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Biochemistry

विट्रो में हाइपोपिग्मेंटेशन गतिविधि का प्रमाणन

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58185
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Biotechnology, Graduate School of Life Sciences & Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 2JinWoo Bio Co. Ltd

Summary

हम विट्रो में रसायनों के हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए तीन प्रयोगात्मक तरीकों का वर्णन: 1 का परिमाणन) सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि और 2) मेलेनाइन सामग्री, और 3) मेलेनिनो के सेलुलर मेलेनिन धुंधला और छवि विश्लेषण द्वारा माप.

Abstract

इस अध्ययन में विट्रो में हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि के परिमाणन के लिए प्रयोगशाला तरीके प्रस्तुत करता है. मेलोनिइन, मेलानोसाइट्स में प्रमुख वर्णक, कई सेलुलर और पर्यावरणीय कारकों के जवाब में संश्लेषित है । मेलेनाइन पराबैंगनी क्षति से त्वचा कोशिकाओं की रक्षा करता है, लेकिन यह भी biophysical और जैव रासायनिक कार्य किया है । मेलानोसाइट्स में मेलानिइन के अत्यधिक उत्पादन या संचय के कारण त्वचा संबंधी समस्याएं हो सकती हैं, जैसे कि freckles, काले धब्बे, झाई, और moles । इसलिए, हाइपोपिग्मेंटेशन एजेंटों के साथ मेलेनोजेनेसिस का नियंत्रण नैदानिक या कॉस्मेटिक जरूरतों वाले व्यक्तियों में महत्वपूर्ण है । मेलेनाइन मुख्य रूप से मेलानोसाइट्स के मेलानोसोम में एक जटिल जैव रासायनिक प्रक्रिया में संश्लेषित किया जाता है, जिसे मेलाजनन कहा जाता है, जो बाह्य और आंतरिक कारकों जैसे हार्मोन, सूजन, उम्र और पराबैंगनी प्रकाश एक्सपोजर से प्रभावित होता है । हम तीन तरीकों का वर्णन करने के लिए रसायन या मेलानोसाइट्स में प्राकृतिक पदार्थों की हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि का निर्धारण: 1 की माप) सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि और 2) मेलिनटिन सामग्री, और 3) धुंधला और बढ़ाता सेलुलर मेलिनेटिन छवि के साथ विश्लेषण.

मेलेनोजेनेसिस में, टायरोसिनेस दर सीमित कदम है कि एल-tyrosine में धर्मांतरित 3, 4-dihydroxyphenylalanine (एल-डोपा) और फिर dopaquinone में catalyzes. इसलिए, टायरोसिनेस के निषेध एक प्राथमिक हाइपोपाइमेंटेशन तंत्र है. संवर्धित मेलानोसाइट्स में, टायरोसिनेस गतिविधि को एक सब्सट्रेट के रूप में एल-डोपा जोड़कर और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा dopaquinone उत्पादन को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित जा सकता है । मेलानोजेनेसिस भी मेलेनाइन सामग्री बढ़ाता द्वारा मापा जा सकता है । मेलाइन युक्त सेलुलर अंश naoh के साथ निकाला जाता है और मेलेनिइन स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिकली मात्रा निर्धारित है. अंत में, मेलेनिनो सामग्री मेलेनिन के fontana-मस्सन धुंधला के बाद छवि विश्लेषण द्वारा मात्रा निर्धारित जा सकता है । हालांकि इन विट्रो assays में परिणाम हमेशा मानव त्वचा में reproduced नहीं किया जा सकता है, इन तरीकों को व्यापक रूप से melanogenesis अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से प्रारंभिक कदम के रूप में संभावित हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि की पहचान । इन पद्धतियों का उपयोग मेलानोसाइट गतिविधि, विकास और विभेद का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है । तीन विभिंन तरीकों के साथ लगातार परिणाम प्रभाव की वैधता सुनिश्चित करते हैं ।

Introduction

मेलिनाइन शरीर विज्ञान, विकृति विज्ञान, और त्वचा, आंखों सहित कई अंगों के विष विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और मस्तिष्क1। मेल्जिन के प्रमुख कार्य फोटो स्क्रीनिंग और जैव रासायनिक प्रभाव हैं । मेलिनाइन प्रकाश की छोटी तरंग दैर्ध्य में वृद्धि की अवशोषण दर के साथ के पास अवरक्त और दृश्य प्रकाश के साथ ही पराबैंगनी (यूवी) विकिरण, अवशोषित; इस प्रकार, मेलिनो दृश्य प्रकाश या यूवी विकिरण2के कारण नुकसान से ऊतकों की रक्षा करता है । मेमेलाइन एक एंटीऑक्सीडेंट है और धातुओं और अन्य विषाक्त रसायनों के लिए एक समानता है; इसलिए, यह ऑक्सीडेटिव और रासायनिक तनाव से ऊतकों की रक्षा कर सकते हैं3. हालांकि, मेमेलाइन के अत्यधिक उत्पादन त्वचा संबंधी मुद्दों का कारण बनता है ।

त्वचा और आईरिस में मेलाइन की मात्रा और गुणवत्ता आईरिस और त्वचा के रंग का सबसे महत्वपूर्ण निर्धारक हैं । व्यक्तियों अलग त्वचा रंग वरीयताओं हो सकता है; कुछ पक्ष tanned त्वचा, जबकि अंय हल्का त्वचा रंग एहसान । इन उपभोक्ता प्रोफाइल पर निर्भर करता है, हाइपोपाइमेंटेशन सौंदर्य प्रसाधन के लिए इष्ट त्वचा4रंग के लिए व्यक्तिगत बाजार को संतुष्ट विकसित किया गया है । तदनुसार, हाइपोपाइमेंटेशन और विरोधी melanogenic गतिविधि के अध्ययन दोनों वैज्ञानिक और व्यावहारिक रूप से महत्वपूर्ण हैं ।

मेलेनोजेनेसिस melanogenesis में एंजाइमेटिक और सहज रासायनिक प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से मेलेनजिन जैवसंश्लेषण की जटिल प्रक्रिया है । एक मेलानोसाइट से घिरा हुआ है लगभग ३६ केराटिनोसाइट्स और melanocyte मेलैनिन संश्लेषण कारखानों कि पड़ोसी keratinocytes के लिए अपने उत्पाद को वितरित कर रहे हैं । त्वचा में, मेलैनाइन का उत्पादन किया जाता है और मेलानोसाइट्स के मेलैनोसोमल डिब्बे में संग्रहित किया जाता है, जिसे डेंडराइटीज के माध्यम से एपिडर्मिस में पड़ोसी केराटिनोसाइट्स तक पहुँचाया जाता है ।

एल tyrosine मेलेनोजेनेसिस के लिए प्रारंभिक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है और एंजाइम टायरोसिनेस दो लगातार प्रतिक्रियाओं कि कन्वर्ट एल-tyrosine में 3, 4-dihydroxyphenylalanine (डोपा) और फिर dopaquinone में. ये प्रतिक्रियाएं मेलेनोजेनेसिस5,6में दर-सीमित कदम हैं । तदनुसार, हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि पहले सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि का आकलन सीधे द्वारा मापा जा सकता है. ऐसा करने के लिए, टायरोसिनेस युक्त मेलानोसाइट अर्क डोपा के साथ incubated कर रहे हैं और dopaquinone नमूनों में उत्पादित ४७५ एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मापा जा सकता है. मूल्यों नमूनों की प्रोटीन सांद्रता द्वारा सामान्यीकृत कर रहे हैं, और नियंत्रण के साथ तुलना में कम dopaquinone गठन में हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि परिणाम के साथ पदार्थों.

दूसरे, हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि सुसंस्कृत मेलानोसाइट्स में मेलेनिइन को मापने के द्वारा सीधे मात्रा निर्धारित जा सकता है । परीक्षण सामग्री के साथ कोशिकाओं के इलाज के बाद, मेलेनिइन क्षारीय शर्तों के तहत निकाला जाता है और मेलेनिइन सामग्री ४०० एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मात्रा में मात्रा निर्धारित है । एक हाइपोपाइमेंटेशन एजेंट नियंत्रण7से कम मेलिनीन सामग्री में परिणाम होगा ।

अंत में, हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि fontana द्वारा मात्रा निर्धारित जा सकता है-masson मेलेनिनो धुंधला और बाद में छवि विश्लेषण । fontana में-masson धुंधला, मेलिनीन granules एक दिखाई काले धातु राज्य के लिए अमोनिया-चांदी नाइट्रेट को कम करने और सूक्ष्म छवियों में कोशिकाओं के काले क्षेत्रों मेलिनीन की मात्रा का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

एक हाइपोपाइमेंटेशन एजेंट आमतौर पर इन तीन तरीकों के साथ सुसंगत और तुलनीय परिणाम देता है, जो पुष्टि करता है कि पदार्थ की गतिविधि मान्य है. वैकल्पिक रूप से, यह हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि की जांच करने के लिए एक परीक्षण पदार्थ के जवाब में मेलेनोजेनेसिस में प्रमुख जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति को मापने के लिए उपयोगी हो सकता है । टायरोसिनेस के अलावा टायरोसिनेस से संबंधित प्रोटीन (टीआरपी-1) और डोपाक्रोम टऑटोमेरेज (टीआरपी-2) मेलानोजेनेसिस8में क्रिटिकल एंजाइम हैं । प्रतिलेखन कारक माइक्रोथैल्मिया-एसोसिएटेड ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (mitf) मेलेनोजेनेसिस में एक मास्टर नियामक है और इसके जीन/प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर या एक प्रवर्तक गतिविधि परख को भी हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

1. मध्यम, यौगिकों, और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. B16F10 विकास पूर्ण माध्यम तैयार करें । 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (कीट) के साथ dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (dmem) पूरक ।
    1. पूर्ण माध्यम के ५०० मिलीलीटर बनाने के लिए, डुलबेको के संशोधित ईगल के मध्यम (dmem) के ४४५ मिलीलीटर fbs के ५० मिलीलीटर और एक 1 L निष्फल कांच की बोतल में 5 मिलीलीटर कीट मिलाएं । धीरे मिश्रण के बाद, एक नई निष्फल कांच की बोतल के लिए एक ०.२-μm बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से मध्यम फिल्टर और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      चेतावनी: सभी सेल संस्कृति तकनीकों को रोगात्मक सुरक्षा में किया जाना चाहिए सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करने के लिए बाँझपन सुनिश्चित करने के कैबिनेट.
  2. lysis बफर तैयार करें: 20 मिमी Tris (hydroxymethyl) एमिनोमेथेन युक्त ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० (v/v) बफर पीएच ७.५ (पीएच एचसीएल के साथ समायोजित) । इस बफर 3 महीने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत । उपयोग करने से पहले lysis बफ़र सही करने के लिए प्रोटेज़ inhibitors जोड़ें ।
  3. टायरोसिनेस अवरोध करनेवाला परख बफर तैयार करते हैं । 1 m णः2PO4 (मोनोबेसिक) और 1 m ना2hpo4 (dibasic) स्टॉक समाधान तैयार करें । मिक्स ४६.३ मिलीलीटर की ना2एचपीओ4 और ५३.७ एमएल का नाह2पीओ4 की एक अंतिम मात्रा तैयार करने के लिए ०.१ एम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच ६.८) ।
    1. परिणामी मिश्रण को 1 L (अंतिम वॉल्यूम) एच2ओ के साथ पतला करें ६.८ को अंतिम समाधान के पीएच को समायोजित करें । इस बफर 1 महीने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
  4. टायरोसिनेस सब्सट्रेट समाधान तैयार: ०.१% 3, 4-dihydroxy-L-फेनिल (dopa, w/v) टायरोसिनेस अवरोध करनेवाला परख बफर में भंग (चरण १.३ को देखें) ।
    सावधानी: उपयोग करते समय बर्फ पर रखें ।
  5. वैकल्पिक रूप से, तैयार १०० U/एमएल मशरूम tyrosinase. टायरोसिनेस अवरोध करनेवाला परख बफर में lyophilized मशरूम टायरोसिनेस भंग. यह समाधान 2 महीने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । मशरूम टायरोसिनेस गतिविधि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि सेल सामग्री की उपस्थिति में गणना कर रहे हैं.
    चेतावनी: समाधान ठंड से पहले इस प्रकार दोहराया ठंड और thawing से बचा जा सकता है aliquoted है । जबकि उपयोग में बर्फ पर समाधान रखो ।
  6. 1 N naoh समाधान तैयार करें । एक volumetric फ्लास्क में naoh के 4 जी वजन और आसुत पानी में भंग १०० मिलीलीटर बनाने के लिए ।
  7. निर्धारण समाधान (10% formalin) तैयार करें । डिसुल्ड वॉटर की ७३ एमएल के साथ ३७% formaldehyde की 27 मिलीलीटर पतला । रोज ताजा तैयार करें ।
  8. अमोनियाकल सिल्वर स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें । एक volumetric फ्लास्क में 10% चांदी नाइट्रेट समाधान के 5 मिलीलीटर तैयार करें । जब तक कि हाला पूरी तरह से भंग हो जाता है अमोनियम हाइड्रोक्साइड समाधान dropwise जोड़ें । चांदी नाइट्रेट समाधान के २०० μl जोड़ें (10%) । समाधान थोड़ा बादल बन जाएगा ।
    सावधानी: संपर्क और साँस लेना से बचें । एक धूआं हुड का प्रयोग करें ।
  9. अमोनियाकल सिल्वर वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें । आसुत जल के ७.५ मिलीलीटर के साथ अमोनियाकाल चांदी के स्टॉक समाधान का पतला २.५ मिलीलीटर । एक बार का प्रयोग करें और फिर त्यागें ।
    सावधानी: संपर्क और साँस लेना से बचें । एक धूआं हुड का प्रयोग करें ।
  10. ०.१% गोल्ड क्लोराइड तैयार करें । 10% गोल्ड क्लोराइड की 1 मिलीलीटर तैयार करें और एक volumetric फ्लास्क में आसुत जल की ९९ मिलीलीटर जोड़ें । रोज ताजा तैयार करें ।
  11. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) तैयार करें । इसमें 8 ग्राम की nacl, ०.२ ग्राम केसीएल की, १.४४ ग्राम की ना2एचपीओ की4 व ०.२४ ग्राम की ख2पो4 में ८०० एमएल आसुत जल की । पीएच को ७.४ एचसीएल के साथ समायोजित करें । परिणामी मिश्रण को डिसल्ड वॉटर के साथ 1 L (अंतिम वॉल्यूम) में पतला करें ।
  12. 5% (w/v) सोडियम थायोसल्फेट समाधान आसुत जल में घोला हुआ तैयार करें ।

2. सेल संस्कृति और उपचार

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध B16F10 कक्षों का उपयोग करें । B16F10 कोशिकाओं को पूर्ण माध्यम में बनाए रखें । सेल संस्कृति फ्लास्क को एक ह्यूमिडिफाइड, 5% सह2 वायुमंडल इनकोबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
  2. परीक्षण यौगिकों, अवरोधक सकारात्मक नियंत्रण, और नकारात्मक नियंत्रण के नमूने तैयार करें ।
    1. उचित सॉल्वैंट्स में परीक्षण यौगिकों को भंग । पानी में घुलनशील यौगिकों को भंग कर दो-आसुत जल में । उचित कार्बनिक विलायक, जैसे, dmso में पानी अघुलनशील यौगिकों भंग ।
    2. यहां, परीक्षण यौगिकों या एक नकारात्मक नियंत्रण के साथ तुलना में हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि का आकलन करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में दोहरी आसुत जल (१२५ μg/एमएल) में भंग आरबूतिन का उपयोग करें । एक नकारात्मक नियंत्रण (वाहन इलाज नियंत्रण) के रूप में, समाधान या परीक्षण नमूना, उदाहरणके लिए, डबल आसुत जल, dmso, इथेनॉल में इस्तेमाल किया buffers का उपयोग करें ।
  3. सेल सीडिंग और उपचार
    1. बीज B16F10 कोशिकाओं में 5 × 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 24 में अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों पूरा माध्यम का उपयोग कर और एक सह में सेते2 इंयूबेटर के लिए 24 ज. ऊष्मायन के बाद, पूर्ण माध्यम महाप्राण ।
    2. dmem मध्यम (fbs और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के बिना) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं जिसमें या तो परीक्षण यौगिकों, एक अवरोधक नियंत्रण, या ७२ एच के लिए एक सह2 इनकोबेटर में एक नकारात्मक नियंत्रण है सूक्ष्मदर्शी के तहत हर 24 एच कोशिकाओं की जांच करें । इस चरण के बाद, आगे प्रयोगों के लिए चरण 3-5 पर जाएँ ।
      सावधानी: परीक्षण पदार्थ और dmem मध्यम का मिश्रण एक ०.२ μm फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाना चाहिए ।

3. सेलुलर tyrosinase गतिविधि को मापने

  1. चरण 2 में वर्णित विधि का उपयोग करके, मीडिया निकालें और ठंडा pbs के ३०० μl के साथ दो बार कोशिकाओं को कुल्ला ।
  2. आइस पर सेल कल्चर प्लेट लगाएं । lysis बफर के ३०० μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए सेते । फिर एक सेल स्क्रैपर का उपयोग कर सेल lysate इकट्ठा और एक १.५-मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए सेल lysate हस्तांतरण ।
  3. 2 एस के लिए १४,५०० rpm पर एक सेल homogenize के साथ सेल lysate homogenize, 3 बार बर्फ पर इंट्रासेलुलर tyrosinase प्राप्त करने के लिए । homogenizer के लिए विशेष इष्टतम स्थिति का उपयोग करें ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० × जी में 10 मिनट के लिए अपकेंद्रिकी और सेल सतह पर तैरनेवाला एक १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण । जबकि उपयोग में बर्फ पर रखें ।
  5. एक ९६-अच्छी तरह से स्पष्ट पॉलीस्टाइरीन microplate के लिए सतह पर तैरनेवाला के ७० μl स्थानांतरण ।
  6. एक ९६-अच्छी तरह से स्पष्ट पॉलीस्टाइरीन माइक्रोप्लेट के लिए टायरोसिनेस सब्सट्रेट (dopa) युक्त समाधान के १४० μl जोड़ें, धीरे शेक, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए सेते ।
  7. वैकल्पिक, एक अच्छी तरह से करने के लिए १०० U/एमएल मशरूम टायरोसिनेस समाधान के ७० μl जोड़ने और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए सेते ।
  8. माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग कर ४७५ एनएम की तरंगदैर्घ्य पर टायरोसिनेस गतिविधि को मापने ।
  9. प्रत्येक नमूने के प्रोटीन एकाग्रता के लिए टायरोसिनेस गतिविधि को सामान्य. एक ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रत्येक नमूने के प्रोटीन एकाग्रता उपाय ।

4. मामेलाइन सामग्री को मापने

  1. चरण 2 में वर्णित विधि का उपयोग करके, मीडिया को निकालें और ठंडा pbs के ३०० μl के साथ दो बार कोशिकाओं को कुल्ला ।
  2. आइस पर सेल कल्चर प्लेट लगाएं । lysis बफर के ३०० μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए सेते । फिर एक सेल स्क्रैपर का उपयोग कर सेल lysate इकट्ठा और एक १.५-मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए सेल lysate हस्तांतरण ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० × जी में 10 मिनट के लिए अपकेंद्रिका ।
  4. एक नई ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और सामान्यीकरण के लिए कुल प्रोटीन एकाग्रता को मापने. एक ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रत्येक नमूने के प्रोटीन एकाग्रता उपाय ।
  5. प्रत्येक गोली के लिए 1 N naoh के ३०० μl जोड़ें और 1 एच के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० × जी में 10 मिनट के लिए भंग समाधान अपकेंद्रिका ।
  7. एक ९६-अच्छी तरह से microplate के लिए सतह पर तैरनेवाला के २०० μl स्थानांतरण ।
  8. ४०० एनएम की तरंगदैर्घ्य पर मेमेलाइन सामग्री को मापें ।
  9. प्रोटीन एकाग्रता के लिए मेलाइन सामग्री को सामान्य.

5. fontana-मस्सन धुंधला

  1. fontana – मस्सन धुंधला
    1. ठंडे पीबीएस के ३०० μl के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं ।
    2. एक अच्छी तरह से करने के लिए 10% formalin के २०० μl जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए सेते ।
    3. आसुत जल से कुल्ला ।
    4. जोड़ें २०० μl के पूर्व गर्म अमोनियाकल चांदी काम कर समाधान और 1 एच के लिए सेते ३७ डिग्री सेल्सियस पर या जब तक कोशिकाओं पीले रंग में हो/
      सावधानी: एक 58-60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ताजा मिश्रित अमोनियाकल सिल्वर वर्क सॉल्यूशन लगाएं और तापमान के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दें ।
    5. अमोनियाकल चांदी काम समाधान निकालें और आसुत जल के साथ कुल्ला ।
    6. आसुत जल निकालें । ०.१% गोल्ड क्लोराइड के २०० μl जोड़ें और आरटी पर 2 मिनट के लिए सेते ।
    7. ०.१% गोल्ड क्लोराइड समाधान निकालें और आसुत जल से कुल्ला करें ।
    8. आसुत जल निकालें । सोडियम थायोसल्फेट समाधान के २०० μl जोड़ें (5%, w/v) और 2 मिनट के लिए सेते ।
    9. सोडियम थायोसल्फेट समाधान निकालें और आसुत जल से कुल्ला करें ।
    10. आसुत जल निकालें । 5 मिनट के लिए परमाणु तेजी से लाल और सेते के २०० μl जोड़ें ।
    11. परमाणु तेजी से लाल निकालें और नल के पानी से कुल्ला ।
    12. नल का पानी निकालें और एक खुर्दबीन के नीचे दाग कोशिकाओं का निरीक्षण ।
  2. fontana – मस्सन धुंधला (दहलीज विश्लेषण imagej का उपयोग कर)
    नोट: छवि विश्लेषण प्रक्रिया का एक उदाहरण imagej सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए पूरक सामग्री में दिखाया गया है ।
    1. प्रोग्राम imagej खोलें ।
    2. फ़ाइल का चयन करें । खुला | माइक्रोस्कोप छवि।
    3. छवि का चयन करें । समायोजित करें । रंग थ्रेशोल्ड ।
    4. fontana के साथ दाग क्षेत्र को मापने के लिए – masson, शून्य करने के लिए चमक पैरामीटर पट्टी सेट और चमक पट्टी को समायोजित बिंदु जिस पर सभी दाग कोशिकाओं (काले या गहरे भूरे रंग) शामिल हैं खोजने के लिए.
    5. विश्लेषण करें चुनें | कणों का विश्लेषणकरें । विश्लेषण कणों विंडो में सारांश बॉक्स की जाँच करें और ठीकदबाएँ । सारांश परिणाम प्राप्त करें और किसी स्प्रेडशीट में चिपकाएं ।
      नोट: परिणामी बॉक्स पैरामीटर का वर्णन निंनानुसार हैं:
      स्लाइस: प्रत्येक छवि का नाम
      गणना: दाग कोशिकाओं की संख्या
      कुल क्षेत्रफल: गिने जाने वाले प्रकोष्ठों का कुल क्षेत्रफल
      औसत आकार: कुल क्षेत्रफल/
      % क्षेत्र: सना हुआ क्षेत्र/कुल क्षेत्रफल × १००%; कुल क्षेत्र की गणना स्वचालित रूप से की जाती है ।
    6. कुल क्षेत्रफल के मान का उपयोग करके मेमेलाइन के साथ दाग वाले सापेक्ष क्षेत्र की गणना करें ।
      सापेक्ष मेमेलाइन दाग क्षेत्र (%) = परीक्षण नमूना के कुल सेलुलर क्षेत्र के मूल्य/नियंत्रण × १०० के औसत कुल क्षेत्र, अर्थात्,

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Representative Results

आरबूतिण के हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि के लिए प्रतिनिधि परिणाम, एक विरोधी melanogenic यौगिक, B16F10 melanocytes में नीचे दिखाए गए हैं । चित्रा 1a से पता चलता है कि आरब्यूटिन ने वाहन-उपचारित नियंत्रण के मुकाबले सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि को काफी दबा दिया । इसी प्रकार, आरब्यूइन से उत्तेजित कोशिकाओं की मेलानीन सामग्री नियंत्रण (चित्र 1b) की तुलना में काफी कम हो गई थी । fontana-मस्सन दाग के साथ दाग कोशिकाओं की सूक्ष्म छवियों चित्रा 1cमें दिखाया गया है । आरबूतण उपचार नियंत्रण के साथ तुलना में काले वर्णक के क्षेत्र में कमी आई ।

Figure 1
चित्रा 1 : आर्बुटन मेलानोसाइट्स में मेलेमोजेनेसिस को दबा दिया । B16F10 कोशिकाओं को आरब्यूइन (१२५ μg/एमएल) के साथ ७२ एच. ए के लिए इलाज किया गया । सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि. B. मेलानइन सामग्री । C. melanin fontana के साथ कल्पना-masson दाग था । डेटा का मतलब है ± SEM (n = 4) । सांख्यिकीय तुलना छात्र के t-परीक्षण (p मान < 0.05 सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया था) का उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

हम परीक्षण यौगिकों की हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया सुसंस्कृत melanocytes का उपयोग । प्रतिनिधि परिणाम आरब्यूटिन, एक टायरोसिनेस अवरोध करनेवाला के हाइपोपाइमेंटेशन प्रभाव है कि टायरोसिनेस गतिविधि और सेलुलर मेनेनाइन सामग्री हिचकते दिखाया । इन पद्धतियों का व्यापक रूप से एंटी-मेलानोजेनिक गतिविधि अनुसंधान में उपयोग किया जाता है । इन assays का उपयोग, हम भी सफलतापूर्वक कई bioactive यौगिकों कि पिछले एक दशक में B16F10 कोशिकाओं पर melanogenesis निरोधात्मक प्रभाव है की पहचान की है9,10,11,12, 13 , 14.

मेमेलाइन विभिन्न वर्णक कोशिकाओं में मेलानोसोम द्वारा उत्पादित होता है, जिसमें त्वचा में मेलानोसाइट्स शामिल होते हैं । इस अध्ययन में, हम B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं है कि मेलेनाइन का उत्पादन, जो संस्कृति माध्यम का कारण बनता है गहरे भूरे रंग या काले15हो जाता है । प्राथमिक मेलानोसाइट्स vivo प्रभाव में अध्ययन करने के लिए जैविक रूप से महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है, लेकिन उनके सीमित प्रफलन क्षमता और उत्पन्न phenotypes में परिवर्तनशीलता के कारण, संवर्धित मेलानोसाइट्स विट्रो मॉडल16में एक विश्वसनीय माना जाता है । इस कोशिका रेखा के मेलेनोजेनेसिस प्राथमिक melanogenesis के उन लोगों के साथ तुलनीय है । इस विधि बेहतर मशरूम टायरोसिनेस गतिविधि परख, जिसमें एंजाइम सीधे सब्सट्रेट और हाइपोपाइमेंटेशन परीक्षण यौगिक के साथ incubated है से सेलुलर पर्यावरण का प्रतिनिधित्व करता है ।

इन प्रयोगों प्रदर्शन से पहले, यह करने के लिए आवश्यक हो सकता है 3-[4, 5-dimethylthiazole-2-yl]-2, 5-डाईफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (mtt) परख या तुलनीय assays, जैसे सेल वायलेट परख, के साथ परीक्षण यौगिक (s). एक परीक्षण पदार्थ कोशिका प्रसार को प्रभावित करता है या cytotoxicity दर्शाती है, तो melanocyte वृद्धि प्रभावित हो सकता है, और परिणाम सही ढंग से सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं. रसायन या प्राकृतिक पदार्थ अक्सर उच्च सांद्रता में कुछ cytotoxicity है और यह हल्के गतिविधि के साथ पदार्थों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । यह भी पदार्थ और प्राकृतिक निष्कर्षों के लिए सेल प्रसार और भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए असामान्य नहीं है. नतीजतन, सेल विकास के कारण अतिरिक्त बायोएक्टिविटी के लिए संभावित जांच की जानी चाहिए, हालांकि सेल विकास पर इन प्रभावों को प्रोटीन एकाग्रता के साथ गतिविधि को सामान्य करके समायोजित किया जा सकता है ।

विभिंन तंत्र हाइपोपिग्मेंटेशन टायरोसिनेस गतिविधि के स्वतंत्र में परिणाम सकता है । melanogenesis एक जटिल जैव संश्लेषण मार्ग है कि कई संकेत पारक्रमण रास्ते और प्रतिलेखन कारक गतिविधियों17शामिल है । इसलिए, कुंजी जीन और प्रोटीन और melanogenic संकेत पारक्रमण रास्ते की अभिव्यक्ति hypopigmentation के एक में गहराई से अध्ययन के लिए जांच की जा सकती है । mitf मेलेनोजेनेसिस और α-melanogenesis-उत्तेजक हार्मोन में एक महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शन कारक है (α-msh) मेलेजेनिक संकेत पारक्रमण रास्ते को उत्तेजित कर सकते हैं18,19. उनके ज्ञात जैविक विशेषताओं के आधार पर, संबंधित संकेत पारक्रमण रास्ते आगे अध्ययन किया जा सकता है ।

जब मेमेलाइन सामग्री को मापने, प्राप्त मूल्यों को भी प्रोटीन एकाग्रता द्वारा सामान्यीकृत किया जाना चाहिए, ताकि परिणाम सही ढंग से सेल प्रति मेमेलाइन सामग्री का प्रतिनिधित्व या प्रति संस्कृति क्षेत्र20. इसके अतिरिक्त, phenol-लाल मुक्त मध्यम अवशोषण पर phenol लाल के नकारात्मक प्रभाव से बचने के लिए यौगिक उपचार कदम में सिफारिश की है.

मेलाइन धुंधला के लिए, हमने fontana-मस्सन दाग का इस्तेमाल किया, जो आर्गेंटाफिन पदार्थों का पता लगाता है, जैसे मेलाइन और आर्जेन्टाफिन सेल21। इस तकनीक का उपयोग पैराफिन या फ्रोजन सेक्शन नमूनों के लिए भी किया जाता है । इस प्रयोग में प्रयुक्त अभिकर्मकों हानिकारक हैं; संपर्क और इनहेलेशन से बचना चाहिए, और अभिकर्मकों को केवल एक धूआं हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए जब भी संभव हो । दाग लगाने के बाद imagej का इस्तेमाल सना एरिया की गणना के लिए किया जाता है । fontana-मस्सन धुंधला के साथ, यह विरल सकारात्मक कोशिकाओं में बेहोश दाग की व्याख्या करने के लिए मुश्किल हो सकता है; हालांकि, यह मेलाइन-रिच मेलानोसाइट्स के लिए एक मुद्दा नहीं हो सकता है । प्रयोगों में प्रयुक्त सिल्वर नाइट्रेट, अमोनियाकल सिल्वर, सोडियम थिओसल्फेट और अमोनियम हाइड्रॉक्साइड को उनकी विषाक्तता के कारण देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए ।

ये व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं melanogenesis और हाइपोपाइमेंटेशन के क्षेत्र में तरीके हैं क्योंकि वे तेजी से कर रहे हैं, आसान, लागत प्रभावी, और विश्वसनीय. ये विधियां उन जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकती है जो उपन्यास यौगिकों या एंटी-मेलानोजेनिक या प्रो-मेलानोजेनिक गतिविधियों के साथ अर्क की पहचान करना चाहते हैं । वे भी melanocyte सेल विकास या सेलुलर गतिविधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक सीमा मानव त्वचा, जो एक जटिल अंग है जिसमें homeostasis विभिंन पर्यावरणीय, रासायनिक, और जैविक कारकों के जवाब में बनाए रखा है पर परिणामों की reproducibility है । इसलिए, विट्रो में इन तरीकों द्वारा पुष्टि की हाइपोपाइमेंटेशन एजेंटों vivo में मानव त्वचा पर महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं हो सकता है ।

संक्षेप में, इन प्रोटोकॉल्स मेलेनोजेनेसिस पर उनके निरोधात्मक प्रभाव के लिए स्क्रीनिंग परीक्षण यौगिकों में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम हैं । हमारा सुझाव है कि इन विधियों से न केवल मेलेनोजेनेसिस पर निरोधात्मक प्रभाव की व्याख्या की जा सकती है बल्कि तंत्र भी शामिल है । bioactive उंमीदवार यौगिकों की पहचान के बाद, आगे परीक्षण जैविक तंत्र या वाणिज्यिक अनुप्रयोगों के अध्ययन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं , vivo उपयोग में पीछा किया ।

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Disclosures

लेखकों के पास रिपोर्ट करने के लिए कोई प्रकटीकरण नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को कृषि, खाद्य, और ग्रामीण मामलों के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित, एग्री-बायोइंडस्ट्री टेक्नोलॉजी डेवलपमेंट प्रोग्राम के माध्यम से खाद्य, कृषि, और वानिकी (आईपीईटी) में प्रौद्योगिकी के लिए कोरिया के योजना और मूल्यांकन संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था (mafra ) (116159-02-2-WT011) और स्कूल ऑफ लाइफ साइंसेज और बायोटेक्नोलॉजी फॉर BK21 प्लस, कोरिया यूनिवर्सिटी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine Sigma D9628
Ammonium hydroxide solution Sigma #320145
Arbutin Fluka #10960
DMEM HyClone SH30243.01
FBS HyClone SH30084.03
Formalin Yakuri Pure Chemicals #16223 37%
Gold chloride American MasterTech AHG0226 0.10%
HCl Samchun chemical H0255
KCl Bio basic Canada Inc. PB0440
KH2PO4 Sigma #60218
Na2HPO4 J.T.Baker #3817-01
NaCl Duksan pure chemicals #81
NaOH Sigma 655104
Nuclear fast red Merck 100121 Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution HyClone SV30010
Silver nitrate Duksan Pure Chemicals #900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) J.T. Baker #3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) Sigma S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate Duksan Pure Chemicals #2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Bio Basic Canada TB0196
Triton X-100 Union Carbide T8787
Tyrosinase from mushroom Sigma T3824 25 KU

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References

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जैव रसायन अंक १४५ hypopigmentation मेलानोजेनेसिस टायरोसिनेस गतिविधि मेलेनिइन सामग्री melanogenesis fontana-मस्सन दाग
विट्रो में हाइपोपिग्मेंटेशन गतिविधि का प्रमाणन
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Kim, Y. J., Kim, M. J., Kweon, D. K., Lim, S. T., Lee, S. J. Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e58185, doi:10.3791/58185 (2019).

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