Summary
Aqui, descrevemos um método simples para induzir úlceras de pressão de pele clinicamente relevantes (PUs) em um modelo do rato da lesão medular (SCI). Este modelo pode ser usado em estudos pré-clínicos de tela para diferentes terapias para cura PUs em pacientes SCI.
Abstract
Úlceras de pressão (PUs) são comuns debilitantes complicações da lesão traumática da medula espinhal (SCI) e tendem a ocorrer em tecidos moles em torno de proeminências ósseas. Lá está, no entanto, pouco conhecido sobre o impacto da SCI na pele ferida cura no contexto de modelos animais em configurações experimentais controlados. Neste estudo, é apresentado um modelo simples, não-invasivo, reprodutível e clinicamente relevantes do mouse de PUs no contexto da SCI completa. Ratos machos adultos (Balb/c, 10 semanas de idade) foram raspados e depilados. Pós-depilação (24 h), os ratos foram submetidos a laminectomia seguida por transecção completa da medula espinhal (vértebras de T9-T10). Logo após, uma prega de pele na parte de trás dos ratos foi levantada e imprensada entre dois discos magnéticos no lugar para próxima 12h, criando assim uma área isquêmica que desenvolveu um PU nos dias seguintes. As áreas feridas demonstraram edema do tecido e desaparecimento epidérmico pelo aplicativo de pós-ímã dia 3. PUs espontaneamente desenvolvido e curado. Cura foi, no entanto, mais lento nos ratos SCI comparado para controlar ratos não-SCI quando a ferida foi criada abaixo do nível do Sci. por outro lado, não há diferença na cura foi vista entre SCI e controle não-SCI os ratos quando a ferida foi criada acima do nível do Sci. Este modelo é uma ferramenta potencialmente útil para estudar a dinâmica de desenvolvimento do plutônio de pele e cicatrização depois SCI, bem como para testar abordagens terapêuticas que podem ajudar a curar essas feridas.
Introduction
Úlceras de pressão (PUs) são grandes complicações secundárias de traumático SCI1. PUs são lesões localizadas da pele e/ou tecidos subjacentes que geralmente ocorrem sobre proeminências ósseas, onde o peso corporal está concentrado, enquanto o paciente está sentado ou deitado1. A pele, gordura e músculo são expostos a uma pressão constante que leva ao desenvolvimento de isquemia localizada, inflamação do tecido, danos mecânicos e necrose2,3.
O desenvolvimento de PUs é afetado por vários fatores locais, incluindo a magnitude da pressão e cisalhamento, carregamento duração, umidade da pele e temperatura, longevidade de lesão e higiene geral da pele. Existem também fatores sistêmicos que desempenham um papel, como a condição física geral, osso e morfologia do tecido muscular e força4, idade do paciente, medidas hematológicas, sexo e fatores até sócio-econômicos, incluindo o estado civil, educação, e renda4,5.
A prevenção e o tratamento de PUs permanecem desafios significativos em pacientes SCI. SCI pacientes desenvolvem PUs em ~ 30-40% dos casos, com uma taxa de re-ocorrência de 60-85%, possivelmente devido ao fraco tecido cicatricial e falta de sensação protetora1. Assim, PUs muitas vezes leva à re-hospitalização de pacientes SCI e em geral representam um encargo financeiro significativo (80% mais vs SCI somente) para o sistema de saúde5,6,7,8,9 , 10.
O melhor de nosso conhecimento, não têm havido estudos nas configurações experimentais controladas para investigar o impacto do SCI sobre o processo de cicatrização do plutônio devido à falta de modelos animais apropriados. Aqui, um modelo de mouse reproduzíveis e clinicamente relevantes do plutônio na pele é descrito. Este modelo pode ser usado para estudar a dinâmica do aparecimento do plutônio e cura posterior, bem como para testar possíveis abordagens terapêuticas para prevenir PU ou melhorar PU cura no contexto da Sci.
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Protocol
Todo animal manipulação e procedimentos cirúrgicos foram realizados em conformidade com um protocolo aprovado pelo Comitê de uso e Rutgers University institucional Cuidado Animal. Os ratos foram alimentados com dieta padrão e água ad libitum.
1. preparação dos instrumentos cirúrgicos e não-cirúrgico
- Esterilize os instrumentos cirúrgicos e não-cirúrgico em autoclave.
- Limpar a mesa de operações cirúrgica com 70% de etanol e aqueça uma almofada de aquecimento para 37 ° C.
- Coloque a almofada de aquecimento na mesa de operações e cubra-o com panos de campo cirúrgicos estéreis.
Nota: Em todos os procedimentos de sobrevivência, a técnica de "Não tocar" é usada aqui para manter a esterilidade.
2. preparação dos animais e realizando a laminectomia espinhal T9-T10
- Adquirir ratos adultos (Balb/c) macho de 10 semanas de idade. Induzir a anestesia em cada animal usando um início de inalador com 5% de isoflurano e depois diminuir para 2-3% para manter a sedação para o restante dos procedimentos.
- Confirme a anestesia completa por não suscitar nenhuma resposta a uma estimulação de nocicepção induzida de pitada cauda/pata.
- Raspar o cabelo sobre o dorso (a cabeça à cauda) com uma tesoura elétrica e em seguida, aplique o creme depilatório (3 min) para remover os pelos restantes. Finalmente, lave o dorso com água/molhado esfrega em execução e devolver os animais de suas gaiolas.
Nota: Isso é necessário para evitar irritação adicional para a pele e contaminação química no momento da pele ferindo - No dia seguinte, aplique pomada oftálmica córneas para proteger os olhos de secagem durante o procedimento cirúrgico e, em seguida, esfregue a pele com 3 preparações alternativas de betadine esfoliante e 70% de etanol.
- Com um bisturi, realize uma incisão na pele (~1.0-1.5 cm) ao longo da linha média na parte de trás ao nível da vértebra T12-T8.
Nota: O nível das vértebras é identificado pela contagem volta da vértebra de T13 usando a localização de costelas flutuantes que correspondem a T13 vértebra11,12. - Limpe o tecido adiposo subcutâneo para obter acesso aos músculos paraspinal e então dissecá-los lentamente para expor os processos espinhosos e lâminas em ambos os lados.
Nota: Fazer este procedimento com muito cuidado para evitar sangramento excessivo ou lesão da medula espinhal, neste momento. - Execute uma laminectomia para expor a medula espinhal (vértebras de T9-T10) por descolar-se suavemente a lâmina vertebral usando fórceps de microdissecting.
Nota: Execute a laminectomia para que um excesso da medula espinhal é exposto para facilitar a criação da lesão. No grupo controle, somente a laminectomia é executada.
3. realizando a lesão medular completa de T9-T10
- Usando fórceps, secure coluna vertebral ao T8 e levante até a exagerar a curvatura da coluna vertebral.
- Com uma tesoura bem, seção entre a vértebra T9 e T10 até o assoalho do canal vertebral, para garantir a completa transecção medular.
- Depois de observar a transecção completa sob um microscópio cirúrgico, aplique um pedaço de toucinho sobre o site de laminectomia para fornecer proteção adicional para a medula espinhal, antes do encerramento do sítio cirúrgico.
- Finalmente, fechar a ferida e suturar os músculos paravertebrais, fáscia superficial, utilizando sutura contínua e em seguida, feche a pele usando sutura clipes12.
- Post-SCI, observar o movimento do intestino no dia seguinte; no entanto, gerencie a bexiga urinária pela evacuação manual da bexiga.
Nota: A escala de Mouse Basso (BMS) pode ser usado para monitorar o progresso do membro posterior recuperação funcional pós-SCI no dia 2 e depois semanal, ver Figura complementar 111,12,13.
4. indução de úlcera de pressão de pele após SCI completa
- Imediatamente após a cirurgia SCI, esfrega as costas do animal com betadine e 70% de álcool.
- Para um PU abaixo do site da SCI, injete na pele dorsal perto do Sacro, um volume muito pequeno (10 µ l) da solução de bupivacaína a 0,125% usando uma agulha 25g em lugares equidistantes ~0.5-1.0 centímetros distante, em uma elipse em torno do local de aplicação do ímã.
Nota: Para um PU acima o site SCI, injete a pele dorsal perto da região cervical. - Delicadamente, levantar uma prega de pele na parte de trás do rato e sanduíche-lo entre 2 discos magnéticos (5 × 12 mm de diâmetro, 2,4 g cada, força magnética de 3800 G) (Figura 1). 11 , 12
- Imediatamente após a aplicação magnética, animais retorno para gaiolas simples colocado sobre uma almofada de aquecimento até a consciência plena é recuperou (Figura 1).
- Após 12 h de aplicação magnética, levemente anestesiar o animal com isoflurano e remover os ímãs. Tirar uma fotografia dos sites ferida, para gravar a aparência inicial do plutônio (dia 0 tempo ponto). Cobrir a ferida com film curativo transparente (3M) para evitar a secagem ou contaminação.
5. pós-operatório Cuidado Animal, eutanásia e coleção de tecidos para a histologia
- Imediatamente após a cirurgia, injete o animal com 1 mL de soro fisiológico a 0,9% por via subcutânea para hidratação.
- Injecte por via subcutânea buprenorfina-SR (1 mg/kg) imediatamente para analgesia.
- Injete por via subcutânea animal diariamente meloxicam (1 mg/kg) e cefazolina (50 mg/kg por 3-7 dias) e duas vezes a evacuação da bexiga manual diária.
- Coloque os animais em gaiolas simples e fornecer alimento acessível e água ad libitum. Ratos com SCI completa podem andar usando suas patas dianteiras e aproximar a comida e a água sem quaisquer dificuldades.
- Remova os clipes cirúrgicos 7 dias após a cirurgia SCI.
- Nos pontos de tempo desejado após SCI e pele ferindo, eutanásia em animais por inalação de CO2 (3-5 min), em conformidade com as diretrizes de AVMA na eutanásia14.
- Coletar amostras de pele feridos, corrigir em formol a 10% por 24 h e em seguida, armazenar em etanol a 70% em 4 ° C até seccionamento.
- Para processar os tecidos, incorporar em parafina e gerar secções finas (5 µm) em um micrótomo. Mancha com hematoxilina e eosina (H & E) para visualizar a morfologia do tecido (Figura 3). Para estudos de imuno-histoquímica (Figura 4), mancha seções usando anticorpos apropriados para Ki67 (proliferação), CD31 (angiogênese) e actina de músculo liso-alfa (α-SMA), conforme descrito no Kumar et al.12
Nota: Software de análise de imagem pode ser usado para quantificar as características de imagem12.
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Representative Results
Este protocolo cria um PU no cenário do Sci. completa brevemente (conforme ilustrado na Figura 1), todos os mouses com ou sem SCI completa tolerado os ímãs muito bem, que permaneceu em sua posição original para o pleno 12 h (figuras 1C, 1D, 1f, 1 h ). Todos os ratos desenvolveram duas feridas circulares, separadas por uma ponte de tecido normal (Figura 1e, 1G, 1i). A resposta inicial ferindo foi semelhante em camundongos sem SCI (Figura 1e), ou com SCI abaixo o site SCI (Figura 1G) ou acima do local SCI (Figura 1i).
A Figura 2 mostra o desaparecimento da epiderme até dia 3 do post ímã remoção e o seu reaparecimento de dia 7, embora com uma migração significativamente mais lenta nas feridas criadas abaixo do nível do SCI em camundongos SCI.
As feridas de pressão foram classificadas conforme critérios previamente publicados12. Figura 3 e Figura 4 descrevem os recursos de curativas no SCI e controlam ratos não-SCI. O grupo SCI exibiu cura mais lento, maior área de cicatriz, mais fina epiderme e derme e menor densidade de pilhas proliferating (Ki67+ células), vasos sanguíneos (CD31+ células) e actina de músculo liso-alfa (α-SMA+) nas feridas da pele 11 , 12.
Quando as feridas de pele não foram criadas acima do nível do SCI, como mostrado na Figura 5, nenhuma mudança no tempo de cicatrização, epidérmica e dérmica espessuras ou área de cicatriz foi vista quando comparados aos controles não-SCI.
Figura 1 : Procedimento experimental para a criação de pressão feridas em não-SCI (n = 3) e complete-SCI ratos (n = 3). Após 1 semana habituação em laboratório, ratos foram raspados e depilados (um). Esquema de colocação de disco magnético (M) (b, modificado de Stadler et al.15). Colocação de discos magnéticos no dorso da pele de um rato normal e sua atividade após a recuperação da anestesia na gaiola (d, c). Nos ratos SCI, discos podem ser colocados abaixo (f) ou acima (h), o SCI do site. A área de lesão cutânea induzida por ímã é visível imediatamente após 12 h de aplicação M, que mostra 2 ferimentos separados por uma ponte de pele intacta no não-SCI (e) e ratos SCI (g, i). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Pele ferida histologia (H & E mancha) e largura de ferida epidérmico. No dia 3 e dia 7, após a aplicação de M, um conjunto de ratos foram sacrificados no SCI (Control + M) e grupos de completar-SCI (SCI + M) para estudar a isquemia induzida por M a efeitos iniciais e, seguidamente, a reperfusão. As setas indicam as bordas da ferida epidérmica, localizadas onde o forro epithelial afina e desaparece. Barra de escala = 1 mm. largura epidérmico ferida como medido em cada grupo (n = 3 em cada ponto de tempo) é representada no diagrama a barra inferior do painel. Significância estatística determinada pelo teste t de Student. * p < 0,05 e * * p < 0,01. Os dados são apresentados como média ± SEM (erro padrão da média). Esta figura foi modificada com a permissão do diário de Neurotrauma, 35, 6, 815-824, (2018), publicado pela Mary Ann Liebert, Inc., New Rochelle, NY12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Impacto da SCI completa PU induzida por M desenvolvimento e cura. (um) representante imagens de feridas cutâneas em SCI (Control + M) e ratos de completar-SCI (SCI + M) após a indução do plutônio no período de 21 dias. Barra de escala = 1 cm. (b) Quantified ferida imagens mostrando a fração de fechamento da ferida em função do tempo. (c, d) Imagens representativas de feridas cicatrizadas, mostrando a área de cicatriz no não-SCI e SCI ratos. área da cicatriz (e) Quantified em não-SCI contra ratos SCI. (f, g) Histologia representativa da ferida curada pele (coloração H & E), mostrando a epiderme (E, setas duplas), derme (D, grandes setas duplas) e a camada de gordura (F). Barra de escala = 100 µm. (h), quantificação da espessura epidérmica e dérmica de feridas cicatrizadas no tempo de fechamento da ferida (21 dias para não-SCI e 35 dias para ratos SCI). Os dados são apresentados como mean±SEM. significância estatística determinada pela ANOVA seguida pelo teste de LSD post-hoc de Fisher e teste t de Student. * p < 0.05, * * p < 0,01, e * * * p < 0,001. Esta figura foi reimpresso com permissão da revista de Neurotrauma, 35, 6, 815-824, (2018), publicado pela Mary Ann Liebert, Inc., New Rochelle, NY12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Expressão de Ki67 e CD31 um SMA em úlceras na pele dos não-SCI e ratos SCI. Ferida de tecidos foram colhidos após o encerramento da ferida, nomeadamente na indução de post-PU dias 21 (Control + M) e 35 (SCI + M). Imagens representativas de 5 µm e espessura seções manchadas com anti-Ki67, anti-CD31 ou anti-α-SMA e visualizado com um objectivo de 40x. Imagens representativas de SCI (a, d, g) e ratos SCI (b, e, h) mostram a distribuição de Ki67+, CD31+,e α-SMA+ (ponto de setas de mancha marrom, vermelha para algumas áreas manchadas) . A área positiva % de expressão como obtidas por análise de imagem é comparada entre os grupos (c, f, i). A área foi em média de três 40 x campos (duas das bordas da ferida) e do centro de ferida por seção (mouse/2, 3 ratos em cada grupo). Os dados são apresentados como média ± significância estatística SEM. foi determinada pelo teste t de Student. Esta figura foi reimpresso com permissão da revista de Neurotrauma, 35, 6, 815-824, (2018), publicado pela Mary Ann Liebert, Inc., New Rochelle, NY12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Impacto da SCI no desenvolvimento e cicatrização de úlceras acima o site SCI. Imagens representativas de úlceras no SCI (Control + M) e ratos SCI (SCI + M) durante o período de observação (um). Barra de escala = 1 cm. A área da cicatriz no dia 21 é representada por círculos (a) e valores foram em média em não-SCI e ratos SCI (b). Quantificados ferida imagens mostrando a fração de fechamento da ferida em função do tempo (c). Histologia representativa de úlceras de pele curada mostrando a epiderme (E, pequena seta dupla) e derme (D, grande seta dupla). Barra de escala = 100 µm (d). Quantificação da espessura epidérmica e dérmica de úlceras cutâneas curadas em tempo de fechamento da ferida (dia 21). Dados são apresentados como média ± significância estatística SEM. determinada pelo ANOVA seguida pelo teste de LSD de posthoc Fisher ou teste-t de Student. NS-estatisticamente não significantes. Esta figura foi modificada e reimpressa com permissão da revista de Neurotrauma, 35, 6, 815-824, (2018), publicado pela Mary Ann Liebert, Inc., New Rochelle, NY12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar a Figura 1: função de Motor em camundongos SCI foi avaliada usando a pontuação de BMS no dia pós-lesão 2 e então semanal. O placar de BMS no 2º dia e semana 5 foram ±0.058 0.058 (0-nenhum movimento mediano, n = 17) e 0.35±0.12 (n = 17, median-0). Dados são representados como mean±SEM. Esta figura foi modificada e reimpressa com permissão da revista de Neurotrauma, 35, 6, 815-824, (2018), publicado pela Mary Ann Liebert, Inc., New Rochelle, NY12. Clique aqui para baixar esta figura.
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Discussion
O protocolo neste estudo descreve um novo modelo experimental de PUs para avaliar o impacto da SCI na cicatrização de feridas. A pele PUs foram induzidas através de um aplicativo de 12 h de dois ímãs de disco de diâmetro de 12 mm em uma prega de pele dorsal, conjunto acima ou abaixo do site da SCI. Os dados mostram que a SCI retarda cicatrização de feridas de pele em camundongos. Importante, essas observações foram feitas especificamente em feridas de pele abaixo do nível da inervação do SCI, como feridas feitas acima do nível do SCI, e, portanto, que permaneceu inervado, foram em grande parte afetado em sua cura padrão em comparação com os ratos não-SCI.
O protocolo de PU aqui descrito é baseado em um método publicado anteriormente usado em ratos, onde os ímãs mais fracos (1000 Gauss) foram aplicados em três ciclos de aplicação magnética 12 h, separados por 12 h sem ímã15. Inicialmente, comparamos usando um, dois e três ciclos de 12 h de aplicação magnética. Uma desvantagem de usar aplicações repetidas é que cada vez que cuidados especiais devem ser tomados para desanexar o ímã da prega da pele e reaplicá-lo no mesmo local exato. Um único aplicativo, portanto, é muito mais simples e foi suficiente para criar um PU na dobra da pele dorsal do mouse. Caso contrário, essa metodologia não requer um dispositivo complexo, não afecte a circulação dos animais e é muito reprodutível. Estudos utilizando imã diferentes tamanhos, formas, e ou pontos fortes, ou tentar criar PUs em diferentes localizações anatômicas podem precisar de reotimizar o protocolo. Como em todos os estudos de cicatrização da pele ferida, é importante aplicar corretamente e regularmente mudar a película transparente cobrindo para evitar a secagem e a contaminação do leito da ferida.
O mecanismo de formação de PU neste modelo baseia-se a força de compressão entre dois ímãs, que deverá ultrapassar substancialmente as pressões de perfusão capilar e venoso na pele e anteriormente foi bem documentado para induzir lesões em maior animais16. Usando um ciclo único 12 h criou uma úlcera de pele que tinha lesão, estendendo-se profundamente na derme, que corresponde aos estágios I e II de acordo com critérios padrão15. Uma limitação dessa técnica é que não fomos capazes de obter uma fase plutônio III-IV. Portanto, se não poderia estudar o envolvimento dos músculos e ossos em desenvolvimento PU e cura sem modificações significativas para nosso modelo atual. Além disso, o PUs que geramos curar espontaneamente e, portanto, não fielmente representam um crônica do plutônio como pode ser visto em pacientes humanos. Curiosamente, no entanto, o método resultou em um PU do tamanho similar inicial fechado com semelhante dinâmica como é comumente usada 1 x 1 cm espessura total excisional pele feridas. O método de indução de PU poupa o subjacente carnosus panículo adiposo, enquanto ele é completamente removido no modelo excisional. Assim, parece que o carnosus panículo não representa um papel importante no processo de fechamento de ferida, que, em ratos e outros roedores, ocorre principalmente através da contração mediada por fibroblastos e miofibroblastos viável derme ao redor do local da ferida, com formação de cicatriz17.
O site da indução do plutônio, acima ou abaixo de SCI, não interfere com a incisão de pele usada para acessar o site da Sci. Portanto, o método pode ser facilmente aplicado abaixo ou acima do nível do SCI, que permite estudos que podem diferenciar o local vs efeitos sistêmicos de SCI na cicatrização de feridas. Enquanto os animais não-SCI continuam a ganhar peso após a indução de PU, o crescimento dos animais SCI é atrofiado. Apesar desta mudança sistêmica profunda, cicatrização de feridas não foi afetada quando o plutônio foi criado acima do nível do SCI. Este modelo pode, portanto, ser usado para compreender melhor o papel da inervação local na cicatrização de feridas. Como em todos os estudos que envolvem SCI, é importante fornecer cuidados especiais e acompanhamento aos ratos post-SCI, que exigem a drenagem manual da bexiga, monitoramento das condições do intestino e tratamento antibiótico profilático11,12 .
Pacientes SCI são desafiados substancialmente mesmo com os melhores cuidados hospitalares e educação, e pele PUs partilhar custos significativos para o sistema de saúde dos Estados Unidos. Este modelo permite lado-a avaliação do efeito da SCI no desenvolvimento do plutônio de pele e cura, que fornece uma plataforma para testar várias estratégias terapêuticas que podem ajudar o plutônio de cura em pacientes SCI.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado parcialmente pela Comissão da investigação da medula espinhal (CSCR15IRG010), o departamento de defesa dos EUA (SC160029) e o Yale departamento de cirurgia Sesma Research Grant Program New Jersey. Agradecemos a Sean o ' Leary do W.M. Keck centro de Neurociências colaborativo, Rutgers para assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magnets | Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO | CD14C | 3800 G Magnetic force |
| Mice standard diet | PMI Nutrition International, Brentwood, MO | Standard Food Pellet | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 029405 | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | Image Analysis Software | |
| BETADINE Surgical Scrub | HENRY SCHEIN Animal Health | ||
| Ophthalmic Ointment | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 008897 | |
| NAIR-Hair Remover Lotion | Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ | ||
| ELOXIJECT (meloxicam) Injection | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 049755 | 5 mg/mL, 10 mL |
| Cefazolin Sodium | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 054846 | 1 g, 10 mL bottle |
| Buprenorphine-SR | ZooPharm, Windsor, CO | - | - |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | BRAUN, Irvine, CA | S8004-5384 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR, Radnor, PA | 16004-130 | |
| BALB/C Male Mouse | Charles River Lab., Wilmington, MA | 28 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicator | Puritan, Guilford, ME | SKU#: 25-806 | |
| Michel Suture Clips | Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA | 12040-01 | |
| Surgical Suture, U.S.P. | Henry Schein Animal Health | 101-2636 |
References
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