.
  7. Valgfrit, tilføje 70 μL 100 U/mL champignon tyrosinase løsning til hver brønd og Inkuber i 2 timer ved 37 ° C.
  8. Måle tyrosinase aktivitet ved en bølgelængde på 475 nm med mikrotiterplade læser.
  9. Normalisere tyrosinase aktivitet med protein koncentrationen af hver prøve. Måle proteinkoncentration af hver prøve ved en Bradford assay.

4. måling af Melanin indhold

  1. Ved hjælp af metoden beskrevet i trin 2, fjerne medier og skyl celler to gange med 300 μl koldt PBS.
  2. Celle kultur pladen anbringes på is. Tilsæt 300 μL lysisbuffer og Inkuber i 5 min. Derefter indsamle cellen lysate ved hjælp af en celle skraber og overføre cellen lysate til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
  3. Der centrifugeres i 10 min på 12.000 × g ved 4 ° C.
  4. Overføre supernatanten til en ny tube og foranstaltning total proteinkoncentration for normalisering. Måle proteinkoncentration af hver prøve ved en Bradford assay.
  5. Tilsættes 300 μl 1 N NaOH til hver pellet og Inkuber ved 60 ° C i 1 time.
  6. Centrifugeres den opløste løsning i 10 min på 12.000 × g ved 4 ° C.
  7. 200 μL af supernatanten overføres til en 96-brønd mikrotiterplade.
  8. Måle melanin indhold ved en bølgelængde på 400 nm.
  9. Normalisere melanin indhold til proteinkoncentration.

5. Fontana – Masson farvning

  1. Fontana – Masson farvning
    1. Vaske cellerne to gange med 300 μl koldt PBS.
    2. Tilføje 200 μl af 10% formalin til hver brønd og Inkuber i 1 time ved 4 ° C.
    3. Skylning med destilleret vand.
    4. Tilføje 200 μl af pre varmede ammoniakalsk sølv arbejder løsning og Inkuber i 1 time ved 37 ° C, eller indtil cellerne bliver gul/brun farve.
      Advarsel: Placer frisk blandet ammoniakalsk sølv brugsopløsning i en 58-60° C vandbad og give tilstrækkelig tid til temperatur til Reagensglasset.
    5. Fjerne ammoniakalsk sølv arbejder løsning og skylles med destilleret vand.
    6. Fjerne destilleret vand. Tilføje 200 μl af 0,1% guld chlorid og inkuberes i 2 min på RT.
    7. Fjerne 0,1% guld chloridopløsning og skylles med destilleret vand.
    8. Fjerne destilleret vand. Tilføje 200 μl af natrium thiosulfate løsning (5%, w/v) og inkuberes i 2 min.
    9. Fjerne natrium thiosulfate løsning og skylles med destilleret vand.
    10. Fjerne destilleret vand. Tilføje 200 μl af nukleare hurtigt røde, og der inkuberes i 5 min.
    11. Fjerne nukleare hurtigt røde og skyl med vand fra hanen.
    12. Fjerne vand fra hanen og observere de farvede celler under et mikroskop.
  2. Fontana – Masson farvning (tærskel analyse ved hjælp af ImageJ)
    Bemærk: Et eksempel på billede analyse procedure bruger ImageJ software er vist i den supplerende materialer.
    1. Åbn programmet ImageJ.
    2. Vælg fil | Åben | Mikroskop billede.
    3. Vælg billede | Justere | Farve tærskel.
    4. For at måle området farves med Fontana – Masson, indstille lysstyrke parameter bar til nul og justere lysstyrken baren for at finde det punkt, hvor alle farvede celler (sort eller mørk brun) er inkluderet.
    5. Vælg analyser | Analysere partikler. Kontroller boksen Summér i vinduet analyze partikler og tryk på OK. Opnå den summariske resultat og indsætte i et regneark.
      Bemærk: Beskrivelse af de resulterende boks parametre er som følger:
      Skive: Navnet på hvert billede
      Tæller: Antallet af farvede celler
      Samlet areal: Samlet areal af de optalte celler
      Gennemsnitlige størrelse: Samlede område/Count
      % Område: farvede område/samlet område × 100%; samlede areal beregnes automatisk.
    6. Beregne relative område farves med melanin ved hjælp af værdien af samlede areal.
      Relative melanin farves område (%) = værdi af cellulære areal af test stikprøven/gennemsnitlige samlede areal af control × 100, dvs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative resultater for hypopigmentering aktivitet af arbutin, en anti-melanogenic sammensatte i B16F10 Melanocytter er vist nedenfor. Figur 1A viser, at arbutin betydeligt undertrykt cellulære tyrosinase aktivitet sammenlignet med kontrolelementet køretøjets-behandlet. På samme måde, melanin indhold af celler stimuleret med arbutin blev reduceret betydeligt sammenlignet med kontrol (figur 1B). Mikroskopiske billeder af celler farves med Fontana-Masson pletten er vist i figur 1 c. Arbutin behandlingen faldt inden for sort pigment sammenlignet med kontrol.

Figure 1
Figur 1 : Arbutin undertrykt melanogenesis i melanocytter. B16F10 celler blev behandlet med arbutin (125 μg/mL) for 72 h. A. Cellulære tyrosinase aktivitet. B. Melanin indhold. C. Melanin blev visualiseret med Fontana-Masson pletten. Data er middel ± SEM (n = 4). Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af Student's t-test (p værdier < 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterede protokoller for at vurdere hypopigmentering aktiviteten af test forbindelser ved hjælp af kulturperler melanocytter. De repræsentative resultater viste hypopigmentering effekt af arbutin, en tyrosinase hæmmer, der hæmmede tyrosinase aktivitet og cellulære melanin indhold. Disse metoder er meget udbredt i anti-melanogenic aktivitet forskning. Bruger disse assays, vi har også med succes identificeret flere bioaktive stoffer, der har melanogenesis hæmmende effekter på B16F10 celler i sidste ti år9,10,11,12, 13 , 14.

Melanin er produceret af melanosomer i forskellige pigment celler, herunder melanocytter i huden. I denne undersøgelse brugte vi B16F10 melanom celler, der producerer melanin, som forårsager næringssubstratet at blive mørk brun eller sort15. Primære melanocytter kan være biologisk vigtige værktøjer til at studere in vivo effekter, men på grund af deres begrænsede proliferativ kapacitet og variabilitet i fænotyper genereret, kulturperler melanocytter anses en pålidelig in vitro-model16. Melanogenesis af denne cellelinje er sammenlignelige med dem af primære melanocytter. Denne metode repræsenterer bedre det cellulære miljø end champignon tyrosinase aktivitet assay, hvor enzymet direkte inkuberes med substrat og hypopigmentering testen sammensatte.

Før du udfører disse eksperimenter, kan det være nødvendigt at foretage 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) assay eller sammenlignelige assays, såsom celle violet assay med test-forbindelser. Hvis et test-kemikalium påvirker celledelingen eller udviser cytotoksicitet, derefter melanocyte vækst kan blive påvirket, og resultaterne kan ikke korrekt repræsentere den cellulære tyrosinase aktivitet. Kemikalier eller naturlige stoffer har ofte nogle cytotoksicitet ved høje koncentrationer, og dette er især vigtigt for stoffer med mild aktivitet. Det er heller ikke ualmindeligt, at stoffer og naturlige ekstrakter til at fremme celle spredning og differentiering. Derfor bør potentialet for yderligere bioactivity forårsager cellevækst undersøgt, selvom disse effekter på cellevækst kunne justeres ved at normalisere aktiviteten med proteinkoncentration.

Forskellige mekanismer kan resultere i hypopigmentering uafhængigt af tyrosinase aktivitet. Melanogenesis er en kompleks biosyntetiske pathway, der involverer flere signaltransduktionsveje og transskription faktor aktiviteter17. Derfor kunne udtryk for centrale gener og proteiner og melanogenic signaltransduktionsveje undersøges for en tilbundsgående undersøgelse af hypopigmentering. MITF er en vigtige transkriptionsfaktor i melanogenesis og α-melanocyte-stimulerende hormon (α-MSH) kan stimulere melanogenic signaltransduktion veje18,19. Afhængigt af deres kendte biologiske karakteristika, kunne relaterede signaltransduktionsveje undersøges yderligere.

Ved måling af melanin indhold, bør de opnåede værdier også blive normaliseret af proteinkoncentration, således at resultaterne korrekt repræsentere melanin indhold pr. celle eller kultur område20. Derudover anbefales phenol-rød-gratis medium taktfast sammensatte behandling til at undgå de negative virkninger af phenol red på absorbans.

For melanin farvning, brugte vi Fontana-Masson pletten, som registrerer argentaffin stoffer, såsom melanin og argentaffin celler21. Denne teknik bruges også til paraffin eller frossen sektion prøver efter deparaffinization trin. De reagenser, der anvendes i dette eksperiment er skadelige; Kontakt og indånding bør undgås, og reagenserne bør anvendes kun i et stinkskab, når det er muligt. Efter farvning, bruges ImageJ til at beregne de farvede område. Med Fontana-Masson farvning, kan det være vanskeligt at fortolke svag farvning i tyndt positive celler; dog kan dette ikke være et problem for melanin-rige melanocytter. Sølv nitrat, ammonium sølv, natrium thiosulfate og ammoniumhydroxid anvendes i eksperimenter skal håndteres med forsigtighed på grund af deres toksicitet.

Disse er almindeligt anvendte er metoder inden for melanogenesis og hypopigmentering, fordi de er hurtige, praktiske, omkostningseffektive og pålidelige. Disse metoder kan være nyttige for efterforskere, der ønsker at identificere nye forbindelser eller ekstrakter med anti-melanogenic eller pro-melanogenic aktiviteter. De kunne også bruges til at vurdere melanocyte cellevækst eller cellulære aktivitet. En begrænsning er reproducerbarheden af resultaterne på menneskers hud, som er et komplekst organ hvor homøostase vedligeholdes som svar på forskellige miljømæssige, kemiske og biologiske faktorer. Derfor kan hypopigmentering agenter bekræftet af disse in vitro-metoder ikke have betydelige virkninger på menneskers hud in vivo.

I sammendrag er disse protokoller et vigtigt første skridt i screening test forbindelser for deres hæmmende effekt på melanogenesis. Vi foreslår, at disse metoder kan forklare ikke kun de hæmmende effekt på melanogenesis, men også den involverede mekanisme. Efter bioaktive kandidat forbindelser er identificeret, yderligere testning kan føre til studier af biologiske mekanismer eller kommercielle applikationer, efterfulgt af in vivo brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger til rapport.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Korea Institut for planlægning og evaluering for teknologi inden for fødevarer, landbrug og skovbrug (IPET) gennem programmet Agri-bioindustrien teknologi udvikling, finansieret af Ministeriet for landbrug, fødevarer og landdistrikter anliggender (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) og skole af biovidenskab og bioteknologi i BK21 PLUS, Korea Universitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine Sigma D9628
Ammonium hydroxide solution Sigma #320145
Arbutin Fluka #10960
DMEM HyClone SH30243.01
FBS HyClone SH30084.03
Formalin Yakuri Pure Chemicals #16223 37%
Gold chloride American MasterTech AHG0226 0.10%
HCl Samchun chemical H0255
KCl Bio basic Canada Inc. PB0440
KH2PO4 Sigma #60218
Na2HPO4 J.T.Baker #3817-01
NaCl Duksan pure chemicals #81
NaOH Sigma 655104
Nuclear fast red Merck 100121 Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution HyClone SV30010
Silver nitrate Duksan Pure Chemicals #900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) J.T. Baker #3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) Sigma S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate Duksan Pure Chemicals #2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Bio Basic Canada TB0196
Triton X-100 Union Carbide T8787
Tyrosinase from mushroom Sigma T3824 25 KU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
  2. Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
  3. Galvan, I., Solano, F. Melanin chemistry and the ecology of stress. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).
  4. Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
  5. Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
  6. Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
  7. Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
  8. Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
  9. Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
  10. Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
  11. Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
  12. Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
  13. Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
  14. Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
  15. Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER 20, Unit 20.1 (2001).
  16. Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
  17. D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. Signaling pathways in melanogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).
  18. Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
  19. Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
  20. Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
  21. Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).

Tags

Biokemi sag 145 hypopigmentering melanogenesis tyrosinase aktivitet melanin indhold melanocytter Fontana-Masson pletten
Kvantificering af hypopigmentering aktivitet In Vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, Y. J., Kim, M. J., Kweon, D.… More

Kim, Y. J., Kim, M. J., Kweon, D. K., Lim, S. T., Lee, S. J. Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e58185, doi:10.3791/58185 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter