Summary
在这里, 我们描述了一个简单的方法, 以诱导临床相关的皮肤压疮 (pu) 在小鼠模型的脊髓损伤 (sci)。该模型可用于临床前的研究, 筛选不同的治疗方法治疗 pu 在 sci 患者。
Abstract
压疮 (pu) 是外伤性脊髓损伤 (sci) 常见的衰弱并发症, 往往发生在骨性突起周围的软组织中。然而, 在受控实验环境中, 在动物模型的背景下, sci 对皮肤伤口愈合的影响鲜为人知。在本研究中, 提出了一种简单、非侵入性、可重复性和临床相关的全 sci 背景下的小鼠 pu 模型。成年雄性小鼠 (巴布克, 10周大) 被剃光并脱毛。脱毛后 (24小时), 小鼠接受椎板切除术, 然后进行完整的脊髓横断 (t9-t10 椎骨)。紧接着, 小鼠背部的皮肤褶皱被抬起, 夹在两个磁碟之间, 在接下来的12小时内, 从而形成了一个缺血区域, 在随后的几天里发展成了一个 pu。在磁石后应用第3天, 受伤部位显示组织水肿和表皮消失。pu 自发地发展和愈合。然而, 与控制非 sci 小鼠相比, sci 小鼠的愈合速度较控制的非 sci 小鼠慢. 相反, 当伤口在 sci 水平以上产生时, sci 和对照非 sci 小鼠之间的愈合没有差异。这个模型是一个潜在的有用的工具, 以研究 sci 后皮肤 pu 的发展和愈合的动态, 以及测试治疗方法, 可能有助于愈合这种伤口。
Introduction
压疮 (pu) 是创伤性 sci1 的主要继发并发症。pu 是局部伤害的皮肤和 (或潜在组织), 通常发生在骨性突起, 其中体重集中, 而病人坐在或躺着1。皮肤、脂肪和肌肉暴露在这种持续的压力下, 导致局部缺血、组织炎症、机械损伤和坏死2, 3.
pu 的发育受几个局部因素的影响, 包括压力和剪切的大小、负荷持续时间、皮肤水分和温度、损伤寿命和一般皮肤卫生。还有一些系统性因素发挥了作用, 如一般身体状况、骨骼和肌肉组织形态和力量4、患者年龄、血液学措施、性别, 甚至包括婚姻状况、教育、和收入4,5。
pu 的预防和治疗仍然是 sci 患者面临的重大挑战。sci 患者在约30-40 的病例中出现 pu, 复发率为 60-85%, 可能是由于疤痕组织薄弱和缺乏保护感 1.因此, pu 往往导致 sci 患者再住院, 总体上对卫生保健系统5、6、7、8、9构成了巨大的经济负担 (仅需增加80% 以上),10个。
据我们所知, 由于缺乏合适的动物模型, 目前还没有在可控实验环境中进行研究, 以调查 sci 对 pu 愈合过程的影响。在这里, 一个可重复和临床相关的小鼠模型的 pu 在皮肤上的描述。该模型可用于研究 pu 发病和随后愈合的动态, 以及测试潜在的治疗方法, 以防止 pu 或改善 pu 愈合的情况下, sci。
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Protocol
所有动物处理和外科手术都是根据罗格斯大学动物护理和使用机构委员会批准的协议进行的。给老鼠喂标准饮食和水。
1. 手术和非手术器械的制备
- 在高压灭菌器中消毒手术和非手术器械。
- 用70% 乙醇清洁手术台, 并将加热垫加热至37°c。
- 将加热垫放在手术台上, 并用无菌手术窗帘覆盖。
请注意:在所有生存过程中, 这里使用 "无接触" 技术来维持无菌。
2. 动物的制备和 t9-t10 脊柱椎板切除术的实施
- 生成成体 (balbbe) 10周大的雄性老鼠。在每个动物中使用吸入器进行麻醉, 从5% 异氟醚开始, 然后减少到 2-3%, 以维持其余手术的镇静剂。
- 确认完全麻醉引起任何反应的尾爪夹被诱导的夜感刺激。
- 用电动剪子把头发剃光在背 (头到尾) 上, 然后涂上脱毛霜 (3分钟), 取出剩余的头发。最后, 用跑步的水/湿擦洗清洗背板, 把动物送回笼子里。
请注意:这是必要的, 以避免额外的刺激皮肤和化学污染时, 皮肤受伤 - 第二天, 应用眼药膏角膜, 以保护眼睛在手术过程中不干燥, 然后, 擦洗皮肤与3替代制剂的 betadine 磨砂和70% 乙醇。
- 用手术刀, 在 t8-t12 椎骨的水平上沿着背部中线进行皮肤切口 (~ 1.0-1.5 厘米)。
请注意:椎体的水平是通过使用与 t13 椎体11,12 相对应的漂浮肋骨的位置对 t13 的椎体进行计数来确定的。 - 清除皮下脂肪组织, 以获得到脊椎旁的肌肉, 然后慢慢解剖他们, 以暴露两侧的刺过程和层。
请注意:在这一点上, 非常小心地做这个程序, 以避免过度出血或脊髓损伤。 - 进行椎板切除术, 通过使用显微解剖钳轻轻剥落脊柱层, 露出脊髓 (t9-t10 椎骨)。
请注意:进行椎板切除术, 使过度的脊髓暴露, 以方便受伤的产生。在对照组中, 只进行椎板切除术。
3. 执行 t9-t10 完全脊髓损伤
- 使用钳子, 在 t8 固定脊柱, 并抬起, 以夸大脊柱曲率。
- 使用精细的剪刀, 分割脊髓之间的 t9 和 t10 椎体一路到椎管的地板, 以确保完整的横截面。
- 在手术显微镜下观察完整的横断后, 在椎板切除术部位涂上一块皮下脂肪, 以便在手术部位关闭之前为脊髓提供额外的保护。
- 最后, 关闭伤口和缝合椎旁肌肉, 浅表筋膜, 使用连续缝合, 然后关闭皮肤使用缝合夹12。
- 后 sci, 观察第二天的排便情况;然而, 通过手动膀胱排空来管理膀胱。
请注意:basso 鼠标量表 (bms) 可用于监测 sci 后的后肢功能恢复的进展, 第二天, 然后每周, 见补充图 111,12,13。
4. 完全 sci 后皮肤压力溃疡的诱导
- sci 手术后, 立即用 betadine 和70% 的酒精擦洗动物的背部。
- 对于 sci 站点下的 pu, 在小囊附近的背侧皮肤中注射一个非常小的体积 (10μl), 在等距位置 ~ 0.5-1.0 cm 相距的地方, 在磁铁应用部位周围的椭圆中使用0.125% 布比卡因的非常小的体积 (10μl)。
请注意:对于 sci 部位上方的 pu, 注射颈椎附近的背侧皮肤。 - 轻轻抬起鼠标背面的皮肤褶皱, 并将其夹在2个磁盘 (直径 5x12 mm, 每个2.4 克, 3800 g 磁力) 之间 (图 1)。11,12
- 在磁铁应用后, 立即将动物送回放置在加热垫上的单个保持架, 直到恢复全意识 (图 1)。
- 采用12小时后, 用异氟烷轻轻麻醉动物并去除磁铁。拍摄伤口部位的照片, 记录 pu 的首次出现 (第0天时间点)。用透明的衣衣膜 (3m) 覆盖伤口, 以避免干燥或污染。
5. 术后动物护理、安乐死和组织学组织收集
- 手术后立即给动物注射1毫升0.9% 的生理盐水进行水合作用。
- 皮下注射丁丙诺非-sr (1 mg/kg) 立即用于镇痛。
- 每天注射动物美洛昔康 (1 mg kg) 和头孢唑啉 (50 mg kg, 3-7), 每天两次手动膀胱排空。
- 将动物放在单个笼子里, 并提供可获取的食物和水.完全 sci 的老鼠可以用前肢行走, 毫无困难地接近食物和水。
- 在 sci 手术后7天内取出手术夹。
- 在期望的时间点在 sci 和皮肤伤害以后, 通过 co 2 吸入安乐死动物 (3-5分钟), 根据 avma 指南关于安乐死 14.
- 收集受伤的皮肤样本, 固定在10% 福尔拉林 24小时, 然后在4°c 下储存在70% 乙醇, 直到切片。
- 为了处理组织, 嵌入石蜡并在微孔上生成薄片 (5μm)。用血红素和 eosin (h & e) 染色, 以显示组织形态 (图 3)。对于免疫组织化学研究 (图 4), 使用适当抗体的 ki67 (增殖)、cd31 (血管生成) 和α-平滑肌肌动蛋白 (α-sma) 的染色切片, 如 kumar 等人所述.
请注意:图像分析软件可用于量化图像特征12。
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Representative Results
该协议在完整 sci 的设置中创建了一个 pu. 简单地 (如图 1所示), 所有有完整 sci 或没有完整 sci 的老鼠都能很好地容忍磁体, 在整个12小时内, 磁体保持在原来的位置 (图1c、1c、1c、1c)).所有的小鼠都有两个由正常组织桥隔开的圆形伤口 (图 1e, 1e, 1e)。在没有 sci 的小鼠 (图 1e) 或 sci 站点下方的 sci (图 1e) 或 sci 站点上方 (图 1e) 中, 最初的伤害反应相似。
图 2描述了在转移磁铁的第3天时表皮消失的情况, 以及在第7天之前表皮的再现, 尽管在 sci 小鼠的 sci 水平以下产生的伤口的迁移速度明显较慢。
压力伤按照先前公布的标准12进行分级。图 3和图 4描述了 sci 小鼠的愈合特征, 并控制了非 sci 小鼠。sci 组表现出愈合缓慢、疤痕面积较大、表皮和真皮变薄, 皮肤创面增殖细胞 (ki67+细胞)、血管 (cd31+细胞) 和α-光滑肌动蛋白 (α-sma+) 密度较低11,12岁
当皮肤伤口被创造在 sci 水平以上时, 如图 5所示, 与非 sci 对照相比, 愈合时间、表皮和皮肤厚度或疤痕区域没有变化。
图 1: 在非 sci (n= 3) 和完全 sci 小鼠 (n = 3) 中产生压力伤口的实验程序.在实验室里居住1周后, 老鼠被剃光并脱毛 (a)。磁盘 (m) 放置示意图 (b, 由 stadler 等人修改)。将磁盘放置在正常小鼠的皮肤背侧, 并在笼子内麻醉恢复后的活动 (d, c)。在 sci 鼠标中, 光盘可以放置在 (f) 或 (h) 以上的 sci 站点。在 m 应用12小时后, 可以立即看到磁致皮肤损伤的区域, 这表明在非 sci (e) 和 sci 小鼠 (g, i) 中, 有2处伤口被完整的皮肤桥隔开。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2皮肤创面组织学 (h & e 染色) 和表皮创面宽度.在 m 应用后的第3天和第7天, 在非 sci (控制 + m) 和完全 sci (sci + m) 组中牺牲了一组小鼠, 以研究 m 诱导的缺血再灌注的早期效应。箭头表示表皮伤口边缘, 位于上皮衬里变薄消失的地方。刻度条 = 1 毫米. 在下面面板条形图中表示在每一组中测量的表皮伤口宽度 (n = 每个时间点 3)。统计意义由学生 t 检验确定。* p < 0.05 和 * * p < 0.01。数据以平均值± sem (均值的标准误差) 表示。经纽约新罗谢尔的 mary ann liebert 公司出版的《神经创伤杂志》 (35, 6, 815-824) (2018年) 批准, 对这一数字进行了修改.请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 完整 sci 对 m 诱导的 pu 发育和愈合的影响.(a) 在21天内, 非 sci (控制 + m) 和完全 sci (sci + m) 小鼠在 pu 诱导后皮肤伤口的代表性图像。刻度条 = 1 厘米 (b) 定量的伤口图像, 显示伤口闭合的分数与时间的函数。(c, d)有代表性的伤口图像显示非 sci 和 sci 小鼠的疤痕区。(e) 非 sci 小鼠与 sci 小鼠的疤痕面积的定量。(f, g)愈合伤口皮肤 (h & e 染色) 的代表性组织学显示表皮 (e, 双箭头), 真皮 (d, 大双箭头), 和脂肪层 (f)。刻度杆 = 100μm (h) 伤口闭合时愈合伤口表皮和皮肤厚度的定量 (非 sci 为 21天, sci 小鼠为 35天)。数据以平均± sem 的形式呈现, 统计意义由方差分析确定, 然后进行后场费舍尔的 lsd 测试和学生的 t 测试。* p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001。这一数字经纽约newrochelle 的 mary ann liebert 公司出版的《神经创伤杂志》 (35, 6, 815-824) (2018年) 允许转载。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: ki67、cd31 和 a-sma 在非 sci 和 sci 小鼠皮肤溃疡中的表达.伤口愈合后, 即在 pu 诱导后的第21天 (控制 + m) 和第35天 (sci + m) 收获伤口组织。5微米厚截面的代表性图像, 用抗 ki67、抗 cd31 或抗α-sma 染色, 并以40x 为目标进行可视化。非 sci (a, d, g) 和 sci (b, e, h) 小鼠的代表性图像显示 ki67+、cd31+和α-sma+ (棕色污渍, 红色箭头指向一些染色区域).比较了图像分析得到的% 正表达面积 (c、 f、 i)。该区域平均来自三个40x 字段 (两个来自伤口边缘, 一个来自伤口中心), 每节 (2/鼠, 每组3只老鼠)。数据以平均± sem 的形式呈现, 统计意义由学生的 t 检验确定。这一数字经纽约newrochelle 的 mary ann liebert 公司出版的《神经创伤杂志》 (35, 6, 815-824) (2018年) 允许转载。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: sci 对 sci 部位以上溃疡发育和愈合的影响.观察期间非 sci (控制 + m) 和 sci (sci + m) 小鼠溃疡的代表性图像 (a)。刻度条 = 1 厘米。第21天的疤痕区由圆圈 (a) 表示, 在非 sci 和 sci 小鼠 (b) 中平均值。定量的伤口图像, 显示伤口闭合的分数与时间 (c) 的函数有关。代表性的皮肤溃疡愈合显示表皮 (e, 小双箭头) 和真皮 (d, 大双箭头)。刻度杆 = 100μm (d)。在伤口闭合时 (第21天) 对愈合的皮肤溃疡的表皮和皮肤厚度进行定量。数据以平均± sem 的形式呈现, 统计意义由方差分析确定, 然后是波斯克·费舍尔的 lsd 测试, 即学生 t 测试。ns 统计上不显著。经纽约新罗谢尔的 mary ann. inc. 出版的《神经创伤杂志》 (35, 6, 815-824) (2018年) 允许对这一数字进行了修改和转载。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1: 在受伤后第2天和每周使用 bms 评分评估 sci 小鼠的运动功能。第2天和第5周的 bms 评分为 0.588±0.58 (中值0-no 运动, n = 17) 和 0.35±0.12 (n = 17, 中 0)。数据表示为平均± sem。经纽约新罗谢尔的 mary ann. inc. 出版的《神经创伤杂志》 (35, 6, 815-824) (2018年) 允许对这一数字进行了修改和转载。请点击此处下载此图.
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Discussion
本研究的方案描述了一种新的 pu 实验模型, 以评估 sci 对创面愈合的影响。皮肤 pu 是通过在 sci 部位上方或下方的背侧皮肤褶皱上应用两个直径为12毫米的圆盘磁体12小时诱导的。数据显示, sci 减缓了小鼠皮肤伤口愈合的速度。重要的是, 这些观察是专门在 sci 神经支配水平以下的皮肤伤口中进行的, 因为在 sci 水平以上的伤口, 因此仍然处于神经支配状态, 与非 sci 小鼠相比, 其愈合模式基本没有受到影响。
本文描述的 pu 协议基于在小鼠中使用的先前公布的方法, 在小鼠中使用较弱的磁体 (1000 高斯) 在12小时磁体应用的三个周期中使用, 该周期由12小时的磁体分离, 且无磁体15。最初, 我们比较使用一个, 两个和三个12小时周期的磁铁应用。使用重复应用的一个缺点是, 每次都必须特别注意将磁体从皮肤褶皱中分离, 并在完全相同的位置重新应用。因此, 单个应用程序要简单得多, 足以在小鼠背部皮肤褶皱中创建一个 pu。否则, 这种方法不需要复杂的设备, 不损害动物的运动, 并且是非常可重现的。使用不同磁体尺寸、形状和强度的研究, 或尝试在不同解剖位置创建 pu, 可能需要重新优化协议。与所有皮肤伤口愈合研究一样, 重要的是正确应用和定期更换透明膜覆盖物, 以避免伤口床的干燥和污染。
该模型中 pu 形成的机制依赖于两个磁体之间的压缩力, 预计这将大大超过皮肤中的毛细血管和静脉灌注压力, 并已有文献记载, 以诱发较大的病变动物16。使用一个12小时周期就会造成皮肤溃疡, 其损伤会深入真皮, 根据标准15, 这相当于第一阶段和第二阶段。这种技术的一个局限性是, 我们无法得到一个阶段 iii-iv pu。因此, 如果不对我们目前的模型进行重大修改, 就无法研究肌肉和骨骼在 pu 发育和愈合中的参与情况。此外, 我们产生的 pu 自发愈合, 因此, 并不忠实地代表一个慢性 pu, 在人类患者中可能看到。然而, 有趣的是, 这种方法导致了一个 pu 的初始相似的大小, 关闭与类似的动态作为常用的1厘米 x 1 厘米全厚度切除皮肤伤口。pu 诱导法可以去除潜在的扁桃体, 而在切除模型中完全去除。因此, 在伤口闭合过程中, 未能发挥主要作用, 在小鼠和其他啮齿类动物中, 这种作用主要是通过在创面周围可行的真皮中由成纤维细胞和肌成纤维细胞介导的收缩发生的。小疤痕形成17。
pu 诱导部位在 sci 上方或下方, 不会干扰用于访问 sci 部位的皮肤切口。因此, 该方法可以很容易地应用于低于或高于 sci 水平, 从而使研究能够区分 sci 对伤口愈合的局部与全身效应。当非 sci 动物在 pu 诱导后继续增加体重时, sci 动物的生长就会受到阻碍。尽管有这种深刻的系统性变化, 伤口愈合没有受到影响时, pu 被创建以上的 sci 水平。因此, 这种模式可以用来更好地了解局部神经支配在伤口愈合中的作用。与所有涉及 sci 的研究一样, 重要的是要为 sci 后的小鼠提供特殊的护理和监测, 因为这些小鼠需要手动引流膀胱, 监测肠道状况,并进行预防性抗生素治疗 11,12.
sci 患者即使有最好的医院护理和教育, 也面临着巨大的挑战, 皮肤 pu 给美国医疗系统带来了巨大的成本。该模型允许并排评估 sci 对皮肤 pu 发育和愈合的影响, 为测试各种治疗策略提供了一个平台, 可能有助于 sci 患者的 pu 愈合。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了新泽西脊髓研究委员会 (csccr15irg010)、美国国防部 (sc160029) 和耶鲁外科奥赫塞研究资助计划的部分支持。我们感谢来自罗格斯 w. m. keck 神经科学合作中心的肖恩·奥莱利的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magnets | Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO | CD14C | 3800 G Magnetic force |
| Mice standard diet | PMI Nutrition International, Brentwood, MO | Standard Food Pellet | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 029405 | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | Image Analysis Software | |
| BETADINE Surgical Scrub | HENRY SCHEIN Animal Health | ||
| Ophthalmic Ointment | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 008897 | |
| NAIR-Hair Remover Lotion | Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ | ||
| ELOXIJECT (meloxicam) Injection | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 049755 | 5 mg/mL, 10 mL |
| Cefazolin Sodium | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 054846 | 1 g, 10 mL bottle |
| Buprenorphine-SR | ZooPharm, Windsor, CO | - | - |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | BRAUN, Irvine, CA | S8004-5384 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR, Radnor, PA | 16004-130 | |
| BALB/C Male Mouse | Charles River Lab., Wilmington, MA | 28 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicator | Puritan, Guilford, ME | SKU#: 25-806 | |
| Michel Suture Clips | Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA | 12040-01 | |
| Surgical Suture, U.S.P. | Henry Schein Animal Health | 101-2636 |
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