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Biochemistry

Quantificazione di Hypopigmentation attività In Vitro

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58185
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Biotechnology, Graduate School of Life Sciences & Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 2JinWoo Bio Co. Ltd

Summary

Descriviamo tre metodi sperimentali per la valutazione dell'attività di hypopigmentation di sostanze chimiche in vitro: quantificazione del contenuto di attività e melanina 2) 1) cellulare tirosinasi e 3) misurazione della melanina di melanina cellulare colorazione e analisi delle immagini.

Abstract

Questo studio presenta metodi di laboratorio per la quantificazione di hypopigmentation attività in vitro. Melanina, il pigmento più importante nei melanociti, è sintetizzata in risposta a più fattori cellulari e ambientali. Melanina protegge le cellule della pelle da danno ultravioletto, ma ha anche funzioni biochimiche e biofisiche. Eccessiva produzione o accumulo di melanina nei melanociti possa causare problemi dermatologici, come lentiggini, macchie scure, melasma e talpe. Di conseguenza, il controllo della melanogenesi con agenti di ipopigmentazione è importante in individui con esigenze cliniche o cosmetici. Melanina è sintetizzata principalmente nei melanosomi dei melanocytes in un complesso processo biochimico chiamato melanogenesi, che sono influenzata dalla estrinseca e fattori intrinseci, quali ormoni, l'infiammazione, l'età e l'esposizione alla luce ultravioletta. Descriviamo tre metodi per determinare l'attività di ipopigmentazione dei prodotti chimici o sostanze naturali nei melanociti: misura della attività della tirosinasi 1) cellulare e contenuto 2) della melanina e melanina cellulare 3) colorazione e quantificare con immagine analisi.

Nella melanogenesi, tirosinasi catalizza la tappa limitante che converte L-tirosina in 3,4-diidrossifenilalanina (l-dopa) e poi in Dopachinone. Di conseguenza, l'inibizione della tirosinasi è un meccanismo primario hypopigmentation. In melanociti coltivati, attività della tirosinasi può essere quantificato l'aggiunta di l-dopa come substrato e misurando dopachinone produzione mediante spettrofotometria. Melanogenesi possono anche essere misurata da quantificare il contenuto di melanina. La frazione cellulare melanina-contenenti è estratta con NaOH e melanina è misurata spettrofotometricamente. Infine, il contenuto di melanina può essere quantificato mediante analisi d'immagine seguendo Fontana-Masson colorazione della melanina. Anche se i risultati di queste analisi in vitro non possono essere sempre riprodotto in pelle umana, questi metodi sono ampiamente utilizzati nella ricerca di melanogenesi, soprattutto come il passo iniziale per identificare potenziali attività di ipopigmentazione. Questi metodi possono essere utilizzati anche per valutare l'attività dei melanociti, la crescita e la differenziazione. Risultati coerenti con i tre diversi metodi garantiscono la validità degli effetti.

Introduction

Melanina svolge un ruolo critico nella fisiologia, patologia e tossicologia di diversi organi tra cui la pelle, occhi e cervello1. Le principali funzioni di melanina sono effetti foto-screening e biochimici. Melanina assorbe la luce visibile e vicino infrarosso, così come la radiazione ultravioletta (UV), con tassi di assorbimento aumentato a lunghezze d'onda più corta della luce; così, melanina protegge i tessuti dai danni causati dalla luce visibile o UV radiazione2. Melanina è un antiossidante e ha un'affinità per metalli e altre sostanze chimiche tossiche; di conseguenza, può proteggere tessuti dallo stress ossidativo e chimica3. Tuttavia, l'eccessiva produzione di melanina provoca problemi dermatologici.

La quantità e qualità di melanina nella pelle e iris sono le determinanti più importanti del colore dell'iride e della pelle. Gli individui possono avere preferenze di colore di pelle differente; alcuni favoriscono la pelle abbronzata, mentre altri preferiscono colori più chiari di pelle. A seconda di questi profili di consumo, ipopigmentazione cosmetici sono stati sviluppati per soddisfare i singoli mercati per pelle favorito colori4. Di conseguenza, gli studi di attività, l'ipopigmentazione e anti-melanogenic sono importanti sia scientificamente e praticamente.

Melanogenesi sono il processo di biosintesi di melanina attraverso una serie di reazioni chimiche spontanee e non enzimatici nei melanociti. Un Melanocita è circondato da circa 36 cheratinociti e melanociti sono le fabbriche di sintesi di melanina che distribuiscono il loro prodotto ai keratinocytes vicini. In pelle, la melanina prodotta e memorizzati nel vano melanosomal dei melanociti è trasportata ai keratinocytes vicini nell'epidermide tramite dendriti.

L-tirosina serve come il substrato iniziale per melanogenesi e l'enzima tirosinasi catalizza due reazioni consecutive che convertono L-tirosina in 3,4-diidrossifenilalanina (DOPA) e poi in Dopachinone. Queste reazioni sono la tappa limitante nella melanogenesi5,6. Di conseguenza, ipopigmentazione attività prima può essere misurata valutando attività tirosinasica cellulare direttamente. Per farlo, gli estratti di melanociti contenente tirosinasi sono incubati con DOPA e il dopachinone prodotta nei campioni può essere misurata mediante spettrofotometria a 475 nm. I valori sono normalizzati dalle concentrazioni di proteine dei campioni e delle sostanze con risultato di attività di hypopigmentation in meno formazione dopachinone rispetto ai comandi.

In secondo luogo, ipopigmentazione attività può essere quantificato misurando la melanina in melanociti coltivati direttamente. Dopo trattando le cellule con il materiale di prova, la melanina viene estratto in condizioni alcaline e il contenuto di melanina è quantificato mediante spettrofotometria a 400 nm. Un agente di ipopigmentazione si tradurrà in un minor contenuto di melanina che la controlli7.

Infine, l'attività di ipopigmentazione può essere quantificata dalla Fontana-Masson melanina macchiatura e analisi delle immagini successive. Nella macchiatura di Fontana-Masson, granuli di melanina riducono il nitrato di ammoniaca-argento allo stato metallico nero visibile e le zone nere delle cellule in immagini microscopiche rappresentano la quantità di melanina.

Un agente di hypopigmentation dà solitamente risultati coerenti e comparabili con questi tre metodi, che conferma che l'attività della sostanza è valido. In alternativa, può essere utile misurare l'espressione di geni chiave e proteine nella melanogenesi in risposta alla sostanza in esame per esaminare l'attività di ipopigmentazione. Oltre alla tirosinasi, proteine tirosinasi (TRP-1) e tautomerase del dopachrome (TRP-2) sono enzimi critici nella melanogenesi8. Il fattore di trascrizione microftalmia-collegata di fattore di trascrizione (MITF) è un regolatore matrice nella melanogenesi e quantificazione dei suoi livelli di espressione di proteina/del gene o un'analisi di attività del promotore è utilizzabile anche per valutare l'attività di ipopigmentazione.

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Protocol

1. preparazione del Medium, composti e reagenti

  1. Preparare mezzo completo di sviluppo di B16F10. Supplemento Dulbecco per volta mezzo di Eagle (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina (PEST).
    1. Per fare 500 mL di terreno completo, mix 445 mL di mezzo di Eagle di Dulbecco modificato (DMEM) con 50 mL di FBS e 5 mL di PEST in una bottiglia di vetro sterilizzati 1 L. Dopo aver mescolato delicatamente, filtrare il mezzo attraverso un filtro di parte superiore della bottiglia da 0,2 µm per una nuova bottiglia di vetro sterilizzati e poi conservare a 4 ° C.
      Attenzione: Tutte le tecniche di coltura cellulare dovrebbero essere intrapresa in sicurezza microbiologica mobile utilizzando una tecnica asettica per garantire la sterilità.
  2. Preparare il tampone di lisi: 20 mM Tris (idrossimetil) amminometano contenente 0,1% Triton X-100 (v/v) tampone a pH 7,5 (pH regolato con HCl). Questo buffer può essere utilizzato per 3 mesi se conservato a temperatura ambiente (TA). Aggiungere gli inibitori della proteasi per il buffer di lisi bene prima dell'uso.
  3. Preparare il tampone di dosaggio inibitore della tirosinasi. Preparare 1 M NaH2PO4 (monobasico) e 1 M Na2HPO4 (bibasici) soluzioni di riserva. Mescolare 46,3 mL di Na2HPO4 e 53,7 mL di NaH2PO4 per preparare un volume finale di tampone fosfato di sodio 0.1 M (pH 6,8).
    1. Diluire la miscela risultante di 1 L (volume finale) con H2O. regolare il pH della soluzione finale a 6,8. Questo buffer può essere utilizzato per 1 mese se conservati a 4 ° C.
  4. Preparare la soluzione di substrato di tirosinasi: 0,1% 3,4-diidrossi-L-fenilalanina (DOPA, p/v) dissolto in tampone di dosaggio inibitore della tirosinasi (Vedi punto 1.3).
    Attenzione: Tenere il ghiaccio mentre è in uso.
  5. Facoltativamente, preparare tirosinasi fungo di 100 U/mL. Sciogliere la tirosinasi fungo liofilizzata in tampone di dosaggio inibitore della tirosinasi. Questa soluzione può essere utilizzata per 2 mesi se conservato a – 20 ° C. L'attività della tirosinasi fungo così come attività tirosinasica cellulare vengono calcolati in presenza di materiali di cella.
    Attenzione: La soluzione è aliquotata prima congelamento così ripetuto congelamento e scongelamento può essere evitato. Mantenere la soluzione sul ghiaccio mentre è in uso.
  6. Preparare la soluzione di NaOH N 1. Pesare 4 g di NaOH in un matraccio tarato e scioglierlo nell'acqua distillata per portare 100 mL.
  7. Preparare la soluzione di fissaggio (10% formalina). Diluire 27 mL di formaldeide al 37% con 73 mL di acqua distillata. Preparare freschi ogni giorno.
  8. Preparare soluzione d'argento ammoniacale. Preparare 5 mL di soluzione di nitrato d'argento 10% in un matraccio tarato. Aggiungere goccia a goccia, la soluzione di idrossido di ammonio fino alla completa dissoluzione del precipitato. Aggiungere 200 μL di soluzione di nitrato d'argento (10%). La soluzione diventerà leggermente nuvolosa.
    Attenzione: Evitare il contatto e l'inalazione. Utilizzare una cappa aspirante.
  9. Preparare soluzione d'argento ammoniacale. Diluire 2,5 mL della soluzione d'argento ammoniacale con 7,5 mL di acqua distillata. Utilizzare una sola volta e poi scartare.
    Attenzione: Evitare il contatto e l'inalazione. Utilizzare una cappa aspirante.
  10. Preparare cloruro 0,1% d'oro. Preparare 1 mL di cloruro 10% oro e aggiungere 99 mL di acqua distillata in un matraccio tarato. Preparare freschi ogni giorno.
  11. Preparare la soluzione salina tampone fosfato (PBS). Aggiungere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4 e 0,24 g di KH2PO4 in 800 mL di acqua distillata. Aggiustare il pH a 7.4 con HCl. Diluire la miscela risultante di 1 L (volume finale) con acqua distillata.
  12. Preparare la soluzione di tiosolfato di sodio 5% (p/v) disciolto in acqua distillata.

2. cultura e trattamento delle cellule

  1. Utilizzare cellule B16F10 commercialmente disponibili. Mantenere le cellule B16F10 in sostanza completa. Mantenere il matraccio di cultura delle cellule in un umidificata, 5% CO2 atmosfera incubatore a 37 ° C.
  2. Preparare le sostanze da testare, controllo positivo dell'inibitore e campioni di controllo negativo.
    1. Sciogliere le sostanze in esame nei solventi appropriati. Sciogliere i composti solubili in acqua in acqua bidistillata. Sciogliere acqua composti insolubili in solvente organico adeguato, ad es., DMSO.
    2. Qui, utilizzare arbutina disciolto in acqua bidistillata (125 μg/mL) come controllo positivo per valutare l'attività di hypopigmentation rispetto ai residui della prova o un controllo negativo. Come controllo negativo (controllo veicolo-trattato), utilizzare le soluzioni o i buffer utilizzati nel campione da analizzare, ad esempio, acqua bidistillata, DMSO, etanolo.
  3. Semina delle cellule e trattamento
    1. Cellule B16F10 seme a 5 × 104 cellule/pozzetto in piastre di coltura 24 pozzetti utilizzando terreno completo e incubare in incubatore a CO2 per 24 h. Dopo l'incubazione, aspirare la sostanza completa.
    2. Incubare le cellule con il mezzo di DMEM (senza FB e 1% di penicillina/streptomicina) contenente sostanze da testare, un controllo di inibitore o un controllo negativo in un'incubatrice di CO2 per celle di 72 h. Check ogni 24h sotto il microscopio. Dopo questo passaggio, passare alla procedura 3-5 per ulteriori esperimenti.
      Attenzione: La miscela della sostanza in esame e DMEM media dovrebbe essere filtrata attraverso un filtro di 0,2 μm.

3. misurazione dell'attività della tirosinasi cellulare

  1. Utilizzando il metodo descritto nel passaggio 2, rimuovere i supporti e sciacquare le cellule due volte con 300 µ l di PBS freddo.
  2. Mettere la piastra di coltura delle cellule sul ghiaccio. Aggiungere 300 μL di tampone di lisi e incubare per 5 min. Raccogliere l'utilizzando un raschietto di cella lysate delle cellule, quindi trasferire il lysate delle cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
  3. Omogeneizzare il lysate delle cellule con un omogeneizzatore di cella a 14.500 giri/min per 2 s, 3 volte sul ghiaccio per ottenere tirosinasi intracellulare. Utilizzare la specifica condizione ottimale per l'omogeneizzatore.
  4. Centrifugare per 10 min a 12.000 × g a 4 ° C e trasferire il surnatante delle cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Tenere il ghiaccio mentre è in uso.
  5. Trasferimento 70 μL del surnatante in una micropiastra 96 pozzetti chiaro polistirolo.
  6. Aggiungere 140 µ l di una soluzione contenente substrato tirosinasi (DOPA) di una micropiastra 96 pozzetti chiaro polistirolo, agitare delicatamente e incubare per 2 ore a 37 ° C.
  7. Opzionale, aggiungere 70 μL di soluzione di tirosinasi fungo 100 U/mL ad ogni pozzetto e incubare per 2 ore a 37 ° C.
  8. Misurare l'attività della tirosinasi alla lunghezza d'onda di 475 nm utilizzando il lettore di micropiastre.
  9. Normalizzare l'attività della tirosinasi alla concentrazione di proteina di ciascun campione. Misurare la concentrazione di proteina di ciascun campione da un'analisi di Bradford.

4. misurare il contenuto di melanina

  1. Utilizzando il metodo descritto nel passaggio 2, rimuovere i supporti e sciacquare le cellule due volte con 300 µ l di PBS freddo.
  2. Mettere la piastra di coltura delle cellule sul ghiaccio. Aggiungere 300 μL di tampone di lisi e incubare per 5 min. Raccogliere l'utilizzando un raschietto di cella lysate delle cellule, quindi trasferire il lysate delle cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
  3. Centrifugare per 10 min 12.000 × g a 4 ° C.
  4. Trasferire il surnatante in una concentrazione di proteine totali di nuovo tubo e misura per la normalizzazione. Misurare la concentrazione di proteina di ciascun campione da un'analisi di Bradford.
  5. Aggiungere 300 μL di 1 N NaOH ad ogni pellet e incubare a 60 ° C per 1 h.
  6. Centrifugare la soluzione disciolta per 10 min a 12.000 × g a 4 ° C.
  7. Trasferire 200 μL del surnatante in una micropiastra a 96 pozzetti.
  8. Misurare il contenuto di melanina ad una lunghezza d'onda di 400 nm.
  9. Normalizzare il contenuto di melanina per la concentrazione nella proteina.

5. Fontana – Masson macchiatura

  1. Macchiatura di Fontana-Masson
    1. Lavare le cellule due volte con 300 µ l di PBS freddo.
    2. Aggiungere 200 μL di formalina al 10% ad ogni pozzetto e incubare per 1 h a 4 ° C.
    3. Sciacquare con acqua distillata.
    4. Aggiungere 200 μL di pre-riscaldato argento ammoniacale soluzione di lavoro e incubare per 1h a 37 ° C o fino a quando le cellule diventano di colore giallo/marrone.
      Attenzione: Porre soluzione d'argento ammoniacale mescolate in un bagno di acqua 58 – 60° C e consentono un tempo adeguato per la temperatura equilibrare.
    5. Argento ammoniacale soluzione di lavoro di rimuovere e sciacquare con acqua distillata.
    6. Rimuovere l'acqua distillata. Aggiungere 200 μL di cloruro 0,1% oro e incubare per 2 minuti a TA.
    7. 0,1% di soluzione di cloruro di oro di rimuovere e sciacquare con acqua distillata.
    8. Rimuovere l'acqua distillata. Aggiungere 200 μL di soluzione di tiosolfato di sodio (5%, p/v) e incubare per 2 min.
    9. Rimuovere la soluzione di tiosolfato di sodio e sciacquare con acqua distillata.
    10. Rimuovere l'acqua distillata. Aggiungere 200 μL di Nuclear Fast Red e incubare per 5 min.
    11. Nuclear Fast Red di rimuovere e sciacquare con acqua corrente.
    12. Rimuovere l'acqua del rubinetto e osservare le cellule marcate sotto un microscopio.
  2. Fontana – Masson macchiatura (soglia analisi usando ImageJ)
    Nota: È riportato un esempio della procedura di analisi di immagine utilizzando il software ImageJ nei materiali supplementari.
    1. Aprire il programma ImageJ.
    2. Selezionare il File di | Aperto | Immagine al microscopio.
    3. Selezionare immagine | Regolare | Soglia di colore.
    4. Per misurare la zona macchiata con Fontana – Masson, impostare la barra della luminosità parametro a zero e regolare la barra della luminosità per trovare il punto in cui tutte le cellule marcate (nero o marrone scuro) sono incluse.
    5. Selezionare analizzare | Analizzare le particelle. Riepiloga la casella nella finestra di particelle analizza e premere OK. Ottenere il risultato di riepilogo e incollare in un foglio di calcolo.
      Nota: La descrizione dei parametri del risultante sono come segue:
      Fetta: Nome di ogni immagine
      Count: Numero di cellule marcate
      Superficie totale: Superficie totale delle cellule contate
      Dimensione media: Area/conteggio totale
      % Di area: Area/totale zona macchiata × 100%; superficie totale viene calcolato automaticamente.
    6. Calcolare la relativa zona macchiata con melanina utilizzando il valore della superficie totale.
      Melanina relativa macchiata zona (%) = valore di superficie cellulare totale dell'area totale del campione/media di test di controllo × 100, vale a dire,

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Representative Results

Risultati rappresentativi per l'attività di ipopigmentazione dell'arbutina, un anti-melanogenetico compound, in B16F10 melanociti sono riportati di seguito. Figura 1A Mostra che quel arbutina ha soppresso significativamente l'attività della tirosinasi cellulare rispetto al controllo veicolo-trattati. Allo stesso modo, il contenuto di melanina delle cellule stimolate con arbutin è stata ridotta significativamente rispetto ai comandi (Figura 1B). Immagini al microscopio delle cellule hanno macchiato con la macchia di Fontana-Masson sono mostrati in Figura 1. Arbutina trattamento ha fatto diminuire l'area del pigmento nero rispetto al controllo.

Figure 1
Figura 1 : Arbutina soppressa melanogenesis in melanociti. B16F10 cellule sono state trattate con arbutina (125 μg/mL) per 72 h. r. Attività della tirosinasi cellulare. B. contenuto della melanina. C. melanina è stata visualizzata con macchia di Fontana-Masson. Sono dati i mezzi ± SEM (n = 4). I confronti statistici sono stati eseguiti utilizzando il test t di Student (valori dip < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo presentato i protocolli per la valutazione dell'attività di ipopigmentazione dei composti di prova utilizzando melanociti coltivati. I risultati rappresentativi hanno mostrato l'effetto di ipopigmentazione dell'arbutina, un inibitore della tirosinasi che ha inibito il contenuto di melanina di attività e cellulare di tirosinasi. Questi metodi sono ampiamente usati nella ricerca di attività anti-melanogenic. Usando queste analisi, abbiamo identificato anche con successo parecchi composti bioattivi che hanno melanogenesi effetti inibitori sulle cellule B16F10 nel passato decennio9,10,11,12, 13 , 14.

La melanina è prodotta dai melanosomes in varie cellule del pigmento, tra cui i melanociti nella pelle. In questo studio, abbiamo utilizzato le cellule del melanoma B16F10 che producono la melanina, che provoca il terreno di coltura diventare scuro marrone o nero15. Melanociti primari potrebbero essere biologicamente importanti strumenti per lo studio degli effetti in vivo, ma a causa della loro limitata capacità proliferativa e la variabilità nei fenotipi generato, melanociti coltivati sono considerati un modello in vitro affidabile16. Melanogenesi di questa linea cellulare sono paragonabile con quelle dei melanocytes primario. Questo metodo rappresenta al meglio l'ambiente cellulare dell'analisi di attività della tirosinasi del fungo, in cui l'enzima direttamente viene incubato con il substrato e ipopigmentazione composto in esame.

Prima di eseguire questi esperimenti, potrebbe essere necessario eseguire l'analisi del 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromuro (MTT) o saggi comparabili, ad esempio l'analisi delle cellule viola, con il test presenti. Se una sostanza in esame riguarda la proliferazione delle cellule o presenta citotossicità, quindi melanocita crescita potrebbe essere colpita, e i risultati potrebbero non rappresentare correttamente l'attività della tirosinasi cellulare. Prodotti chimici o sostanze naturali hanno spesso alcuni citotossicità alle alte concentrazioni, e ciò è particolarmente importante per le sostanze con attività delicata. Inoltre non è raro per le sostanze ed estratti naturali per promuovere la proliferazione e differenziamento in cellule. Di conseguenza, occorre esaminare il potenziale per ulteriori bioattività causando la crescita delle cellule, sebbene questi effetti sulla crescita delle cellule potrebbero essere registrati normalizzando l'attività con la concentrazione nella proteina.

Vari meccanismi potrebbero causare ipopigmentazione indipendente di attività della tirosinasi. Melanogenesi sono una via biosintetica complessa che coinvolge molteplici vie di trasduzione del segnale e trascrizione fattore attività17. Pertanto, l'espressione di geni chiave e proteine e vie di trasduzione del segnale melanogenetico potrebbe essere esaminato per uno studio approfondito del hypopigmentation. MITF è un fattore di trascrizione importante nella melanogenesi e ormone α-melanocita-stimolante (α-MSH) in grado di stimolare melanogenetico signal transduction pathways18,19. A seconda delle loro caratteristiche biologiche note, vie di trasduzione del segnale correlate potrebbero essere studiate ulteriormente.

Quando misurando il contenuto di melanina, i valori ottenuti devono essere normalizzati anche dalla concentrazione della proteina, in modo che i risultati correttamente rappresentano il contenuto di melanina per cellulare o per cultura zona20. Inoltre, privo di fenolo-rossi medio è consigliabile nel passaggio trattamento composto per evitare gli effetti negativi di rosso fenolo su assorbanza.

Per la colorazione della melanina, abbiamo usato la macchia di Fontana-Masson, che rileva le sostanze argentaffin, come cellule di melanina e argentaffin21. Questa tecnica è utilizzata anche per paraffina o congelato della sezione campioni seguendo il passo di sparaffinatura. I reagenti utilizzati in questo esperimento sono nocivi; contatto e l'inalazione dovrebbe essere evitati, e i reagenti devono essere utilizzati solo in una cappa aspirante quando possibile. Dopo la colorazione, ImageJ è utilizzato per calcolare la zona macchiata. Con Fontana-Masson colorazione, può essere difficile interpretare la macchiatura debole nelle cellule scarsamente positive; Tuttavia, questo non può essere un problema per i melanociti ricchi di melanina. Il nitrato d'argento, argento ammoniacale, tiosolfato di sodio e idrossido di ammonio utilizzati negli esperimenti devono essere maneggiati con cura a causa della loro tossicità.

Questi sono ampiamente utilizzati sono metodi nel campo della melanogenesi e ipopigmentazione perché sono veloce, pratico, conveniente e affidabile. Questi metodi possono essere utili per i ricercatori che vogliono identificare nuovi composti o estratti con attività anti-melanogenic o pro-melanogenic. Sono inoltre utilizzabili per valutare la crescita delle cellule melanociti o attività cellulare. Una limitazione è la riproducibilità dei risultati sulla pelle umana, che è un organo complesso in cui l'omeostasi è mantenuta in risposta a vari fattori ambientali, chimici e biologici. Pertanto, gli agenti di hypopigmentation confermati da questi metodi in vitro potrebbero non avere effetti significativi sulla pelle umana in vivo.

In sintesi, questi protocolli sono un passo iniziale importante nello screening test composti per i loro effetti inibitori sulla melanogenesi. Suggeriamo che questi metodi possono spiegare non solo gli effetti inibitori sulla melanogenesi, ma anche il meccanismo in questione. Dopo aver identificati composti bioattivi candidato, ulteriori test può condurre agli studi dei meccanismi biologici o applicazioni commerciali, seguite da uso in vivo.

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Disclosures

Gli autori non hanno alcuna informativa al rapporto.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dalla Korea Institute of Planning e valutazione per la tecnologia in cibo, agricoltura e silvicoltura (IPET) attraverso il programma di sviluppo della tecnologia Agri-Bioindustry, finanziato dalla Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) e scuola di Scienze della vita e della biotecnologia per BK21 PLUS, Università della Corea.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine Sigma D9628
Ammonium hydroxide solution Sigma #320145
Arbutin Fluka #10960
DMEM HyClone SH30243.01
FBS HyClone SH30084.03
Formalin Yakuri Pure Chemicals #16223 37%
Gold chloride American MasterTech AHG0226 0.10%
HCl Samchun chemical H0255
KCl Bio basic Canada Inc. PB0440
KH2PO4 Sigma #60218
Na2HPO4 J.T.Baker #3817-01
NaCl Duksan pure chemicals #81
NaOH Sigma 655104
Nuclear fast red Merck 100121 Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution HyClone SV30010
Silver nitrate Duksan Pure Chemicals #900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) J.T. Baker #3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) Sigma S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate Duksan Pure Chemicals #2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Bio Basic Canada TB0196
Triton X-100 Union Carbide T8787
Tyrosinase from mushroom Sigma T3824 25 KU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biochimica problema 145 ipopigmentazione melanogenesi attività della tirosinasi contenuto di melanina melanociti macchia di Fontana-Masson
Quantificazione di Hypopigmentation attività In Vitro
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Kim, Y. J., Kim, M. J., Kweon, D.… More

Kim, Y. J., Kim, M. J., Kweon, D. K., Lim, S. T., Lee, S. J. Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e58185, doi:10.3791/58185 (2019).

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